CN101434978B

CN101434978B - 扩增的核酸方法

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Publication number: CN101434978B
Application number: CN200810180915.XA
Authority: CN
Inventors: 三好隼人; 岩木义英; 森寿弘
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2007-11-14
Filing date: 2008-11-14
Publication date: 2013-03-20
Anticipated expiration: 2028-11-14
Also published as: US8420323B2; US20090162903A1; CN101434978A; EP2060638B1; JP2009136284A; JP5401080B2; EP2060638A1

Abstract

本发明提供一种使用寡核苷酸引物和DNA聚合酶进行核酸扩增的方法。本发明的扩增方法包括：将含有至少一种脱氧核苷三磷酸、至少一种DNA聚合酶、至少两种寡核苷酸引物、以及作为模板的核酸片段的反应溶液进行孵育，以上述引物的3’末端作为起点进行聚合酶反应，从而对该核酸片段进行扩增，其特征在于，将标识序列添加到第一寡核苷酸引物的5’末端，该标识序列为在作为模板的核酸片段中存在的一段碱基序列，在所述模板上，该碱基序列位于该模板中的与第一寡核苷酸引物的3’端部分(第一寡核苷酸与模板核酸退火的部分)基本上相同的序列的3’末端侧。

Description

扩增的核酸方法

技术领域

本发明涉及一种核酸的扩增方法。更具体地说，本发明涉及一种核酸的扩增方法，其特征是，采用DNA聚合酶，通过对反应溶液进行孵育，进行聚合酶反应。

背景技术

在分子生物学的研究中，一般来说，核酸的扩增是通过利用DNA聚合酶采用酶学方法来进行的。作为核酸的扩增方法，聚合酶链反应(PCR)是一种公知的方法。为了对作为目标的目标核酸序列进行扩增，PCR法由以下3个工序构成：将作为模板的双链DNA变性为单链DNA的工序(变性工序)；将引物退火到单链DNA上的工序(退火工序)；以及，以引物作为起点使互补链延伸的工序(延伸工序)。在通常的PCR法中，在使用扩增仪(Thermal Cycler)时，变性工序、退火工序、延伸工序分别在不同的温度下进行。但是，在3种不同的温度下进行核酸扩增反应时，温度控制麻烦，并且还会造成这样的问题：消耗的时间会随着循环次数的增加而成比例地增加。

因此，人们开发了可以在恒温状态下实施的核酸扩增方法。例如可以列举，RCA(滚环扩增，Rolling Circle Amplification，参见Proc.Natl.Acad.Sci，vol.92，4641-4645(1995))、ICAN(恒温和嵌合引物引发的核酸扩增，Isothermal and Chimeric primer-initiatedAmplification of Nucleic acids)、LAMP(环介导的DNA恒温扩增，Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA，参见Bio Industry，第18卷、第2期(2001))、NASBA(基于核酸序列的扩增方法，Nucleic acid Sequence-based Amplification method，参见Nature，350，91～(1991))、TMA(转录介导的扩增方法，Transcription mediatedamplification method，参见J.Clin Microbiol.第31卷、3270～(1993))等。

SDA法(日本特开平5-130870号公报)是采用外切核酸酶的循环分析法，其为利用聚合酶延伸反应使靶核酸片段的目的部位扩增的一种方法。该方法是这样一种方法：以特异性地杂合到靶核酸片段的目的部位上的引物作为起点进行聚合酶延伸反应，同时使5’→3’外切核酸酶发生作用，从而将引物从相反方向降解。新的引物代替降解的引物进行杂合，并再次通过DNA聚合酶进行延伸反应。该通过聚合酶进行的延伸反应与通过外切核酸酶(该外切核酸酶将之前已延伸的链除去)进行的降解反应依次地、周期性地反复进行。这里，通过聚合酶进行的延伸反应与通过外切核酸酶进行的降解反应可以在恒温条件下进行。但是，该方法中除了聚合酶外，还必须使用外切核酸酶，这样的话消耗成本，同时还必须花费精力来设计引物。

LAMP法是近年开发的对于靶核酸片段的目的部位进行扩增的方法。该方法中，通过使用至少4种引物(该至少4种引物互补地识别靶核酸片段的至少6个特定部位)和链置换型的Bst DNA聚合酶(该聚合酶为在5’→3’方向上没有核酸酶活性、而且边使模板上的双链DNA解离为单链DNA边催化延伸反应的聚合酶)，在恒温条件下，将靶核酸片段的目的部位扩增为特别结构。不过，这种方法需要使用至少4种引物以识别6个特定部位，而引物的设计非常困难。

ICAN法也是近年开发的对于靶核酸片段的目的部位进行扩增的方法。该方法为这样一种方法：采用RNA-DNA嵌合引物、具有链置换活性和模板交换活性的DNA聚合酶、以及RNaseH，进行恒温的基因扩增。嵌合引物与模板结合后，通过DNA聚合酶可以合成互补链。之后，RNaseH将来源于嵌合引物的RNA部分切断，从切断的部分开始进行延伸反应，同时伴随有链置换反应和模板交换反应，这样的反应反复进行，基因由此得以扩增。不过，该方法也必须用到被称作嵌合引物的特殊引物，而引物的设计非常困难。

在日本特表平11-509406号公报中，记载了在具有链置换能力的DNA聚合酶存在下，采用至少1组寡核苷酸引物，将目的区域中的DNA在恒温条件下反应，由此扩增的方法。不过，日本特表平11-509406号公报中记载的方法存在着需要比较长的反应时间这样的问题。

在日本特开2002-233379号公报中，记载了在具有链置换能力的DNA聚合酶存在下，采用至少1组寡核苷酸引物，将目标区域中的DNA在恒温条件下反应，由此进行扩增的方法。不过，日本特开2002-233379号公报中记载的方法存在着显著生成非特异性的扩增产物这样的问题。

[非专利文献1]Proc.Natl.Acad.Sci，vol.92，4641-4645(1995)

[非专利文献2]Bio Industry，第18卷，第2期(2001)

[非专利文献3]Nature，350，91～(1991)

[非专利文献4]J.Clin Microbiol.第31卷，3270～(1993)

