CN101451953B - 一种生物毒性的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物毒性的检测方法，包括以下步骤：a、选择步骤，选择微生物，所述微生物内包含有荧光物质；b、混合步骤，向微生物中加入待测液，并混合；所述待测液中包含有待测样本；c、检测步骤，光源发出的光到达混合液，激发所述荧光物质发出荧光；测量所述荧光物质发出的荧光；分析荧光的变化，得到待测样本的生物毒性。本发明具有应用范围广等优点。
Description
技术领域
本发明涉及环境中各样本的生物毒性检测，尤其涉及一种生物毒性的检测方法。
背景技术
人类生活在环境之中，环境中的某些成分可能对人的生活和健康带来危害，因此很有必要对环境进行检测和监测。但传统的理化分析手段只能对某些特定的理化指标如温度、pH值、溶解氧等进行单一检测，而环境中的各种物质对人体的影响是一综合协同效应。因此，需要对这些物质的综合效应进行检测，生物毒性检测就是这样一项技术。
目前，生物毒性检测所采用的方法有：基于细菌生长抑制的检测法；基于生物酶活性的检测法，如脱氢酶的毒性检测法；基于大型蚤类的检测法；基于藻类的检测法；基于鱼类的检测法等。
在上述检测方法当中，基于细菌生长抑制的检测法由于具有检测方便、快速等优点，因此得到了最为广泛的应用。
基于细菌生长抑制的检测法的主要原理为：采用发光细菌，如深海荧光细菌(Vibrio fischeri)的发光特性进行检测。发光细菌生物发光反应是由分子氧作用，细胞内荧光酶催化，将还原态的黄素单核苷酸及长链脂肪醛氧化为黄素酸(FMN)及长链脂肪酸，在这些特殊的氧化反应过程中能够产生115K/mol自由能，这些自由能能够使最后生成的产物处于激发态，从而能够产生光子。总的来说，发光细菌生物发光是由于细菌本身的新陈代谢引起的，而环境中的各种生物毒物对细菌的新陈代谢有影响，从而影响到发光细菌的发光强度，这样通过对发光强度的检测就可以达到对环境中综合生物毒性进行检测的目的。
由于光学检测具有非接触、便捷等各种优点，所以发光细菌生长抑制检测法成为了目前生物检测的主要方法。但是，发光细菌种类较少，其生活环境有限，若是只用发光细菌作为环境生物毒性检测的唯一标志物，并不能适应各种复杂环境的需要。
发明内容
为了解决现有技术中的上述不足，本发明提供了一种利用微生物新陈代谢过程中的常见物质的荧光特性来进行环境生物毒性检测的新方法，满足了各种环境生物毒性检测的需要。
为实现上述发明目的，本发明所采用的方法如下：
一种生物毒性的检测方法，包括以下步骤：
a、选择步骤
选择微生物，所述微生物内包含有荧光物质；
b、混合步骤
向微生物中加入待测液，并混合；所述待测液中包含有待测样本；
c、检测步骤
光源发出的光到达混合液，激发所述荧光物质发出荧光；
测量所述荧光物质发出的荧光；
分析荧光的变化，得到待测样本的生物毒性。
作为优选，所述微生物是细菌或真菌。
作为优选，在所述步骤a中，通过如下方式将微生物配制成溶液：
根据检测的需要，选择菌种；
将所述菌种接种于培养基中；
待所述菌种培养到对数生长期时，配制为一定浓度的菌悬液。
作为优选，在所述步骤a中，通过如下方式将微生物配制成溶液：
根据检测的需要，选择菌种；
将所述菌种接种于培养基中；
待所述菌种培养到对数生长期时，制成冻干粉剂；
配制为一定浓度的菌悬液。
所述荧光物质为核黄素、还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、卟啉、色氨酸、苯基丙氨酸、三磷酸腺苷中的至少一种。
光源发出的光包含单个或多个激发波长，激发一种或多种荧光物质发出荧光。
作为优选，所述微生物是枯草芽孢杆菌或酿酒酵母。
连续测量荧光物质发出的荧光。
本发明的基本原理为：在各种细胞中，一般都含有核黄素(riboflavin)、还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、卟啉(porphyrin)、色氨酸(tryptophan)、苯基丙氨酸(phenylalanine)以及三磷酸腺苷(ATP)等荧光物质，这些物质在外界激发光的激发下，可以产生荧光。同时，这些荧光物质又都参与到细胞的新陈代谢中。因此，一旦环境中有影响生物的毒性物质存在，就会影响到这些荧光物质在细菌中的浓度、价态、以及分布等情况，例如还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)具有荧光效应，而氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)就不具有荧光效应。因此，利用荧光法对微生物中的这些荧光物质的浓度、价态、以及分布进行检测，就可以达到生物毒性的检测目的。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
