CN101451134A - 从人微量b细胞中扩增人抗体重链及轻链基因片段的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及从人微量B细胞中扩增人抗体重链及轻链基因片段的方法，该方法应用独创的RT－Nest－PCR技术和基于生物信息学基础上的集群引物的设计，从人的微量(10个)B细胞中扩增出人抗体重链和轻链可变区基因片段能涵盖目前所有已报导的人抗体的基因。本发明有利于克隆，表达和重组出人抗各类肿瘤相关抗原和传染病抗原的人单克隆抗体，是一条创新的用基因工程方法研制人单克隆抗体的关键技术。

Description

从人微量B细胞中扩增人抗体重链及轻链基因片段的方法

技术领域

本发明涉及生物医学、基因工程和免疫学领域，尤其涉及从人微量B细胞中扩增人抗体重链及轻链基因片段的方法。

背景技术

抗体类药物以其安全有效，特异性高的优点，已成为国际药品市场上的一大类新型的诊断和治疗剂。到目前为止，美国FDA已批准了24个抗体药物上市，全球有超过200家公司正在研发单抗治疗药物，约有360个产品正在研发之中，全球抗体类药物市场销售额在2000年时为17亿美元，2004年达103亿美元，预计到2010年全球市场将达300亿美元。目前国内抗体药物市场尚未形成，年销售额不足亿元。由于鼠源性抗体不仅受到人体免疫***的排斥，而且Fc片段不能有效地激活人体效应***，所以用人抗体取代鼠抗体是克服鼠单抗在临床应用障碍的关键，而杂交瘤技术又不能提供稳定分泌人抗体的细胞株。随着基因工程技术的发展为人源化抗体的研制提供了基础，特别是用人抗体恒区置换鼠抗体相应部位的人鼠嵌合抗体。这类抗体分子70％-90％为人源，在抗原特异性和亲和力方面都较好地保留了亲代抗体的特征，而免疫源性降低了12％左右，在体内的半衰期和效应功能也有所提高。完全人单克隆抗体则是最理想的选择。目前生产人抗体的方法主要包括抗体库技术和转基因小鼠技术，但这两类技术均尚处在实验室研发阶段，不够成熟。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的不足而提供一种从人微量B细胞中扩增人抗体重链及轻链基因片段的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：从人微量B细胞中扩增人抗体重链及轻链基因片段的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)从人全血中分离B细胞及B细胞的保存

1)人全血预处理

EDTA或柠檬酸进行抗凝处理的人全血加入二倍体积的缓冲液(含有0.1％BSA，2mM EDTA的PBS缓冲液)离心后，去上清，在血细胞中加入等体积上述溶液混匀后，用于B细胞的分离；

2)人B细胞的分离

用包被抗CD19抗体的磁珠方法从人全血中分离人B细胞；该方法具体为：使用DYNAL公司的Dynabeads CD19(Pan B)细胞分离试剂盒及DETACHaBEAD CD19试剂盒按操作说明书分离B细胞；

3)人B细胞的保存

分离得到的B细胞用冻存液(含10％胎牛血清，10％ DMSO的DMEM)冻存于液氮中，该冻存方法至少在2年内可保持细胞膜及RNA的完整；

(2)集群引物来源和设计

1)搜寻γ重链及λ、κ轻链的基因序列

应用生物信息学的方法从基因库获得文献已报导的所有的人抗体的γ重链及λ、κ轻链的基因序列；

2)分拣，归类各γ重链及λ、κ轻链的基因序列

将上述搜索到的基因分类为γ、λ、κ三组基因序列，在各组序列中进行一系列对比，并将相似的序列进行兼并；

3)人抗体γ重链及λ、κ轻链的集群引物设计

由于是用微量的B细胞扩增人γ重链及λ、κ轻链的基因序列，所得到的模板的量十分稀少，因此设计了nest-PCR：即通过两次PCR的方法来扩增目的γ重链及λ、κ轻链的基因片段，为此设计了两组集群引物：

a.第一次PCR引物：长21bp，γ重链引物为18对，λ轻链引物为35对，κ轻链引物为33对；

b.第二次PCR引物：长49bp，在第一次PCR引物的基础上，5’引物加上AscI酶切位点及信号肽序列，3’引物向上游移动了20bp，形成巢式结构，并引入了NotI酶切位点，这使PCR效率及稳定性大为提高，减少了PCR反应的非特异性产物，并使所获得的人抗体的轻、重链功能性片段可直接进行克隆及表达；

(3)人B细胞中抗体相关基因的扩增

1)从10个人B细胞中获取微量mRNA

用裂解缓冲液(Lysis Buffer with Lysis Enhancer，Invitrogen公司)逐级稀释B细胞，准确地取10个B细胞，置于200微升薄壁PCR管中，并配置裂解反应体系，体系中含oligo-d(T)₂₀ 3.85uM及RNase OUT 3.08U，轻柔混合后，置PCR仪中75℃保温10分钟，立即***冰中至完全冷却；