[专利文献1]日本特开平5-130870号公报

[专利文献2]日本特表平11-509406号公报

[专利文献3]日本特开2002-233379号公报

发明内容

发明要解决的问题

为了解决上述问题，本发明提供一种采用寡核苷酸引物和DNA聚合酶即可以实施的核酸扩增方法。为了解决上述问题，本发明还提供一种简便而且迅速的核酸扩增方法，该方法能够在短时间内特异性地、高效地扩增目标核酸序列。

解决问题所采用的手段

为了解决上述问题，本发明人进行了深入的研究。结果发现在以下的核酸扩增方法中，通过将碱基序列(该碱基序列为：在作为模板的核酸片段中，存在于与第一寡核苷酸基本上相同的碱基序列的下游侧(即3’末端侧)的碱基序列)添加到第一寡核苷酸引物的5’末端，就能够成功地只对目标核酸序列特异性地进行扩增，其中所述的核酸扩增方法为：将含有至少一种脱氧核苷三磷酸、至少一种DNA聚合酶、至少两种寡核苷酸引物、以及作为模板的核酸片段的反应溶液进行孵育，以上述引物的3’末端作为起点进行聚合酶反应，从而将该核酸片段扩增。

即，本发明提供一种核酸的扩增方法，该方法为这样一种核酸扩增方法：将含有至少一种脱氧核苷三磷酸、至少一种DNA聚合酶、至少两种寡核苷酸引物、以及作为模板的核酸片段的反应溶液进行孵育，以上述引物的3’末端作为起点进行聚合酶反应，从而将该核酸片段扩增，其特征在于，将标识序列添加到第一寡核苷酸引物的5’末端，该标识序列为在作为模板的核酸片段中存在的一段碱基序列，在所述模板上，该碱基序列位于该模板中的与第一寡核苷酸引物的3’端部分(第一寡核苷酸与模板核酸退火的部分)基本上相同的序列的下游侧(即3’末端侧)。图1显示的是第一寡核苷酸引物、第二寡核苷酸引物和标识序列的位置关系的示意图。

优选的是，该标识序列的3’末端的碱基存在于：在作为模板的核酸片段的碱基序列中的、与第二寡核苷酸引物的碱基序列基本上互补的碱基序列的下游侧(即3’末端侧)。图2显示的是第一寡核苷酸引物、第二寡核苷酸引物和标识序列的位置关系的示意图。

优选的是，该标识序列存在于：在作为模板的核酸片段的碱基序列中的、与第二寡核苷酸引物的碱基序列基本上互补的碱基序列的下游侧(即3’末端侧)。图3显示的是第一寡核苷酸引物、第二寡核苷酸引物和标识序列的位置关系的示意图。

优选的是，添加到第一寡核苷酸引物的5’末端上的标识序列为2个碱基以上且20个碱基以下的序列。

优选的是，添加到第一寡核苷酸引物的5’末端的标识序列为：在作为模板的核酸片段的碱基序列上，在距与第一寡核苷酸引物的3’端部分(第一寡核苷酸与模板核酸退火的部分)基本上相同的序列的3’末端200个碱基以内的区域中存在的碱基序列。

优选的是，所述反应溶液中还含有至少0.01％以上的表面活性剂。

优选的是，所述表面活性剂为非离子型表面活性剂。

优选的是，所述非离子型表面活性剂的特征在于选自聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯类、聚氧乙烯烷基酚醚类、聚氧乙烯烷基醚类。

优选的是，所述反应溶液中还含有二价阳离子。

优选的是，所述反应溶液中还含有解链温度调节剂。

优选的是，所述解链温度调节剂为二甲基亚砜、甜菜碱、甲酰胺或甘油、或者它们中的两种以上的混合物。

优选的是，所述的至少一种DNA聚合酶为具有链置换能力的DNA聚合酶。

优选的是，所述的至少一种具有链置换能力的DNA聚合酶为选自来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的5’→3’外切核酸酶缺失的Bst.DNA聚合酶、来源于热坚芽孢杆菌的5’→3’外切核酸酶缺失的Bca DNA聚合酶、来源于Thermococcus litoralis的5’→3’外切核酸酶缺失的Vent.DNA聚合酶、及来源于酸热脂环酸杆菌的DNA聚合酶中的聚合酶。

优选的是，核酸的扩增工序在基本上恒温的条件下进行。

优选的是，核酸的扩增工序在50℃以上100℃以下的条件下进行。

优选的是，核酸的扩增工序基本上在60分钟以内进行。

发明效果

通过本发明，能够非常有效地进行形成高分子量产物的反应，所以能够仅对目标核酸序列进行特异性的扩增，其中所述形成高分子量产物的反应是通过将标识序列(即，在作为模板的核酸片段的碱基序列上，与第一寡核苷酸引物的3’端部分(第一寡核苷酸与模板核酸退火的部分)基本上相同的序列的3’末端侧(即下游侧)所存在的碱基序列)添加到第一寡核苷酸引物的5’末端而进行的。而且，根据本发明，可以提供一种简便、迅速、高灵敏度的核酸扩增方法，从而不必采用复杂的温度控制、使用特殊的酶、进行复杂的引物设计就能够对目标核酸序列进行扩增。

附图说明

图1显示的是本发明中引物和标识序列的位置关系的示意图。

图2显示的是本发明中引物和标识序列的位置关系的示意图。

图3显示的是本发明中引物和标识序列的位置关系的示意图。

图4显示的是实施例中所用的引物相对于β2AR基因的位置关系的详细情况。

图5显示的是通过本发明的扩增反应而得到的扩增产物的荧光检测结果。

图6显示的是通过本发明的扩增反应而得到的扩增产物的荧光检测结果。

图7显示的是通过本发明的扩增反应而得到的扩增产物的荧光检测结果。

图8显示的是通过本发明的扩增反应而得到的扩增产物的电泳结果。

图9显示的是通过本发明的扩增反应而得到的扩增产物的电泳结果。

图10显示的是通过本发明的扩增反应而得到的扩增产物的电泳结果。

图11显示的是实施例中所用的引物相对于β2AR基因的位置关系的详细情况。

图12显示的是通过本发明的扩增反应而得到的扩增产物的电泳结果。

图13显示的是实施例中所用的引物相对于β2AR基因的位置关系的详细情况。

图14显示的是通过本发明的扩增反应而得到的扩增产物的电泳结果。

图15显示的是本发明的扩增产物的形成机理的详细情况。

具体实施方式

以下对本发明进行详细说明。

本发明的核酸扩增方法为这样一种核酸扩增方法，其包括：将含有至少一种脱氧核苷三磷酸、至少一种DNA聚合酶、2价阳离子、至少两种寡核苷酸引物、以及作为模板的核酸片段的反应溶液进行孵育，以上述引物的3’末端作为起点进行聚合酶反应，从而将该核酸片段扩增，其特征在于，将标识序列添加到第一寡核苷酸引物的5’末端，该标识序列为：在作为模板的核酸片段中存在的一段碱基序列，在所述模板上，该碱基序列位于该模板中的与第一寡核苷酸引物的3’端部分(第一寡核苷酸与模板核酸退火的部分)基本上相同的序列的3’末端侧(即下游侧)。

