CN101426533A - 免疫刺激组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了包括免疫共刺激多肽和抗原或感染剂的缀合物。将缀合物用于产生或增强对抗抗原或感染剂的免疫应答。本发明该提供了用用于产生或增强对抗原或感染剂的免疫应答的缀合物修饰的免疫细胞。本发明还提供了免疫刺激部分，其包括用于刺激免疫应答的免疫共刺激多肽。本发明还提供了免疫治疗方法和治疗或预防感染的方法。

Description

免疫刺激组合物和方法

相关申请的交叉参考

本申请依据35 U.S.C.§199(e)要求以下U.S.临时申请的申请日的权益：60/748,177(2005年12月8日申请)；60/771,179(2006年2月6日申请)；60/799,643(2006年5月12日申请)；和60/863,173(2006年10月27日申请)。在此将前述的每一篇申请以其整体引入作为参考。

发明领域

本发明总地涉及产生或增强免疫应答的方法，包括对抗抗原的免疫应答，涉及用于实现该方法的组合物，以及涉及用于该方法中的修饰免疫细胞。

发明背景

已经描述了针对加强宿主的免疫应答来处理特征在于缺乏免疫力或通过侵略性更大的免疫应答可解决的疾病和病症的方法。这种方法在其中有利的示例性疾病或病症包括癌症、流感和人免疫缺陷病毒(HIV)。

通常使用涉及外科手术、化疗和放疗的癌症处理，但是这些方法缺乏肿瘤特异性，导致不利的副作用和不太满意的临床应答。因此，通过特异性针对目标癌细胞的应答来加强对癌症的免疫应答而对正常细胞没有显着有害影响的方法将呈现出超过传统癌症疗法的明显优势。

存在一致的意见：免疫监测在肿瘤的预防和根除中起着作用，并且T细胞介导的获得性免疫在该过程中也起着作用。参见，例如，Pardoll，Nat.Rev.Immunol.2002，2：227-38；Rosenberg，Nature 2001，411：380-84；Finn，OJ.Nat.Rev.Immunol.2003，3：630-41。T细胞介导的免疫也在各种免疫治疗方法中起作用，已经在临床前和有限的临床情况中显示出功效。参见，例如，Pardoll，上文；Finn，上文；Antonia等，Curr.Opin.Immunol 2004，16：130-6。通过免疫***来靶向肿瘤，因为它们表达肿瘤相关抗原(TAA)，其是突变的或超/异常表达的自体蛋白，或源自致癌病毒的蛋白质。参见，例如，Finn，上文；Antonio，上文。在生理条件下，通过树突细胞(DC)来挑选肿瘤抗原，携带至外周淋巴器官，并在免疫条件下递呈至天然T细胞，使其激活并分化成效应细胞(T_eff)。然后这些细胞运输至肿瘤位点并产生用于肿瘤根除的抗肿瘤应答。参见，例如，Spiotto等，Immunity.2002；17：737-47；Ochsenbein等，Nature 2001；411：1058-64；Yu等，Nat.Immunol.2004；5：141-9)。

生产性T细胞应答需要三个不同的信号：信号1、2和3。通过T细胞受体(TCR)与专门的抗原递呈细胞(APC)表面上的主要组织兼容性复合物(MHC)分子相互作用产生了信号1。通过一系列共刺激分子介导了信号2，并且对于持续的免疫应答是关键。通过激活的淋巴细胞和APC(如巨噬细胞和DC)精心制成的细胞因子转导了信号3，并且对于效应免疫应答的维持是重要的。

肿瘤已经产生了各种机理来规避免疫监视。这些机理包括：(i)缺乏信号1，由肿瘤细胞上的MHC/肿瘤抗原生物分子复合物的无效展示，该信号转导的缺乏或MHC类似物MIC的表达引起，抑制了表达NKG2抑制受体的自然杀伤(NK细胞)；(ii)缺乏信号2，由肿瘤细胞上缺乏共刺激分子或共抑制分子的表达引起；(iii)通过抗炎分子的分泌，肿瘤反应性T细胞中无反应力的诱导，通过凋亡的T_eff细胞的物理消除或天然产生的CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺T调控(T_reg)细胞的诱导的肿瘤介导的免疫应答的抑制，和(iv)通过肿瘤基质的免疫力调节。积累的证据表明了这些机理中的许多可以在带有大肿瘤负荷的患者体内同时运行。

由于可以防止癌症复发的免疫***的特异性、安全性、功效和长期记忆的前景，包括来自目标癌症的抗原的癌症疫苗引起了特别的关注。一旦确定了免疫***在保护个体对抗癌症中起着重要作用并可以调节来根除动物模型中已有的肿瘤，投入了相当大的努力来研发治疗疫苗。参见，例如，Berzofsky等，J.Clin.Invest 2004，113：1515-25；Platsoucas等，Antivcancer Res.2003；23，1969-96；Finn，上文。目前的疫苗策略包括使用结合非特异性或特异性佐剂的特异性TAA，完整的肿瘤细胞裂解物，遗传修饰来表达共刺激分子、细胞因子和/或趋化因子的肿瘤细胞，用肿瘤抗原脉冲或用肿瘤RNA或DNA转染的DC，以及肿瘤内注射各种编码各种免疫刺激分子的载体。这些方法有效的功效源于使用一个或几个免疫逃避策略推进肿瘤来控制免疫应答的能力，或由于是免疫抑制机理、TAA的无效递呈或缺乏有效的DC、T_eff细胞和NK细胞的激活。

发明概述

本发明提供了免疫刺激组合物和方法。

根据一个实施方案，本发明提供了包括(a)第一缀合物和(b)第二缀合物的组合，第一缀合物包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的缀合物成员；第二缀合物包括(i)包括第一抗原的缀合物成员和(ii)包括结合对的第二个成员的缀合物成员。在一个实施方案中，结合对的第一个成员可以包括抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，而结合对的第二个成员可以包括生物素。在另一个实施方案中，第一缀合物可以包括含有第一免疫共刺激多肽和结合对的第一个成员的融合多肽。在一个特定的实施方案中，第一免疫共刺激多肽选自4-1 BBL、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80和CD40L。

在一个特定的实施方案中，第一抗原与感染剂相关，如人或禽流感或人免疫缺陷病毒。在另一个特定的实施方案中，第一抗原是肿瘤相关抗原。

在一个实施方案中，组合物进一步包括第三缀合物，其包括(i)包括第二免疫共刺激多肽和结合对的第一个成员的缀合物成员和(ii)包括第二抗原和结合对的第二个成员的缀合物成员。在该实施方案中，第二免疫共刺激多肽与第一免疫共刺激多肽相同或不同；第二抗原与第一抗原相同或不同；第三缀合物的第一个和第二个结合对成员与第一和第二缀合物的第一个和第二个结合对成员相同或不同。此外，第一缀合物成员可以通过第一个和第二个结合对成员之间的结合来结合第二缀合物成员。

在另一个实施方案中，组合的第二缀合物包括(i)包括感染剂的缀合物成员和(ii)包括结合对的第二个成员的缀合物成员。

根据本发明的另一个方面，提供了产生或增强对抗表达第一肿瘤相关抗原的肿瘤的免疫应答的方法，所述方法包括将以下的物质给予带有肿瘤的患者：(a)包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的缀合物成员的第一缀合物；和包括(i)包括第一肿瘤相关抗原的缀合物成员和(ii)包括结合对的第二个成员的缀合物成员的第二缀合物；或(b)已经在体外用第一和第二缀合物处理过的免疫细胞。

在一个实施方案中，将第一和第二缀合物给予患者，分开或同时，包括作为单个组合物的一部分。

在另一个实施方案中，将已经在体外用第一和第二缀合物处理过的免疫细胞给予患者。在一个特定的实施方案中，免疫细胞包括用于免疫共刺激多肽的受体，并且其中通过免疫共刺激多肽和受体之间的结合将第一缀合物缀合免疫细胞，通过第一个和第二个结合对成员之间的结合将第二缀合物缀合免疫细胞。

在一个实施方案中，该方法进一步包括给予第三缀合物，其包括(i)包括第二免疫共刺激多肽和结合对的第一个成员的缀合物成员和(ii)包括第二肿瘤相关抗原和结合对的第二个成员的缀合物成员。在该实施方案中，第二免疫共刺激多肽与第一免疫共刺激多肽相同或不同；第二抗原与第一抗原相同或不同；第三缀合物的第一个和第二个结合对成员与第一和第二缀合物的第一个和第二个结合对成员相同或不同。此外，第一缀合物成员可以通过第一个和第二个结合对成员之间的结合来结合第二缀合物成员。

根据本发明的另一个方面，提供了修饰免疫细胞来产生或增强对表达肿瘤相关抗原的肿瘤或感染剂的免疫应答的方法，包括将表达第一免疫共刺激多肽受体的免疫细胞接触(a)第一缀合物和(b)第二缀合物，第一缀合物包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的缀合物成员；第二缀合物包括(i)包括与肿瘤或感染剂相关的抗原或感染剂的缀合物成员，和(ii)包括结合对的第二个成员的缀合物成员。可以通过免疫共刺激多肽和受体之间的结合将第一缀合物缀合免疫细胞，并可以通过第一个和第二个结合对成员之间的结合将第二缀合物缀合免疫细胞。

在一个实施方案中，免疫细胞是T细胞，如CD4+细胞或CD8+细胞，或嗜中性粒细胞，自然杀伤细胞，单核细胞或树突细胞。

在另一个实施方案中，免疫细胞包括第一免疫共刺激多肽的受体，并且该方法进一步包括将免疫细胞接触第三缀合物，该第三缀合物包括(i)包括第二免疫共刺激多肽和结合对的第一个成员的缀合物成员和(ii)包括与肿瘤或感染剂相关的第二抗原或感染剂和结合对的第二个成员的缀合物成员。在该实施方案中，第二免疫共刺激多肽与第一免疫共刺激多肽相同或不同；第二抗原，如果存在，与第一抗原(如果存在)相同或不同；第三缀合物的第一个和第二个结合对成员与第一和第二缀合物的第一个和第二个结合对成员相同或不同。此外，第一缀合物成员可以通过第一个和第二个结合对成员之间的结合来结合第二缀合物成员。

根据本发明的另一个方面，提供了表达第一免疫共刺激多肽受体的修饰免疫细胞，其中用(a)第一缀合物和(b)第二缀合物来修饰修饰的免疫细胞，第一缀合物包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的缀合物成员，第二缀合物包括(i)包括第一抗原或感染剂的缀合物成员和(ii)包括结合对的第二个成员的缀合物成员，其中第一缀合物通过免疫共刺激多肽和受体之间的结合来缀合免疫细胞，并且第二缀合物通过第一个和第二个结合对成员之间的结合来缀合免疫细胞。在一个实施方案中，免疫细胞是T细胞，如CD4+细胞或CD8+细胞，或嗜中性粒细胞，自然杀伤细胞，单核细胞或树突细胞。

根据本发明的另一个方面，提供了诱导或增强对抗感染剂的免疫应答的方法，所述方法包括将以下物质给予患有感染剂感染或处于感染剂感染风险中的患者：(a)第一缀合物和(b)第二缀合物，第一缀合物包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的缀合物成员，第二缀合物包括(i)包括与感染剂相关的第一抗原或包括感染剂的缀合物成员和(ii)包括结合对的第二个成员的缀合物成员。在一个实施方案中，通过直接注射至感染部位来给予第一和第二缀合物中的至少一个。

在一个特定的实施方案中，感染是人或禽流感，并且第一抗原选自H、N、M1、M2e、NS1、NS2(NEP)、NP、PA、PB1和PB2。在另一个特定的实施方案中，感染是HIV，并且第一抗原选自由Gag蛋白、Pol、Vif、Vpr、Rev、Vpu、包膜抗原决定部位、Tat和Nef构成的HIV抗原。

在一个实施方案中，该方法进一步包括给予第三缀合物，其包括(i)包括第二免疫共刺激多肽和结合对的第一个成员的缀合物成员和(ii)包括第二个与感染剂相关的抗原或感染剂和结合对的第二个成员的缀合物成员，其中第二免疫共刺激多肽与第一免疫共刺激多肽相同或不同；第二抗原，如果存在，与第一抗原(如果存在)相同或不同；第三缀合物的第一个和第二个结合对成员与第一和第二缀合物的第一个和第二个结合对成员相同或不同，并且第一缀合物成员通过第一个和第二个结合对成员之间的结合来结合第二缀合物成员。

根据本发明的另一个方面，提供了包括免疫共刺激多肽和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的缀合物。

根据本发明的另一个方面，提供了诱导动物免疫刺激应答的方法，包括将包括免疫共刺激多肽和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的缀合物给予动物。在一些实施方案中，该方法进一步包括将抗原给予动物。

附图简述

图1A和1B各自列出了包括核心链霉抗生物素蛋白和鼠LIGHT蛋白胞外结构域的融合蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)和氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。图1B中下划线的是核心链霉抗生物素蛋白序列。

图2A和2B各自列出了包括人CD80胞外结构域和核心链霉抗生物素蛋白的融合蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)和氨基酸序列(SEQID NO：4)。图2B中下划线的是核心链霉抗生物素蛋白序列。

图3A和3B各自列出了包括鼠4-1BBL胞外结构域和核心链霉抗生物素蛋白的融合蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)和氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。图3B中下划线的是核心链霉抗生物素蛋白序列。

图4A和4B各自列出了包括核心链霉抗生物素蛋白和人4-1BBL胞外结构域的融合蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO：7)和氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。图4B中下划线的是核心链霉抗生物素蛋白序列。

图5A和5B各自列出了包括核心链霉抗生物素蛋白和人CD86胞外结构域的融合蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO：9)和氨基酸序列(SEQID NO：10)。图5B中下划线的是核心链霉抗生物素蛋白序列。

图6A、6B和6C列出了HPV16E6(SEQ ID NO：11)、HPV 16 E6变体(SEQ ID NO：12)和HV 16 E7(SEQ ID NO：13)的氨基酸序列。

图7A & 7B列出了实施例中所用的CSA-人CD40L的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO：14&15)。

图8显示了异源混合的淋巴细胞反应的结果，使用天然BLAB/c淋巴细胞作为应答物，而异源C57BL/6照射过的脾细胞作为刺激物。给所示培养物补充1μg/ml CSA-41 BBL融合蛋白。

图9显示了ex vivo T细胞增殖的结果，其中用可溶性抗-CD3单克隆抗体(0.5μg/ml)和照射过的脾细胞刺激从C57B/6小鼠挑选的CD8⁺T细胞，在CSA-41BBL融合蛋白(0.5μg/ml)、对照CSA蛋白(0.19μg/ml)或抗4-1BB单克隆抗体克隆3H3(5μg/ml)的存在或不存在下。

图10显示了用CFSE标记一百万OT-I CD8⁺T细胞并转移至用生物素化的OVA(10μg/注射)和与生物素化的OVA混合的CSA-4-1 BBL融合蛋白(1μg/注射)(41BBL+OVA)或包括生物素化的OVA和CSA-4-1BBL的缀合物免疫的B6.SJL小鼠中时，抗原特异性CD8+T细胞的增殖性应答。最后一组(^*)显示了使用和4-1BBL等摩尔水平的5μg缀合10μg生物素化的OVA的CSA-4-1 BBL的应答。

图11A是直方图，显示了PE+未处理DC的细胞(填充灰色的区域)、用生物素化PE处理的DC(虚线)和用生物素化的PE//CSA-4-1BBL缀合物处理的DC(实线)。图11B显示了接受每个处理的DC的PE的平均荧光强度(MFI)。

图12A显示了流式细胞术的结果，进行流式细胞术来分析未处理(黑灰色)或在GM-CSF存在下用CSA-41BBL(实线)或LPS(虚线)处理的DC的CD86和II类MHC的水平。图12B显示了CD86和II类MHC的平均荧光强度。

图13显示了来自天然的、生物素化的OVA/CSA处理的和生物素化的OVA/CSA-4-1 BBL处理的动物的DC细胞上CD40、CD86和II类MHC表达的平均荧光强度。

图14A显示了共培养实验的结果，其中从天然BALB/c小鼠的脾脏和外周***挑选CD4⁺CD25^-(单阳性，SP)和CD4⁺CD25⁺(双阳性，DP)T细胞，并且单独培养3天，或在补充照射过的脾细胞、抗CD3抗体(0.5μg/ml)和所示浓度(μg/ml)的4-1 BBL或等摩尔量的对照CSA蛋白的培养物中，以1:1比例培养3天。图14B中显示了CFSE测试的结果，其中将用CFSE标记的SP T细胞在图14A中所述条件下用于抑制测试中，除了使用0.5μg/ml的4-1 BBL。显示了每个直方图的***细胞的百分比。

图15显示了ex vivo T细胞增殖的结果，其中从天然BALB/c小鼠的脾脏和外周***挑选CD4⁺CD25^-(单阳性，SP)和CD4⁺CD25⁺(双阳性，DP)T细胞，并且单独培养，或在0.5μg/ml抗CD3抗体和照射过的脾细胞存在下以1:1比例培养，使用或不用1μg/ml的4-1BBL。

图16显示了CSA-hCD40L和CSA-mCD40L构建体的构建。剪头表示引物(a、b、c、d)及其用于克隆目的的方向。

图17显示了流式细胞术分析，证明了CSA-mCD40L和CSA-hCD40L与CD40受体的结合，其中用CSA-mCD40L或CSA-hCD40L孵育人THP-1和鼠A20细胞系，用FITC标记的抗-链霉抗生物素蛋白抗体染色，并在流式细胞术中分析。图(a)和(b)各自显示了CSA-mCD40L与人和鼠细胞系的结合，而图(c)和(d)各自显示了CSA-hCD40L与人和鼠细胞系的结合。

图18显示了流式细胞术分析，证明了用CSA-hCD40L刺激的巨噬细胞上的II类HLA和共刺激分子的上调，其中用100ng/mlCSA-hCD40L将人THP-1细胞系刺激48小时(细实线)，并在流式细胞术中使用II类HLA(图18A)和CD80(图18B)的抗体来分析。将用CSA蛋白(实心直方图)孵育的细胞和表达膜结合鼠CD40L(粗实线)的CHO细胞转染子分别作为阴性和阳性对照。

图19显示了流式细胞术分析，证明了用CSA-mCD40L刺激的鼠DC的表型突变，其中用各种浓度的CSA-mCD40L(空心直方图)刺激骨髓衍生的不成熟的DC各种时间段，并使用对于CD80(图19A)和CD86(图19B)表达特异性的抗体来分析。留下未刺激的细胞(细实线)或用CSA蛋白刺激的细胞(实心直方图)用作对照。显示了每106个细胞用200ng蛋白刺激48小时的数据。

图20显示了通过用CSA-CD40L刺激的人单核细胞分泌细胞因子，其中用1μg/ml rhsCD40L+增强剂(图20A)和100ng/ml CSA-hCD40L(图20B)或250ng/ml CSA-mCD40L(图20C)或CSA刺激初步洗脱的人单核细胞18小时，并通过ELISA分析上清液的IL-1β和IL-6。图20D显示了用CSA或CSA-hCD40L(1μg/ml)刺激遗传改进来表达人CD40(CD40KO)的鼠巨噬细胞细胞系时的结果，提取RNA并通过RNAse保护测试来分析，使用RiboQuant多探针RNAse保护***，使用模板mck-3b。显示了用于IL-6、L32和GAPDH的保护探针。直方图表示用管家基因L32标准化后的IL-6的条带密度。

图21显示了用CSA-hCD40L刺激的巨噬细胞中的iNOS表达的刺激，其中用IFN-γ准备转染用来表达人CD40的鼠CD40KO巨噬细胞系24小时，然后用1μg/ml商业rhsCD40L和增强剂或300ng/mlCSA-hCD40L或CSA蛋白刺激细胞24小时，使用抗-iNOS抗体通过蛋白质印迹分析细胞裂解物。直方图表示iNOS条带的密度。