与发光细菌生物毒性检测法相比较，最主要的优点就是广谱适应性：本发明采用一般细胞中都含有的荧光物质，对细胞的新陈代谢进行检测，从而达到检测样本生物毒性的目的。因此，本发明无需局限于发光菌，而是可以根据实际待测样本的需要，选择对被测样本中物质最为敏感的细菌等微生物来作为“传感器”进行光学检测，这样就大大提高了生物毒性测量的适用范围和检测灵敏度。因此，可以用来作为环境生物毒性检测的微生物种类的选择范围大大扩大，有利于满足各种不同场合的需求。
目前，荧光检测技术已非常成熟；同时，由于荧光法使用激发光源，所以还可以通过不同波长的激发光源的选择，选择性地对新陈代谢的不同标志物进行检测，达到提取更多、更合适检测信息的目的。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步详尽描述。
实施例1：
一种生物毒性的检测方法，包括以下步骤：
a、选择步骤
根据检测待测样本的需要，选择枯草芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌中含有荧光物质，如核黄素、还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸以及三磷酸腺苷；
采用枯草芽胞杆菌常用的培养基进行培养，待培养到对数生长期，配制为适当浓度的菌悬液加入测试管中；
b、混合步骤
向测试管中加入待测液，如含有待测样本氯化汞的溶液，使之和菌种充分接触；
c、检测步骤
光源发出测量光，测量光的波长包括270nm、292nm和344nm，所述测量光到达混合液；
其中，270nm的光激发枯草芽胞杆菌中的核黄素发出荧光、292nm的光激发枯草芽胞杆菌中的三磷酸腺苷发出荧光、344nm的光激发枯草芽胞杆菌中的还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸发出荧光；
在518nm处测得核黄素发出的荧光、在388nm处测得三磷酸腺苷发出的荧光、在465nm处测得还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸发出的荧光；关闭所述光源10分钟；
之后打开光源，再次测得：在518nm处核黄素发出的荧光、在388nm处三磷酸腺苷发出的荧光、在465nm处还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸发出的荧光；
比较前后两次测得的荧光强度的变化，从而得到待测样本的生物毒性。
实施例2：
一种生物毒性的检测方法，与实施例1不同的是：
步骤a为：
根据检测待测样本的需要，选择枯草芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌中含有荧光物质，如核黄素、还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸以及三磷酸腺苷；
采用枯草芽胞杆菌常用的培养基进行培养，待培养到对数生长期，以冷冻干燥法制成冻干粉剂；
向冻干粉剂中加入溶液，使枯草芽孢杆菌恢复到原来的生理状态，配制为适当浓度的菌悬液加入测试管中。
实施例3：
一种生物毒性的检测方法，与实施例2不同的是：
步骤c为：
光源发出测量光，测量光的波长包括270nm、292nm和344nm，所述测量光到达混合液；
其中，270nm的光激发枯草芽胞杆菌中的核黄素发出荧光、292nm的光激发枯草芽胞杆菌中的三磷酸腺苷发出荧光、344nm的光激发枯草芽胞杆菌中的还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸发出荧光；
在518nm处测得核黄素发出的荧光、在388nm处测得三磷酸腺苷发出的荧光、在465nm处测得还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸发出的荧光；
一直保持荧光测量5分钟，以得到反应的动态数据；根据荧光的动态变化情况，得到待测样本的生物毒性。
实施例4：
一种生物毒性的检测方法，包括以下步骤：
a、选择步骤
根据检测待测样本的需要，选择酿酒酵母，酿酒酵母中含有荧光物质，如核黄素、还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸以及三磷酸腺苷；