作为本发明的一个例子的实施例1中所用的引物相对于β2AR基因的位置关系的详细情况如图4所示。在该实施例1中，添加到第一寡核苷酸引物(序列编号1)的5’末端的标识序列为5’—CCACGACG—3’(序列编号1并参照图4)。在作为模板的核酸片段的碱基序列中，与第一寡核苷酸引物的3’端部分(第一寡核苷酸与模板核酸退火的部分)基本上相同的碱基序列对应于5’—CTTGCTGGCACCCAATA—3’。这样，在作为模板的核酸片段的碱基序列中，位于与第一寡核苷酸引物的3’端部分(第一寡核苷酸与模板核酸退火的部分)基本上相同的碱基序列的下游侧(即3’末端侧)的碱基序列对应于5’—CCACGACG—3’(参照图4)，该碱基序列就对应于添加到第一寡核苷酸引物(序列编号1)的5’末端上的标识序列。

本发明的核酸扩增方法的概略如图15所示。将第一寡核苷酸引物退火到作为模板的核酸片段，并以该寡核苷酸引物的3’末端作为起点进行聚合酶反应。这时，通过将标识序列(该标识序列为：在作为模板的核酸片段的碱基序列上，与第一寡核苷酸引物的3’端部分(第一寡核苷酸与模板核酸退火的部分)基本上相同的碱基序列的3’末端侧所存在的碱基序列)添加到第一寡核苷酸引物的5’末端，以第一寡核苷酸引物作为起点进行聚合酶反应，作为该聚合酶反应的扩增产物，得到了在其5’末端含有标识序列的扩增核酸片段(称其为核酸片段A)，即该扩增核酸片段含有：在作为模板的核酸片段的碱基序列中的、位于与第一寡核苷酸引物的3’端部分(第一寡核苷酸与模板核酸退火的部分)基本上相同的碱基序列的下游测(即3’末端侧)所存在的碱基序列。

接着，将第二寡核苷酸引物退火到通过上述方法得到的扩增核酸片段A上，并以该寡核苷酸引物的3’末端作为起点进行聚合酶反应。这时，由于在作为模板的扩增核酸片段A的5’末端存在有标识序列(该标识序列为：在作为模板的核酸片段的碱基序列中，在与第一寡核苷酸引物的3’端部分(第一寡核苷酸与模板核酸退火的部分)基本上相同的碱基序列的下游侧(即3’末端侧)存在的碱基序列)，因此在所得到的扩增核酸片段(称其为核酸片段B)的3’末端含有与标识序列基本上互补的序列(该序列为这样的序列：与在作为模板的核酸片段的碱基序列中的、和第一寡核苷酸引物的3’端部分(第一寡核苷酸与模板核酸退火的部分)基本上相同的序列的下游侧(即3’末端侧)存在的碱基序列，基本上互补的序列)。

核酸片段B的3’末端的序列与核酸片段A中所含有的序列在2处互补。

核酸片段B的3’末端与存在于核酸片段A的3’末端上的互补序列形成双链，并以此为起点进行聚合酶反应，由此合成得到高分子的扩增核酸片段。

同样，所得到的高分子的扩增核酸片段与存在于核酸片段A的3’末端上的互补序列形成双链，并以此为起点进行聚合酶反应，由此合成得到分子量更高的扩增核酸片段。

以下对本发明中所采用的成分进行说明。

(1)脱氧核苷三磷酸

采用脱氧核苷三磷酸作为延伸反应的底物。具体地说，优选使用dATP、dCTP、dGTP、dTTP的混合物。作为脱氧核苷三磷酸，也可以含有dNTP的类似物(例如，7-脱氮-dGTP等)。

此外，脱氧核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP的混合物)的最终浓度均在0.1mM～3.0mM的范围内，优选在0.75mM～3.0mM的范围内，更优选在1.0mM～2.0mM的范围内，特别优选在1.0mM～1.5mM的范围内。

(2)DNA聚合酶

在本发明中，采用具有链置换能力的聚合酶。在本说明书中，所谓“链置换能力”是指具有这样的活性：在根据作为模板的核酸序列进行DNA复制时，通过置换DNA链来进行链置换，以使退火到模板链上的互补链解离，即，具有能够进行链置换(strand displacement)的活性。作为具有链置换能力的聚合酶的具体例子，可以列举来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的5’→3’外切核酸酶缺失的Bst.DNA聚合酶、来源于热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)的5’→3’外切核酸酶缺失的Bca DNA聚合酶、来源于Thermococcuslitoralis的5’→3’外切核酸酶缺失的Vent.DNA聚合酶、及来源于酸热脂环酸杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)的DNA聚合酶中的聚合酶等，但并不局限于此。具有链置换能力的聚合酶，既可以是来源于天然的，也可以是通过基因工程制造的重组蛋白质。

(3)二价阳离子

在本发明中，根据所使用的酶的金属需求性等，使用二价阳离子。作为所述二价阳离子，可以使用镁盐、钙盐和其他的金属盐，例如，可以使用氯化镁、醋酸镁、硫酸镁等。所述二价阳离子的最终浓度优选在1mM～20mM的范围内，更优选在2mM～10mM的范围内。