图22显示了在12.5和25μg的剂量，与LPS相比较，CSA-4-1BBL的强烈体内佐剂影响，使用50μgOVA作为抗原。依据体内杀灭百分比报道了结果。

图23显示了接种(i)PBS(◆，n＝20)；(ii)50μg P1+12.5μg CSA(■，n＝6)；(iii)25μg CSA-4-1BBL(▲，n＝10)；(iv)50μg P1+25μgCSA-4-1BBL(Δ，n＝13)或(v)50μg P1+10μg CpG(□，n＝7)对现有的***的作用。接种P1和CSA-4-1BBL的组合物导致了显着提高的存活率，而接种P1或CSA-4-1 BBL提供了相当成功的免疫治疗。

图24显示了接种生物素化的OVA/CSA-4-1BBL缀合物在防止肿瘤生长中的结果。显示了接种OVA(Δ)、生物素化的OVA/CSA-4-1BBL缀合物(▲)和对照小鼠(●)的小鼠无肿瘤存活，接种生物素化的OVA/CSA-4-1BBL缀合物的小鼠显示出100％存活。

图25显示出CFSE染色的细胞的流式细胞术，证明了与抗原单独或抗原和LPS相比较，4-1BBL能将体内的抗原特异性CTL应答增强至较高的水平。在每个图的角上作为肽脉冲的CFSE高峰的百分比裂解来表示结果，与标准化至天然动物的参照CFSE低峰相比较。

图26显示了流式细胞术数据，证明了4-1BBL共刺激提高了体内的抗原递呈。

图27显示了流式细胞术数据，证明了4-1BBL共刺激提高了树突细胞在体内的抗原吸收。

发明详述

本发明提供了用于产生或增强免疫应答的方法和组合物，包括对抗抗原的免疫应答，抗原如TAA或与感染剂相关的抗原，感染剂如人和禽流感或HIV。本发明还提供了用于产生或增强对抗原的免疫应答的修饰免疫细胞。本发明还提供了免疫治疗方法，包括癌症免疫治疗方法，如减小肿瘤大小的方法和抑制肿瘤细胞生长的方法，以及治疗或预防传染的方法。

生产性获得性免疫应答需要次要淋巴器官的组织化结构内的天然T效应(“Teff”)细胞和APC之间协同且及时的相互作用。这种相互作用促进了Teff细胞和APC的相互激活，导致各种细胞表面配体和受体以及对启动、维持和长期记忆应答重要的可溶性蛋白的表达。如上所述，至少三个信号(信号1、2和3)涉及最初的天然T细胞的激活。已经暗示了几个免疫共刺激分子刺激了这些信号中的一个或多个。

本发明涉及一个或多个免疫共刺激多肽和一个或多个与肿瘤或感染剂相关的抗原在将抗原递呈至免疫细胞的方法中的用途，使得诱导有效的对抗肿瘤或感染剂的免疫应答。或者，可以替代与其相关的抗原而使用感染剂。尽管不希望受到任何理论的束缚，认为本发明通过促进抗原递呈和激活免疫应答获得了有利的结果。在另一个可替换的实施方案中，本发明提供了包括免疫共刺激多肽的免疫刺激部分，用于刺激免疫应答。

出于本申请的目的，以下的术语具有这些定义：

如在此所用的，“一个”或“一种”意思是一个或多个，除非特意指出只表示一个。

如在此所用的“给予”包括所有给患者提供物质的合适方式。常用的途径包括口服、舌下、经粘膜、经皮、直肠、***、皮下、肌内、静脉内、动脉内、鞘内、通过导管、通过植入等。在一些实施方案中，将组合物接近或直接给予肿瘤，如通过直接注射至肿瘤中或注射至血液，如肿瘤是血液肿瘤时。

如在此所用的“抗原”没有限制。抗原包括蛋白质、脂质、糖、核酸、化学部分和其它诱导免疫应答的分子。抗原包括蛋白质，其可以是修饰或未修饰的，如通过糖基化或甲基化来修饰，例如是环化的或结合脂质。与感染剂或疾病相关的抗原包括是感染剂一部分的抗原，如包膜蛋白、衣壳蛋白、表面蛋白、毒素、细胞壁、抗原性脂质等。其它抗原可以只在宿主存在下表达。在一些实施方案中，其它合适的抗原可以包括宿主的抗原，包括诱导、修饰或作为传染或疾病标记而另外超表达的那些。所有这样的源自感染剂、传染、病症或疾病的抗原或与感染剂、传染、病症或疾病相关的抗原适用于本发明中。根据本发明还适于用作“抗原”的是包括全长蛋白抗原性部分的肽，如包括诱导免疫应答的蛋白质的一部分的肽，如免疫原性抗原决定部位。例如，合适的抗原可以包括合成的诱导免疫应答的肽。

“结合对”指的是通过任一种分子力相互作用的两个分子，分子力包括，例如，离子、共价、疏水、范德华和氢键，使得该结合对具有相互特异性结合的特性。特异性结合的意思是在没有结合另一个分子的条件下，结合对成员呈现出相互结合。结合对的实例是生物素-抗生物素蛋白、激素-受体、受体-配体、酶-底物、IgG-蛋白A、抗原-抗体等。

“免疫共刺激多肽”意思是提高个体对抗病原体(包括感染剂)或肿瘤的免疫应答的多肽。

如在此所用的“免疫细胞”包括涉及获得性或先天性免疫***的产生、调节或作用的任何细胞。免疫细胞包括T细胞，如CD4+细胞、CD8+细胞和各种其它T细胞子集、B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞和树突细胞，以及嗜中性粒细胞。

如在此所用的“患者”包括任何脊椎动物，包括马、羊、公山羊、牛、猪、鸟类、狗、猫和灵长类物种。在一个实施方案中，患者是人。本领域技术人员将认识到特定的免疫共刺激分子、信号分子、细胞标记、细胞类型、感染剂等，关于一个物种讨论时，在不同的物种中具有相应的类似物，并且本发明包括这样的类似物及其在相应和相关物种中的用途。

如在此所用的“肿瘤”包括实体和非实体肿瘤(如淋巴瘤)；以及从癌变前损伤和良性肿瘤发展至癌性的、恶性的和转移性肿瘤的不同肿瘤阶段。

概括地，本发明提供了使用(a)第一缀合物和(b)第二缀合物产生或增强对抗第一抗原的免疫应答的方法，第一缀合物包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的缀合物成员，第二缀合物包括(i)包括第一抗原的缀合物成员和(ii)包括结合对的第二个成员的缀合物成员。抗原是TAA或与感染剂相关的抗原，或感染剂自身。可以将包括抗原或感染剂的缀合物直接给予患者，或可以用来处理免疫细胞，然后将其给予患者。本发明还提供了包括缀合物的组合物、用缀合物处理过的免疫细胞和制备处理过的免疫细胞的方法。

本发明还提供了包括免疫共刺激多肽的免疫刺激部分，如包括免疫共刺激多肽和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的缀合物或融合蛋白。本发明还提供了诱导动物免疫刺激应答的方法，包括将免疫刺激部分给予动物。在一些实施方案中，还将抗原给予动物。还提供了包括该部分的组合物。

根据本发明的一个方面，作为包括选择性靶向一种或多种类型的免疫细胞的免疫共刺激多肽的缀合物的一部分将抗原或感染剂呈现给免疫细胞，如以下所述的免疫共刺激多肽的任一种。因此，根据一个实施方案，本发明提供了包括免疫共刺激多肽和肿瘤或感染剂相关的抗原或感染剂的缀合物。可以通过任何方式将抗原或感染剂与免疫共刺激多肽缀合，包括通过共价结合、直接或通过连接物、或通过结合对成员。

在一个实施方案中，通过结合对的结合相互作用将抗原或感染剂与免疫共刺激多肽缀合。根据该实施方案，将每个抗原(或感染剂)和免疫共刺激多肽与结合对的成员缀合，并且结合对成员的结合相互作用将缀合物中的抗原(或感染剂)和免疫共刺激多肽连接在一起，如免疫共刺激多肽-结合对的第一个成员::结合对的第二个成员-抗原(或感染剂)缀合物。

根据该实施方案，本发明提供了包括(a)第一缀合物和(b)第二缀合物的组合，第一缀合物包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的缀合物成员，第二缀合物包括(i)包括与肿瘤或感染剂相关的第一抗原(或感染剂自身)的缀合物成员和(ii)包括结合对的第二个成员的缀合物成员。

在另一个实施方案中，组合包括第三缀合物，其包括(i)包括第二免疫共刺激多肽的缀合物成员和(ii)包括与肿瘤或感染剂相关的第二抗原(或感染剂自身)的缀合物成员，其中第三缀合物的免疫共刺激多肽与第一缀合物的免疫共刺激多肽相同或不同，而第二抗原与第一抗原相同或不同。在该实施方案的特定方面中，通过结合对成员与每个免疫共刺激多肽和第二抗原之间的结合，免疫共刺激多肽和第三缀合物的第二抗原结合在一起。根据该实施方案，第三缀合物的结合对成员与第一和第二缀合物的第一个和第二个结合对成员相同或不同。

可以在分开的组合物中提供第一、第二和任选第三缀合物。或者，可以在单个组合物中提供第一和第二缀合物，并在分开的组合物中提供第三缀合物。在另一个可替换的实施方案中，在单个组合物中提供第一个、第二个和第三缀合物。在另一个可替换的实施方案中，在一个组合物中提供第一缀合物，并在另一个组合物中提供第二个和第三缀合物。

每个组合物任选可以包括药物学上可接受的载体。药物学上可接受的载体是可以用作组合物介质的物质，因为在给药范围中，该物质是惰性的或另外在医学上是可接受的，以及与活性剂是兼容的。药物学上可接受载体可以含有本领域公知的常规药物添加剂。

免疫共刺激多肽

免疫共刺激分子涉及天然T细胞和抗原递呈细胞之间的天然相互作用，其导致相互的激活并促进各种细胞表面配体和受体的表达，和引起免疫应答的启动、维持和长期记忆的可溶性蛋白。如上所述，至少三个信号需要天然T细胞的最初激活。通过T细胞受体(TCR)与专门的APC(如树突细胞(DC))表面上的主要组织兼容性复合物(MHC)分子呈现的名义肽之间的相互作用产生了信号1。通过通过几个不同的分子介导了信号2，并且对于持续的免疫应答是关键。通过激活的T细胞和APC精心制成的细胞因子转导信号3，并且对于效应免疫应答的维持是重要的。

已经鉴定了多种免疫共刺激分子。根据本发明有用的示例性免疫共刺激分子(多肽)包括，但不限于，LIGHT、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、ICOS、ICOSL(包括B7h、B7-H2、B7RP-1、GL-50和LICOS)、CD94(KP43)、CD40L(CD154)、ICAM-I(CD54)、ICAM-2、ICAM-3、SLAM(CD150)、HAS(CD24)、4-1BB(CDw137)、4-1BBL(CDw137L)、OX40L、CD28、CD40(BP50)、CD25(IL-2Rα)、淋巴毒素(LTα或LTβ)、TNF、Fas-L、GITR(激活可诱导TNRF)、GITR配体、CD1 1a(α_L整联蛋白)、CD11b(α_M整联蛋白)、L-selectin(CD62L)、CD69(非常早期激活抗原)、CD70(CD27L)、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、4-1BBL、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF和APRIL。参见， 例如，Watts & DeBenedette，1999，Curr.Opin.Immunol.，11：286-93。

除非在此特指为“全长”，在此参照免疫共刺激多肽包括全长多肽及其呈现出免疫共刺激功能的片段或部分，包括但不限于，以下特意鉴定的那些片段和部分。因此，例如，参照4-1BBL多肽意味着包括呈现出免疫共刺激功能的全长4-1 BBL的片段或部分的多肽，如4-1BBL的胞外结构域或全长4-1 BBL蛋白。在一个实施方案中，免疫共刺激多肽不包括免疫共刺激分子的跨膜结构域。在一个实施方案中，免疫共刺激多肽包括免疫共刺激分子的胞外结构域，或其受体结合片段。

代表性的核酸序列和所编码的免疫共刺激多肽的实例包括GenBank登录号No.AB029155(鼠LIGHT)；NM_172014(人TNFSF14mRNA转录物变体2)；NM_003807(人TNFSF14 mRNA转录物变体1)；NM_005191(人CD80 mRNA)；NM_009855(鼠CD80 mRNA)；NM_214087(猪CD80 mRNA)；NM_009404(鼠Tnfsf9 mRNA)；NM_003811(人TNFSF9 mRNA)；NM_181384(褐家鼠TnfsfP mRNA)；BAA88559(鼠LIGHT蛋白)；Q9QYH9(鼠TNFSF 14膜结合蛋白和可溶性蛋白)；AAH18058(人TNFSF14蛋白)；NP_005182(人CD80蛋白)；NP_033985(鼠CD80蛋白)；NP_037058(褐家鼠CD80蛋白)；NP_003802(人TNFSF9蛋白)；NP_033430(鼠TNFSF9蛋白)；NP_852049(褐家鼠TNFSF9蛋白)；NM_012967(褐家鼠ICAM-1mRNA)；X69711(人ICAM-1 mRNA)；X52264(鼠ICAM-I mRNA)；X69819(人ICAM-3 mRNA)；AF296283(鼠ICAM-4 mRNA)；NM_021181(人SLAMF7 mRNA)；NM_033438(人SLAMF9 mRNA)；NM_029612(鼠SLAMF9 mRNA)；NM_144539(鼠SLAMF7 mRNA)；L13944(鼠CD18基因)；X53586(人整联蛋白α6 mRNA)；X68742(人整联蛋白α mRNA)；J04145(人嗜中型粒细胞粘附受体α-M亚基mRNA)；AJ246000(人白细胞粘附受体，L-selectin mRNA)；AY367061(人L-selectin mRNA，部分cds)；Y13636(鼠CD70 mRNA)；NM_001252(人TNFSF7 mRNA)；BC000725(人TNFSF7 mRNA(cDNA克隆MGC：1597 IMAGE：3506629)，完整cds)；X69397(人CD24基因和完整CDS)；NM_013230(人CD24 mRNA)；NM_012752(褐家鼠CD24 mRNA)；Y00137(鼠肿瘤坏死因子-β(淋巴毒素)基因)；X02911(人肿瘤坏死因子-β(淋巴毒素)基因)；D00102(人淋巴毒素mRNA，完整CDS)；X01393(人淋巴毒素mRNA)；和A06316((人淋巴毒素mRNA)中所示的那些。可以找到编码相同或其它免疫共刺激多肽的核酸序列和/或共刺激多肽的氨基酸序列，例如，通过搜索公众可获得的GenBank数据库(例如，在环球网上的ncbi.nlm.nih.gov可获得)。

CD28和CD80/CD86之间的相互作用似乎在信号2的转导中起着重要作用。参见，例如，Harding & Allison，J.Exp.Med.1993，177：1791-96；Ramarathinam等，J.Exp.Med.1994，179：1205-14；Townsend& Allison，Science 1993，259：368-70；Gause等，J.Immunol.1997，159：1055-58。CD80通常不在静止的B细胞上表达，而是在外周血单核细胞和DC上以低水平表达；然而，在激活后，这两种细胞以及巨噬细胞和其它APC上的CD80表达得到上调。参见，例如，Lenschow等，Ann.Rev.Immunol.1996，14：233-58；Freeman等，J.Immunol 1989，143：2714-22。相反，CD86在外周血单核细胞和DC上得到组成型表达，并且在B细胞上得到更快速的上调。参见，例如，Lenschow等，上文，Inaba等，J.Exp.Med.1994，180：1849-60。TCR与APC上的MHC/肽复合物的相互作用使CD80/86分子与CD28同时增强并导致脂质激酶磷脂酰肌醇3-激酶的酪氨酸磷酸化，其随后抑制一系列导致IL-2基因表达的诱导、细胞增殖和分化成效应功能的复杂胞内事件。参见，例如，Slavik等，Immunol.Res.1999，19：1-24；Azuma等，Nature 1993，366：76-79；Allison & Krummel，Science1995，270：932-33。

信号2可以通过调节抗凋亡基因(如Bal-xL)防止细胞死亡而进一步增大产生性免疫应答。参见，例如，Radvanyi等，J.Immunol.1996，156：1788-98；Boise等，Immunity 1995，3：87-98；Boise & Thompson，Science 1996，274：67-68。免疫激活的最初阶段后，T细胞和APC表面上的多种其它受体-配体对得到上调。这些“次要的”受体/配体对，如4-1 BBL/4-1 BB，在最初激活后的维持、免疫体内平衡和免疫记忆的产生中起着重要作用。参见，例如，Yu等，Nat.Immunol.2004，5：141-49；Armitage等，Nature 1992，357，80-82；Zhai等，J.Clin.Invest.1998，102：1142-51；Bourgeois等，Science 2002，297：2060-63；Kikuchi等，Nat.Med.2000，6：1154-59。

1. 4-1 BBL

在本发明的一个特定实施方案中，免疫共刺激多肽是4-1 BBL多肽。4-1 BBL(也称为4-BB-L，4-BB配体，TNFSF9、ILA配体)是在激活后两到三天在激活的B细胞、巨噬细胞和DC上表达的II型蛋白。参见，例如，Alderson等，Eur.J.Immunol.1994，24：2219-27；Goodwin等，Eur.J.Immunol.1993，23：2631-41；Pollok等，Eur.J.Immunol.1994，24：367-74；DeBenedette等，J.Immunol.1997，158：551-59。其受体，4-1 BB(CD137)，在激活的CD4⁺和CD8⁺T细胞表面上，在自然杀伤细胞、单核细胞和静止的DC上得到表达。参见，例如，Pollock，上文；Wilcox等，J.Immunol.2002，169：4230-36；Futagawa等，Int.Immunol.2002，14：275-86；Pollok等，J.Immunol.1993，150：771-81。

4-1 BB/4-1 BBL相互作用还将信号2以CD28-无关性方式转移至CD8⁺T细胞，并刺激它们来产生细胞因子、扩大并获取效应物功能。参见，例如，Cannons等，J.Immunol.2001，167：1313-24；Hurtado等，J.Immunol.1995，155：3360-67。Kim & Broxmeyer，J.Hematother.Stem Cell Res.2001，10：441-49；Saoulli等，J.Exp.Med.1998，187：1849-62；Shuford等，J.Exp.Med.1997，186：47-55；Tan等，J.Immunol.1999，163：4859-68；Vinay & Kwon，Semin.Immunol.1998，10：481-89。4-1 BB/4-1 BBL相互作用对于单核细胞和DC的激活、细胞因子的合成以及与NK细胞的信息交流也是重要的。参见，例如，Futagawa等，上文；Wilcox等，J.Clin.Invest 2002，109：651-9。相似地，除了通过cyclinD2和E的上调和cyclin-依赖性激酶抑制剂p27kip1的下调促进抗原特异性T细胞扩大的作用，4-1BB信号在T细胞存活中起着作用，因为其通过抗凋亡Bcl-xL和Bcl-1的上调和长期免疫记忆的建立防止了激活诱导的细胞死亡。参见，例如，Takahashi等，J.Immunol.1999，162：5037-40；Hurtado等，J.Immunol.1997，158：2600-09；Kim等，Eur.J.Immunol.1998，28：881-90。还显示出4-1BB/4-1BBL相互作用选择性地促进1型细胞因子，如IL-2、IFN-γ和TNF-α，表明4-1BB是1型效应T细胞特异性的共刺激分子，其在肿瘤根除中起着作用。

最近已经表明T_reg细胞组成型表达4-1BB受体并且通过4-1 BB受体的信号转导抑制了这些细胞的抑制功能。参见，例如，Choi等，上文；Morris等，上文，以及以下的实施例。这是重要的，因为T_reg细胞在免疫***的肿瘤逃避中起着重要作用。几个临床研究证明了T_reg细胞的数目和肿瘤进展之间存在直接的关联。Curiel等，Nat.Med.2004，10：942-49。实际上，动物模型中T_reg细胞的根除导致大的肿瘤根除，提供了它们在肿瘤进展中主要作用的直接证据。Yu等，J.Exp.Med.2005，201：779-91。相似地，感染剂，如HIV，可以使用T_reg细胞，用于免疫逃避。

