CN101444188B - 一种竹子种胚培养的消毒方法 - Google Patents
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Abstract
一种竹子种胚培养的消毒方法，以竹子当年生健康种子为外植体，将剥壳后的籽粒于医用酒精中浸泡4～6min，然后再于0.1wt.％升汞溶液中搅拌25～35min或者0.2～0.3wt.％次氯酸钠溶液中搅拌10～20min，最后用医用酒精浸泡4～6min。本消毒方法简单，可有效去除表面细菌和内生细菌，为建立无菌体系、促进继代培养和生根奠定基础，为开发利用优良竹种提供技术特征。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种生物组织培养快速繁殖的方法，特别涉及种胚培养快速繁殖的方法，确切地说是一种竹子种胚培养的消毒方法。
二、背景技术
竹子是森林资源之一。全世界竹类植物约有70多属1200多种，主要分布在热带及亚热带地区，少数竹类分布在温热带和寒带。竹子是常绿(少数竹种在旱季落叶)浅根性植物，对水热条件要求高，而且非常敏感，地球表面的水热分布支配着竹子的地理分布。东南亚位于热带和南亚热带，又受太平洋和印度洋季风汇集的影响，雨量充沛，热量稳定，是竹子生长理想的生态环境，也是世界竹子分布的中心。中国竹类资源十分丰富，有适于热带生长的合轴型丛生竹种、亚热带生长的单轴型散生竹种和高海拔高纬度地区生长的耐寒性强的复轴型混生竹种。据统计，全国竹类植物共有48个属，500多种。这些竹种分布在北纬40°以南的广大国土上。由于各地气候、土壤、地形的变化和竹种本身种属特性的差异，中国竹子分布具有明显的地带性和其区域性。竹子生长快，适应性强，同时又具有广泛的用途。竹子与人民生活息息相关，竹子的利用涉及衣、食、住、行用各方面，竹子用于建筑的历史久远，在远古时代，人类从巢居和穴居向地面房居演进的过程，竹子就发挥了重要的作用。竹材具有强度大、弹性大、耐磨损、耐腐蚀、抗弯曲等特性，与木材相比具有硬度强、稳定性高、胶合度好、外观美丽等优点。全世界年产竹材有1500多万吨，除传统的用于建房、制造家具和工艺品外，主要用于制造竹质人造板和高级竹制纸，其需求与日俱增；竹笋是极受人们喜爱的美味山珍，其富含多种氨基酸和人体必须的微量元素，是天然的保健品，也已成为竹资源开发利用的一大支柱产品；竹子还是四季常青的长绿物种，具有调节气候、涵养水源、保持水土、减弱噪音、净化空气、防止风害的作用，备受人们的青睐，古今人们都不得取之以保护和美化人类的生活环境。由上可见，竹在人们的日常生活领域中作出了极为重要的贡献，展示了竹文明的风采。因此，竹与人类生活的关系，正如苏东坡所述：“食者竹笋，居者竹瓦，载者竹筏，炊者竹薪，衣者竹皮，书者竹纸，履者竹鞋，真可谓不可一日无此君也。”因此对优良竹种进行快速繁对开发和利用宝贵的竹资源具有重要的意义。
慈竹(Sinocalmus affinis(Rendle)Mcclure)又名义竹、慈孝竹、子母竹。属于禾木科竹亚科(Bambusadea)慈竹属，为地下茎合轴丛生型，广泛地分布于地球的北纬46°至南纬47°之间的热带，亚热带和暖温带地区。它是我国西南地区栽培较广、用途较大、经济价值较高的材用竹种，秆高一般10-15m，最高20m，胸径一般4-6cm，最粗11cm，节间长一般5-50cm，最长130cm。其纤维素含量多，达52％以上；纤维长度大，纤维长宽比较大，分子聚合度相对较高，且其产量高，最高年产达45000kg.hm-2，是优秀的制浆造纸、竹纤维和竹编胶合板用竹。适应性广，能耐-6～-8℃的低温。它是很有前途的竹种之一。鉴于传统繁殖主要是采用埋竹节或或枝条扦插等方法，但1条竹节或1粒种子只产生1株竹苗。另外许多种的竹枝扦插生根困难，其繁殖速度远远不能满足生产的需要，又需耗费大量人力物力。利用组织培养的方法进行竹子的快速繁殖是解决这一问题的最佳途径。
关于组织培养，自1968年Alexander和Rao关于成熟种胚离体培养的报道。此后，对于竹类植物的离体快繁研究内容层出不穷，对于竹类植物的快速繁殖技术逐渐受到重视。近年来，就目前已有的报道来看，不少关于竹类组织培养的最新报道都将侧重点放在了愈伤组织诱导进而得到植株再生方面，其中也不乏通过愈伤组织实现器官发生进而实现植株再生的。用种胚培养过程中，若种子消毒不彻底会引起细菌污染，在初代培养中，表面细菌引起的污染通常在2～3d就能在外植体周围或培养基表面形成明显的如水污状、油污状、气泡或干缩的红、黄、乳白等颜色的菌落。若在外植体培养后3～5d内并未发现细菌污染，以后则不断出现明显的或不明显的细菌菌落，就可能是由内生细菌引起的污染。