(4)表面活性剂

在本发明中，也可以向反应溶液中添加表面活性剂。通过使用表面活性剂，可以达到防止发生非特异性的核酸扩增这样的有利效果。对于本发明中可以使用的表面活性剂的种类没有特别的限定，例如可以使用烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠(SDS)、磺基琥珀酸辛酯盐、硬脂酸皂类等阴离子(anion)型表面活性剂；蔗糖脂肪酸酯、POE失水山梨醇脂肪酸酯(Tween 20、Tween 40、Tween 60、Tween 80等)、脂肪酸烷醇酰胺、POE烷基醚(Brij35、Brij58等)、POE烷基苯基醚(Triton X-100、Triton X-114、Nonidet P40等)、壬基酚、月桂醇、聚乙二醇、聚氧乙烯·聚氧丙烯嵌段共聚物、POE烷基胺、POE脂肪酸双苯基醚等非离子(nonion)型表面活性剂；氯化十六烷基吡啶鎓、十二烷基二甲基苄基氯化铵、硬脂基三甲基氯化铵等阳离子(cation)型表面活性剂等。对于表面活性剂的用量没有特别的限定，只要能够达到本发明的效果即可，但是优选为0.01％以上，更优选为0.05％以上，进一步优选为0.1％以上。对表面活性剂的用量的上限没有特别的限定，通常在10％以下，优选在5％以下，更优选在1％以下。

在表面活性剂中，特别优选使用非离子型表面活性剂。在非离子型表面活性剂中，优选亲水性较强的表面活性剂，用HLB值表示的话，优选HLB值在12以上。更优选HLB值在14以上，优选HLB值的上限为20。另外，优选HLB值在17以下，更优选HLB值为14以上17以下。从结构上来说，所述表面活性剂优选选自聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯类、聚氧乙烯烷基醚类。还有，在聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯中，优选的化合物是聚氧乙烯失水山梨醇单脂肪酸酯。例如，可以用以下的结构式来表示。

(式中，x+y+z+w＝20，R表示碳原子数为12～18的烷基。)

对于烷基的位置没有特别的限定，但是可以优选使用以下的结构式所表示的化合物。

(式中，x+y+z+w＝20，R表示碳原子数为12～18的烷基。)

作为此类表面活性剂，就物质名称而言，聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯类非离子型表面活性剂可以列举聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯等。可以列举商品名分别为Tween 20、Tween 40、Tween 60和Tween 80等的表面活性剂。此外，对于表面活性剂的用量也没有特别的限定，但是优选为0.01％以上，更优选为0.05％以上，进一步优选为0.1％以上。

(5)寡核苷酸引物

在本发明中使用的寡核苷酸引物具有与模板DNA基本上互补的碱基序列，并且从该引物的3′末端可以进行DNA链的延伸。由于寡核苷酸引物具有与模板DNA基本上互补的碱基序列，所以可以将其退火到作为模板的DNA上。作为本发明使用的寡核苷酸引物，可以使用由脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸构成的物质，也可以是含有修饰的核糖核苷酸或修饰的脱氧核糖核苷酸的物质。

在本发明中，将标识序列(即，在作为模板的核酸片段的碱基序列中的、与第一寡核苷酸引物的3’端部分(第一寡核苷酸与模板核酸退火的部分)基本上相同的序列的下游侧(即3’末端侧)所存在的碱基序列)添加到第一寡核苷酸引物的5’末端。

优选的是，添加到第一寡核苷酸引物的5’末端上的标识序列为2个碱基以上、20个碱基以下的序列。

优选的是，添加到第一寡核苷酸引物的5’末端的标识序列为2个碱基以上、16个碱基以下的序列。

优选的是，添加到第一寡核苷酸引物的5’末端的标识序列为4个碱基以上、14个碱基以下的序列。

优选的是，添加到第一寡核苷酸引物的5’末端的标识序列位于：在作为模板的核酸片段的碱基序列上，与第一寡核苷酸引物的3’端部分(第一寡核苷酸与模板核酸退火的部分)基本上相同的序列的3’末端侧(即下游侧)的200个碱基以内的位置。

优选的是，添加到第一寡核苷酸引物的5’末端的标识序列位于：在作为模板的核酸片段的碱基序列上，与第一寡核苷酸引物的3’端部分(第一寡核苷酸与模板核酸退火的部分)基本上相同的序列的3’末端侧(即下游侧)的100个碱基以内的位置。

优选的是，添加到第一寡核苷酸引物的5’末端的标识序列位于：在作为模板的核酸片段的碱基序列上，与第一寡核苷酸引物的3’端部分(第一寡核苷酸与模板核酸退火的部分)基本上相同的序列的3’末端侧(即下游侧)的60个碱基以内的位置。

优选的是，添加到第一寡核苷酸引物的5’末端的标识序列位于：在作为模板的核酸片段的碱基序列上，与第一寡核苷酸引物的3’端部分(第一寡核苷酸与模板核酸退火的部分)基本上相同的序列的3’末端侧(即下游侧)的50个碱基以内的位置。

对于寡核苷酸引物的长度没有特别的限定，但是一般来说，为10～100个左右核苷酸的长度，优选为15～50个左右核苷酸的长度，更优选为15～40个左右核苷酸的长度。

可以使用巾售的DNA合成仪(例如，美国应用生物***公司(Applied Biosystem Inc.)制造的DNA合成仪-394型等)，根据亚磷酰胺法来合成所述寡核苷酸引物。

在反应溶液中，寡核苷酸引物的用量优选为0.1μM以上，更优选为1μM以上，特别优选为1.5μM以上。

(6)作为模板的核酸片段

在本发明中，作为模板的核酸(DNA或RNA)可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA、mRNA、总RNA中的任意一种。既可以使用从有可能含有作为模板的核酸的试样中所制备的核酸，也可以直接使用有可能含有作为模板的核酸的试样。对于含有作为模板的核酸的试样的种类没有特别的限定，可以列举例如体液(例如，全血、血清、尿、脑脊髓液、***、唾液等)，组织(例如，癌组织等)，用拭子采取的试样，来源于细胞培养物之类的生物体的试样，诸如病毒、细菌、真菌、酵母菌、植物和动物之类的含有核酸的试样，有可能混入有微生物的试样(例如，食品等)，或诸如土壤、废水之类的环境中的试样。在从上述试样中制备核酸时，对于制备方法没有特别的限定，例如，可以采用表面活性剂处理、超声处理、用玻璃珠进行精制等本领域的技术人员公知的方法。对于从试样中精制核酸，可以采用苯酚提取法、色谱法、凝胶电泳法或密度梯度离心分离等方法进行。