尽管不希望受到理论的束缚，认为根据本发明将4-1BBL用作免疫共刺激多肽可以激活T细胞上的4-1BB同源受体，形成几个重要的免疫刺激作用。一个作用是信号2以CD28-无关性方式转移至CD8⁺T细胞，这刺激T细胞来产生细胞因子、扩大并获取效应物功能。4-1 BB/4-1 BBL相互作用的另一个作用是激活单核细胞和DC，其导致细胞因子的合成和释放。4-1 BB信号的另一个作用是通过防止激活诱导的细胞死亡(AICD)促进T细胞存活和建立长期免疫记忆。4-1 BB/4-1 BBL相互作用的再一个作用是从T细胞、DC和巨噬细胞选择性地产生1型细胞因子，如IL-2、IFN-γ和TNF-α，其作用于对肿瘤根除重要的1型效应T细胞。此外，如以上所解释的，4-1 BB/4-1 BBL相互作用可以抑制T_reg细胞的抑制剂功能。因此，例如，4-1 BBL抗原缀合物可以特异性地结合表达4-1 BB受体的DC，促进抗原递呈，激活DC，用于产生初级T细胞应答，直接作用于激活的T细胞(包括T_reg细胞)和NK细胞来加强对抗抗原的应答T_reg细胞。

4-1 BBL含有254个氨基酸(26624Da)。参见Alderson等，Eur JImmunol.1994年9月；24(9)：2219-27。可以在Swiss-Prot数据库中依据登录号no.P41273找到人4-1 BBL的全部氨基酸序列。4-1 BBL是II型糖蛋白，由残基1-28形成潜在的细胞质结构域，残基29-49形成单个预测的跨膜结构域，残基50-254形成潜在的胞外结构域，而残基35-41表示聚-Leu链。可以在GenBank登录号no.NM_003811中找到编码人4-1 BBL的核苷酸序列。

如上所述，激活后2-3天，通过激活的抗原递呈细胞，包括激活的B细胞、巨噬细胞和DC来表达4-1 BBL。4-1 BB，是4-1 BBL的受体，在激活的CD4⁺和CD8⁺T细胞表面上，在自然杀伤细胞、单核细胞和静止的DC上得到表达。可以结合其同源受体4-1 BB的4-1 BBL的残基50-254或其片段可以连接结合对成员或表达为含有结合对成员的融合蛋白，根据本发明来使用。例如，图3A和3B列出了CSA-鼠4-1 BBL的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO：5和6)。图4和B显示了包括人4-1 BBL胞外结构域和核心链霉抗生物素蛋白的融合蛋白的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO：7和8)。

2. CD80 & CD86

CD80(也称为B7.1，CD28LG，LAB7)和CD86(也称为B7.2，CD28LG2，LAB72)是示例共刺激多肽，两者都结合T细胞表达的CD28/CTLA4共受体。CD80含有288个氨基酸(33048Da)。参见Freeman等，J.Immunol.143(8)，2714-2722(1989)。可以在Swiss-Prot数据库中依据登录号no.P33681找到人CD80的全部氨基酸序列。CD80是I型糖蛋白，由残基1-34形成分泌信号，残基35-242形成潜在的胞外结构域，残基243-263形成潜在的跨膜结构域，而残基264-288形成潜在的细胞质结构域。因此，没有分泌信号序列的成熟CD80分子表示氨基酸35-288。可以在GenBank登录号no.NM_005191中找到编码人CD80的核苷酸序列。

可以结合其同源受体CD28的CD80的残基35-242或其片段可以连接结合对成员或表达为含有结合对成员的融合蛋白，根据本发明来使用。例如，图2A和2B列出了包括人CD80(B7.1)胞外结构域和核心链霉抗生物素蛋白的嵌合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO：3)和氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。

CD86(B7.2)含有329个氨基酸(37696Da)。参见Freeman等，Science 262(5135)，909-911(1993)。可以在Swiss-Prot数据库中依据登录号no.P42081找到人CD86的全部氨基酸序列。CD86是I型糖蛋白，由残基1-23形成分泌信号，残基24-247形成潜在的胞外结构域，残基248-268形成潜在的跨膜结构域，而残基269-329形成潜在的细胞质结构域。因此，没有分泌信号序列的成熟B7.2分子表示氨基酸24-329。可以在GenBank登录号no.NM_175862中找到编码人CD86的核苷酸序列。

可以结合其同源受体CD28的CD86的残基24-247或其片段可以连接结合对成员或表达为含有结合对成员的融合蛋白，根据本发明来使用。例如，图5A和5B列出了包括人CD86(B7.2)胞外结构域和核心链霉抗生物素蛋白的嵌合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO：9)和氨基酸序列(SEQ ID NO：10)。

CD86通常不在静止的B细胞上表达，而是在外周血单核细胞(PBC)和DC上以低水平表达；然而，在激活后，B细胞和其它APC如巨噬细胞和DC上的表达得到上调。相反，CD86在PBC和DC上得到组成型表达，并且在B细胞上得到更快速的上调。T细胞受体(TCR)与APC上的MHC/肽复合物的相互作用使T细胞上的CD80/86与CD28同时增强，这导致脂质激酶磷脂酰肌醇3-激酶的酪氨酸磷酸化，其随后抑制一系列导致IL-2基因表达的诱导、细胞增殖和分化成效应物功能的复杂胞内事件。信号2可以通过调节抗凋亡基因(如Bal-xL)防止细胞死亡而进一步增大产生性免疫应答。

3. L1GHT

免疫激活的最初阶段后，“次要的”受体/配体对，如4-1BBL/4-1BB和LIGHT/HVEM，在T细胞和APC的表面上得到上调。这些受体/配体对涉及最初激活事件后的维持、免疫体内平衡和免疫记忆的产生。

LIGHT多肽(也称为TNFS14、HVEM-L、LTg、TR2)是与淋巴毒素同源的TNF超家族成员。参见Mauri等，Immunity 8(1)，21-30(1998)。可以在Swiss-Prot数据库中依据登录号no.O43557找到人LIGHT的全部氨基酸序列。LIGHT含有240个氨基酸(26351Da)并且是II型糖蛋白，由残基1-37形成潜在的细胞质结构域，残基38-58形成单个预测的跨膜结构域，而残基59-240形成潜在的胞外结构域。***位点涉及残基82-83。可以在GenBank登录号no.NM_172014中找到编码人LIGHT的核苷酸序列。

可以结合其同源受体HVEM、LTβR或TR6的LIGHT的残基59-240或其片段可以连接结合对成员或表达为含有结合对成员的融合体，根据本发明来使用。例如，图1A和1B列出了包括核心链霉抗生物素蛋白和鼠LIGHT胞外结构域的嵌合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO：1)和氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。

LIGHT主要在激活的T细胞、NK细胞和未成熟的树突细胞上表达，并用来调节免疫应答的各个方面。作为膜结合蛋白来合成LIGHT，但是其细胞表面表达受到几个翻译后机制的调节。在表达的几分钟内通过基质金属蛋白酶从细胞表面分离LIGHT并作为可溶性分子累积(异形体1；大概表示残基83-240；Swiss-Prot O43557-1)。细胞表面细胞质片段表示异形体2(Swiss-Prot O43557-2)。此外，各种细胞类型在泡囊中存储LIGHT并在激活时通过各种生物刺激分泌出来。尽管LIGHT的可溶性形式的作用没有得到充分的表征，可以作为负反馈环，通过与HVEM和LTβR竞争来抑制膜结合形式的功能。

LIGHT与三个不同的受体相互作用：(1)T细胞上的疱疹病毒进入介质(HVEM)，(2)LTβR，其主要在上皮细胞和基质细胞上表达，和(3)各种细胞上的可溶性诱骗受体。这些相互作用赋予LIGHT不同的功能。与基质细胞上的LTβR的相互作用与各种细胞因子/趋化因子的产生、***(LN)器官发生和二级***构的恢复相关。另一方面，LIGHT与淋巴细胞上的HVEM受体的相互作用导致细胞因子的激活和产生，主要为IFN-γ和GM-CSF。关于这点，LIGHT/HVEM轴似乎传送与Th1型应答激活相关的共刺激信号，这在肿瘤消除中起着关键作用。

LIGHT在淋巴器官发生和Th1型应答产生中起作用。参见，例如，Yang等，2002，J.Biol.Regul.Homeost.Agents，16：206-10；Schneider等，2004，Immunol.Rev.，202：49-66。

已经在体外和体内的不同肿瘤模型中显示出LIGHT的作用。已经报道了通过表达LIGHT的单纯疱疹病毒扩增子转导的慢性淋巴细胞性白血病细胞能增强混合淋巴细胞反应中的T细胞增殖。已经显示MDA-MB-231人乳癌细胞上的LIGHT超表达抑制肿瘤生长。LIGHT转染至不同的癌细胞系中刺激这些细胞中的ICAM-1表达。认为ICAM-1的存在是有益的，因为它能够有效传导信号，以在肿瘤细胞中产生抗肿瘤活性。除了T细胞激活以外，LIGHT的另一个重要功能是通过LTβR转导信号的能力，这在次级***构的产生中起着重要作用，通过趋化因子表达的诱导以及基质细胞中粘附分子来介导。LIGHT与基质细胞上的LTβR的相互作用调节CCL21的表达，这控制天然T细胞回到淋巴组织。

其中将肿瘤细胞工程化来展示LIGHT的本发明的实施方案的一个优势是LIGHT刺激淋巴器官生成和支持Th1型应答产生的能力。另一个优势是LIGHT刺激对抗肿瘤的免疫应答和激活肿瘤基质来进一步扩大这些应答的能力。

基质作为物理屏障来防止淋巴细胞渗透至肿瘤部位中。基质还抑制了肿瘤微小环境内的淋巴细胞激活。这可能是由于缺乏T细胞激活需要的共刺激信号和/或各种免疫抑制可溶性介质的存在，如TGF-β和IL-10，这些通过基质成纤维细胞和肿瘤细胞合成并分泌。基质通过将肿瘤细胞限于肿瘤部位来促进免疫无知，因此防止它们转移至区域性的***。

肿瘤基质细胞还表达各种免疫受体，如LTβR，根据本发明可以将其开发用于抗肿瘤免疫的增强。

4. OX40L

OX40L是由树突细胞和其它APC表达的，并结合存在于激活的T细胞上的OC40。OX40L含有183个氨基酸(21950Da)。参见Miura等，Mol.Cell.Biol.11：1313-1325(1991)。可以在Swiss-Prot数据库中依据登录号no.P23510找到OX40L的全部氨基酸序列。OX40L是II型糖蛋白，残基1-23为细胞质结构域，残基24-50为跨膜结构域，而残基51-183为胞外结构域。OX40L的核苷酸序列为3510bp，编码序列为157-708(参见GenBank登录号no.NM_003326.2)。可以结合其同源受体OX40的OX40L的残基51-183或其片段可以连接结合对成员或表达为含有结合对成员的C-端融合体，根据本发明来使用。

5. CD40L

CD40L是由激活的T细胞表达的，并且还作为胞外可溶形式存在，其通过蛋白水解过程源自膜形式。CD40L(也称为TNFSF5)含有261个氨基酸(29350Da)。参见Villinger等，Immumogenetics 53：315-328(2001)。可以依据登录号no.Q9BDN3找到CD40L的全部氨基酸序列。CD40L是II型糖蛋白，残基1-22为细胞质结构域，残基23-43为跨膜结构域，而残基44-261为胞外结构域。CD40L的核苷酸序列为1834bp，编码序列为73-858(参见GenBank登录号no.NM_000074)。可以结合其同源受体CD40的CD40L的残基44-261或其片段可以连接结合对成员或表达为含有结合对成员的N-端融合体，根据本发明来使用。

6. PD-L1

PD-L1在激活的T和B细胞、树突细胞、角化细胞和单核细胞上得到表达。PD-L1(也称为B7-H；B7H1；PDL1；PDCD1L1)含有290个氨基酸(33275Da)。参见，Dong等，Nat.Med.5：1365-1369(1999)。可以在Swiss-Prot数据库中依据登录号no.Q9NZQ7找到PD-L1的全部氨基酸序列。PD-L1含有290个氨基酸，在N端的18个氨基酸表示信号序列。胞外结构域位于氨基酸19-238，跨膜结构域位于残基239-259，而细胞质结构域位于残基260-290。PD-L1的核苷酸序列(1553bp)可在公众数据库中获得(参见GenBank登录号no.NM_014143)(编码序列为53-925)。通过可替换的剪接，存在PD-L1的异形体。可以结合其同源受体PDCD1的PD-L1的胞外结构域或其片段可以连接结合对成员或表达为含有结合对成员的N-端融合体，根据本发明来使用。

7. GL50

GL50异形体1得到广泛表达(脑、心脏、肾脏、肝脏、肺、胰腺、胎盘、骨骼肌、骨髓、结肠、卵巢、***、睾丸、***、淋巴细胞、脾脏、胸腺和扁桃体)；GL50异形体2(swissprot O75144)在***、淋巴细胞和脾脏中以及在激活的单核细胞和树突细胞上表达。GL50(也称为B7-H2；B7H2；B7RP-1；B7RP1；ICOS-L；ICOSLG；KIAA0653；和LICOS)含有290个氨基酸(33275Da)。参见，Wang等，Blood96：2808-2813(2000)。可以在Swiss-Prot数据库中依据登录号no.O75144找到GL50的全部氨基酸序列。GL50含有302个氨基酸，N端的18个氨基酸表示信号序列。胞外结构域位于氨基酸19-256，跨膜结构域位于残基257-277和细胞质结构域位于残基278-302。GL50的核苷酸(3239bp)在公众数据库中可获得(参见GenBank登录号no.NM_015259)(编码片段表示135-1043)。通过可替换的剪接，存在GL50的异形体。可以结合其同源受体ICOS的GL50的胞外结构域或其片段可以连接结合对成员或表达为含有结合对成员的N-端融合体，根据本发明来使用。

表1概括了各种示例性共刺激分子及其受体并包括共受体配体对缀合物的实施方案。

表1

 

构建体名称和方向	受体	受体表达
			CD80-CSA	CD28	几乎所有人CD4 T细胞和大约50％的CD8T细胞上组成型表达
GL50-CSA	ICOS	在静止的T细胞上可检测在激活的CD4+ T和CD8+ T细胞以及NK细胞上得到上调
			PD-L1-CSA	PD-1	在CD4+和CD8+ T细胞、B细胞和单核细胞上诱导型表达NK-T细胞上低水平上表达
CSA-CD40L	CD40	B细胞、单核细胞、DC、内皮细胞和上皮细胞上组成型表达
			CSA-4-1BBL	CD137	激活的T细胞(48h峰值，96h下降)以及细胞因子处理的NK细胞DC子集(低)、人单核细胞、滤泡DC、CD4+CD25+调节T细胞上组成型表达
CSA-OX40L	OX40	激活的CD4(优选)和CD8(强烈的抗原应答)T细胞(48h峰值，96h下降)
			CSA-LIGHT	HVEM	静止的T细胞、单核细胞和未成熟的DC上组成型表达T细胞激活和DC成熟时得到下调

根据本发明可以使用其它免疫共刺激多肽。例如，US2003/0219419(在此将其内容全部引入作为参考)描述了可用于本发明中的IL-2-CSA融合蛋白和CSA-CD40L融合蛋白。总之，根据本发明有用的示例性免疫共刺激多肽包括以下的。

表2：B7和CD28家族成员

 

配体	受体
		CD80(B7.1)	CD28，CTA-4(CD152)
CD86(B7.2)	CD28，CTA-4
		ICOSL(B7h，B7-H2，B7RP-1，GL50，LICOS)	ICOS(AILIM)
PD-L1(B7-H1)	PD-1
		PD-L2(B7-DC)	PD-1
B7-H3	未知
		B7-H4(B7x；B7S1)	未知(BTLA？)
未知(HVEM*)	BTLA

^*是TNF成员

表3：TNF家族成员

 

配体	受体
		OX40L	OX40(CD134)
4-1 BBL	4-1 BB(CD137)
		CD40L(CD154)	CD40
CD27L(CD70)	CD27
		CD30L	CD30
LIGHT	HVEM、LTβR、DcR3
		GITRL	GITR
BAFF(BLyS)**	BAFF-R、TACI、BCMA
		APRIL**	TACI、BCMA

^**这些是B细胞相关的

表4A：B7家族成员的核苷酸和/或氨基酸序列的参考文献

 

配体(人)	参考文献
		CD80(B7.1)	Freeman等，J.Immunol.143：2714-2722(1989)。
CD86(B7.2)	Freeman等，Science 262：909-911(1993)。
		ICOSL	Wang等，Blood 96：2808-2813(2000)。Yoshinaga等，Int.Immunol.12：1439-1447(2000)。
PD-L1	Dong等，Nat.Med.5：1365-1369(1999)。Freeman等，J.Exp.Med.192：1027-1034(2000)
		PD-L2	Tseng等，J.Exp.Med.193：839-846(2001)Latchman等，Nat.Immunol.2：261-268(2001)
B7-H3	Steinberger等，(2003年9月)提交至EMBL/GenBank/DDBJ数据库。Mingyi等，J.Immunol 168：6294-6297(2002)。
		B7-H4(B7x；B7S1)	Zang等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100：10388-92(2003)。Sica等，(2003年4月)提交至EMBL/GenBank/DDBJ数据库。

表4B：TNF家族成员的核苷酸和/或氨基酸序列的参考文献

 

配体	参考文献
		OX40L	Baum等，Circ.Shock 44：30-34(1994)。Miura等，Mol.Cell.Biol.11：1313-1325(1991)。Godfrey等，J.Exp.Med.180：757-762(1994)。
4-1BBL	Alderson等，Eur.J.Immunol.24：2219-2227(1994)。
		CD40L	Graf等，Eur.J.Immunol.22：3191-3194(1992)。Hollenbaugh等，EMBO J.11：4313-4321(1992)。
CD27L(CD70)	Goodwin等，Cell 73：447-456(1993)。
		CD30L	Smith等，Cell 73：1349-1360(1993)。
LIGHT	Mauri等，Immunity 8：21-30(1998)。
		GITRL	Gurney等，Curr.Biol.9：215-218(1999)。
BLyS	Moore等，Science 285：260-263(1999)。
		APRIL	Hahne等，J.Exp.Med.188：1185-1190(1998)。

抗原&感染剂

本发明的方法和组合物用于产生或增强对抗任何抗原或感染剂的免疫应答，包括对抗TAA、与感染剂相关的抗原和感染剂自身。根据本发明，将与靶向肿瘤或感染剂相关的抗原(或感染剂自身)呈现于免疫细胞，因此产生或增强免疫应答。

1.TAA

在一个实施方案中，抗原是TAA，并且本发明提供了有效产生或增强患者对抗肿瘤的免疫应答的癌症免疫治疗方法。根据该实施方案，本发明提供了降低肿瘤大小的方法和抑制肿瘤细胞生长的方法。

本发明对抗有用的代表性肿瘤细胞包括，但不限于，癌，其可以源自各种身体器官中的任一种，包括肺、肝脏、***、膀胱、胃、结肠、胰腺、皮肤等。癌可以包括产生于器官或腺体中的腺癌和源于鳞状上皮的鳞状细胞癌。可以治疗的其它癌症包括肉瘤，如骨肉瘤或骨源性肉瘤(骨)，软骨肉瘤(软骨)，平滑肌肉瘤(平滑肌)，横纹肌肉瘤(骨骼肌)，间皮肉瘤或间皮瘤(体腔的膜内层)，纤维肉瘤(纤维组织)，血管肉瘤或血管内皮瘤(血管)，脂肪肉瘤(脂肪组织)，神经胶质瘤或星形细胞瘤(脑中发现的神经***)，粘液肉瘤(原始胚胎***)，esenchymous或混合中胚层肿瘤(混合的***类型)。除了骨髓瘤，还易于治疗白血病和淋巴瘤。

已经鉴定了多种与特定肿瘤类型相关的TAA。这些包括人末端酶逆转录酶(hTERT)，survivin，MAGE-1，MAGE-3，人绒膜***，癌胚抗原，α胎蛋白，胰腺癌胚抗原，MUC-1，CA125，CA15-3，CA19-9，CA549，CA195，***特异性抗原；***特异性膜抗原，Her2/neu，gp-100，突变K-ras蛋白，突变p53，截断的上皮生长因子受体，嵌合蛋白^p210BCR-ABL；人***瘤病毒的E7蛋白，和EB病毒的EBNA3蛋白。可以根据本发明使用这些抗原中的任一种，其抗原片段和抗原和/或片段的混合物来产生或增强患者的抗肿瘤免疫应答。表5列出了示例性TAA以及与这些TAA相关的疾病。

表5.