三、发明内容
本发明旨在提供一种通过种胚培养、快速繁殖优良竹种的方法，所要解决的技术问题是外植体的消毒问题以提高无菌苗的成活率。
本发明所称的竹子种胚培养是以竹子当年生健康种子为外植体，所谓健康种子是指籽粒饱满、色泽鲜亮，且无病虫害的种子，其消毒方法就是对剥去种壳后的籽粒在组织培养之前所进行的无菌化处理方法，包括剥壳、浸泡、分离和洗涤，所述的浸泡就是将剥去种壳的籽粒首先于医用酒精中浸泡4～6min，分离，无菌水洗涤；然后再于0.1wt.％(重量百分浓度，以wt.％表示)升汞溶液中搅拌25～35min或者于有效氯含量为0.2～0.3wt.％次氯酸钠溶液中搅拌10～20min，分离，无菌水洗涤；最后用医用酒精浸泡4～6min，分离，无菌水洗涤，用无菌纸吸干水分后接种于培养基上。医用酒精就是浓度为70％的消毒酒精。
为提高无菌苗的成活率，也可以使用以下消毒方法，先用医用酒精浸泡4～6min，分离，无菌水洗涤；次用0.2～0.3wt.％次氯酸钠溶液搅拌15～30min，分离，无菌水洗涤；最后用0.1wt.％升汞溶液搅拌25～35min，分离，无菌水洗涤，用无菌纸吸干水分后接种与培养基上。
这种方法可将无菌苗提高到80％以上。
优选使用有效氯含量为0.25wt.％次氯酸钠溶液。
无菌苗≥90％以上的消毒方法是将剥去种壳的籽粒首先用有效氯含量为0.2～0.3wt.％次氯酸钠溶液搅拌10～20min，分离，无菌水洗涤；次用0.05～0.15wt.％高锰酸钾溶液浸泡10～14小时，其间每隔两小时更换一次新鲜的高锰酸钾溶液，分离，无菌水洗涤；再用医用酒精搅拌3～8min，分离，无菌水洗涤；最后于0.1wt.％升汞溶液中搅拌25～35min，分离，无菌水洗涤，用无菌纸吸干水分后接种于培养基上。
本消毒方法简单，可有效去除表面细菌和内生细菌。为建立无菌体系、促进继代培养和生根奠定基础，从而提高种胚培养的成活率，为开发利用优良竹种提供技术保证。
四、具体实施方式
现以慈竹为例，非限定实施例叙述如下：
1、种子经表面清洁后，挑选色泽鲜亮、颗粒饱满、无病虫害的种子，剥掉种壳，将籽粒在超净工作台上用70％酒精浸泡5min(不断搅拌)，无菌水冲洗5次，再用0.1％的升汞溶液浸泡30min(不断搅拌)，无菌水冲洗5次。用无菌纸吸干水后接种于培养基上。
2、种子经表面清洁后，挑选色泽鲜亮、颗粒饱满、无病虫害的种子，剥掉种壳，将籽粒在超净工作台上用70％酒精浸泡5min(不断搅拌)无菌水冲洗5次，再用0.2％次氯酸钠浸泡15min(不断搅拌)，无菌水冲洗5次，再用70％酒精浸泡5min(不断搅拌)，无菌水冲洗5次。用无菌纸吸干水后接种于培养基上。
3、种子经表面清洁后，挑选色泽鲜亮、颗粒饱满、无病虫害的种子，剥掉种壳，将籽粒在超净工作台上用70％酒精浸泡5min(不断搅拌)，无菌水冲洗5～8次，再用有效氯含量为2.5％的次氯酸钠溶液浸洗15～30min，无菌水冲洗5～8次，再用0.1％的升汞溶液浸泡30min(不断搅拌)，无菌水冲洗5～8次，用无菌纸吸干水后接种于培养基上。
4、种子经表面清洁后，挑选色泽鲜亮、颗粒饱满、无病虫害的种子，剥掉种壳，将籽粒用有效氯含量为2.5％的次氯酸钠溶液浸洗15min，无菌水冲洗5～8次，再用0.1％高锰酸钾浸泡12小时，其间每隔2小时换高锰酸钾溶液一次，然后在超净工作台上用70％酒精浸泡5min(不断搅拌)，无菌水冲洗5～8次，再用0.1％的升汞溶液浸泡30min(不断搅拌)，无菌水冲洗5～8次，用无菌纸吸干水后接种于培养基上。
Claims (3)
1.一种竹子种胚培养的消毒方法，以竹子当年生健康种子为外植体，包括剥壳、浸泡、分离和洗涤，其特征在于：将籽粒于医用酒精中浸泡4～6min后依次用0.2～0.3wt.％次氯酸钠溶液搅拌15～30min和0.1wt.％升汞溶液搅拌25～35min。
2.根据权利要求1所述的消毒方法，其特征在于：用0.25wt.％次氯酸钠溶液搅拌20min。
3.一种竹子种胚培养的消毒方法，以竹子当年生健康种子为外植体，包括剥壳、浸泡、分离和洗涤，其特征在于：将籽粒首先用0.2～0.3wt.％次氯酸钠溶液搅拌10～20min，次用0.05～0.15wt.％高锰酸钾溶液浸泡10～14小时，其间每隔两小时换一次新鲜的高锰酸钾溶液，再用医用酒精搅拌3～8min，最后于0.1wt.％升汞溶液中搅拌25～35min。
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