当对具有来源于RNA的序列的核酸进行扩增时，以该RNA作为模板进行逆转录反应合成得到cDNA，以该cDNA作为模板来实施本发明的方法。在逆转录反应中使用的引物，可以是具有与特定的模板RNA互补的碱基序列的引物，也可以是寡聚dT引物或具有随机序列的引物。用于逆转录的引物的长度优选是6～100个左右核苷酸的长度，更优选是9～50个左右核苷酸的长度。对于逆转录反应中使用的酶没有特别的限定，只要其具有以RNA作为模板来合成cDNA的活性即可，例如可以使用源自禽类骨髓细胞瘤病病毒的逆转录酶(AMV RTase)、源自Molony鼠白血病病毒的逆转录酶(MMLV RTase)及Rous相关病毒-2的逆转录酶(RAV-2RTase)等。此外，也可使用同时具有逆转录活性的链置换型DNA聚合酶。

在本发明中，基因组DNA或核酸扩增片段之类的双链DNA、以及利用逆转录反应由RNA制备得到的cDNA之类的单链DNA可用作模板DNA。上述的双链DNA，既可以在变性为单链DNA后用于本发明的方法中，也可以不进行这样的变性而用于本发明的方法中。

(7)对模板核酸片段的预处理

本发明中的模板核酸，也可以在经过预处理工序之后用作扩增模板。

预处理用的试剂可以含有(例如)表面活性剂、抗凝剂、蛋白质分解酶、脂类分解酶。作为试剂的液性，可以是酸性，也可以是碱性。

作为预处理工序，可以包括在高温(例如98℃)下进行加热的工序或者采用变性处理剂进行处理的工序。而且，在高温加热后，可以包括骤冷至4℃以下的工序。

(8)解链温度调节剂

在本发明的反应溶液中，可以添加解链温度调节剂。作为解链温度调节剂的具体例子，可以列举二甲基亚砜(DMSO)、甜菜碱、甲酰胺或甘油、四烷基铵盐或它们中的2种以上的混合物。对于解链温度调节剂的用量没有特别的限定，然而，在使用DMSO或甲酰胺、甘油的情况中，通常它们在反应溶液中的含量为10％以下。

甜菜碱或四烷基铵盐的添加量为0.2M～3.0M，优选为0.5M～1.5M左右。

(9)缓冲成分

在本发明的反应溶液中，可以含有缓冲成分。对于缓冲成分没有特别的限定，可以使用例如N，N-二(羟乙基)甘氨酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、三羟甲基氨基甲烷和磷酸盐(磷酸钠、磷酸钾等)等。缓冲成分的最终浓度在5mM～100mM的范围内，特别优选在10mM～50mM的范围内，此外，pH是对于扩增反应中使用的酶的最佳pH，一般来说为6.0～9.0，特别优选使用pH7.0～9.0的缓冲成分。

(10)荧光色素

在本发明的反应溶液中，可以含有荧光色素。对于荧光色素没有特别的限定，例如可以使用SYBR Green I等。

(11)本发明的核酸扩增方法

以下对本发明的核酸扩增方法进行说明。在本发明中，将含有至少一种脱氧核苷三磷酸、至少一种DNA聚合酶、二价阳离子、至少两种寡核苷酸引物、以及作为模板的核酸片段的反应溶液进行孵育。由此，以上述引物的3’末端作为起点进行聚合酶反应，从而可以将该核酸片段扩增。本发明中，优选在基本上恒温的条件下进行核酸的扩增工序。对反应溶液进行孵育时的温度优选在50℃以上，更优选为55℃以上，例如，可以在60℃左右的温度下进行孵育。优选的温度范围例如为从大约50℃到大约70℃，更优选为从大约55℃到大约65℃。这种情况下，引物的非特异性退火被抑制，DNA扩增的特异性提高，而且，由于模板DNA的二级结构被解除，所以DNA聚合酶的延伸活性也得以提高。本发明的核酸扩增方法可以在基本上恒温的条件下实施。在本发明中，所谓“恒温”是指各工序的反应温度没有很大的变化，各工序在基本上一定的温度下进行。

在本发明中，对于将反应溶液在基本上恒温的条件下进行孵育的时间没有特别的限定，只要能够将目标核酸片段进行扩增即可。孵育时间例如可以为5分钟以上12小时以内。孵育时间优选为5分钟以上2小时以内，更优选为5分钟以上60分钟以内，进一步优选为5分钟以上30分钟以内，也可以为5分钟以上15分钟以内。

本发明的核酸扩增方法的一个优点在于，在基本上恒温的条件下进行核酸扩增工序时，不必使温度升高或降低。在传统的PCR法中需要使温度升高或降低，并且例如需要使用扩增仪(Thermal Cycler)之类的反应装置，而在基本上恒温的条件下进行核酸扩增时，仅仅使用可使温度保持一定的装置就可以实施扩增。

(12)本发明的核酸扩增方法的应用

本发明的核酸扩增方法能够用于核酸的检测、标记、碱基序列的确定、碱基变异的检测(包括单碱基多型态的检测等)等。在本发明的核酸扩增方法中，不必使用能够进行温度调节的反应装置，所以可以使用大量的反应液来进行扩增反应。

由本发明的核酸扩增方法所得到的扩增产物，可以采用本领域的技术人员公知的方法来进行检测。例如，采用凝胶电泳法，通过用溴化乙锭进行凝胶染色，可以检测特定大小的反应产物。用于检测扩增产物的检测体系，可以使用荧光偏振法、免疫检测法、荧光能量转移法、酶标记法(例如，过氧化酶、碱性磷酸酶等)、荧光标记法(例如，荧光素、罗丹明等)、化学发光法或生物发光法等。也可以利用Taqmanprobe或Molecular Beacon检测。通过使用用生物素等标记的标记核苷酸也可以检测扩增物。在这种情况中，可以采用荧光标记亲合素或酶标记亲合素等来检测扩增产物中的生物素。此外，通过使用本领域的技术人员公知的氧化还原型嵌入剂(intercalator)，也能够由电极来检测扩增产物。而且，也可以使用SPR来检测扩增产物。