 

抗原	疾病
		cTAGE-1和变体	皮肤T细胞淋巴瘤
BLA或鞘糖脂(Pk抗原)	Burkitt’s淋巴瘤
		人T细胞白血病病毒相关的细胞膜抗原(HTLV-MA)	成人T-细胞白血病淋巴瘤(ATL)
胸腺细胞表面抗原JL1	大部分的急性白血病
		成人T细胞白血病相关的人逆转录病毒相关的抗原(ATLA)	成人T细胞白血病
EB病毒(EPV)抗原	Burkitt’s淋巴瘤，霍奇金氏疾病
		间变型淋巴瘤激酶(ALK)	CD30+间变型大细胞淋巴瘤
融合蛋白(NPM/ALK和变体)	(ALCL)
		常见急性成淋巴细胞白血病抗原(CALLA)	大部分急性成淋巴细胞白血病
免疫球蛋白Id；II型糖蛋白(例如，HM1.24；KW-2，KW-4，KW-5，KW-12)；癌胚抗原未成熟层粘连蛋白受体蛋白(OFA-iLRP)；EBV蛋白(例如，LMP2A)	淋巴增殖性疾病

例如，可以在Novellino等，“A listing of human tumor antigensrecognized by T cells：March 2004 update”(由T细胞识别的人肿瘤抗原的列表：2004年3月更新)Cancer Immunology and Immunotherapy，54：187-207(2005)中找到由T细胞识别的其它人TAA，在此将其引入作为参考。对应于这些疾病的动物correllaries以及对应于其它动物疾病的许多动物TAA是本领域已知的并包括在本发明的范围之内。

在本发明的一个实施方案中，TAA选自人末端酶逆转录酶(hTERT)和survivin，作为TAA。在>85％人癌症中表达hTERT，尽管其表达限于正常组织中。参见，例如，Vonderheide等，Immunity 1999，10：673-79。相似地，survivin，已经鉴定为凋亡抑制剂，在正常组织中不存在，但在大部分肿瘤类型中得到表达，包括肺、结肠、胰腺、***和***癌中。参见，例如，Ambrosini等，Nat.Med.1997，3：917-21。因为这些TAA在大部分癌症类型中得到表达，并且在正常组织中很少或不存在，因此对于根据本发明的癌症免疫治疗方法中的使用是有吸引力的抗原。

在本发明的另一个实施方案中，TAA与***相关。全世界每年大概有500,000名妇女产生***并且是妇女癌症死亡的第二大诱因。***与人***状瘤病毒引起的生殖器病毒感染直接相关并且是全世界的健康问题。在大概一半的***中特别发现了16型HPV。生殖器16和18型HPV，以及不太常见的31、33、35、45、51和56型，也涉及***和其它***与生殖器癌症的病原学。癌细胞中发现的HPV类型在体外研究中具有转化活性，并且病毒转化蛋白，E6和E7(也称为“早期”蛋白)在***细胞系和HPV-相关癌症中得到组成型表达。已知E6和E7各自结合肿瘤抑制剂p53和成视网膜细胞瘤(Rb)。在HPV相关恶性转化中，后期基因(L1和L2)和一些早期基因(E1和E2)通常丢失，留下E6和E7作为癌中通常发现的唯一开放阅读框。E6和E7的表达很可能胜过了通常由蛋白如p53和Rb的介导的细胞增殖的调节，使其不受控制地生长并提供了恶性转化的潜能。

因此，根据本发明的一个特定实施方案，TAA是E6和E7中的一个或多个。根据本发明的E6和E7的使用给予了几个优势。首先，E6和E7在大部分***中得到组成型表达。其次，尽管大部分肿瘤抗原源自正常的蛋白质或突变的自体蛋白，E6和E7是完全的外源病毒蛋白，并且比突变蛋白带有更多的抗原肽或抗原决定部位。第三，E6和E7在恶性表型的诱导和维持中起着重要作用，而如果没有功能性E6和E7，这些细胞将不再是致癌的。

来自不同物种(例如，人，牛)的E6和E7蛋白的核苷酸和氨基酸序列和用于不同***状瘤病毒类型(例如，HPV 16和18)是本领域已知的。参见，例如，http://www.stdgen.lanl.gov/stdgen/virus/hpv/index.html.的HPV序列数据库。HPV 16 E6、HPV 16 E6变体和E7的氨基酸各自列于图6A(SEQ ID NO：11)、6B(SEQ ID NO：12)和6C(SEQ ID NO：13)中。

2.感染剂

本发明对抗有用的代表性感染剂包括，但不限于，任何病毒、细菌、真菌或原生动物。表6列出了感染剂的实例。

表6

人和禽流感、HIV、丙肝、肺结核、西尼罗河病毒、隐球菌(脑膜炎)、疱疹、衣原体和炭疽是代表性的感染剂。根据本发明可以使用与感染剂相关的任何抗原。

根据一个实施方案，将感染剂自身用于根据本发明的缀合物中。根据该实施方案，使用包括感染剂如病毒和结合对成员的缀合物。可以使用任何感染剂，如病毒，包括人和禽流感病毒或HIV，或任何其它病毒。可以将感染剂改良或减毒来降低或消除其传染力。

只为了说明的目的，参照流感更详细地描述了本发明的这个方面。流感是由流感病毒引起的接触传染病，通常引起鼻子、喉咙和肺中的症状，以及发热、头疼、疲劳和头疼。还导致了并发症，如肺炎、支气管炎或窦和耳朵感染或恶化的慢性病症。将流感病毒分为A、B或C型。属于A和B型的菌株在群体中循环并与大部分人流感病例相关。A型流感在人群中引起无法抵挡的大部分的公共健康问题。

根据其两个蛋白的组成将A型流感病毒亚分类；血凝素(H)，促进病毒结合并进入目标细胞的蛋白，和神经氨酸酶(N)，涉及新形成的病毒颗粒从受感染细胞中释放出来并通过身体来传播。已经鉴定出十四个血凝素亚型(H1-H15)和9个神经氨酸酶亚型(N1-N9)。人群中大的流感爆发由单个血凝素亚型(H1、H2和H3)和两个神经氨酸酶亚型(N1和N2)引起。例如，1918年的流感病毒的血凝素是H1，其神经氨酸酶是N1，因此称为H1N1亚型。其它的爆发包括1975年的H2N2亚型，1968年的H3N2亚型，和最近在东南亚、中国以及现在在欧洲和中东在鸟类和人类中爆发的H5N1。

流感A病毒经常通过涉及血凝素和神经氨酸酶的反应或抗原位点的突变或改变的机理，或一个血凝素或神经氨酸酶亚型由另一个亚型的突发替代来发展。这些机理形成新的病毒亚型并使流感病毒逃避免疫***的防御并传播。每年都会出现流感A病毒的抗原变体，并且基于世界卫生组织正在进行的流感病毒国际监视，需要最新的疫苗制剂。由于这种新流感病毒亚型不断出现的现象，如近些年的H5N1，预期将会发生更大的流感爆发。在特定的似是而非的生物***情况中，将实验室产生的病毒进行相似的设计来实现抗原改变，并因此引起逃避已建立的宿主防御的爆发。

本发明的缀合物可以用于流感疫苗中，流感疫苗容易生产并可快速制造，可以基于当前的健康需要来改变和更新其抗原成分，而没有任何困难，其选择性地靶向病毒机构和受感染的细胞，并且对于治疗性效果，可以注射后给予，以及注射前给予，用于预防。

因此，根据一个实施方案，将流感抗原(或其抗原片段)用作本发明缀合物的抗原成分。例如，抗原可以包括一个或多个H1和N1(都是高度致免疫的)和/或一个或多个核蛋白(NP)和基质蛋白1(MP1)和/或基质蛋白2(MP2)(全部是高度保守的结构蛋白)。根据本发明，来自流行株如H5的蛋白，也可以用作抗原。尽管不希望收到任何理论的束缚，胞内蛋白如NP和MP2可以提供更通用的疫苗，因为它们呈现出几乎没有改变，并因此防止异种病毒感染，而不需要每年调整。例如，NP在流感A分离物中呈现出>90％的蛋白序列同源性，并含有占优势的细胞毒性T细胞目标抗原决定部位。本发明中有用的其它流感抗原包括PA、PB1和PB2(RNA聚合酶亚基)以及NS1和NS2(干扰素应答抑制剂和RNP核输出)。请参阅，Brown，2000，Biomed.Pharmacother.54：196-209；Steinhauer等，2002，36：305-32；De Jong等，2000，40：218-28；Alexander，Vet.Microbiol.74：3-13。

因此，根据一个实施方案，将A型流感血凝素蛋白(或其抗原片段)用作本发明缀合物的抗原成分。目前通过皮下注射含有H作为主要成分的流感疫苗来获得流感的预防。例如，来自流感病毒A/PuertoRico/8/34(PR8)(N1H1)的H1是主要的循环H蛋白，且已经得到充分的表征，并可以根据本发明来使用。在另一个实施方案中，将A型流感神经氨酸酶蛋白(或其抗原片段)用作缀合物的抗原成分。将包括含有H-蛋白的缀合物或含有N-蛋白的缀合物的组合物用作对抗流感的疫苗。(例如，目前的流感疫苗包括作为主要成分的H蛋白，并且已经显示出能诱导足够的免疫力来预防同源病毒的流行)。或者，给予包括H蛋白的缀合物和包括N蛋白的缀合物两者，或抗原的任意组合物，如可变和保守抗原的组合物将是有利的。通过给予两种或多种组合物来实现这，每个组合物包括含有单个抗原的缀合物，或在单个组合物中提供两个或多个缀合物(并因此提供两个或多个抗原)来实现这。在一个实施方案中，基于目前的公共健康需要来选择缀合物的抗原成分。

在一个实施方案中，缀合物包括4-1 BBL作为免疫共刺激多肽。尽管不希望受到任何理论的束缚，认为将该缀合物体内给予患者时，将通过DC上的4-1 BBL和4-1 BB之间的相互作用来结合DC，使得疫苗内在化和流感抗原在DC的表面上递呈，以及DC的激活和成熟。DC的激活随后导致与CD8和CD4T细胞的相互作用并激活这些细胞。然后，激活的CD4 T细胞与B细胞反应，并使它们激活和分化成分泌抗体的细胞，导致体液应答。CD8 T细胞的激活还导致更多的CD8 T细胞的分化和增殖，其用来杀灭受病毒感染的细胞。缀合物还可以直接结合激活的CD8和CD4 T细胞，表达4-1 BB受体，并进一步扩大信号。此外，缀合物(通过4-1 BBL)可以直接结合激活的自然杀伤(NK)细胞，其也用来杀灭受病毒感染的细胞，这些全部导致更强的免疫应答。因此，缀合物将产生细胞和体液应答，支持其在治疗性和预防性疫苗中的功效。

本领域技术人员可以以类似的方法来选择用作对抗其它感染剂疫苗的缀合物的抗原成分，基于与这些感染剂相关的抗原。例如，与HIV相关的抗原包括HIV包膜gp120抗原决定部位(例如，可变环，如V3)，或其它HIV蛋白，如Gag蛋白(Pr55^gag、基质p17、衣壳p24、核衣壳p7)、p5；Pol(聚合酶)、Vif(病毒传染力因子p23)；Vpr(病毒蛋白R p15)；Rev(病毒基因表达的调节剂p19)；Vpu(病毒蛋白U)；Env(gp160、gp120、gp41)；Tat(转录激活子p14)；和负效应物p24)。参见，例如，Peters，201.Vaccine 2：688-705；Michael，2003，Clin.Med.3：269-72；Gandhi & Walker，2002，Ann.Rev.Med.53：149-72；Haseltine，1991，FASEB 5：2349-60。疫苗中有用的其它抗原包括b型流感嗜血杆菌(Haemophilius influenzae)的荚膜多糖、脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)的荚膜多糖、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的荚膜多糖、乙肝的表面抗原，以及失活的白喉外毒素和破伤风毒素。参照如上所述的流感抗原，根据本发明来使用这些抗原。

结合对

示例结合对是生物素和链霉抗生物素蛋白(SA)或抗生物素蛋白。还可以使用保持对生物素的基本结合活性的SA或抗生物素蛋白片段，如各自至少50％或更多天然SA或抗生物素蛋白的结合活性。这样的片段包括“核心链霉抗生物素蛋白”(“CSA”)，全长链霉抗生物素蛋白多肽的截断形式，其包括链霉抗生物素蛋白残基13-138、14-138、13-139和14-139。参见，例如，Pahler等，J.Biol.Chem.1987.262：13933-37。还可以使用保持强烈结合生物素的其它链霉抗生物素蛋白和抗生物素蛋白的截断形式。参见，例如，Sano等，J Biol Chem.1995年11月24日，270(47)：28204-09(描述了核心链霉抗生物素蛋白变体16-133和14-138)(U.S.专利no.6.022,951)。还可以使用保持基本生物素结合活性或提高的生物素结合活性的链霉抗生物素蛋白突变体和链霉抗生物素蛋白核心形式。参见，Chilcoti等，Proc Natl Acad Sci U S A.1995 Feb28；92(5)：1754-8；Reznik等，Nat Biotechnol.1996年8月；14(8)：1007-11。例如，可以使用具有降低免疫原性的突变体，如通过定点诱变除去潜在的T细胞抗原决定部位或淋巴细胞抗原决定部位突变的突变体。参见Meyer等，Protein Sci.200110：491-503。同样，也可以使用保持基本生物素结合活性或提高的生物素结合活性的抗生物素蛋白的突变体和抗生物素蛋白的核心形式。参见，Hiller等，J.Biochem.(1991)278：573-85；Livnah等，Proc Natl Acad Sci USA(0：5076-80(1993)。为了方便，在此刻的描述中，如在此所用的术语“抗生物素蛋白”和“链霉抗生物素蛋白”包括这些结合对成员的生物素结合片段、突变体和核心形式。抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白可从商业供应商获得。此外，可以找到编码链霉抗生物素蛋白和抗生物素蛋白的核酸序列以及链霉抗生物素蛋白和抗生物素蛋白氨基酸序列，例如，在GenBank登录号No.X65082；X03591；NM_205320；X05343；Z21611和Z21554。

如在此所用的“生物素”包括能够结合表面如细胞表面(包括肿瘤细胞表面)的含生物素部分，如NHS-生物素和EZ-Link^TM Sulfo-NHS-LC-生物素(Pierce)。这样的生物素的蛋白反应性形式是可购得的。

在本发明的范围中，生物素及其结合伴侣抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白之间的相互作用赋予了几个优势。例如，生物素对于链霉抗生物素蛋白(10¹³M^-1)和抗生物素蛋白(10¹⁵M^-1)具有非常高的亲和性。此外，链霉抗生物素蛋白和抗生物素蛋白是各自结合四个生物素分子的四聚合多肽。因此，包括链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白的免疫共刺激部分具有形成四聚物和高级结构的趋势。因此，它们可以交联其对应的免疫细胞受体，用于更有效的信号转导，如通过受体的累积。

本领域技术人员将认识到可以使用其它机理(例如，其它缀合方法，例如使用其它连接部分或化学或基因交联)来提供免疫共刺激分子的高阶结构，如包括免疫共刺激分子的二聚物、三聚物、四聚物和高阶多聚物的缀合物，其同样呈现出有利的特性。这样的缀合物包括在本发明的范围内。

缀合物

可以通过本领域公知的方法来形成包括免疫共刺激多肽、抗原或感染剂和结合对成员的缀合物。例如，可以将多肽/抗原/感染剂和结合对成员相互共价结合或相互直接缀合或通过连接物相互缀合。根据一个实施方案，多肽/抗原/感染剂和结合对成员是融合蛋白的成分。可以通过本领域已知的各种不同方法中的任一种来制备融合蛋白。例如，可以化学合成或使用公知的重组核酸技术产生融合蛋白的一种或多种成分多肽。(如在此所用的，“核酸”指的是RNA或DNA)。例如，可以使用聚合酶链式反应(PCR)来获得本发明中有用的核酸序列。例如，各种PCR方法描述于PCR Primer：A Laboratory Manual(PCR引物：实验室手册)，Dieffenbach 7 Dveksler编辑，Cold Spring HarborLaboratory Press，1995。

根据一个实施方案，免疫共刺激多肽通过其C-端与结合对成员的N-端结合。例如，免疫共刺激多肽通过其C-端结合核心链霉抗生物素蛋白(CSA)的N-端。因此，本发明包括CD80-CSA融合蛋白，其中CD80部分通过其C-端结合CSA的N-端。根据另一个实施方案，免疫共刺激多肽通过其N-端与结合对成员的C-端结合。例如，免疫共刺激多肽通过其N-端结合CSA的C-端。例如，本发明包括CSA-4-1 BBL、CSA-LIGHT、CSA-CD40L和CSA-OX40L融合蛋白，其中CSA部分通过其C-端结合免疫共刺激多肽的N-端。免疫共刺激多肽可以直接与结合对成员结合或通过一个或多个连接部分如一个或多个连接多肽与结合对成员结合。

根据一个实施方案，将免疫共刺激多肽、抗原或感染剂生物素化。可以通过本领域已知的方法来形成生物素化的缀合物，并在以下的实施例中举例说明。

例如，可以使用来自Avidity，Inc.(Denver，CO)的生物素AviTag技术来产生生物素化的蛋白质或感染剂。生物素AviTag由独特的15个氨基酸肽构成，该肽由生物素连接酶BirA识别，将生物素连接肽序列中的赖氨酸残基。Schatz，1993，Biotechnology，11：1138-43。生物素AviTag可以在遗传上与任何目标蛋白融合，使蛋白质受到生物素分子的标记。

生物素AviTag技术的一个潜在缺陷是低程度生物素化的可能性，因为***在标记片段中的单个唯一赖氨酸残基处生物素化蛋白质。为了克服这样的问题，可以使用纯化的生物素连接酶在体外修饰纯化的标记蛋白。因为是通过酶进行的生物素化，反应条件是比较温和的，标记是高度特异性的，并且反应比使用生物素衍生物的蛋白质化学修饰更有效。或者，可以使用Jordan等，2003，Clin.Diag.Lab.Immunol.10：339-44中所述的方法来产生遗传工程化的生物素化蛋白。

免疫共刺激多肽、结合对成员、抗原或感染剂的片段在本发明中是有用的，只要片段保持参照的全长部分的活性。因此，例如，免疫共刺激多肽片段应当保持其免疫共刺激活性(例如，保持其结合其受体或配体的能力)，结合对成员片段应当保持其结合其结合伴侣的能力，而抗原或感染剂片段应当保持其诱导对抗参照全长抗原或感染剂的免疫应答的能力。可以通过本领域的常规方法筛选保持活性的片段。以上列出了免疫共刺激多肽的示例性片段。

缀合物可以在结合对成员和免疫共刺激多肽、抗原或感染剂之间包括连接物，如肽连接物。可以选择连接物的长度和组成来增强缀合物的任一或两个功能端的活性(例如，共刺激多肽/抗原、感染剂或结合对成员)。连接物通常为约3至约15个氨基酸长，更优选约5至约10个氨基酸长，然而，可以使用更短或更长的连接物，或可以全部分配连接物。在这点上，可以使用已经用来连接单链抗体的重链和轻链的弹性连接物(例如，(Gly₄Ser)₃)。参见，Huston等(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA，85：5879-5883；U.S.专利No.5,091,513，5,132,405，4,956,778；5,258,498和5,482,858。其它连接物是FENDAQAPKS或LQNDAQAPKS。免疫球蛋白Fc片段的一个或多个结构域(例如，CH1、CH2和/或CH3)也可以用作连接物。还可以使用化学连接物。