采用酿酒酵母常用的培养基进行培养，待培养到对数生长期，配制为适当浓度的菌悬液加入测试管中；
b、混合步骤
向测试管中加入待测液，如含有待测样本氯化汞的溶液，使之和菌种充分接触；
c、检测步骤
光源发出测量光，测量光的波长包括270nm、292nm和344nm三个激发波长，所述测量光到达混合液；
其中，270nm的光激发枯草芽胞杆菌中的核黄素发出荧光、292nm的光激发枯草芽胞杆菌中的三磷酸腺苷发出荧光、344nm的光激发枯草芽胞杆菌中的还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸发出荧光；
采用荧光光度计测量250-700nm内分别由核黄素、三磷酸腺苷、还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸发出的荧光；关闭所述光源10分钟；
之后打开光源，再次采用荧光光度计测量250-700nm内分别由核黄素、三磷酸腺苷、还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸发出的荧光；
比较前后两次测得的荧光强度的变化，得到待测样本的生物毒性。
实施例5：
一种生物毒性的检测方法，包括以下步骤：
a、选择步骤
根据检测待测样本的需要，选择枯草芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌中含有荧光物质，如色氨酸；
采用枯草芽孢杆菌常用培养基进行培养，待培养到对数生长期，配制为适当浓度的菌悬液加入测试管中；
b、混合步骤
向测试管中加入待测液，如含有待测样本氯化汞的溶液，使之和菌种充分接触；
c、检测步骤
光源发出测量光，测量光的波长为280nm，280nm的光激发枯草芽胞杆菌中的色氨酸发出荧光，所述测量光到达混合液；
在357nm处测得色氨酸发出的荧光；关闭所述光源10分钟；
之后打开光源，再次在357nm处测得色氨酸发出的荧光；
比较前后两次测得的荧光强度的变化，得到待测样本的生物毒性。
需要指出的是，上述实施方式不应理解为对本发明保护范围的限制。本发明的关键是，利用微生物新陈代谢过程中的常见物质的荧光特性来进行环境生物毒性检测。在不脱离本发明精神的情况下，对本发明作出的任何形式的改变均应落入本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种生物毒性的检测方法，包括以下步骤：
a、选择步骤
根据待测样本的需要，选择微生物，所述微生物内包含有荧光物质；
b、混合步骤
向微生物中加入待测液，并混合；所述待测液中包含有待测样本；
c、检测步骤
光源发出的光到达混合液，激发所述荧光物质发出荧光；
测量所述荧光物质发出的荧光；
分析荧光的变化，得到待测样本的生物毒性。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述微生物是细菌或真菌。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：在所述步骤a中，通过如下方式将微生物配制成溶液：
根据检测的需要，选择菌种；
将所述菌种接种于培养基中；
待所述菌种培养到对数生长期时，配制为一定浓度的菌悬液。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：在所述步骤a中，通过如下方式将微生物配制成溶液：
根据检测的需要，选择菌种；
将所述菌种接种于培养基中；
待所述菌种培养到对数生长期时，制成冻干粉剂；
配制为一定浓度的菌悬液。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述荧光物质为核黄素、还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、卟啉、色氨酸、苯基丙氨酸、三磷酸腺苷中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：光源发出的光包含单个或多个激发波长，激发一种或多种荧光物质发出荧光。
7.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述微生物是枯草芽孢杆菌或酿酒酵母。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：连续测量荧光物质发出的荧光。
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