也可以通过检测焦磷酸镁来检测核酸的扩增。在这种情况下，可以采用根据浑浊度进行的检测、以及本领域的技术人员公知的其他方法来进行检测。

通过实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明并不局限于这些实施例。

实施例

<实施例1>通过带有标识的引物进行的核酸扩增(标识的设计位置的影响)

(1)含有靶核酸片段的核酸试样溶液的配制

将3.0ng的Human Genomic DNA(Clontech公司制造)在98℃下加热3分钟，使之成为单链后，在下述条件下对β2AR基因中的序列进行扩增。

<引物>

使用β2AR基因作为目标进行引物的设计。各引物的序列如下所示。

引物(1)(正向引物1)：

5’—CCACGACGCTTGCTGGCACCCAATA—3’(序列编号1)

引物(2)(正向引物2)：

5’—GGCAGGAACTTGCTGGCACCCAATA—3’(序列编号2)

引物(3)(正向引物3)：

5’—TGGGTGGTCTTGCTGGCACCCAATA—3’(序列编号3)

引物(4)(反向引物)：

5’—CCGGCGCATGGCTT—3’ (序列编号4)

上述引物相对于β2AR基因的位置关系的详细情况如图4所示。

这里，引物(1)、(2)、(3)的5’末端的8个碱基(标识序列)分别与，在作为模板的核酸片段的碱基序列中的、和引物(1)、(2)、(3)的3’端部分(引物与模板核酸退火的部分)基本上相同的碱基序列的下游侧(即3’末端侧)所存在的各序列基本上相同。

(2)核酸扩增反应

采用具有如下所示组成的反应液，在60℃下反应60分钟，以实施扩增反应。酶使用的是NEB公司生产的Bst.DNA Polymerase。

<反应液的组成>

(3)扩增产物的检测

采用实时荧光检测装置(Mx3000p，Stratagene公司制造)对上述(2)中的扩增反应进行荧光检测。结果如图5至图7所示。

可以看出，能够对来自核酸试样的样品所进行的核酸扩增反应进行实时检测。采用Mx3000p分析软件，计算在上述的图中当荧光量达到250时所需要的时间(Ct值)，结果如表1所示。

[表1]

正向引物	反向引物	Ct值[分钟]
			引物(1)	引物(4)	38.0
引物(2)	引物(4)	37.7
			引物(3)	引物(4)	40.8

(4)扩增产物的电泳

使用3重量％的琼脂糖凝胶、0.5x TBE缓冲液(50mM Tris，45mM硼酸、0.5mM EDTA，pH8.4)，在100V下进行60分钟的电泳。结果如图8～10所示。

无论采用哪种引物的组合，均可以得到梯状的规则的电泳图案。由该结果可知，能够得到具有一定规律的扩增产物，即，能够对扩增反应进行控制。

(5)扩增产物的序列解析

将扩增产物用NucleoSpin(注册商标)Extract II(MACHEREY-NAGEL公司制造)进行纯化，并利用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen公司制造)将其重组到载体中，用该载体对大肠菌进行转化。将经过转化的大肠菌在添加有氨苄西林的LB培养基中进行培养。

利用QIAprep Miniprep(Qiagen公司制造)，从培养后的大肠菌中回收质粒DNA。

对所回收的质粒DNA进行测序，以确定碱基序列。采用ABIPRISM 310 Genetic Analyzer(ABI公司制造)进行测序。使用M13反向引物(M13 Reverse Primer)作为引物。

M13反向引物

5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’(序列编号5)

由测序的结果可知，在由引物(1)与引物(4)的组合所产生的扩增产物中，存在具有以下序列的核酸。

(1)

5’-CCACGACGTTCTTGCTGGCACCCAATAGAAGCCATGCGCCGG-3’

3’-GGTGCTGCAAGAACGACCGTGGGTTATCTTCGGTACGCGGCC-5’

(42个碱基对)(序列编号6)

(2)

5’-CCACGACGTTCTTGCTGGCACCCAATAGAAGCCATGCGCCGGACCACGAC-3’

3’-GGTGCTGCAAGAACGACCGTGGGTTATCTTCGGTACGCGGCCTGGTGCTG-5’

5’-GTTCTTGCTGGCACCCAATAGAAGCCATGCGCCGG-3’

3’-CAAGAACGACCGTGGGTTATCTTCGGTACGCGGCC-5’

(85个碱基对)(序列编号7)

(3)

5’-CCACGACGTTCTTGCTGGCACCCAATAGAAGCCATGCGCCGGACCACGAC-3’

3’-GGTGCTGCAAGAACGACCGTGGGTTATCTTCGGTACGCGGCCTGGTGCTG-5’

5’-GTTCTTGCTGGCACCCAATAGAAGCCATGCGCCGGACCACGACGTTCTTG-3’

3’-CAAGAACGACCGTGGGTTATCTTCGGTACGCGGCCTGGTGCTGCAAGAAC-5’

5’-CTGGCACCCAATAGAAGCCATGCGCCGG-3’

3’-GACCGTGGGTTATCTTCGGTACGCGGCC-5’

(128个碱基对)(序列编号8)

通过测序所得到的扩增产物的链长与图8的电泳结果一致。

扩增产物(1)为夹在2个引物之间的区域。

扩增产物(2)为：两个扩增产物彼此通过该扩增产物中的正向引物的5’末端序列(标识序列)和在反向引物的5’末端侧存在的序列进行杂合而生成的扩增产物，其具有“夹在引物之间的区域”+“反向引物与标识序列之间的序列”+“夹在引物之间的区域”这样的结构(以下，称其为2倍体)。

与扩增产物(2)相似，扩增产物(3)为：各扩增产物彼此通过该扩增产物中的正向引物的5’末端序列(标识序列)以及在反向引物的5’末端侧存在的序列进行杂合而生成的扩增产物，其具有“夹在引物之间的区域”+“反向引物与标识序列之间的序列”+“夹在引物之间的区域”+“反向引物与标识序列之间的序列”+“夹在引物之间的区域”这样的结构(以下，称其为3倍体)。

由测序的结果可知，在由引物(2)与引物(4)的组合所产生的扩增产物中，存在具有以下序列的核酸。

(1)