修饰的、改变的或突变的核酸和多肽在本发明中也是有用的，只要它们保持参照核酸或多肽的活性。例如，适用于本发明的核酸和多肽序列与参照核酸或多肽，即，与编码已知免疫共刺激多肽或结合对成员的核酸序列，具有至少约80％的序列同一性(包括至少80％的序列同一性)。在一些实施方案中，核酸序列或多肽与参照核酸或多肽具有至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的序列同一性。

本发明包括碱基改变“沉默”的核酸，因为它们编码相同的氨基酸(即。简并核酸序列)。本发明还包括编码具有保守氨基酸置换的多肽的核酸，以及这样的多肽。保守氨基酸置换(例如，用不同的疏水性残基替代一个疏水性残基)是本领域公知的并可以例如通过点突变等来实现。可以使用本领域已知的受体结合和/或生物筛选方法来证实给定的修饰序列、变体或突变体的适用性，如以上关于片段所述的那些方法。

如在此所用的，通过测定比对的核酸或多肽序列中配对位置的数量，将配对位置的数量除以比对核苷酸或氨基酸各自的总数并乘以100来计算“％序列同一性”。配对的位置指的是在比对序列的相同位置出现相同核苷酸或氨基酸的位置。比对核苷酸或氨基酸的总数指的是比对第二个序列需要的核苷酸或氨基酸的最小数量，并不包括非同源序列的比对(例如，强迫的比对)，如可以在目标序列的N-端或C-端融合的那些序列(即，编码免疫共刺激多肽或结合对成员的序列)。比对核苷酸或氨基酸的总数可以对应于完整的编码序列，或可以对应于全长序列的片段，如在此所限定的。

可以使用Altschul等(1997，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402)描述的算法来比对序列，因为引入了BLAST(基本局部比对搜索工具)程序中，在环球网的ncbi.nlm.hih.gov可获得。可以进行BLAST搜索或比对来测定核酸分子(“询问序列”)和任何其它序列或其片段之间的百分比序列同一性，使用Altschul算法。可以使用BLASTN来比对和比较核酸序列之间的同一性，而使用BLASTP来比对和比较氨基酸序列之间的同一性。使用BLAST程序计算编码治疗性多肽的核酸序列与另一个序列之间的百分比同一性时，可以使用各自程序的缺省参数，包括缺口惩罚的缺省。

可以通过如DNA或RNA印迹分析(即，杂交)、PCR或原位杂交分析这样的方法来检测本发明的核酸。通常通过转染细胞系中的免疫细胞化学或通过十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳接着考马斯蓝染色或蛋白质印迹分析来检测多肽，使用具有特定多肽的特异性结合亲和性的抗体(单克隆或多克隆)。这些方法中的许多更详细地描述于Sambrook等(1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。

编码免疫共刺激多肽和结合对成员的核酸序列可以在构建体中可操作地相互连接，使用常规的分子生物学技术。参见，例如，MolecularCloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)(Sambrook等，2001，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press)或Short Protocolsin Molecular Biology(分子生物学的简洁实验方案)(Ausubel等，2002，第5版，Current Protocols)。适用于这些方法中的构建体是可购得的并是本领域日常使用的。构建体可以包括表达需要的序列，如启动子序列，调控序列，如增强子序列，和应答序列和/或可诱导的序列，调节核酸序列的表达。如在此所用的，“可操作地连接”指的是(i)以指导或调节核酸表达的方式相对于核酸序列来放置启动子和/或其它调控序列；和/或(ii)放置编码免疫共刺激多肽的核酸和编码结合对成员的核酸，使得编码序列“在框内”，即，使得构建体编码包括免疫共刺激多肽和结合对成员的融合蛋白。

可以通过本领域已知的方法将构建体繁殖或表达，以在宿主细胞内产生多肽。如在此所用的，术语“宿主”或“宿主细胞”意思是不仅包括原核生物，如大肠杆菌，而且包括真核生物，如酵母、昆虫、植物和动物细胞。动物细胞包括，例如，COS细胞和HeLa细胞。可以用DNA分子(例如，构建体)转化或转染宿主细胞，使用本领域技术人员公知的任一种技术，如磷酸钙或醋酸锂沉淀、电穿孔、脂转染和微粒轰击。含有本发明载体的宿主细胞可以用于如繁殖载体、生产核酸(例如，DNA或RNA)、表达免疫共刺激多肽或其片段或表达融合蛋白的目的，如上所述。

图1A & 1B、2A & 2B、3A & 3B、4A & 4B、5A & 5B和7A & 7B显示了代表性的核酸序列(SEQ ID NO.1、3、5、7、9&14)，这些序列包括包含核心链霉抗生物素蛋白和免疫共刺激多肽的免疫共刺激部分的编码序列，以及相应编码的氨基酸序列(SEQ ID NO.2、4、6、8、10 & 15)。

免疫治疗

本发明的一个实施方案提供了产生或增强对抗第一抗原或感染剂的免疫应答的方法，通过将(a)第一缀合物和(b)第二缀合物给予需要的患者，第一缀合物包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的缀合物成员，而第二缀合物包括(i)包括第一抗原或感染剂的缀合物成员和(ii)包括结合对的第二个成员的缀合物成员。在可替换的实施方案中，用第一和第二缀合物处理免疫细胞，然后给予患者。如上所述，可以使用任何免疫共刺激多肽和与肿瘤或感染剂相关的任何抗原(或感染剂自身)，同样可以使用任何结合对。

本发明包括使用嵌合共刺激分子，使用或不使用与目标抗原的缀合。

在将缀合物直接给予患者的实施方案中，可以同时或在不同时间按次序给予第一缀合物和第二缀合物。在一个实施方案中，在给予患者之前，通过结合对成员的结合活性将缀合物结合在一起。例如，可以在体外混合第一和第二缀合物并在单个组合物中给予。在另一个实施方案中，首先给予第一缀合物，接着在足以使免疫共刺激多肽结合免疫细胞的时间后，给予第二缀合物。例如，时间段可以为一至几小时，一天至数天，一周或更长。

可以将第一或第二缀合物全身或局部给予患者，如通过静脉内、鼻内、腹膜或皮下注射。在一个实施方案中，通过直接注射至肿瘤部位，如通过肿瘤内注射，或注射至局部感染部位，来局部给药一个或多个组合物。在另一个实施方案中，通过不同的途径来给药一个或多个组合物。例如，可以局部给药一个或多个组合物，而全身给药一个或多个组合物。

在缀合物用来处理随后直接给予患者的免疫细胞的实施方案中，用第一和第二缀合物同时或在不同的时间按次序处理免疫细胞。在一个实施方案中，在用于处理免疫细胞之前，第一和第二缀合物通过结合对成员的结合活性结合在一起。例如，可以将第一和第二缀合物混合在单个组合物中并用来在体外处理免疫细胞，如通过将免疫细胞接触组合物。在另一个实施方案中，用第一缀合物处理免疫细胞，一段时间后用第二缀合物处理。该时间段，例如，为一至几小时，一天至几天，一周或更长时间。通过上述的任何方式将处理过的免疫细胞给予患者，包括全身或局部给药，如肿瘤内注射或注射至局部感染的部位中。

根据一个实施方案，该方法进一步包括给予第三缀合物或用第三缀合物来处理免疫细胞。在一个实施方案中，第三缀合物包括(i)包括免疫共刺激多肽的缀合物成员和(ii)包括与肿瘤或感染剂相关的第二抗原或感染剂自身的缀合物成员。第三缀合物的免疫共刺激多肽可以与第一缀合物的免疫共刺激多肽相同或不同，第二抗原可以与第一抗原相同或不同。在该实施方案的特定方面，免疫共刺激多肽和第二抗原通过结合对成员与各自相连的免疫共刺激多肽和第二抗原的相互作用结合在一起。根据该实施方案，第三缀合物的第一个和第二个结合对成员可以与第一和第二缀合物的第一个和第二个结合对成员相同或不同。

在一个实施方案中，第一缀合物包括结合组成型受体的免疫共刺激多肽，如CD80、LIGHT和CD40L，而第三缀合物包括结合诱导型受体的免疫共刺激多肽，如4-1 BBL和OX40L。

以下的表7提供了组成型和诱导型共刺激分子的列表。

表7

 

组成型	诱导型
		CD80-CSA	CSA-4-1BBL
CSA-CD40L	CSA-OX40L
		CSA-LIGHT	PD-L1-CSA
	GL50-CSA

可以通过测定肿瘤细胞增殖和/或肿瘤大小的降低来测试癌症免疫治疗的功效。肿瘤细胞的数量不是静止的，并且反应出经受细胞***的细胞数量和细胞死亡数量(例如，通过凋亡)。提高个体对抗肿瘤细胞的免疫应答可以抑制细胞的增殖。在此所用的肿瘤细胞的增殖指的是给定时间段内(例如，几小时，几天，几周或几个月)肿瘤细胞数量的增加(在体外或在体内)。可以通过肿瘤细胞增加速率的降低、肿瘤细胞的完全失去或其中增殖的任何降低来测量肿瘤细胞增殖的抑制。实体肿瘤大小的降低是肿瘤细胞增殖抑制的表征。

通过免疫共刺激多肽(如4-1 BBL)与其受体的相互作用，通过提供将TAA特异性靶向DC的能力，本发明赋予了超过现有癌症疫苗的优势。此外，本发明提供了可以通过注射给予患者并通过DC在体内吸收的疫苗，使得抗原递呈和激活，而不需要DC的分离和ex vivo操纵或使用基因治疗。

可以通过测定患者的感染负荷，已经通过测定临床终点，如发烧或肿胀，来测定免疫治疗对抗传染的功效。

根据本发明的抗生物素蛋白/生物素结合对的使用(或提供高阶免疫共刺激分子的其它机理)赋予了更多的优势：提供了四聚体结构(或其它多聚体结构)，该结构允许免疫共刺激受体交联，用于更强的应答，并允许多个抗原分子传送至DC。在一个实施方案中，结合对的第一个成员，即，第一缀合物(包括第一免疫共刺激多肽)的结合对成员是抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或核心链霉抗生物素蛋白，而结合对的第二个成员，即，第二缀合物的结合对成员(包括第一抗原或感染剂)是生物素。在另一个实施方案中，结合对的第一个成员是生物素，而结合对的第二个成员是抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或核心链霉抗生物素蛋白。

将4-1 BBL用作免疫共刺激多肽可以给予更多的优势，因为用4-1 BBL刺激DC显示出使T_reg细胞的抑制功能无效，T_reg细胞在免疫***的肿瘤逃避中起着主要作用。因此，本发明包括4-1 BBL和TAA的缀合物将TAA传送至DC，用于有效的递呈，激活DC，用于产生各种细胞因子，并使T_reg细胞的功能无效，同时加强Teff和NK细胞的功能，用于肿瘤根除。

修饰的免疫细胞

本发明还提供了可用于上述免疫治疗方法中的修饰免疫细胞，及其制备方法。根据本发明的这个方面，提供了修饰免疫细胞来产生或增强对表达第一抗原相关抗原的肿瘤或对感染剂的免疫应答的方法。该方法包括将表达第一免疫共刺激多肽受体的免疫细胞接触(a)第一缀合物和(b)第二缀合物，第一缀合物包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的缀合物成员；第二缀合物包括(i)包括与肿瘤或感染剂相关的抗原或感染剂的缀合物成员和(ii)包括结合对的第二个成员的缀合物成员。根据该方法，通过免疫共刺激多肽和受体之间的结合将第一缀合物与免疫细胞缀合，通过第一个和第二个结合对成员之间的结合将第二缀合物与免疫细胞缀合。

可以通过任何方式将免疫细胞与第一和第二缀合物接触，并可以在体内或在体外来实现这。例如，体内方法可以包括将第一和第二缀合物给予含有免疫细胞和含有肿瘤或感染剂或处于含有肿瘤或感染剂风险中的患者。根据该方法，可以基本上同时(在相同或分开的组合物中)或按次序(在分开的组合物中)来给予第一和第二缀合物。在患者含有肿瘤的一个实施方案中，通过肿瘤内注射来给予第一和第二缀合物中的至少一个。

示例性的体外方法可以包括将免疫细胞在体外接触第一和第二缀合物，如通过接触包括第一和第二缀合物的单个组合物，或接触各自包括第一和第二缀合物的第一个和第二个组合物。在单个组合物中提供缀合物时，它们可以通过组合物中提供的第一个和第二个结合对成员之间的结合而结合在一起。

在本发明的这个方面中，可以使用任何免疫共刺激多肽、抗原或感染剂，以及结合对成员，包括上述的每一种。

根据该方法可以修饰表达第一免疫共刺激多肽受体的任何免疫细胞。在一个实施方案中，免疫细胞是T细胞或嗜中性粒细胞。示例性T细胞包括CD4+细胞，CD8+细胞，自然杀伤细胞，单核细胞和树突细胞。

在本发明这个方面的更多实施方案中，免疫细胞包括第二免疫共刺激多肽的受体，并且该方法进一步包括将免疫细胞与第三缀合物接触，第三缀合物包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的第一缀合物成员和(ii)包括与肿瘤或感染剂相关的抗原(或感染剂自身)的第二缀合物成员。在这个实施方案中，第二免疫共刺激多肽可以和第一免疫共刺激多肽相同或不同，而第二抗原，如果存在，可以和第一抗原(如果存在)相同或不同。在另一个特定的实施方案中，第一和第二缀合物成员各自进一步包括第一个和第二个结合对成员。根据该实施方案，第三缀合物的第一个和第二个结合对成员与第一和第二缀合物的第一个和第二个结合对成员相同或不同。此外，第一缀合物成员可以通过第一个和第二个结合对成员之间的结合与第二缀合物成员结合。

象如上所述的第一和第二缀合物一样，第三缀合物可以含有任何免疫共刺激多肽、抗原或感染剂以及结合对成员，包括本文描述的任意那些。

在相关方面中，本发明提供了通过该方法制得的免疫细胞群。与其它的免疫细胞接触时，这样的免疫细胞产生或增强对肿瘤的免疫应答。

本发明还提供了表达第一免疫共刺激多肽受体的修饰免疫细胞，其中用(a)第一缀合物和(b)第二缀合物来修饰修饰的免疫细胞，第一缀合物包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的缀合物成员；第二缀合物包括(i)包括第一抗原或感染剂的缀合物成员和(ii)包括结合对的第二个成员的缀合物成员。根据该实施方案，通过免疫共刺激多肽和受体之间的结合将第一缀合物与免疫细胞缀合，通过第一个和第二个结合对成员之间的结合将第二缀合物与免疫细胞缀合。

按照上述的方法，在本发明的这个方面中，可以使用任何免疫共刺激多肽、抗原或感染剂，以及结合对成员，包括上述的每一种。

此外，根据该方法，可以修饰表达第一免疫共刺激多肽受体的任何免疫细胞。在一个实施方案中，免疫细胞是T细胞或嗜中性粒细胞。示例性T细胞包括CD4+细胞、CD8+细胞、自然杀伤细胞、单核细胞和树突细胞。

免疫刺激部分

本发明还提供了具有免疫刺激活性的免疫刺激部分。单独给药时，或用作佐剂结合抗原或其它免疫刺激剂给药时，免疫刺激部分是有用的。例如，在疫苗、癌症免疫治疗以及基于免疫失调的治疗中，免疫刺激部分是有用的。可以将免疫刺激部分配制于适用于给予动物的组合物中，并可以给予需要免疫刺激的动物，如接受疫苗、癌症免疫治疗或经受基于免疫失调治疗的动物。

根据一个实施方案，免疫刺激部分包括上述免疫共刺激多肽的任一种，如4-1 BBL、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80和CD40L。在另一个实施方案中，免疫共刺激多肽选自4-1BBL、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF和APRIL。再一个实施方案中，免疫共刺激多肽是4-1 BBL。

根据该实施方案的一个特定方面，免疫刺激部分进一步包括链霉抗生物素蛋白或核心链霉抗生物素蛋白。例如，免疫刺激部分可以是包括免疫刺激多肽和核心链霉抗生物素蛋白的缀合物或融合蛋白。

在另一个实施方案中，免疫刺激部分基本上由免疫共刺激多肽和链霉抗生物素蛋白或核心链霉抗生物素蛋白构成。根据该实施方案，免疫刺激部分没有包括，或没有缀合或另外结合任何其它免疫刺激剂，如另一个免疫共刺激多肽或抗原。

本发明还包括免疫刺激方法，包括将免疫刺激部分给予需要免疫刺激的患者。在该方法的一个实施方案中，免疫刺激部分包括免疫共刺激多肽和链霉抗生物素蛋白或核心链霉抗生物素蛋白。在另一个实施方案中，免疫刺激部分基本上由免疫共刺激多肽和链霉抗生物素蛋白或核心链霉抗生物素蛋白构成。在进一步的实施方案中，该方法进一步包括将抗原给予患者，与免疫刺激部分的给药同时或按次序(之前或之后)。在同时给药的一些实施方案中，在单个组合物中给药免疫刺激部分和抗原，如包括免疫刺激部分和抗原的混合物。在同时给药的其它实施方案中，在分开的组合物给药免疫刺激部分和抗原。在一些实施方案中，作为上述的含抗原缀合物来给予抗原，如包括抗原和结合对成员的缀合物。在其它实施方案中，没有作为包括结合对成员的缀合物来给予抗原。

免疫刺激方法的另一个实施方案基本上由给予免疫刺激部分构成，免疫刺激部分基本上由免疫共刺激多肽和链霉抗生物素蛋白或核心链霉抗生物素蛋白构成。根据该实施方案，没有给予其它将与免疫刺激部分缀合或另外结合的免疫刺激剂，如另一个免疫共刺激多肽或抗原。因此，例如，没有给予生物素化的分子，如生物素化的细胞或包括生物素的蛋白质缀合物。

尽管不希望受到任何理论的束缚，认为本发明的免疫刺激部分刺激了细胞表面免疫受体及其配体之间的相互作用，因此促进了体液和细胞免疫应答。包括链霉抗生物素蛋白(或核心链霉抗生物素蛋白)的免疫刺激部分形成稳定的四聚体饱和寡聚物，其有效地结合受体并刺激B细胞、单核细胞和树突细胞，用于产生细胞因子、趋化因子和上调免疫刺激分子。

以下的实施例更详细地说明了本发明，并且不是用来限制本发明任何方面的范围。

实施例

实验方法

动物。成年近交BALB/c(H-2^d)和C57B/6小鼠购自JacksonLaboratories(Bar Harbor，Maine)。TCR转基因OT-I、DO11.10、C57BL/6.SJL动物购自Taconics(Germantown，NY)并依据NIH指导来饲养。

表达OVA的A20细胞的建立。OVA构建体获自刘易斯威尔大学的Dr.Tom Mitchell并直接克隆至用BglII和EcoRI限制的pcDNA3载体中(Invitrogen，San Diego，CA)。细菌转化并在氨苄青霉素培养基上选择后，将几个克隆接受迷你质粒制备并用BglII/EcoRI消化来鉴定阳性克隆。然后将含有***片段的克隆用于大的质粒制备，并根据制造商的说明使用Lipofectamine^TM2000(Invitrogen)试剂盒转染至A20细胞中。在含有G418(Geneticin)的培养基中选择细胞并使用蛋白质印迹、对抗OVA的抗体或T细胞增殖测试来测定OVA的表达。

TC-1可移植***模型的建立。在C57BL/6小鼠中建立TC-1肿瘤模型。通过用HPV-16 E6和E7以及激活的ras致癌基因共转化初级C57BL/6小鼠肺上皮细胞来产生致肿瘤的TC-1细胞系，并已经表征为人***的模型。TC-1细胞在同系C57BL/6小鼠中形成肿瘤。为了建立模型，将1×10⁵个肿瘤细胞移植至C57BL/6小鼠的右侧，并监控动物的肿瘤生长。

