CN101446406B - 一种光纤倏逝场照明器 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种光纤倏逝场照明器，光纤一端的一部分研磨成斜面，且斜面过光纤芯位置1-10微米，当光从光纤芯入射，在斜面处被反射至光纤端面处，并在光纤端面发生全内反射。本发明结合光纤技术和内反射成像原理，在单根光纤上制作可以用于生物照明的倏逝场照明器。此设计与现有倏逝场照明器相比，具有结构简单、体积更小以及光路更加灵活、稳定等优点，能够实现对生物表面的多方面照明，在倏逝场照明器的性能方面有了很大突破。可以方便地结合显微镜技术构成新型的荧光显微成像***同时也极易和其它成像技术、探测技术相结合，应用范围广泛。

Description

一种光纤倏逝场照明器

技术领域

本发明属于荧光显微成像技术领域，特别涉及一种光纤倏逝场照明器。

背景技术

生命科学中大量的事实表明细胞的动力学特征源于单个蛋白质分子的聚合和相互作用，为了研究细胞动力学就需要发展超高分辨率的成像技术，从而能够在分子尺度上探测细胞生命活动的细节。在这种需求下，20世纪30年代电子显微镜发展起来。它导致了细胞研究的革命，使得生物学家得以从亚显微水平上认识细胞世界。进入80年代，非光学类扫描探针显微术特别是原子力显微镜的出现更是将成像的分辨率推进到纳米的精度。但是这些显微术均在不同程度上存在***结构复杂、成像检测环境要求苛刻等困难，尤其是不能像光学显微术那样提供重要的光学信息(如偏振态、折射率、光谱等)和进行无损伤性生物活体探测，这些均大大限制了它们在高分辨率细胞成像中的应用。与此同时，新一代光学显微技术发展起来。它们以其高的空间分辨率和时间分辨率、无损伤、以及对单分子活体探测的可行性，再次成为生物学家、物理学家和成像学家们研究的热点。全内反射荧光显微术是近年来新兴的一种光学成像技术，它利用全内反射产生的倏逝场来照明样品，从而致使在厚度在百纳米级的光学薄层内的荧光团受到激发，荧光成像的信噪比很高。这种方法的成像装置简单，极易和其它成像技术、探测技术相结合。目前已成功的实现100nm甚至更低的空间分辨率。

目前，基于全内反射原理进行倏逝场照明的荧光显微成像的实现方式大致有两种：棱镜式照明器和物镜式照明器。激光透过棱镜或物镜后以一定角度照射到盖玻片表面，形成全反射，倏逝波激发生物样品的荧光分子，荧光分子所发射的光经过物镜成像到照相机或CCD上，实现对生物样品的荧光记录。两种形式的显微镜各有优缺点，对于棱镜式而言，从激光器出来的光以精确选定的入射角入射到棱镜上，在载玻片的表面发生全反射，产生的倏逝场激发位于两玻片之间的样品发射出荧光，实现起来相对简单。同时它的缺点也很明显：1.棱镜尺寸较大，因此留给生物样品和物镜之间的空间较小，所以在此仪器上安装一些诸如原子力显微镜、近场光学显微镜等其他探测仪器非常困难，2.由于光路较为复杂，使得光路调节、样品更换等环节操作难度很大。而对物镜式而言，则可以克服以上缺点，激光聚焦到物镜后焦面并经过物镜边缘入射，物镜出射光为平行光并斜入射至盖玻片上，调节激光入射位置和斜入射的角度，即可达到全内反射要求，从而实现倏逝场照明。倏逝场所激发的荧光仍旧经过物镜接收，通过双色镜滤掉除荧光以外的其他波长的光，成像在物镜后方的照相机或CCD上，实现对生物样品的荧光纪录，目前大多数生物学家采用物镜式照明器的全内反射荧光显微镜。物镜式照明器同样也有明显的缺点：1.照明器与显微镜观察***共光路，增加了光路的复杂性，2.由于形式的限制，只能观察细胞贴壁生长的下表面，而对于生物研究更有意义的细胞表面尤其是侧面的观察则无能为力，3.大数值孔径显微镜物镜的引入极大地增加了***成本。

发明内容

本发明的目的针对与现有高分辨率荧光显微成像技术的不足，将光纤技术与全内反射原理相结合，提出了一种适用于荧光显微成像的光纤倏逝场照明器，将倏逝场照明器制作在直径为125微米的单根光纤上，使得倏逝场照明器具有更简单的结构，更小的尺寸，光路更加灵活、稳定，能够对生物样品的表面实现多方位照明，大大提高了倏逝场照明器的性能，并能够方便地与显微镜技术结合构成新型的荧光显微成像***。

本发明的技术方案为：

一种光纤倏逝场照明器，其特征在于：光纤一端的一部分研磨成斜面，且斜面过光纤芯位置1-10微米，当光从光纤芯入射，在斜面处被反射至光纤端面处，并在光纤端面发生全内反射。