2)用上述微量mRNA为模板进行反转录反应

上述样品离心，置于冰上，配置RT反应体系，反应体系中含5×RT缓冲液，0.33mM dNTP，1.33U RNase OUT(Invitrogen)，6.67U Super ScriptIII反转录酶(Invitrogen)，3mM DTT，用重蒸水(RNase Free TAKARA)补足体积，混匀，短暂离心，置于PCR仪中进行反转录反应，条件如下：50℃50分钟，85℃ 10分钟，反应结束后4℃保持；

3)从上述cDNA产物中扩增γ重链及λ、κ轻链的可变区基因片段

应用nest-PCR的方法，用两次PCR扩增出γ重链及λ、κ轻链的基因片段：

a.第一次PCR反应：将反转录产物(15微升)用重蒸水稀释5倍，各取PCR反应终体积(30微升)的1/5分别置于三个200微升PCR管中，用于扩增γ重链及λ、κ轻链的基因片段；PCR反应体系中每管含：0.2uM各自的3’引物，10×PCR缓冲液，0.2mM dNTP(Invitrogen)，1.5mM MgCl2，0.04U PlateinumTaq DNA Polymerase(聚合酶Invitrogen)及0.4uM各自5’集群引物，用重蒸水补足体积；

反应条件：94℃ 1分钟，94℃ 15秒，55℃ 30秒，72℃ 1分钟，然后共40个循环，反应结束后4℃(冰浴)保存；

b.第二次PCR反应：将上述产物分别置于三个200微升PCR管中，扩增γ重链及λ、κ轻链的目的基因序列；每管含：模板(30微升反应终体积的1/5)，0.2uM各自的3’引物，10×PCR缓冲液，0.2mM dNTP(Invitrogen)，1.5mMMgCl2，0.04U Plateinum Taq DNA Polymerase(聚合酶Invitrogen)及0.4uM各自5’引物，用重蒸水补足体积；

反应程序：94℃ 1分钟，然后94℃ 15秒，60℃ 30秒，72℃ 1分钟共40个循环，反应结束后4℃(冰浴)保存，取部分产物用1％琼脂糖电泳检测。

所述的步骤(2)设计的集群引物如表1所示：

表1：5’端集群引物及3’端引物

本发明是用人的微量B细胞总mRNA作为模板，根据目前文献发表的数百种人的抗体轻、重链基因序列，利用生物信息学技术设计，合成了多达20-30种的集群引物，同时发展了从微量B细胞反转录总mRNA的方法，发明了独特的RT-PCR方法，保证在此基础上能扩增出已报导的人抗体基因库中人抗体的轻、重链基因片段而不被遗漏。

由于10个人B细胞的总mRNA量及经RT-PCR获得的cDNA模板量均极低，加上集群引物的使用，一般的PCR方法均无法扩增出所设计的人抗体的轻、重链片段。我们发展了一套有特色的、有效的PCR扩增方法，其特点是使用二次扩增的Nest-PCR方法，即在第一次PCR的引物基础上在5’引物上加上28bp核酸片段，而3’端向上游移动20bp，从而使PCR方法的效率及稳定性大为提高，并减少了反应的非特异性产物，使微量模板的扩增获得成功。

本发明根据目前文献上已经报导的人抗体基因的基因库序列，应用生物信息学技术，分别设计了针对人抗体的重链及二条轻链的功能性片段的集群引物。使用这些集群引物，不仅可以扩增基本涵盖目前已发表的人抗体基因库中的所有基因的片段，而且带有适合于Nest-PCR的设计特点，又发展了一套高效的PCR扩增技术，解决了模板量低，引物种类多的扩增难题。所获得的PCR产物，即人抗体的轻、重链功能性片段，因而，他们可表达和重组成有活力的抗体片段，可为多种制备人单克隆抗体的生物工程技术提供理想的模板，所以本发明是生物工程技术研制单克隆抗体的一项关键技术。

附图说明

图1为人抗体γ重链基因片段及λ轻链基因片段电泳图；

图1中，1：DNA Marker(DL2,000 TAKARA)，2：人抗体γ重链基因片段，3：人抗体λ轻链基因片段，4：阴性对照。

图2为人抗体λ轻链基因片段及κ轻链基因片段电泳图；

图2中，1：人抗体λ轻链基因片段，2：人抗体κ轻链基因片段，3：阴性对照，4：DNA Marker(DL2,000 TAKARA)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步说明。