使用昆虫DES表达***的重组4-1BBL的表达和纯化。按照Singh等，2003，Cancer Res.63：4067-73中所述的使用果蝇DES表达***(Invitrogen；Carlsbad，CA)来建立表达4-1BBL的稳定转化子。在设定为25℃和105rpm的培养箱摇瓶中，在补充1mM硫酸铜的果蝇无血清培养基(Gibco；Carlsbad，CA)中诱导转化子的重组蛋白表达72小时。通过离心收集培养物上清液并接受大规模纯化，使用钴(II)-羧甲基天冬氨酸盐交联的琼脂糖固定的金属亲和性树脂(BD-Talon，BDBiosciences)或Ni-NTA金属亲和性树脂(Qiagen)，利用6x-His-标记物工程化至蛋白质中。

简而言之，通过逐滴加入95％乙醇产生10％乙醇的终浓度，来沉淀含有4-1 BBL的培养基，在4℃过夜孵育后，将沉淀的4-1BBL重新溶解于1/10的体积中，使用结合缓冲液(50mM磷酸钠pH7.0；500mM氯化钠；0.5％吐温-20；1％甘油；5mM 2-巯基乙醇)。使用5×凝胶床体积的结合缓冲液来平衡金属亲和性树脂，加入含有4-1 BBL的重新溶解的蛋白质溶液，并用颠倒旋转在室温孵育45分钟。用50-100ml洗涤缓冲液(50mM磷酸钠pH7.0；500mM氯化钠)将结合4-1 BBL的金属亲和性树脂洗涤2次。用2×凝胶床体积的洗脱缓冲液(50mM磷酸钠pH7.0；500mM氯化钠，150mM咪唑)从金属亲和性树脂洗脱结合的4-1 BBL。

合并纯化的4-1 BBL洗出液并装载于Amicon Ultra^TM(Millipore；Bedford，Mass)离心过滤装置中，使用30kD分子量截留膜。将离心过滤装置在3000rpm(2000×g)4℃离心15分钟。将无菌PBS加入截留物中，并将滤器在3000rpm(2000×g)再次离心。从离心过滤装置中吸出浓缩/脱盐的4-1BBL的截留物，置于无菌低温小瓶中，并储存在液氮中。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分离蛋白的纯度。根据制造商的说明使用BCA蛋白测定(Pierce)来测定蛋白质浓度。

生物素化的OVA的表达和纯化。将上述的OVA构建体亚克隆至来自Avidity，Inc.(Denver，CO)的pAN和pAC载体中，用来各自表达N-端以及C-端AviTag-蛋白质融合体。细菌转化并在氨苄青霉素培养基上选择后，将几个克隆接受最小质粒制备并用合适的限制酶消化来鉴定阳性克隆。将含有***片段的克隆用于大的质粒制备。将质粒用于转化AVB100大肠杆菌，这是具有稳定整合至染色体中的birA连接酶基因的菌株。用L-***糖诱导蛋白质表达，L-***糖用于带有生物素标记物的OVA的高水平表达。使用AviTag抗体琼脂糖纯化所表达的蛋白质。使用蛋白质印迹测定纯化OVA的浓度、内毒素水平和生物素化，并将碱性磷酸酶缀合的链霉抗生物素蛋白用于探测。如果需要，使用Detoxi-凝胶内毒素去除试剂盒(Pierce)除去内毒素。将生物素化的OVA缀合CSA-4-1BBL融合蛋白，并在体内增殖测试中使用OT-I TCR转基因细胞来测试，如下所述。将蛋白质等分并在-70℃直至使用。

增殖测试。对于体内增殖测试，从OT-I(OVA_257-264/K^b)TCR转基因动物收集脾脏和***细胞。用5μM CFSE(羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯)标记细胞并通过尾静脉注射将一百万个CFSE-标记的细胞转移至CD45.1⁺致癌B6-SJL小鼠中。24小时后，用单独的10μgOVA，与CSA或CSA-4-1BBL混合的OVA或缀合CSA或CSA-4-1 BBL的OVA激发动物。3天后收集脾脏和***细胞，并通过***gate中的CD8⁺CD45.1^-(OT-1)细胞群中的CFSE稀释分析来测定增殖。将从没有接受OVA蛋白的一些动物收集的细胞用来测定亲本群体，用于分析。

如下进行体外增殖测试：将来自BALB/c小鼠的CFSE标记的DO11.10(OVA_323-339/I-A^d)TCR转基因细胞用作应答剂，以不同的比例来对抗照射过的表达OVA的A20转染子，持续3天。收集培养物并在流式细胞术中分析增殖。

流式细胞术。使用标准程序进行流式细胞分析，首先滴定目标一抗和二抗，然后在流式细胞术使用最佳浓度。参见，例如，Mhoyan等，1997，Transplantation 64：1665-70。同型匹配的抗体用作负对照。将样品在FACS Calibur或Vantage Sorter(Becton Dickinson；MountainView，CA)上运行，并使用FlowJo软件(TreeSoft)进行分析。

免疫治疗。如下进行接种。简而言之，以各种摩尔比将CSA-4-1BBL融合蛋白与PBS中的生物素化OVA混合，然后通过腹膜内注射至BALB/c小鼠中，用于预接种，或用于免疫治疗，注射至已经在侧面皮下接种致死量的活A20(1×10⁶)细胞的动物中。对照包括没有接种的动物或接种对照蛋白的那些。一旦检测到，使用卡尺每隔一天测量肿瘤并作为最长直径和垂直直径的平均值±标准误差来报告。当肿瘤大小达到大约20mm直径时，将动物麻醉，以避免不舒服。

统计学。使用Kaplan-Meier曲线估算处理对肿瘤存活的作用。使用对数级检验(Savage/Mantel Cox概括的)测定不同组之间的存活差异。涉及来自各自动物组实验数据比较的程序与使用F检验(两组)或Levene’s检验(多组)检测的变化相等。如果变化不相等，进行对数变换。当比较正常分布的样品平均值时，使用Student’s t检验(两组)或Newman-Keuls检验(多组)。当数据没有正常分布时，使用Mann-Whitney U检验(两组)或Kruskal-Wallis检验(多组)。将统计学差异定义为P<0.05。

实施例1：CSA-4-1 BBL扩大了同种抗原产生的应答

如上所述，4-1 BBL在获得性和先天性免疫应答调节中起着重要作用。4-1 BBL作为共刺激分子，用于激活CD4⁺和CD8⁺ T细胞、NK细胞和DC，并抑制T_reg细胞的抑制功能。因此，该分子可以用作产生有效肿瘤应答的特定佐剂，用于癌症治疗。

由于核心链霉抗生物素蛋白部分的存在，CSA-4-1 BBL融合蛋白形成四聚/寡聚结构，并且是可溶性的分子。使用同种抗原混合淋巴细胞反应(MLR)证明了CSA-4-1 BBL对T细胞应答的免疫刺激活性，如下所述。

在CSA-4-1 BBL的存在或不存在下，将C57BL/6小鼠***细胞用作对抗BALB/c照射过的脾细胞的应答剂。在培养阶段的最后18小时，用[³H]胸腺嘧啶核苷标记培养物，并测定增殖。与对照比较，补充CSA-4-1BBL的培养物显示出有效的增殖活性(图8)。

实施例2：CSA-4-1 BBL提高了T细胞增殖

为了测定4-1-BBL融合蛋白与对抗4-1 BB的单克隆抗体的相对活性，在增殖测试中，在各种含量的4-1 BBL融合蛋白和抗体的存在下，用次佳浓度的抗-CD3抗体将通过流式细胞术分选的CD4⁺和CD8⁺T细胞多克隆刺激。融合蛋白对T细胞增殖的活性比抗体高70-倍(图9)。

因为该抗体Ab已经显示出在癌症免疫治疗的动物模型中具有有效的活性。参见，例如，Melero等，1998，Cell Immunol.190：167-72；Melero等，1997Nat.Med.3：682-85，该数据表明CSA-4-1BBL融合蛋白将是癌症疫苗的有用成分，作为佐剂或作为将TAA传送至DC的载体。

实施例3：生物素化的OVA/CSA-4-1BBL缀合物对CD8⁺T细胞的作用

使用可购得的试剂盒(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)将卵清蛋白肽(OVA)生物素化。将生物素化的OVA在体外与CSA-4-1BBL融合蛋白以不同的比例预先混合，用于缀合，并将一百万个OT-1T细胞在腹膜内注射至获得性转移的天然C58BL/6.SJL动物中。具体地，用CFSE标记一百万个OT-I CD8⁺ T细胞并转移至B6.SJL小鼠中，该小鼠用生物素化的卵清蛋白(10μg/注射)(“OVA”)和与生物素化的OVA混合的CSA-4-1BBL(1μg/注射)(“41BBL+OVA”)或缀合的OVA-生物素/CSA-4-1 BBL(“41BBL-OVA”)免疫。(图10)图10的最后一张图(“41 BBL-OVA”)显示了对5μg缀合10μg生物素化的OVA的CSA-4-1 BBL的应答。为了对照，以与CSA-4-1BBL等摩尔水平来使用核心链霉抗生物素蛋白(“SA”)。

如图10中所示的，与对照“SA/OVA”缀合物(33.6％)或未缀合的单个蛋白质“41 BBL+OVA”(35.5％)相比较，4-1 BBL/OVA缀合物在OT-1细胞中产生了有效的(73.5％)增殖应答。增殖应答是剂量依赖性的，因为5μg剂量的CSA-4-1 BBL比1μg剂量(73.5％)产生了更高的应答(94.5％)。

该实施例显示了CSA-4-1 BBL融合蛋白提高了抗原特异性CD8⁺ T细胞的增殖应答，表明4-1 BBL-CSA/生物素化的抗原构建体可以成功地将抗原传送至专门的APC并激活这些细胞，用于产生有效的免疫应答。

实施例4：CSA-4-1 BBL将抗原传送至DC

该实施例证明了CSA-41BBL有效地将抗原传送至DC。生物素化的PE用作荧光抗原。用250ng CSA-41 BBL在冰上与生物素化的PE(250ng)缀合30分钟。用生物素化的PE(250ng/ml)或生物素化的PE/CSA-41BBL缀合物将Jaw II树突细胞(5×10⁵/孔)培养16小时。使用流式细胞术检测PE的水平。图11A是显示PE+细胞的柱状图。灰色填充部分表示未处理的细胞，黑色虚线表示用生物素化PE处理的细胞，而黑线表示用生物素化PE/CSA-41 BBL缀合物处理的细胞。图11B显示了每个处理的PE平均荧光强度(MFI)，并且证明了缀合物处理过的细胞呈现出显著更高的应答。

实施例5：CSA-4-1 BBL激活DC

该实施例证明了4-1 BBL激活树突细胞。Jaw II树突细胞(5×10⁵/孔)未处理，或用5μg/ml CSA-41BBL缀合物或5μg/ml脂多糖(LPS)在5ng/ml GM-CSF存在下在24-孔平板中处理48小时。使用流式细胞术分析CD86和II类MHC水平，如图12A中所示的。右侧灰色填充部分表示同型处理的细胞，黑灰色填充的表示未处理的细胞，黑线表示CSA-4-1BBL处理的细胞，而虚线表示LPS处理的细胞。图12B显示了CD86和II类MHC的平均荧光强度(MFI)，并证明了CSA-4-1BBL处理的细胞呈现出显著更高的应答。

实施例6：CSA-4-1 BBL将抗原传送至DC并在体内激活DC

该实施例证明了CSA-4-1 BBL将生物素化的抗原传送至树突细胞并驱动这些细胞在体内激活。将生物素化的OVA接触CSA-41BBL来产生生物素化的OVA/CSA-4-1 BBL缀合物。将缀合物或生物素化的OVA/CSA缀合物静脉内注射至天然C57BL/6小鼠中。24小时后，将动物麻醉并收集脾细胞。使用流式细胞术分析CD11c+细胞群中的树突细胞激活。测定来自天然、生物素化OVA-SA处理的和生物素化OVA/CSA-41-BBL处理的动物的树突细胞上的CD40、CD86和II类MHC表达的平均荧光强度(MFI)，如图13所示的。该图证明了生物素化的OVA/CSA-41-BBL处理过的动物呈现出显著更高的应答。

实施例7：CSA-4-1 BBL中和Treg细胞的抑制功能

如上所述，天然产生的CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺Treg细胞组成型地表达4-1 BB受体，因此，应答4-1 BBL刺激。以下的实施例证明了Treg细胞上4-1BBL融合蛋白的刺激活性。

使用流动分选分离CD4⁺CD25^-Teff细胞和CD4⁺CD25⁺Treg细胞，以1:1比例在照射过的同系细胞和抗CD3抗体的存在下培养。为了区分CD4⁺CD25⁺(DP)对CD4⁺CD25^-(SP)T细胞在共培养实验中的增殖，用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE，Molecular Probes，OR)将CD4⁺CD25^-染色并用于抑制测试中。简而言之，用PBS洗涤细胞，在4ml2.5μM CFSE/1×10⁶细胞中(当较少量的细胞得到标记时，保持该比例)在室温孵育7分钟。然后将细胞在两体积的肽牛血清中孵育1分钟，并用PBS洗涤2次来确保除去所有过量的CFSE。使用流式细胞术测定增殖。

Treg细胞没有应答抗CD3刺激，因为它们是无反应力的，但显示出应答4-1BBL的适度增殖(图15)。特别地，Treg细胞抑制Teff细胞的增殖应答，这是通过加入4-1BBL可以逆转的一种作用。这与使用天然Treg细胞的数据相一致，其中通过CSA-4-1BBL的存在抵消了扩大细胞的抑制作用。

这些数据证实了4-1 BBL的免疫调节作用，及其用于癌症免疫治疗的用途。例如，4-1 BBL融合蛋白加强了Teff功能，而下调了Treg细胞的抑制功能，用于更强有力的抗肿瘤免疫应答。

实施例8：4-1 BBL的双重作用

4-1BB/4-1 BBL介导的信号在调节Treg功能中的作用是最近两个研究的主题，具有相反的发现。尽管一个研究证明了4-1 BB信号抵消Treg细胞的抑制作用，Chol等，2004，J.Leukoc.Biol.75：785-91，而另一个研究则报道了4-1 BB信号介导Treg增殖，对其抑制功能没有显著作用，Zheng等，2004，J.Immonul.173：2428-34。为了澄清这种矛盾，使用CSA-4-1 BBL融合蛋白来研究4-1BB信号在Treg功能中的作用。

从天然BALB/c小鼠的脾脏和外周***分选CD4⁺CD25^-(单阳性；SP)和CD4⁺CD25⁺(双阳性；DP)T细胞，并单独或以1:1的比例培养3天。将培养物补充照射过的脾细胞，抗CD3抗体(0.5μg/ml)，4-1BBL的浓度(μg/ml)或等量的对照CSA蛋白显示于图14A中。在共培养实验中，使用流式细胞分选从天然BALB/c小鼠纯化的CD4⁺CD25⁺双阳性(DP)T细胞显著抑制了由抗体对抗CD3诱导的单阳性(SP)CD4⁺CD25^-Teff细胞的增殖应答。通过给培养物补充1μg/mlCSA-4-1 BBL有效而特异性地逆转了该抑制作用，但没有使用等摩尔水平的对照CSA。

为了测试所观察到的由CSA-4-1 BBL融合蛋白引起的抑制逆转是否是由于SP细胞的增殖应答的恢复引起的，用CFSE标记SP细胞，并在CSA-4-1 BBL(0.5μg/ml)或用作对照蛋白的CSA存在下用于共培养实验中。CSA-4-1 BBL将SP的增殖从对照的44％和CSA蛋白的46％提高至DP细胞的60％，显著降低了SP T细胞(16％)的增殖，这通过4-1BBL得到显著恢复(34％)，但CSA对照蛋白没有(17％)。(图14B)这些数据证明了4-1 BBL融合蛋白下调了Treg细胞的抑制功能。

因此，我们的工作表明了CSA-4-1 BBL融合蛋白对Treg细胞呈现出两种相反的活性。一方面，它与抗CD3抗体和IL-2协同作用来促进Treg细胞扩大。另一方面，它阻断天然和激活的Treg细胞的抑制功能，不仅是在Treg细胞接触4-1 BBL融合蛋白时，因为从培养基将其除去导致了抑制功能的恢复。

4-1 BBL这后一种作用在使用Treg细胞作为免疫逃避机制的肿瘤和感染的范围中具有一定的意义。

实施例9：抗原-4-1-BBL缀合物作为癌症疫苗的用途(a)表达作为可溶性蛋白的OVA的A20转染子的产生。

根据制造商(Invitrogen)的实验方案使用Lipofectamine^TM2000试剂盒将上述的OVA构建体转染至A20细胞中。在G418选择培养基中选择稳定的转染子，在单细胞水平克隆，并使用蛋白质印迹测试OVA的表达。将具有显著水平的OVA表达的克隆作为CFSE增殖测试中OVA肽特异性的DO11.10 CD4⁺ T细胞的刺激剂，如参照以上的图10所述的。一旦证实了对于OVA表达是阳性的，将一百万个活的A20细胞皮下注射至BALB/c小鼠的右侧中。每隔一天监控动物的肿瘤产生和存活，并当肿瘤直径达到20mm大小时，将动物麻醉。将接种亲本A20细胞的动物作为肿瘤生长的对照。当注射至同系BALB/c小鼠中时，表达OVA的A20细胞转染子将形成肿瘤。

(b)使用昆虫DES***产生CSA-4-1 BBL融合蛋白。

使用DES表达***(Invitrogen)和我们建立的实验方案制备CSA-4-1 BBL蛋白。参见，例如，Singh等，2003，Cancer Res.63：4067-73；Yolcu等，2002，Immunity 17：795-808。使用固定化金属基亲和性色谱纯化融合蛋白，利用工程化至CSA-4-1 BBL融合蛋白之后呢单个6XHis标记物。将蛋白质脱盐，通过超滤浓缩，并通过SDS-PAGE分析纯度。使用二辛可宁酸(BCA)测试(Pierce)测定蛋白质制剂的浓度，并使用来自Cambrex的

Chromogenic LAL终点测试来检测内毒素的存在。

(c)OVA的生物素化

根据制造商(Molecular Probes，San Diego，CA)的实验方案使用DSB-X生物素标记试剂盒将马来酰亚胺激活的无内毒素的鸡OVA(Pierce)生物素化。在PBS中彻底渗析后，使用蛋白质印迹测定生物素化OVA的浓度、内毒素水平和生物素化，并将缀合碱性磷酸酶的链霉抗生物素蛋白用于探测。如果需要，使用Detoxi-凝胶内毒素去除试剂盒(Pierce)除去内毒素。将生物素化的OVA缀合CSA-4-1BBL融合蛋白。将蛋白缀合物等分，并冷冻于-80℃，直至使用。(d)生物素化的OVA/CSA-4-1BBL缀合物作为癌症疫苗的用途

将CSA-4-1BBL和生物素化的OVA在PBS中以不同的摩尔比预先混合，如1:1、1:5、1:10、5:1和10:1的4-1BBL：OVA，并以不同剂量(如10、50和100μgOVA)以每周三次的间隔通过腹膜内注射至一组BALB/c小鼠中。注射缀合链霉抗生物素蛋白的生物素化OVA，生物素化的OVA单独或混合CSA-4-1BBL的未生物素化的OVA动物用作对照。

用1百万个活的A20肿瘤细胞在右侧皮下激发动物，每隔一天监控肿瘤产生和存活，并在肿瘤直径达到20mm大小时，将动物麻醉。

用生物素化的OVA/CSA-4-1 BBL缀合物接种将产生有效的抗肿瘤免疫应答，使得预防肿瘤生长。用未缀合的4-1 BBL和OVA接种也可以产生应答，但任何这样的应答将小于抗原/4-1 BBL缀合物产生的。用单独的OVA或CSA-OVA接种只产生最小的应答，因此在预防肿瘤生长中应该是无效的。

实施例10：用抗原-4-1BBL缀合物的早期/后期接种

如上所述，肿瘤通过随着肿瘤生长过程产生的各种机制来逃避免疫***。在还没有建立逃避机制时，通过与肿瘤激发同时接种动物来证明本发明的缀合物在肿瘤进展早期的功效。一旦已经建立肿瘤并且已经完全产生免疫逃避机制，通过接种动物来证明本发明的缀合物对抗已建立肿瘤的功效。