所述的光纤可以是单模光纤或多模光纤。

所述的光纤纤芯可以是在光纤轴心，也可以偏离轴心。

所述的斜面是通过研磨加工形成的，斜面上可以镀全反射膜也可以不镀膜。

所述的光纤端面可以是垂直于轴心的平面，也可以是斜平面。

本发明具有如下特点：1、将倏逝场照明器制作在直径为125微米的单根光纤上，使得倏逝场照明器具有更简单的结构，更小的尺寸，无需外部光学***，光路更加稳定，操作更加灵活。2、光纤倏逝场照明器能够对生物样品的表面实现多方位照明，大大提高了倏逝场照明器的性能。3、光纤倏逝场照明器采用标准光纤制作，成本低廉，且与光源耦合方便。4、光纤倏逝场照明器由于物理尺寸小，所以能够方便地与其他检测技术相结合构成新型的荧光显微成像***。

附图说明

图1为本发明轴心光纤的倏逝场照明器的结构示意图。

图2为本发明斜面处镀全发射膜的结构示意图。

图3为本发明倏逝场的光强I随界面距离z图。

图4为本发明的光全反射图。

图5为本发明的偏心光纤的倏逝场照明器的结构示意图。

图6为利用本发明的光纤倏逝场照明器构成荧光显微***示意图。

具体实施方式

以下结合实施例和附图本发明作进一步说明，但不应以此限制本发明的保护范围。

本发明可以通过如下的方式实现：

取一段光纤1，利用光纤切割技术将光纤端面切割加工成垂直于光纤轴线的平面。利用光纤端研磨加工技术将光纤芯2所在位置研磨成斜面3。如果光纤1本身折射率较大，斜面3角度能够使得光纤芯2中的光在此处发生全反射，并保证照射在光纤端面上也能发生全发射，则此处斜面3无须镀膜。如图1所示。否则为保证光纤芯中的光在此处发生全反射，需要利用镀膜技术将斜面镀膜4。如图2所示。

光纤端面处全内反射产生的倏逝场能够照射生物样品，使在百纳米级厚的光学薄层内的荧光团受到激发，而范围外的荧光团不受影响。

本发明基于如下原理：

全内反射是一种普遍存在的光学现象。考虑一束平面光从光纤芯斜面3处被反射到光纤端面处。入射光在光纤表面上一部分发生反射，另一部分则透射出光纤1。入射角和透射角之间满足关系式

n₁ sinθ₁＝n₂ sin θ₂

这里n₁是光纤的折射率，n₂是光纤外介质的折射率，θ₁为入射角度，θ₂为透射角。当入射角增大，增大到临界角θ_c时，这时的透射角为90°；当入射角继续增大到大于临界角时，光不再透射，也就是发生了全反射，如图3所示。由sne11定律可知

θ₂＝90°

${\mathrm{\θ}}_c={\sin }^{-1}\left(\frac{n_2}{n_1}\right)$

由上式可知，当n₁＜n₂，全反射就可能发生。当光发生全反射时，由于波动效应，有一部分光的能量会穿过界面渗透到光纤外介质中，平行于界面传播。这部分光场就是所谓的倏逝场。现在考虑一束单色光，横截面光束强度是I₀，以大于临界角的角度θ入射。倏逝场的光强I随界面距离z的关系为：

I＝I₀exp(-z/d)

$d=\mathrm{\λ}/{4\mathrm{\πn}}_1\sqrt{{\sin }^2\mathrm{\θ}-{(n_2/n_1)}^2}$

式中λ是入射波波长，d为透射深度。d一般小于200nm，对于可见光约为100nm。

如果将光纤1直接研磨成锥角α小于90°-θ_c的斜面3，在光纤芯2处即可发生全发射，但是这种做法存在一些弊端，如：1.斜面角度过小，锥体区域过长，光纤1只能以极小角度接近样品，不利于实验操作；2.光纤芯2处模场直径通常在10微米以下，照明区域过小；3.全发射后的光在光纤侧面再次反射后会有部分功率从光纤头出射，这些杂散光使得背景光增强，极大地降低了对比度。

合理设计光纤1端结构，使得全反射发生在光纤端面则能有效克服以上弊端。这是因为：1.利用光纤端面作为照明区域，有效缩小了照明器的物理尺寸，而且操作更灵活；2.光纤端面距离光纤芯2有一定距离，光束本身的发散特性能够有效地增加照明区域；3.光被端面反射后在光纤侧面的再次反射与照明方向相反，因而不会引入杂散光。

为使全发射发生在光纤端面处，需要在光纤芯2处加工合适角度，从而将光纤芯2中的光反射至光纤端面处，以光纤端面垂直于光纤轴心、光纤芯2位于轴心的光纤为例。如图4所示。光被斜面3反射至光纤端面处，并刚好在光纤端面发生全反射，入射角度为θ₁，则光纤芯处斜面3与轴线的夹角为 $\mathrm{\α}=\frac{{\mathrm{\θ}}_1}{2}$ ，在周围介质为水(折射率1.33)的情况下，如果光纤1本身折射率较高，如n₁＝1.6，则全反射的临界角θ_c＝56.23°，令θ₁＝58°，则α＝29°，由于90°-α＝61°也大于θ_c＝56.23°，因此在斜面3上会发生全反射，所有光均会被反射至光纤端面，由于θ₁＞θ_c，光纤端面能够满足全反射条件。如果光纤本身折射率不高，如n₁＝1.46，则全反射的临界角θ_c＝65.64°，令θ₁＝66°，则α＝33°，由于入射角90°-α＝57°小于θ_c＝65.64°，在斜面上会发生透射现象，为保证所有光均被反射至光纤端面，需要在光纤斜面处镀全发射膜4。

