CN101445818A - 金龟子绿僵菌小孢子亚种代谢产物的杀菌培育及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种有抑菌、杀菌作用的金龟子绿僵菌小孢子亚种代谢产物的杀菌培育及使用方法，属于微生物技术领域。本发明通过2级培养法得到绿僵菌素并作为杀菌剂使用，试验证明绿僵菌素不仅可有效预防和治疗白粉病对作物产生的危害，还能杀灭多种农作物病菌，是一种理想微生物杀菌剂，具有杀菌速度快、防治效果高、对环境无污染、对靶标以外的生物无毒害的特点，其制剂生化合成速度快、生产成本低、无三废排放，环保、安全。
Description
技术领域
本发明涉及一种真菌代谢产物的培育使用方法，尤其是一种有抑菌、杀菌作用的金龟子绿僵菌小孢子亚种代谢产物的杀菌培育及使用方法，属于微生物技术领域。
背景技术
白粉病是一种作物常见病，主要由真菌感染作物叶片。发病时，叶上先出现褪绿小点，再发展为有白色絮状物的不规则粉斑，霉层由稀疏至稠密呈毡状，病斑扩大连片，直至覆满整个叶面，可使叶片变黄褐枯死，亦影响植物的茎、叶柄及果实。白粉病的发病周期短，一年会反复感染多次，且发病后病情都很严重，该病对农作物生产的危害性很大。防治此病除了清理病枝、病叶，集中处理烧毁，添加肥料加强作物的抗病能力外，还配合用杀菌剂。
常用微生物杀菌剂是一类控制植物病原菌的制剂，主要有农用抗生素、细菌杀菌剂、真菌杀菌剂和病毒杀菌剂等化学杀菌类型。微生物杀菌剂主要抑制病原菌能量产生、干扰生物合成和破坏作物病原菌细胞结构。内吸性强、毒性低，有的兼有刺激植物生长的作用。微生物杀菌剂防治植物病害的机理随生防菌及其代谢产物的种类及植物与病原菌的变化而异。其中主要的机制有竞争作用、拮抗作用、重寄生作用和诱导植物抗性，或两种以上机制的协同作用。但是白粉病的抗药性较强和常发性，采用一般药剂的预防效果较差，且有一定毒性，容易污染环境。
发明内容
本发明的目的是：针对目前农作物生产中危害性大、抗药性强、一般药剂防治效果差的白粉病病害，提出一种金龟子绿僵菌小孢子亚种GXW26-8代谢产物——绿僵霉素生物杀菌剂的杀菌培育及使用方法，该生物杀菌剂可以高效杀灭白粉病菌，并且安全环保。
本发明涉及的金龟子绿僵菌小孢子亚种GXW26-8菌株，于2004年10月10日在中国湖北省武汉大学、中国典型培养物保藏中心CCTCC保藏，保藏编号为CCTCCNO：M204078，拉丁学名为Metarhiziumanisopliae var.anisoplia GXW26-8(下文简称GXW26-8)。
本发明GXW26-8代谢产物绿僵霉素培育方法采用2级培养法，包括以下步骤：
A.将马铃薯与蔗糖混合装入容器中，其中蔗糖的重量百分比为18-22％，灭菌后温度达28-32℃时接种GXW26-8，常温培养15-20天采收取孢子；
B.将马铃薯中加水煮沸后过滤，在滤液中加入重量百分比18-22％的蔗糖，灭菌后得到培养液；
C.待培养液冷却至28-32℃时，将步骤A所得孢子在无菌条件下接种至培养液中，经发酵后储存一个月以上，得到GXW26-8代谢产物；
D.用筛网过滤步骤C所得GXW26-8代谢产物，滤液灌装入瓶，即得到本发明的生物杀菌剂——GXW26-8代谢产物绿僵霉素。
之后可以按需：
E.将滤液稀释后喷洒至病菌感染的环境中。
观察发现：金龟子绿僵菌小孢子亚种GXW26-8菌株在发酵过程中出现以下现象：初发酵时，发酵液为青灰色液体；10小时后逐渐转为乳白色，发酵液的浓度和粘度较初发酵增4-5倍，持续时间达150个小时左右；进入约200个小时后，在乳白色液体下部逐渐有沉淀物形成，并在贮液罐中部形成丝状聚合物，最后聚合成块状半透明具有很强拉力的多糖蛋白块；上部逐渐形成桔黄色的液体，性质稳定耐贮，具有抗菌、抑菌、杀菌现象。