5’-GGGACGAGTTCTTGCTGGCACCCAATAGAAGCCATGCGCCGG-3’

3’-GGGACGAGAAGAACGACCGTGGGTTATCTTCGGTACGCGGCC-5’

(42个碱基对)(序列编号9)

(2)

5’-GGGACGAGTTCTTGCTGGCACCCAATAGAAGCCATGCGCCGGACCACGAC-3’

3’-CCCTGCTCAAGAACGACCGTGGGTTATCTTCGGTACGCGGCCTGGTGCTG-5’

5’-GTCACGCAGGAAAGGGACGAGTTCTTGCTGGCACCCAATAGAAGCCATGC-3’

3’-CAGTGCGTCCTTTCCCTGCTCAAGAACGACCGTGGGTTATCTTCGGTACG-5’

5’-GCCGG-3’

3’-CGGCC-5

(105个碱基对)(序列编号10)

(3)

5’-GGGACGAGTTCTTGCTGGCACCCAATAGAAGCCATGCGCCGGACCACGAC-3’

3’-CCCTGCTCAAGAACGACCGTGGGTTATCTTCGGTACGCGGCCTGGTGCTG-5’

5’-GTCACGCAGGAAAGGGACGAGTTCTTGCTGGCACCCAATAGAAGCCATGC-3’

3’-CAGTGCGTCCTTTCCCTGCTCAAGAACGACCGTGGGTTATCTTCGGTACG-5’

5’-GCCGGACCACGACGTCACGCAGGAAAGGGACGAGTTCTTGCTGGCACCCA-3’

3’-CGGCCTGGTGCTGCAGTGCGTCCTTTCCCTGCTCAAGAACGACCGTGGGT-5’

5’-ATAGAAGCCATGCGCCGG-3’

3’-TATCTTCGGTACGCGGCC-5’

(168个碱基对)(序列编号11)

通过测序所得到的扩增产物的链长与图9的电泳结果一致。

此处，扩增产物(1)为夹在2个引物之间的区域。

扩增产物(2)为：两个扩增产物彼此通过该扩增产物中的正向引物的5’末端序列(标识序列)和在反向引物的5’末端侧存在的序列进行杂合而生成的扩增产物，其为2倍体。

与扩增产物(2)相似，扩增产物(3)为：各扩增产物彼此通过该扩增产物中的正向引物的5’末端序列(标识序列)和在反向引物的5’末端侧存在的序列进行杂合而生成的扩增产物，其为3倍体。

由测序的结果可知，在由引物(3)与引物(4)的组合所产生的扩增产物中，存在具有以下序列的核酸。

(1)

5’-TGGGTGGTTTCTTGCTGGCACCCAATAGAAGCCATGCGCCGG-3’

3’-ACCCACCAAAGAACGACCGTGGGTTATCTTCGGTACGCGGCC-5’

(42个碱基对)(序列编号12)

(2)

5’-TGGGTGGTTTCTTGCTGGCACCCAATAGAAGCCATGCGCCGGACCACGAC-3’

3’-ACCCACCAAAGAACGACCGTGGGTTATCTTCGGTACGCGGCCTGGTGCTG-5’

5’-GTCACGCAGGAAAGGGACGAGGTGTGGGTGGTTTCTTGCTGGCACCCAAT

3’-CAGTGCGTCCTTTCCCTGCTCCACACCCACCAAAGAACGACCGTGGGTTA

5’-AGAAGCCATGCGCCGG-3’

3’-TCTTCGGTACGCGGCC-5’

(116个碱基对)(序列编号13)

(3)

5’-TGGGTGGTTTCTTGCTGGCACCCAATAGAAGCCATGCGCCGGACCACGAC-3’

3’-ACCCACCAAAGAACGACCGTGGGTTATCTTCGGTACGCGGCCTGGTGCTG-5’

5’-GTCACGCAGGAAAGGGACGAGGTGTGGGTGGTTTCTTGCTGGCACCCAAT-3’

3’-CAGTGCGTCCTTTCCCTGCTCCACACCCACCAAAGAACGACCGTGGGTTA-5’

5’-AGAAGCCATGCGCCGGACCACGACGTCACGCAGGAAAGGGACGAGGTGTG-3’

3’-TCTTCGGTACGCGGCCTGGTGCTGCAGTGCGTCCTTTCCCTGCTCCACAC-5’

5’-GGTGGTTTCTTGCTGGCACCCAATAGAAGCCATGCGCCGG-3’

3’-CCACCAAAGAACGACCGTGGGTTATCTTCGGTACGCGGCC-5’

(190个碱基对)(序列编号14)

通过测序得到的扩增产物的链长与图10的电泳结果一致。

此处，扩增产物(1)为夹在2个引物之间的区域。

由该结果可知，无论是哪个扩增产物，都是通过标识序列形成高分子量的产物。即，通过将碱基序列(该碱基序列为：在作为模板的核酸片段的碱基序列中的、在与第一寡核苷酸引物的3’端部分(第一寡核苷酸与模板核酸退火的部分)具有基本上相同的序列的下游侧(即3’末端侧)所存在的碱基序列)添加到第一寡核苷酸引物的5’末端，能够积极地形成高分子量的产物，从而能够控制扩增反应。

<实施例2>通过带有标识的引物进行的核酸扩增(标识序列的长度的影响)

(1)含有靶核酸片段的核酸试样溶液的配制

<引物>

引物(5)(正向引物5)：

5’—TGGTCTTGCTGGCACCCAATA—3’(序列编号15)

引物(6)(正向引物6)：

5’—TGGGTGGTCTTGCTGGCACCCAATA—3’(序列编号16)

引物(7)(正向引物7)：

5’—TGGGTGGTGGGCCTTGCTGGCACCCAATA—3’(序列编号17)

引物(8)(正向引物8)：

5’—TGGGTGGTGGGCATCTTGCTGGCACCCAATA—3’(序列编号18)

引物(9)(反向引物2)：

5’—TCCCTTTCCTGCGTGAC—3’ (序列编号19)