由于发生全内反射时，倏逝场的典型透射深度一般在100nm左右。如果将光纤端面紧贴样品放置，则倏逝场对样品的垂直照射深度也为100nm左右。只有这个小范围内的荧光分子将被激发，而在这个范围以外的荧光分子则完全不受影响。所以全内反射荧光显微术具有其它成像方法无法比拟的高的信噪比，细胞的光损伤和光漂白也很小。

实施例一：光纤纤芯位于在光纤轴心的倏逝场照明器制作。结合图2说明制作步骤如下：

1、光纤的预处理：取一段光纤，利用光纤剥线钳剥除光纤一端的涂覆层约30mm，用酒精和***混合液将光纤包层清洗干净。

2、用光纤切割刀在光纤拉细部分中间进行切割，由于光纤主要为二氧化硅制成，此动作会造成光纤平整的断裂开来分成两段，并且断面为平面。

3、利用光纤研磨技术将光纤端研磨为α＝29°的斜平面，研磨深度以超过光纤芯位置1-10微米为宜。

4、利用真空镀膜技术将步骤3研磨的斜面镀全反射膜。

5、将激发光引入光纤芯，则在光纤端面处产生深度为100nm左右的倏逝场，如果将光纤端面紧贴样品放置，则倏逝场对样品的垂直照射深度也为100nm左右。只有这个小范围内的荧光分子将被激发，而在这个范围以外的荧光分子则完全不受影响。

如果光纤本身折射率较大，可根据实际情况取消步骤4。

实施例二：偏心光纤的倏逝场照明器制作。结合图5说明制作步骤如下：

1、光纤的预处理：取一段光纤，利用光纤剥线钳剥除光纤一端的涂覆层约30mm，用酒精和***混合液将光纤包层清洗干净。

2、用光纤切割刀在光纤拉细部分中间进行切割，由于光纤主要为二氧化硅制成，此动作会造成光纤平整的断裂开来分成两段，并且断面为平面。

3、利用光纤研磨技术将光纤端研磨为α＝29°的圆台形，也可以为其他角度的圆台形，满足全反射要求就成，研磨深度以刚好接近光纤芯位置为宜。

4、再次利用光纤研磨技术在圆台形上继续将光纤端研磨出α＝29°的斜平面，也可以为其他角度的斜平面，满足全反射要求就成，研磨深度以超过光纤芯位置1-10微米为宜。

5、利用真空镀膜技术将步骤4研磨的斜面镀全反射膜。

6、将激发光引入光纤芯，则在光纤端面处产生深度为100nm左右的倏逝场，如果将光纤端面紧贴样品放置，则倏逝场对样品的垂直照射深度也为100nm左右。只有这个小范围内的荧光分子将被激发，而在这个范围以外的荧光分子则完全不受影响。

制作好的倏逝场照明器如图5所示，相比于实施例一所制作的倏逝场照明器，偏心光纤所制作的照明器倏逝场照明范围将更大。

实施例三，利用光纤倏逝场照明器实现生物细胞荧光显微成像。图6为利用光纤倏逝场照明器构成荧光显微***示意图。光源使用波长λ＝488nm泵浦激光器。光源5发出的光经过一个透镜6聚焦后的耦合入光纤7，光纤倏逝场照明器用钢管保护后，安装在一个可三维平动、一维转动的机械调节架8上，通过该机械调节架8能够调节光纤在样品池10内的***位置、***深度和***角度，样品池置于一个倒置生物显微镜的载物台11上，图像经过一个滤光片12后由显微镜物镜13成像于CCD14上进行采集。

用显微镜的载物台将样品9移入视野中，然后将调节好***角度的光纤倏逝场照明器移入视场并贴近样品待照明区域，倏逝场激发样品发出荧光，荧光信号近显微镜物镜收集，被CCD接收并成像。

Claims (4)

1.一种光纤倏逝场照明器，其特征在于：光纤一端的一部分研磨成斜面，且斜面过光纤芯位置1-10微米，当光从光纤芯入射，在斜面处被反射至光纤端面处，并在光纤端面发生全内反射，将倏逝场照明器制作在直径为125微米的单根光纤上，斜面能够使得光纤芯中的光在斜面处发生全反射，或者利用镀膜技术在斜面上镀全反射膜。

2.根据权利要求1所述的一种光纤倏逝场照明器，其特征在于：所述的光纤为单模光纤或多模光纤。

3.根据权利要求1所述的一种光纤倏逝场照明器，其特征在于：所述的光纤纤芯为光纤轴心或偏离轴心。

4.根据权利要求1所述的一种光纤倏逝场照明器，其特征在于：所述的光纤端面为垂直于轴心的平面或斜平面。

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