分析得出桔黄色液体为绿僵菌素，通过试验发现绿僵菌素能够抑制和杀灭多种霉菌，尤其对白粉病原菌孢子萌发的抑制率达100％，时间长达5-7天，作为作物已发白粉病的冶疗剂使用，用药后4-6小时内白粉病菌丝和孢子变成黑色，失去活力，病指下降为零级，药效期6天左右。
经大量室内外生测和防病试验表明，绿僵菌素是一种新型微生物杀菌剂，具有杀菌速度快、防治效果高、对环境无污染、对靶标以外的生物无毒害的特点。制剂生化合成速度快、生产成本低、无三废排放、兼有固体发酵的孢子杀虫，从2003年至今进行室内外多次生测表明：GXW26-8的孢子粉可以防治多种鳞翅目害虫，其中对抗药较强的斜纹夜蛾、银纹夜蛾3龄以下幼虫防治效果均在85％以上。
附图说明
图1为本发明优选实施例一绿僵菌素的紫外光谱图。
图2为本发明优选实施例一绿僵菌素的荧光光谱图。
具体实施方式
实施例一
本实施例所用的金龟子绿僵菌小孢子亚种GXW26-8菌株，于2004年10月10日在武汉中国典型培养物保藏中心CCTCC保藏，保藏编号为：CCTCCNO：M204078，拉丁学名为Metarhizium anisopliae var.anisopliaGXW26-8。
GWX26-8代谢物绿僵菌素的杀菌培育及使用方法采取2级培养法，步骤如下：
A.将马铃薯与蔗糖按重量比5:1装入200ml扁形耐高压瓶中，在15磅高压条件下灭菌20分钟后，当温度降到28-32℃时，接种GXW26-8，常温下培养15-20天采收孢子；
B.将马铃薯与水按重量比约1:2混合，煮沸30分钟后进行过滤，在滤液中加入20％蔗糖，灭菌20分钟，得到培养液；
C.待培养液自然冷却至28-32℃时，将步骤A中所得孢子于无菌条件下接种至培养液中，在溶氧15％、PH7、温度30℃的条件下发酵79小时，抽样测定，当酵液中GXW26-8菌含量大于500亿个/ml时，发酵合格。再经过40天以上，温度30℃的储存得到杀菌剂，即GXW26-8代谢产物；对GXW26-8代谢产物进行成分定量分析：
1.PH测定
仪器：PHS-3TS精密测定仪；方法：标准缓冲液校正后测定；结果：PH＝6.84。
2.紫外、荧光光谱测定
仪器：岛津-紫外分光光度仪、岛津-荧光分光光度仪；方法：以双蒸水为参比溶液，分别测定200-800nm波长处紫外、荧光的光谱吸收，见附图1和附图2；结果：样品无明显紫外吸收，在400nm波长处有荧光吸收。
3.成分分析
仪器：Heraeus低温高速离心机；Termo超低温冰箱；Christ冷冻干燥机；方法：8000rpm，10min将样品分离得上清及沉淀；在-80℃将样品预冻4h，然后置冷冻干燥机中干燥，分别得到上清和沉淀的冻干粉，称重；上清桔黄液体为：53.6mg/ml。
(1)粗蛋白含量
方法：考马斯亮蓝法；
样品处理：采用考马斯亮蓝法试剂盒，以标准蛋白为对照，根据蛋
计算蛋白含量。
(2)测定结果：未检出蛋白含量。
4.凯氏定氮法
(1)样品处理：样品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用
硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。
(2)测定结果：上清桔黄液体蛋白含量0.938mg/ml。
5.测定多糖
(1)样品处理：多糖在浓硫酸作用下，水解成单糖，并迅速脱水生成糠醛衍生物，与苯酚缩合成有色化合物，然后用比色法测定其多糖含量。
(2)测定结果：上清桔黄液体多糖含量51mg/ml。
6.元素分析
(1)样品处理：用MICRO元素分仪分析样品。