一种从人微量B细胞中扩增人抗体重链及轻链基因片段的方法，该方法包括以下步骤：

一、从人全血中分离B细胞及B细胞的保存

1.人全血预处理

取人全血2毫升于EDTA处理过的试管内，加入4毫升缓冲液I(含有0.1％BSA，2mM EDTA的PBS，pH7.4)600g离心10分钟，小心地将上层清液弃去，加入与血球等体积上述溶液混匀。

2.人B细胞的分离

将上述预处理的全血分装入2个2毫升离心管中，每管加入25微升磁性微珠(Dynabeads CD19(Pan B)DYNAL)，将试管置于慢速旋转的微量混合器上室温孵育45分钟然后将试管置于专用磁铁上，移去未吸附的血球悬液，用缓冲液I洗吸有B细胞的磁珠4次。用300微升含有1％胎牛血清的DMEM分三次将磁珠转移至一个离心管中，加入30微升分离液(DETACHaBEADCD19，DYNAL)在混合器上室温孵育1小时后试管置于磁铁架上上，吸取CD19⁺的B细胞悬液，细胞计数，共获1.6×10⁵个B细胞。

3.人B细胞的保存

将上述B细胞悬液离心，弃去上清，沉淀中加入500微升冻存液(DMEM内含10％胎牛血清及10％DMSO)混匀后，分装，冻存于液氮中。冻存2年后，显微镜下观察细胞完整，PCR仍可获得抗体重链和轻链的基因片段。

二、集群引物来源和设计

运用生物信息学的方法设计了集群引物，见表1。

上述引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，用重蒸水溶解引物，即得到100uM的储存液。各取γ重链第一次PCR的18条5’引物2微升，混合得36微升混合引物(总浓度为100uM)，同样的方法得36微升γ重链第二次PCR的5’混合引物(总浓度为100uM)和λ轻链两次PCR的35条5’混合引物各70微升(总浓度均为100uM)，及κ轻链两次PCR的33条5’引物各66微升(总浓度均为100uM)。上述100uM混合引物各取10微升(剩余作为储存液保存于-20℃)分别加入90微升重蒸水，即得10uM 5’引物混合物。

三、B细胞中抗体相关基因的扩增

1.从10个B细胞中获取微量mRNA

用裂解缓冲液(Lysis Buffer with Lysis Enhancer，Invitrogen)逐级稀释B细胞，准确地取10个B细胞(5微升，每微升2个细胞)，置于200微升薄壁PCR管中，加入1微升oligo d(T)₂₀(50uM)，0.5微升RNase OUT(40U/ul)，轻轻混合，置于PCR仪上75℃保温10分钟，立即***冰中至完全冷却。

2.用上述微量mRNA为模板进行反转录反应

上述样品离心，置于冰中，加入3微升5×RT缓冲液，0.5微升dNTP(10mM)，0.5微升RNase OUT(40U/ul)，0.5微升Super Script III反转录酶(200U/ul，Invitrogen)，0.5微升DTT(0.1M)，3.5微升重蒸水(RNase FreeTAKARA)。混匀，短暂离心，置于PCR仪上进行反转录反应，条件如下：50℃ 50分钟，85℃ 10分钟，反应结束后4℃保持。

3.从上述cDNA产物中扩增γ重链及λ、κ轻链的基因序列

(1)第一次PCR反应：将上述产物用重蒸水稀释5倍，各取6微升分别置于三个200微升PCR管中，每管分别加入：1.2微升各自已配置好的第一次PCR5’引物(10uM)，0.6微升各自的第一次PCR3’引物(10uM)，3微升10×PCR缓冲液，0.6微升dNTP(10mM，Invitrogen)，0.9微升MgCl₂(50mM)，0.24微升Plateinum Taq DNA Polymerase(DNA聚合酶5U/ul，Invitrogen)，17.46微升重蒸水，反应总体积为30微升。

反应程序：94℃ 1分钟，然后94℃ 15秒，55℃ 30秒，72℃ 1分钟共40个循环，反应结束后4℃(冰浴)保存。

(2)第二次PCR反应：将上述产物各取6微升分别于三个200微升PCR管中，每管分别加入：1.2微升各自已配置好的第二次PCR5’引物(10uM)，0.6微升各自的第二次PCR3’引物(10uM)，3微升10×PCR缓冲液，0.6微升dNTP(10mM，Invitrogen)，0.9微升MgCl₂(50mM)，0.24微升Plateinum Taq DNAPolymerase(DNA聚合酶5U/ul，Invitrogen)，17.46微升重蒸水，反应总体积为30微升。

反应程序：94℃ 1分钟，然后94℃ 15秒，60℃ 30秒，72℃ 1分钟共40个循环，反应结束后4℃(冰浴)保存。

取5ul产物用1％琼脂糖电泳检测。

用本实施例方法得到的人抗体γ重链750bp基因片段及λ、κ轻链700bp基因片段如图1、图2所示。

Claims (2)

1.从人微量B细胞中扩增人抗体重链及轻链基因片段的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)从人全血中分离B细胞及B细胞的保存