(a)在肿瘤进展早期的功效

用一百万个活的A20细胞在右侧激发BALB/c小鼠，同时在腹膜内接种生物素化的OVA/CSA-4-1 BBL缀合物。一周重复接种抗原/4-1 BBL缀合物一次，持续四周，到该时间，对照动物中的肿瘤直径将达到10-15mm大小。未操纵的动物和接种CSA-OVA缀合物的动物将作为对照。

(b)对抗已建立肿瘤的功效

在右侧将BALB/c小鼠皮下接种1百万个活的A20肿瘤细胞。监控动物的肿瘤产生，并且当肿瘤达到直径4-6mm大小时，接种生物素化的OVA/CSA-4-1 BBL缀合物。接种实验方胺最初将涉及每周腹膜内注射，直至肿瘤小鼠或达到直径20mm的大小。

在肿瘤消失后60天用2百万个活的A20细胞激发有效根除其肿瘤的动物，用来测试记忆应答。

尽管不希望受到任何理论的限制，在肿瘤进展早期给予时，与一旦建立了肿瘤的给药相比较，本发明的抗原/4-1 BBL缀合物在预防肿瘤生长中具有更高的功效，这是由于在肿瘤进展过程的早期缺少各种抑制机制。尽管如此，由于抗原对DC的特异性靶向，用于有效的抗原递呈，DC的激活，用于产生危险信号(佐剂作用)以及下调Treg细胞的抑制功能，抗原/4-1 BBL缀合物在根除已建立的肿瘤中显示出功效。除了对DC的间接作用，通过结合激活T和NK细胞上的4-1BB受体，导致它们强有力的增殖、存活和记忆T细胞功能，重复注射疫苗可以进一步加强免疫***。

实施例11：抗原-4-1 BBL缀合物通过旁观者作用的功效。

以下的实施例将证明生物素化的OVA/CSA-4-1 BBL缀合物产生了对抗未确定的A20肿瘤抗原(而不是OVA)的免疫应答，通过旁观者作用或抗原决定部位扩展。

将BALB/c动物在右侧接种表达OVA的A20，在左侧接种亲本未修饰的A20细胞。一旦可摸出肿瘤，将动物接种生物素化的OVA/CSA-4-1 BBL缀合物。按照上述的接种时间表，但也可以按照需要来改变以提高功效。监控动物中两种肿瘤类型的生长。

或者，在根除表达OVA的A20肿瘤后60天，在对侧用2百万个亲本A20细胞皮下激发动物，该动物在接种生物化的OVA/CSA-4-1 BBL缀合物后已经成功根除了肿瘤(如以上的实施例)。

生物素化的OVA/CSA-4-1BBL缀合物疫苗将显示出对抗缺乏作为TAA的OVA的亲本A20肿瘤的功效。例如，对抗OVA的有效免疫应答将导致肿瘤的杀灭，肿瘤抗原的脱落，并通过APC捕获和递呈，用于产生对抗新一组TAA的T细胞应答。可以通过产生的对抗A20-OVA肿瘤的旁观者作用来进一步促进亲本肿瘤的根除。

实施例12：使用细菌表达***产生生物素化的抗原。

在一些情况中，有利的是在遗传上产生生物素化的抗原，用作本发明疫苗的抗原成分。在这点上，可以使用Avidity，Inc.(Denver，CO)的生物素AviTag技术。生物素AviTag由唯一的15个氨基酸肽构成，该肽由生物素连接酶BirA识别，生物素酶连接生物素与肽序列中的赖氨酸残基。生物素AviTag可以在遗传上融合至任何目标蛋白，使得可以用生物素分子标记蛋白质。

将编码OVA的cDNA亚克隆至pAN和pAC载体中，以各自表达N-端以及C-端AviTag-蛋白融合体。用稳定整合至染色体中的birA基因转化AVB100大肠杆菌，并用L-***糖诱导，用于高水平表达携带生物素标记物的OVA。使用AviTag抗体琼脂糖纯化所表达的蛋白。使用BCA试剂盒、Chromogenic LAL试剂盒和用缀合碱性磷酸酶的链霉抗生物素蛋白作探针的蛋白质印迹测定纯化OVA的浓度、内毒素水平和生物素化。如果需要，使用Detoxi-凝胶内毒素去除试剂盒(Pierce)来除去内毒素。

如上所述，将生物素化的OVA与CSA-4-1BBL缀合。将蛋白质缀合物等分并在-80℃冷冻，直至使用。

实施例13：包括TERT和Survivin的抗原/4-1 BBL缀合物的用途

以上举例的生物素化抗原/CSA-4-1 BBL缀合物和生物素化的OVA/CSA-4-1 BBL可以与任何抗原用于任何疫苗情况中。在癌症疫苗的范围中，两种通用人TAA，末端酶逆转录酶和survivin，可以是本发明的生物素化抗原/CSA-4-1 BBL缀合物的有利抗原成分。

实施例14：E7/4-1 BBL缀合物

如上所述，包括人***状瘤病毒E7抗原作为抗原成分的本发明的缀合物在对抗***中是有用的。该实施例涉及本发明的这个特定实施方案。

(a)生物素化的HPV-16E7的产生

将生物素化的E7用作缀合物的抗原成分，该缀合物根据本发明用作HPV疫苗。在一个实施方案中，全长E7蛋白提供了最大数量的抗原决定部位。使用来自TC-1细胞的总RNA通过RT-PCR克隆编码全长HPV-16 E7的cDNA。证实序列后，将cDNA在具有6X-His标记物的框内亚克隆至pMIB/V5-His载体(Invitrogen)中，用于在DES***中组成型表达和分泌。如上所述使用金属亲和性树脂纯化分泌的蛋白。按照制造商的实验方案(Pierce)使用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素在体外将纯化的E7生物素化。简而言之，将纯化的浓缩E7在磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中缓冲交换，并在室温用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素孵育1消失。使用切线流过滤(Spectrum Labs，NJ)除去未缀合的生物素。

(b)E7/4-1 BBL缀合物的产生

按照上述的一般程序，使用生物素化的E7和CSA-4-1 BBL融合蛋白产生包括E7和4-1 BBL的缀合物。为了比较，如下产生E7/4-1 BBL融合蛋白。将编码E7和4-1 BBL的cDNA在具有6X-His标记物的框内亚克隆至pMIB/V5-His载体(Invitrogen)中，用于在DES***中组成型表达和分泌，并将蛋白表达和纯化，如上所述。

(c)E7/4-1 BBL缀合物的结合活性

如下测定E7/4-1 BBL缀合物的生物素结合和4-1BB受体结合活性。

对于生物素结合，将TC-1细胞生物素化并在冰上用PBS中的CSA-4-1 BBL(100ng/10⁶细胞)孵育。用PBS将细胞彻底洗涤，用荧光染料标记的抗4-1 BBL的抗体来染色，并使用流式细胞术来分析。缀合CSA的生物素化细胞用作对照。

为了测试缀合物或融合蛋白与激活T细胞上的4-1 BB受体的结合，用5μg/ml的伴刀豆球蛋白(ConA)将来自C57BL/B6小鼠的脾细胞激活36h，用PBS洗涤并用在冰上用各种浓度的缀合物或融合蛋白孵育。将细胞彻底洗涤，并用合适的荧光染料标记的4-1BBL、核心链霉抗生物素蛋白或E7的抗体来染色，并在流式细胞术中分析。

使用1:4比例(CSA-4-1BBL:E7)通过第一个形成缀合物来测定CSA-4-1 BBL缀合物与生物素化E7的结合，接着CSA-生物素结合的化学计算，然后在夹层ELISA中测试缀合物。简而言之，将缀合的蛋白结合覆盖抗E7抗体的96-孔平板，洗涤，然后用反应性抗-链霉抗生物素蛋白抗体孵育，来测量存在的E7/4-1 BBL复合物的含量。证实缀合物的形成后，测试它们结合激活T细胞上4-1 BB受体的能力，如上所述。

实施例15：通过E7/4-1 BBL缀合物诱导的免疫应答

(a)剂量的最佳化

可以如下测定包括E7/4-1BBL缀合物的疫苗的最佳剂量。使用1、10或50μg生物素化的E7，通过以两个比例(如1:4和1:8的CSA-4-1 BBL:E7)混合生物素化的E7和CSA-4-1 BBL来形成包括生物素化E7和CSA-4-1 BBL的缀合物。还使用了相当量的对照未生物素化的E7。(这些E7剂量是基于证明了接种50μg E7能有效产生对抗TC-1细胞的保护性免疫应答的研究)。通过在各种实验方案下，如以下所述的那些，测定对疫苗的免疫应答，可以测定4-1 BBL:E7的最佳比例和抗原的最佳含量，并通过实验来调节。

(b)四聚物分析

对于CD8⁺ T细胞的扩大，四聚物染色可以测定疫苗功效。给C57BL/6雌性小鼠腹膜内注射上述PBS中的疫苗制剂。注射PBS、CSA-4-1 BBL、CSA-4-1 BBL+未生物素化的E7或E7-4-1 BBL融合蛋白的小鼠作为对照。10天后，腹膜内给予第二次相等的剂量，并在最后一次接种后三天，收集脾细胞，并使用四聚物技术和流式细胞术定量E7-特异性CD8+T细胞的数量。简而言之，用FITC-抗-CD8抗体标记来自免疫动物的脾细胞，并用E7的免疫显性抗原决定部位(肽49-57(RAHYNIVTF))标记I类MHC H-2D^b的PE-四聚物。(四聚物可以获自National Institutes of Health Tetramer Facility(Atlanta，GA))。装载仙台病毒核蛋白324-332肽(FAPGNYPAL)的I类H-2D^b分子用作负对照。染色后，通过流式细胞术来分析细胞，以定量对四聚物阳性的CD8+T细胞的百分比。

(c)胞内IFN-γ分析

疫苗诱导的CD8+T细胞对于IFN-γ(效应CD8⁺ T细胞的信号细胞因子)表达的表征使得可以测定T细胞的功能。将雌性C57BL/6腹膜内注射最佳剂量的生物素化E7/CSA-4-1 BBL缀合物疫苗(如上所述测定的)，并在10天后，收集来自免疫动物的脾细胞，并与表达E7的照射过的TC-1细胞共培养5天，然后补充Golgi转运抑制剂布雷菲德菌素A过夜。使用Ficoll梯度收集活细胞并用抗鼠Fcγ受体抗体(来自美国典型培养物中心的2.4G2)孵育一小时，接着用FITC标记的抗-CD8抗体染色。然后将细胞固定、渗透、对于PE标记的抗IFN-γ抗体(Pharmingen)染色并通过流式细胞术分析。用同型抗体染色的细胞用作对照。来自用PBS、E7-4-1 BBL融合蛋白或CSA-4-1 BBL+未生物素化E7免疫动物的脾细胞用作对照。

(d)杀灭应答

如下测定了疫苗诱导的CD8+T细胞裂解表达E7分子的TC-1细胞的能力。将从上述接种的动物收集的脾细胞在100μg/ml E7蛋白存在下共培养5天。将培养物补充50U/ml外源IL-2来支持CD8+T细胞的生长。使用Ficoll梯度收集有活力的脾细胞并用作JAM测试中对抗TC-1靶细胞的效应细胞，以不同的效应物:目标物比例(如1:1、10:1、20:1、40:1和80:1)。参见，例如，Singh等，2003，Cancer Res.63：4067-73。因为由CD8+T细胞引起的肿瘤细胞的直接杀灭对癌症免疫治疗是重要的，该测试中功效的证明将进一步支持疫苗对抗***的功效。

(e)CD4+T细胞增殖应答

如下测定了生物素化的E7/CSA-4-1 BBL在诱导CD4+T细胞应答中的功效。用CFSE标记来自免疫动物的脾细胞，并在上述的相同培养条件下与重组E7共培养，除了没有将IL-2加入培养物中。在培养过程中的不同天收集细胞，用APC-CD4抗体染色，并使用流式细胞术分析增殖。没有使用E7蛋白或使用OVA蛋白的培养物用作对照。因为存在一般的意见：CD4+T细胞应答对于CD8+T细胞和B细胞应答是重要的，该测试中功效的证明进一步支持了疫苗对抗***的功效。

(f)体液应答

如下测定用生物素化的E7/CSA-4-1 BBL疫苗体内处理来产生体液应答的能力。收集来自接种小鼠的血液，并分离血清和用于筛选覆盖E7蛋白的Maxisorb ELISA平板(Nalgene Nunc International)。用缀合辣根过氧化物酶的山羊抗-鼠IgG和山羊抗-鼠IgM抗体检测抗-E7IgG和IgM。对照包括从接种PBS和对照蛋白如上述那些的动物收集的血清。

生物素化的E7/CSA-4-1 BBL缀合物疫苗在这些测试中将产生有效的应答。接种E7-4-1 BBL融合蛋白也产生了应答，但预期任何这样的应答将是较小规模的。接种CSA-4-1 BBL加未生物素化的E7可以产生应答，但是任何这样的应答不会和缀合物疫苗一样强，因为APC吸收E7抗原是随机情况，不会和通过缀合物获得的E7靶向传送至APC一样有效。

实施例16：E7/4-1 BBL缀合物的治疗功效

在两种不同的情况中测定了本发明包括E7/4-1 BBL缀合物的疫苗在预防和根除TC-1可移植肿瘤模型中肿瘤形成的功效。第一种情况涉及在肿瘤注射前，免疫逃避机制还没有产生时接种。第二种情况涉及对抗完全产生了免疫逃避机制的已建立肿瘤的接种。给C57BL/6小鼠注射TC-1细胞来诱导肿瘤形成，并在TC-1注射之前和之后接种生物素化的E7/CSA-4-1 BBL缀合物。如上所述测定免疫应答。每隔一天还监控小鼠的肿瘤产生和存活，并当肿瘤达到直径20mm大小时，将动物麻醉。

(a)E7/4-1 BBL缀合物对抗随后的肿瘤激发的功效。

以下实施例将证明用本发明的E7/4-1 BBL缀合物免疫产生了对抗肿瘤激发的保护性免疫。

给雌性C57BL/6小鼠腹膜内注射单独的PBS、单独的CSA-4-1 BBL、与未生物素化E7混合的CSA-4-1 BBL、本发明的生物素化E7/CSA-4-1 BBL缀合物和E-7-4-1 BBL融合蛋白。使用如上所述最佳化的剂量。收集TC-1细胞，重悬浮于无菌PBS中并用于在最后一次免疫后注射十四天。在右侧用1×10⁵个TC-1细胞皮下激发小鼠并观察60天。作为证实缀合物对E7⁺肿瘤特异性的对照，用A20癌细胞激发一组免疫过的小鼠。每隔一天监控小鼠的肿瘤产生和存活，并当肿瘤达到20mm直径大小时，将动物麻醉。在第一次肿瘤激发后60天用1×10⁶个TC-1细胞再次激发没有产生肿瘤的动物来测试记忆应答。以十四天的间隔，将来自每组的小鼠牺牲，并收集它们的脾细胞。如上所述，使用四聚物染色和细胞因子染色，将脾细胞用于测定CD8+T细胞应答。

(b)E7/4-1 BBL缀合物对抗已有肿瘤的功效

如下证明了本发明的E7/4-1 BBL缀合物对抗预先已经存在的肿瘤的治疗效果。

将雌性C57BL/6小鼠在右侧皮下注射TC-1细胞并在100％小鼠具有可触知的肿瘤时接种。每周在腹膜内给予如上所述最佳化剂量的疫苗直至肿瘤大小达到20mm直径，在这时将小鼠麻醉。测定肿瘤的生长率和发病率，持续60天。此外，测定长期存活并持续90天。

用本发明的生物素化E7/CSA-4-1 BBL缀合物接种将在两种情况中产生有效的抗肿瘤免疫应答，使得防止肿瘤生长并根除已有的肿瘤。接种未缀合的CSA-4-1 BBL和E7以及接种E7-4-1 BBL融合蛋白也可以产生抗肿瘤应答，但任何这样的应答将是最小的，并且在防止肿瘤生长或根除已有肿瘤中很可能是无效的。

实施例17：包括流感A抗原的缀合物

通过从流感A RNA的逆转录酶-聚合酶链式反应产生目标流感蛋白(例如，H1、N1、NP和/或MP2)的cDNA。将cDNA亚克隆至pCSA载体中，并转移至果蝇昆虫细胞中，用于建立稳定的转染子。

利用工程化至蛋白中的6X-His标记物，使用金属亲和性树脂和切线流过滤(ApoImmune已经使用的方法和技术)从果蝇培养基纯化所分泌的H1、N1、NP和MP2蛋白。通过凝胶电泳、免疫印迹技术、基质辅助激光解吸/离子化质谱(MALDI-MS)和分析超离心来分析纯化的蛋白。

将CSA-4-1 BBL(如上所述制得)以1:4的摩尔比与生物素化的H1、N1、NP或MP2混合，来形成流感A/4-1BBL缀合物。简而言之，用CSA-4-1BBL将生物素化的H1、N1、NP或MP2在4℃孵育一小时。用CSA-4-1BBL孵育未生物素化的H1、N1、NP或MP2，来作为未缀合的对照。可以将缀合物配制于用作疫苗的组合物中。

实施例18：对抗流感A的接种

(a)剂量最佳化

给C57BL/6小鼠接种不同剂量的流感A抗原/4-1 BBL缀合物，如上所述。使用标准免疫技术测定小鼠中的免疫应答，这些技术包括四聚物技术、细胞因子染色、细胞毒性测试和体液应答的测量，如上所述。将最初的结果用来测定疫苗的最佳剂量方案。

(b)接种和感染激发

如下在用流感A激发的小鼠中证明流感A抗原/4-1 BBL缀合物疫苗的预防性和治疗性功效。在感染前后用流感A抗原/4-1 BBL缀合物疫苗治疗人流感病毒感染的动物，并测量病毒滴定度来测定治疗功效。在感染后第1、3、5、7和9天收集来自接种和对照感染动物的肺。每天测定体重丢失，作为发病率的直接测量。

在另一系列的实验中，评价肺病理学并测定肺病毒滴定度。出于该目的，将肺均质并将匀浆在1500×g离心15分钟后收集病毒上清液，并冷冻于-80℃直至随后的分析。将来自肺的病毒上清液的稀释液加入96-孔U底平板中，至3×10⁴ MDCK细胞/孔，在37℃持续24小时，从孔中除去培养基，并加入无血清培养基。四天后，在鉴定培养物上清液不再凝集鸡红血球的稀释度后，使用已知病毒浓度的标准曲线和TCID的Reed-Munch计算来测定病毒滴定度。

实施例19：免疫共刺激CD40L部分

在该实施例中所用的人单核细胞性白血病THP-1和鼠A20B-细胞淋巴瘤系购自美国典型培养物中心(ATCC，Rockville，MD，USA)。在补充10％热灭活肽牛血清(FBS；Valley Biomedical，Winchester，VA，USA)、12mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素(全部来自GIBCO)和50μM 2-巯基乙醇(Sigma，St.Louis，MO，USA)的DMEM(GIBCO，Gaithersburg，MD，USA)中培养A20细胞。在补充5％ FBS、100U/ml青霉素和0.1mM Hepes缓冲液(GIBCO)的RPMI中培养THP-1细胞，在37℃，在潮湿的5％CO₂培养箱中。将细胞在悬浮液中生长，37℃，5％CO₂。

该实施例中所用的中国仓鼠卵巢(CHO)和稳定的鼠CD154转染的CHO(CHO-mCD40L)系由Dr.Gail Bishop(衣阿华州大学)提供，并维持于含有100mM Hepes，50μg/ml庆大霉素和5％ FBS的RPMI 1640中(GIBCO)。

从人外周血单核细胞通过逆流洗脱分离的初级单核细胞是来自Dr.Laryy Wahl(NICDR)的礼物。

按照之前所述的，用含有v-myc和v-raf致癌基因的鼠重组J2逆转录病毒感染骨髓细胞来建立来自CD40敲除小鼠(CD40KO细胞系)的永久巨噬细胞系。参见，例如，Clemon-Miller等，2000，Immunobiol.202：477-92。