上述引物相对于β2AR基因的位置关系的详细情况如图11所示。

这里，将与4个碱基、8个碱基、12个碱基、14个碱基的序列[这些碱基序列分别和，存在于在作为模板的核酸片段的碱基序列上的、位于与引物(5)、(6)、(7)、(8)的3’端部分(引物与模板核酸退火的部分)基本上相同的碱基序列的3’末端侧的序列(下游侧序列)，基本上相同](即标识序列)分别添加到引物(5)、(6)、(7)、(8)的5’末端。

(2)核酸扩增反应

采用具有如下所示组成的反应液，在60℃下反应60分钟，以实施扩增反应。酶使用的是NEB公司的Bst.DNA Polymerase。

<反应液的组成>

(3)扩增产物的电泳

对于所得到的扩增产物，采用3重量％的琼脂糖凝胶、0.5x TBE缓冲液(50mM Tris，45mM硼酸、0.5mM EDTA，pH8.4)，在100V下进行60分钟的电泳。结果如图12所示。

无论采用哪种引物的组合，均可以得到梯状的规则的电泳图谱。由该结果可知，能够得到具有一定规律的扩增产物，与实施例1一样，可以认为通过标识序列形成了高分子量的产物。即，由该结果可知，能够对扩增反应进行控制。

<比较例1>

作为比较例，没有将碱基序列(该碱基序列为：在作为模板的核酸片段的碱基序列上，在与第二寡核苷酸引物的碱基序列基本上互补的碱基序列的下游侧(即3’末端侧)所存在的碱基序列)添加到第一寡核苷酸引物的5’末端进行核酸扩增，下面对该比较例进行描述。

(1)含有靶核酸片段的核酸试样溶液的配制

将3.0ng的Human Genomic DNA(Clontech公司制造)与预处理液(30mM NaOH、0.05％Tween20)一起在98℃下加热3分钟，使之成为单链后，在下述条件下对β2AR基因中的序列进行扩增。

<引物>

引物(1)(正向引物)：

5’—CTTGCTGGCACCCAATA—3’(序列编号20)

引物(2)(反向引物)：

5’—CCGGCGCATGGCTT—3’(序列编号4)

上述引物相对于β2AR基因的位置关系的详细情况如图13所示。

(2)核酸扩增反应

<反应液的组成>

(3)扩增产物的电泳

对于所得到的扩增产物，使用3重量％的琼脂糖凝胶、0.5x TBE缓冲液(50mM Tris，45mM硼酸、0.5mM EDTA，pH8.4)，在100V下进行60分钟的电泳。结果如图14所示。

虽然有一些的规律性，但得到的是基本上为模糊不清的电泳图谱。即，高分子量产物形成反应的规律性较低。

序列表

<110>富士胶片株式会社

<120>核酸的扩增方法

<130>FI-081398-59:56

<150>JP2007-295337

<151>2007-11-14

<160>20

<170>Patentln version 3.3

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>1

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>2

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>3

<210>4

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>4

<210>5

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>5

<210>6

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：扩增产物

<400>6

<210>7

<211>85

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：扩增产物

<400>7

<210>8

<211>128

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：扩增产物

<400>8

<210>9

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：扩增产物

<400>9

<210>10

<211>105

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：扩增产物

<400>10

<210>11

<211>168

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：扩增产物

<400>11

<210>12

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：扩增产物

<400>12

<210>13

<211>116

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：扩增产物

<400>13

<210>14

<211>190

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：扩增产物

<400>14

<210>15

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>15

<210>16

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>16

<210>17

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>17

<210>18

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>18

<210>19

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>19

<210>20

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成DNA

<400>20

Claims

1.一种核酸的扩增方法，其包括：通过将含有至少一种脱氧核苷三磷酸、至少一种DNA聚合酶、至少两种寡核苷酸引物、以及作为模板的核酸片段的反应溶液进行孵育，以上述引物的3’末端作为起点进行聚合酶反应，从而对所述核酸片段进行扩增，其特征在于，将标识序列添加到第一寡核苷酸引物的5’末端，该标识序列为：在作为模板的核酸片段的碱基序列中，在距与第一寡核苷酸引物的3’端部分基本上相同的序列的3’末端100个碱基以内的区域中所存在的碱基序列，其中所述的第一寡核苷酸引物的3’端部分为第一寡核苷酸引物与模板核酸退火的部分，并且添加到第一寡核苷酸引物的5’末端上的标识序列为4个碱基以上且20个碱基以下的序列，其中所述反应溶液中还含有二价阳离子，并且所述的至少一种DNA聚合酶为具有链置换能力的DNA聚合酶。

2.权利要求1所述的核酸的扩增方法，其中，所述标识序列的3’末端的碱基存在于，在作为模板的核酸片段的碱基序列中的、与第二寡核苷酸引物的碱基序列互补的碱基序列的3’末端侧。

3.权利要求1所述的核酸的扩增方法，其中，所述反应溶液中还含有至少0.01％以上且10％以下的表面活性剂。

4.权利要求3所述的核酸的扩增方法，其中，所述表面活性剂为非离子型表面活性剂。

5.权利要求4所述的核酸的扩增方法，其特征在于，所述非离子型表面活性剂选自聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯类、聚氧乙烯烷基醚类。

6.权利要求1所述的核酸的扩增方法，其中，所述反应溶液中还含有解链温度调节剂。

7.权利要求6所述的核酸的扩增方法，其中，所述解链温度调节剂为二甲基亚砜、甜菜碱、甲酰胺或甘油、或者它们中的两种以上的混合物。

8.权利要求1所述的核酸的扩增方法，其中，所述的至少一种具有链置换能力的DNA聚合酶为选自来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的5’→3’外切核酸酶缺失的Bst.DNA聚合酶、来源于热坚芽孢杆菌的5’→3’外切核酸酶缺失的Bca DNA聚合酶、来源于Thermococcuslitoralis的5’→3’外切核酸酶缺失的Vent.DNA聚合酶、及来源于酸热脂环酸杆菌的DNA聚合酶中的聚合酶。

9.权利要求1所述的核酸的扩增方法，其中，核酸的扩增工序在恒温的条件下进行。

10.权利要求9所述的核酸的扩增方法，其中，核酸的扩增工序在50℃以上100℃以下的条件下进行。

11.权利要求1所述的核酸的扩增方法，其中，核酸的扩增工序在60分钟以内进行。