(2)测定结果：C℅54.12℅、H℅8.56℅、N℅0.27℅。
D.对步骤C中所得杀菌剂进行200目筛网过滤得到桔黄色均一液体，灌装入棕色塑料瓶或铝铂罐中，常温贮存；
E.将滤液稀释后喷洒至细菌感染的环境中，作为植物白粉病抑菌剂使用，按照1:100倍液喷雾；作为植物白粉病治疗剂使用，按1:150倍液喷雾。
杀菌剂的抗菌活性见下表：
| 指示菌 | 抑制孢子萌发 | 抑制菌丝生长 | 抑制病斑 |
| 南瓜白粉病菌 | a | b | b |
| 豇豆白粉病菌 | a | b | b |
| 车前草白粉病菌 | a | b | b |
| 黄阳木白粉病菌 | a | b | c |
| 番茄早疫病菌 | c | ||
| 番茄晚疫病菌 | b | ||
| 茄子绵疫病菌 | b | b | |
| 黄瓜白粉病菌 | a | b | b |
| 禾本科作物白粉病菌 | a | b | b |
| 甜瓜软腐病原菌 | c | b | |
| 黑曲霉菌 | b | ||
| 黄曲霉菌 | c |
表中：a表示活性较强、b表示中等活性、c表示活性不明显、d表示没有活性。数据表明：GXW26-8代谢产物绿僵菌素作为杀菌剂的药效明显。
总之，试验证明绿僵菌素不仅可有效预防和治疗白粉病对作物产生的危害，还能杀灭多种农作物病菌，是一种理想的微生物杀菌剂，具有杀菌速度快、防治效果高、对环境无污染、对靶标以外的生物无毒害的特点，其制剂生化合成速度快、生产成本低、无三废排放，环保、安全。
Claims (7)
1.金龟子绿僵菌小孢子亚种代谢产物的杀菌培育方法，其步骤为：
A.将马铃薯与蔗糖混合装入容器中，其中蔗糖的重量百分比为18-22％，灭菌后温度达28-32℃时接种GXW26-8，常温培养15-20天采收取孢子；
B.将马铃薯中加水煮沸后过滤，在滤液中加入重量百分比18-22％的蔗糖，灭菌后得到培养液；
C.待培养液冷却至28-32℃时，将步骤A所得孢子在无菌条件下接种至培养液中，经发酵后储存一个月以上，得到GXW26-8代谢产物；
D.用筛网过滤步骤C所得GXW26-8代谢产物，滤液灌装入瓶，即得到生物杀菌剂GXW26-8代谢产物绿僵霉素。
2.根据权利要求1所述的金龟子绿僵菌小孢子亚种代谢产物的杀菌培育方法，其特征在于：所述步骤C在溶氧15％、PH6-8、温度范围28-32℃的环境下发酵72-80小时。
3.根据权利要求2所述的金龟子绿僵菌小孢子亚种代谢产物的杀菌培育方法，其特征在于：所述步骤C发酵后的发酵液中GXW26-8菌株含量大于500亿/ml；在25-32℃温度下储存发酵液。
4.根据权利要求3所述的金龟子绿僵菌小孢子亚种代谢产物的杀菌培育方法，其特征在于：所述步骤D中筛网为200目。
5.根据权利要求1所述的金龟子绿僵菌小孢子亚种代谢产物的使用方法，其特征在于还包括步骤：
E.将得到的生物杀菌剂GXW26-8代谢产物绿僵霉素稀释后喷洒至病菌感染的环境中。
6.根据权利要求5所述的金龟子绿僵菌小孢子亚种代谢产物的使用方法，其特征在于：所述步骤E中稀释的倍数为1∶80-150倍。
7.根据权利要求1所述的金龟子绿僵菌小孢子亚种代谢产物绿僵菌素作为生物杀菌剂的应用。
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|---|---|---|---|---|
| CN107446955A (zh) * | 2017-08-25 | 2017-12-08 | 陕西省微生物研究所 | 以中药废弃物为基质的抗虫土壤调节剂及其生产方法 |
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