1)人全血预处理

EDTA或柠檬酸进行抗凝处理的人全血加入二倍体积的缓冲液(含有0.1％BSA，2mM EDTA的PBS缓冲液)离心后，去上清，在血细胞中加入等体积上述溶液混匀后，用于B细胞的分离；

2)人B细胞的分离

用包被抗CD19抗体的磁珠方法从人全血中分离人B细胞；

3)人B细胞的保存

分离得到的B细胞用冻存液(含10％胎牛血清，10％DMSO的DMEM)冻存于液氮中，该冻存方法至少在2年内可保持细胞膜及RNA的完整；

(2)集群引物来源和设计

1)搜寻γ重链及λ、K轻链的基因序列

应用生物信息学的方法从基因库获得文献已报导的所有的人抗体的γ重链及λ、κ轻链的基因序列；

2)分拣，归类各γ重链及λ、K轻链的基因序列

将上述搜索到的基因分类为γ、λ、κ三组基因序列，在各组序列中进行一系列对比，并将相似的序列进行兼并；

3)人抗体γ重链及λ、K轻链的集群引物设计

由于是用微量的B细胞扩增人γ重链及λ、κ轻链的基因序列，所得到的模板的量十分稀少，因此设计了nest-PCR：即通过两次PCR的方法来扩增目的γ重链及λ、κ轻链的基因片段，为此设计了两组集群引物：

a.第一次PCR引物：长21bp，γ重链引物为18对，λ轻链引物为35对，K轻链引物为33对；

b.第二次PCR引物：长49bp，在第一次PCR引物的基础上，5’引物加上AscI酶切位点及信号肽序列，3’引物向上游移动了20bp，形成巢式结构，并引入了NotI酶切位点，这使PCR效率及稳定性大为提高，减少了PCR反应的非特异性产物，并使所获得的人抗体的轻、重链功能性片段可直接进行克隆及表达；

(3)人B细胞中抗体相关基因的扩增

1)从10个人B细胞中获取微量mRNA

用裂解缓冲液(Lysis Buffer with Lysis Enhancer，Invitrogen公司)逐级稀释B细胞，准确地取10个B细胞，置于200微升薄壁PCR管中，并配置裂解反应体系，体系中含oligo-d(T)₂₀ 3.85uM及RNase OUT 3.08U，轻柔混合后，置PCR仪中75℃保温10分钟，立即***冰中至完全冷却；

2)用上述微量mRNA为模板进行反转录反应

上述样品离心，置于冰上，配置RT反应体系，反应体系中含5×RT缓冲液，0.33mM dNTP，1.33U RNase OUT(Invitrogen)，6.67U Super ScriptIII反转录酶(Invitrogen)，3mM DTT，用重蒸水(RNase Free TAKARA)补足体积，混匀，短暂离心，置于PCR仪中进行反转录反应，条件如下：50℃50分钟，85℃ 10分钟，反应结束后4℃保持；

3)从上述cDNA产物中扩增γ重链及λ、κ轻链的可变区基因片段

应用nest-PCR的方法，用两次PCR扩增出γ重链及λ、κ轻链的基因片段：

a.第一次PCR反应：将反转录产物(15微升)用重蒸水稀释5倍，各取PCR反应终体积(30微升)的1/5分别置于三个200微升PCR管中，用于扩增γ重链及λ、κ轻链的基因片段；PCR反应体系中每管含：0.2uM各自的3’引物，10×PCR缓冲液，0.2mM dNTP(Invitrogen)，1.5mM MgCl2，0.04U PlateinumTaq DNA Polymerase(聚合酶Invitrogen)及0.4uM各自5’集群引物，用重蒸水补足体积；

反应条件：94℃ 1分钟，94℃ 15秒，55℃ 30秒，72℃ 1分钟，然后共40个循环，反应结束后4℃(冰浴)保存；

b.第二次PCR反应：将上述产物分别置于三个200微升PCR管中，扩增γ重链及λ、κ轻链的目的基因序列；每管含：模板(30微升反应终体积的1/5)，0.2uM各自的3’引物，10×PCR缓冲液，0.2mM dNTP(Invitrogen)，1.5mMMgCl2，0.04U Plateinum Taq DNA Polymerase(聚合酶Invitrogen)及0.4uM各自5’引物，用重蒸水补足体积；

反应程序：94℃ 1分钟，然后94℃ 15秒，60℃ 30秒，72℃ 1分钟共40个循环，反应结束后4℃(冰浴)保存，取部分产物用1％琼脂糖电泳检测。

2.根据权利要求1所述的从人微量B细胞中扩增人抗体重链及轻链基因片段的方法，其特征在于，所述的步骤(2)设计的集群引物如表1所示：

表1：5’端集群引物及3’端引物

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