为了产生稳定的表达转染子的人CD40，用10μgDNA在600v，20μ秒和2个脉冲将J2转化的系电穿孔。转染后24h将zeocin(100μg/ml)加入培养基中，并将有抵抗力的菌落染色，用于CD40的表面表达。使用FACS Vantage SE(Becton Dicknson，San Jose CA，USA)分选高CD40表达的细胞，并维持，用于这些研究中。

(a)CSA-CD40L部分的克隆和表达

使用分离自阿维丁链霉菌(Streptpmyces avidinii)的基因组DNA作为模板和特异性引物(图16中的a和b)在PCR中克隆编码CSA的基因。使用产自总RNA的第一链cDNA作为模板和CD40L-特异性引物(图16中的c和d)在PCR中克隆人CD40L的胞外结构域，总RNA分离自植物凝血素(PHA)激活的人外周血淋巴细胞。以与CSA-hCD40L的相同方式克隆鼠CD40L，使用分离自用伴刀豆球蛋白A(ConA)激活的鼠脾细胞的总RNA。

然后在框内将CSA/CD40L基因亚克隆至pMT/BiP/V5-His CuSO4-可诱导的载体中，用于表达至果蝇S2表达***中(DES；Invitrogen，San Diego，CA，USA)。根据制造商的实验方案(Invitrogen)使用磷酸钙转染试剂盒用20μg重组载体来转染果蝇S2细胞。通过用1μgpCoHygro载体共转染来建立稳定的转染子并在300μg/ml潮霉素存在下维持。使用500μM终浓度的硫酸铜获得重组蛋白的表达。诱导后3天收集培养物上清液，用40％过硫酸铵沉淀，并对于PBS进行渗析。

按照之前所述的，使用改进的金属离子亲和性色谱方法纯化重组蛋白。参见，例如，Lehr等，2000，Protein Expression Purif.，19：362-68。简而言之，将培养上清液或沉淀的蛋白通过包装螯合琼脂糖快流(Pharmacia Biotech，Upsala，Sweden)的Pharmacia XK16柱，并用50mM咪唑洗脱重组蛋白。使用Bradford染料结合方法或ELISA(R&DSystems，Minneapolis，MN，USA)测定蛋白质浓度。

(b)通过蛋白质印迹和ELISA表征CSA-CD40L部分

使用Quantikine CD40L免疫测试检测并定量CSA-hCD40L的表达，其使用预先覆盖于微量平板上的CD40L特异性的多克隆Ab，按照制造商的说明所述的(R&D Systems)。对于蛋白质印迹分析，首先通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳在天然和变性条件下将CSA-hCD40L和CSA-mCD40L的上清液分级，然后使用半干印迹装置(BioRad，Hercules，CA，USA)转移至聚乙二烯二氟化物膜上。首先在阻断缓冲液中孵育膜，然后在阻断缓冲液中以1:1000稀释度的山羊抗-SA Ab(Pierce，Rockford，IL，USA)中室温孵育1小时。然后将膜彻底洗涤，并用1:4000稀释度的缀合辣根过氧化物酶的抗山羊抗体孵育1小时。最后，根据制造商的说明(ECL，AmershamBiosciences，UK)使用化学发光底物检测蛋白质。

在非变性PAGE条件下，转染子表达高水平的形成稳定四聚物和高阶结构的CSA-CD40L部分。只在100℃而非60℃加热后的变性条件下，才发生解离成单体。这些数据证明了免疫共刺激部分的CD40L多肽没有影响表达、正确的折叠和CSA作为寡聚物的存在。

(c)受体结合和激活测试

用200ng/ml的CSA-CD40L(人或鼠)部分或对照CSA蛋白将一百万个CD40阳性鼠A20B细胞淋巴瘤或人巨噬细胞THP-1细胞在4℃孵育30分钟。用PBS洗涤几次后，使用缀合FITC的抗链霉抗生物素蛋白抗体(Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)在流式细胞术中检测结合的蛋白。将CSA用作负对照来检测非特异性结合。通过用100ng/ml CSA-hCD40L或CSA培养0.5×10⁶个CHO细胞或与用CD40L膜形式转染的0.5×10⁶个CHO细胞共培养48小时来测定CSA-CD40L刺激对CD80和II类MHC分子表达的作用。然后将细胞洗涤，并用饱和浓度的缀合FITC的抗-CD80(L307.4)和II类HLA(TU36)抗体(BD-PharMingen，San Diego，CA，USA)染色，并通过流式细胞术来分析。

CSA-mCD40L结合了人和鼠CD40受体(图17A&B，暗线)，如通过流式细胞术所测定的，并显示于图17中。相反，CSA-hCD40L只与人细胞上的受体相互作用，与鼠细胞具有最小至不可检测的结合(图17C&D，暗线)，证明了其的物种特异性。这些相互作用使CD40-特异性的，因为将CSA用作对照蛋白时，不存在可检测的结合(图17，灰色填充部分)。

使用II类HLA(图18A)和CD80(图18B)分子的抗体在流式细胞术中在所有测试的CSA-hCD40L蛋白浓度检测THP-1细胞表面上的II类MHC和CD80分子的上调表达，在刺激后48小时在100ng蛋白质/5×10⁵个细胞获得最大上调。CSA-hCD40L(细实线)在上调II类HLA分子中比CHO细胞上表达的膜结合形式的CD40L(粗实线)更有效(55.8的MFI对35.5)。相反，通过两种形式的CD40L的CD80上调几乎是相当的(33.6的MFI对36.2)。上调的表达是CSA-hCD40L特异性的，因为用CSA蛋白的孵育(实心柱状图)没有显著影响CD80和II类HLA分子的表达超过背景水平。

(d)骨髓衍生的DC的产生

从6至8周大小鼠的股骨冲洗出骨髓，并通过吸移分散成单个细胞，用氯化铵钾(ACK)溶液裂解红血球。然后使用TIB105、TIB146和克隆RL-172杂交瘤细胞培养物饱和的上清液的混合物耗尽单细胞悬浮液的T和B细胞，在冰上持续30分钟。(培养物上清液是匹兹堡大学的Dr.Tatiana Zorina的礼物，PA)。用兔子补体将细胞在37℃孵育30分钟，并在完全培养基(RPMI 1640，2mM L-谷氨酰胺、100μg/ml青霉素和链霉素、10％FBS、0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、1μg/ml茚甲新和50μM N-甲基-L-精氨酸)(Sigma)中在六孔平板中以10⁶个细胞/ml浓度培养过夜(37℃，5％CO₂)。通过温和吸移收集未附着的细胞，并以10⁵个细胞/ml的浓度重悬浮于补充重组鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(5ng/ml)和rmIL-4(5ng/ml)(全部来自USBiological，Swampscott，MA，USA)的完全培养基中。将细胞在六孔平板中(4ml/孔)培养5天。

在第五天，对于细胞表面MHC和共刺激分子的表达，测定培养物中存在的DC的类型，并用不同浓度(0.1-0.5μg/10⁶个细胞)的CSA-mCD40L、单独的培养基或CSA孵育。在不同的天数收集细胞并使用PE标记的抗CD11c的单克隆抗体(HL3)和FITC标记的CD80(16-10A1)和CD86(GL1)的mAb(全部来自PharMingen)来分析成熟标记的表达。

用各种浓度(0.1-0.5μg/10⁶个细胞)的鼠CSA-CD40L孵育48小时的来自第5天鼠骨髓培养物的未成熟树突细胞显示出提高的CD80和CD86共刺激分子的表达(图19A&B)，在0.2μg/10⁶个细胞的浓度，对CD80表达上调的作用高于CD86的(倍3对2倍)。更高浓度的CSA-CD40L融合蛋白或更长的孵育时间段没有导致进一步的上调(数据未显示)。该作用是免疫共刺激部分特异性的，因为用CSA蛋白孵育的细胞在超过背景水平的共刺激分子表达中具有最小至不可检测的改变。

(e)促炎细胞因子产生的分析

将人单核细胞涂布于96-孔微量滴定平板中并使用1μg/ml可购得的三聚重组人CD40L(rhsCD40L)+1μg/ml增强子(Alexis Bochemicals，San Diego，CA，USA)和100ng/ml CSA-hCD40L、CSA-mCD40L或CSA来刺激。在孵育18小时后收集上清液并通过ELISA来测试，对所有的细胞因子使用OptEIA^TM装置(PharMinger)。使用E-maxPrecision微量滴定平板读数器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA)来进行分析。

人单核细胞连接CSA-hCD40L导致超过单独CSA5倍的人IL-1β产生刺激，这等于由rhsCD40L诱导的水平(图20A&B)。相似地，用CSA-mCD40L的人单核细胞刺激导致强有力的人IL-6刺激(图20C&D)。因此，人和鼠CSA-CD40L融合蛋白都能够刺激人单核细胞上的CD40来产生IL-1β和IL-6。

(f)RNAse保护测试

通过RNAse保护测试来进行细胞因子mRNA合成的分析。将细胞涂布于6-孔平板中并使用CSA-CD40L通过CD40刺激3至4小时。用增强子表达CD40L和rhsCD40L的CHO转染子用作对照。按照制造商的说明(Invitrogen)所述的使用Trizol来提取RNA。将RNA(5μg)与放射性标记的探针在55℃杂交过夜，探针产自人细胞因子/RNA模板套系，mCK-3b(RiboQuant，BD-PharMingen，San Diego，CA，USA)。将RNAse处理在37℃进行45分钟，此后纯化受保护的探针，并使用TBE缓冲液中的5％聚丙烯酰胺凝胶(BioRad)通过凝胶电泳来收集。将凝胶干燥并暴露于Kodak Biomax XL X-射线胶片(Eastman Kodak，Rochester，NY，USA)。使用未消化的探针作为标记，在半对数坐标纸上以移动距离对核苷酸长度来作出标准曲线。然后从图中推断样品中RNAse保护条带的特性。

如图20D中所示的，用CSA-hCD40L刺激导致IL-6mRNA超过单独的CSA 2.8-倍提高。

总而言之，这些数据表明人和鼠CSA-CD40L能够诱导单核细胞和巨噬细胞中的CD40信号。

(g)CSA-hCD40L刺激IFN-γ引发的巨噬细胞中的iNOS产生

IFN-γ引发的巨噬细胞的CD40连接导致一氧化氮产生的刺激，这在巨噬细胞的杀微生物和细胞毒活性中起着关键作用。可诱导的一氧化氮合酶(iNOS)属于从L-精氨酸催化合成一氧化氮的一氧化氮合酶家族。Th1和Th2 T辅助细胞可以不同地调节巨噬细胞中的精氨酸代谢。Th1细胞诱导通过巨噬细胞的iNOS产生，而Th2细胞诱导巨噬细胞产生精氨酸酶，其与抗炎功能相关。因此，巨噬细胞iNOS产生是Th1型免疫应答的标志。

如下证明了CSA-CD40L部分刺激鼠巨噬细胞中iNOS产生的能力。用IFN-γ将CD40KO-人CD40细胞引发24小时，随后用CSA-hCD40L、rhsCD40L或单独的CSA刺激24h。将细胞裂解物标准化并通过蛋白质印迹来分析，使用抗-iNOS Ab。如图21中所证明的，用CSA-hCD40L或rhsCD40L而不是CSA刺激巨噬细胞导致iNOS产生的刺激。用1μg/ml商业rhsCD40L刺激导致超过背景6倍的iNOS刺激，而用300ng/ml的CSA-hCD40L刺激导致超过单独的CSA9倍的iNOS刺激。这些数据表明CSA-hCD40L是巨噬细胞iNOS产生的有效刺激剂。

实施例20：由CSA-4-1BBL诱导的体内杀灭应答

用50μg卵清蛋白(OVA)作为抗原，和两个剂量(各自为12.5μg和25μg)的CSA-4-1BBL或LPS作为佐剂，在静脉内免疫天然C57BL/6小鼠。将天然动物用作对照。

七天后，所有小鼠接受如下制备的CFSE标记的目标细胞。将来自天然C57BL/6小鼠的脾细胞分成两群。用0.25μM CFSE(CFSE^低)标记第一个群，用2.5μM CFSE标记第二个群，然后用2μg/ml OVA_257-264肽(SIINFEKL)脉冲1小时(CFSE^高)。将细胞以1∶1的比例混合，将总的1×10⁷个细胞静脉内注射至接受动物中。48小时后收集脾脏，并通过流式细胞术分析CFSE荧光强度。结果显示于图22中，表示为肽脉冲的CFSE^高峰与参照CFSE^低峰相比较的百分比裂解，标准化至天然动物。如图22中所示的，用OVA和CSA-4-1BBL免疫在目标细胞内产生了有效的体内杀灭应答，CSA-4-1BBL证明了在两个测试的浓度比LPS更强的佐剂作用。

实施例21：用4-1BBL共刺激极大程度地提高了小鼠中对HPV16 E7蛋白的免疫应答，控制了TC-1肿瘤并诱导了抗肿瘤记忆。

在基于给予HPV16 E7抗原决定部位P1的CD8+T细胞抗原决定部位(具有氨基酸序列RAHYNIVTF)的接种实验方案中，在右侧用1×10⁵个活的TC-1细胞皮下激发天然B6小鼠，TC-1细胞稳定表达人***状瘤病毒-16E7蛋白。图23显示了该TC-1肿瘤模型中小鼠的存活。10天后，小鼠接受一次以下之一的皮下注射：(i)PBS(◆，n＝20)；(ii)50μg P1+12.5μg CSA(■，n＝6)；(iii)25μg CSA-4-1BBL(▲，n＝10)；(iv)50μg P1+25μg CSA-4-1 BBL(Δ，n＝13)，或(v)50μg P1+10μgCpG(□，n＝7)。

如图23中所示的，用P1或CSA-4-1 BBL免疫获得了一些成功的免疫治疗，但是用P1和CSA-4-1 BBL接种获得了更高的结果(包括提高的存活)。所有只接受PBS的动物产生了肿瘤。

在第60天(黑色箭头)将存活的动物再次激发。一周监控肿瘤生长3次。与单独的P1或CSA-4-1 BBL，或P1和CpG相比较，肿瘤激发后一起给予CSA-4-1 BBL和P1限制提高了动物的存活。重要地，P1+CSA-4-1 BBL组中没有一个存活动物在第二次激发时产生肿瘤，证明了免疫记忆。

实施例22：接种OVA/CSA-4-1 BBL防止了肿瘤生长

用缀合25μg CSA-4-1 BBL的50μg OVA或50μg生物素化的OVA免疫天然C57BL/6小鼠。留下一些动物未处理作为对照。7天后，用1×10⁵个OVA表达-EG.7肿瘤细胞在右侧皮下激发小鼠。使用卡尺一周监控肿瘤生长三次。结果(无肿瘤存活)显示于图24中。如所示的，所有对照动物和接种OVA的动物产生了肿瘤，而接种了生物素化的OVA/CSA-4-1 BBL的所有动物没有产生肿瘤，证明了接种生物素化的OVA/CSA-4-1 BBL导致thyoma肿瘤生长的100％防止。

实施例23：4-1 BBL强烈提高了体内抗原特异性CTL应答

用(1)50μg OVA，(ii)50μg OVA和25μg CSA-4-1BBL，(iii)50μgOVA和25μg抗-CD137抗体或(iv)50μg OVA和25μg LPS给天然C57BL/6小鼠静脉内免疫。天然动物用作对照。七天后，所有小鼠接受CFSE标记的靶细胞。简而言之，将来自天然C57BL/6小鼠的脾脏分成两群。用0.25μM CFSE标记第一个群(CFSE低)。用2.5μM CFSE标记第二个群，然后用2μg/ml OVA_257-264 SIINFEKL肽脉冲1小时(CFSE高)。将细胞以1:1的比例混合，并将总的1×10⁷个细胞静脉内注射至接受动物中。48小时后收集脾脏，并通过流式细胞术分析CFSE荧光强度，结果显示于图25中。将结果表示于每个图的角上，作为肽脉冲的CFSE高峰与参照CFSE低峰相比较的百分比裂解，标准化至天然动物。该测试揭示了4-1BBL可以将抗原特异性的CTL应答提高至较高水平(95％)，与单独的抗原(OVA)(24.2％)，或抗原和LPS(35％)相比较，导致大部分靶细胞的杀灭。

实施例24：4-1BBL共刺激提高了体内抗原递呈至CD8+T细胞用(i)10μg OVA，(ii)10μg OVA和5μg 4-1BBL将天然B6-SJL(CD45.1+)动物静脉内免疫，或(iii)留下未处理。2天后，通过静脉内注射，动物接受1×10⁶ CFSE标记的OT-1细胞(CD45.2+)。3天后收集脾脏，并使用流式细胞术分析OT-1细胞的增殖，如图26中所示的。4-1BBL和抗原的一起给予提高了抗原递呈至CD8+T细胞，如通过大部分OT-1细胞的增殖所证明的。(对于OVA+4-1BBL为83.2％；对于OVA为13.7％；对于未处理的为8.8％)。

实施例25：4-1BBL共刺激提高了树突细胞的抗原吸收

给天然BALB/c小鼠皮下注射25μg OVA-FITC，25μg OVA-FITC和10μg CSA，或25μg OVA-FITC和25μg CSA-4-1BBL。3小时后，收集注射部位的腹股沟***。使用流式细胞术分析FITC+CD11c+群中的细胞，来测定体内荧光标记的抗原更新，如图27中所看到的。如所示的，4-1 BBL信号提高了CD11c+DC的抗原吸收，而对照CSA蛋白没有效果。

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尽管足够详细地描述和举例说明了本发明，用于本领域技术人员来制备和使用，各种替换、改变和改进应当是清楚的，而没有脱离本发明的精神和范围。在此提供的实施例是优选实施方案的表示，并不是打算来限制本发明的范围。本领域技术人员将产生其中的改变和其他用途。这些改变包括在本发明精神内，并由权利要求的范围来限定。

对在此公开的本发明形成各种替代和改变而没有脱离本发明的范围和精神是本领域技术人员显而易见的。

说明书中提及的所有专利和出版物是本发明所属领域的普通技术人员水平的表示。在此引入所有专利和出版物作为参考，至如同每篇单独的出版物特意并单独表示引入作为参考的相同程度。

可以在缺少在此未特意公开的任意要素、限制的情况下合适地实施在此说明性描述的本发明。因此，例如，在此的每个情况中，术语“包括”、“基本上包括”和“包含”中的任一个可以由其他两个术语中的任一个来替代。已经使用的术语和表述用作描述而非限制的术语，没有使用这样的术语和表述排除所示和所述的任何等价特征或其一部分的意图，但是认为各种改变在所要求的本发明范围内是可能的。因此，应当理解尽管已经通过优选的实施方案和任选特征特异性地公开了本发明，在此公开的概念的改变和变化依靠本领域的技术人员，并且认为这样的改变和变化在所附权利要求限定的本发明的范围内。

以下列出了其他示例性实施方案和权利要求：

示例性实施方案

1.一种组合，其包括：

(a)第一缀合物，包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的缀合物成员；和

(b)第二缀合物，包括(i)包括第一抗原的缀合物成员和(ii)包括所述结合对的第二个成员的缀合物成员。

2.实施方案1的组合，其中所述结合对的所述第一个成员包括抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，并且所述结合对的所述第二个成员包括生物素。

3.实施方案2的组合，其中所述结合对的所述第一个成员包括核心链霉抗生物素蛋白。

4.实施方案1的组合，其中所述第一缀合物包括融合多肽，该融合多肽包括所述第一免疫共刺激多肽和所述结合对的所述第一个成员。

5.实施方案1的组合，其中所述第一免疫共刺激多肽选自4-1 BBL、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80和CD40L。

6.实施方案5的组合，其中所述第一免疫共刺激多肽是4-1 BBL。

7.实施方案6的组合，其中所述第一缀合物包括融合多肽，该融合多肽包括SEQ ID NO：8的氨基酸序列。

8.实施方案1的组合，其中所述第一抗原与感染剂相关。

9.实施方案8的组合，其中所述感染剂选自人或禽流感和人免疫缺陷病毒。

10.实施方案1的组合，其中所述第一抗原是肿瘤相关抗原。

11.实施方案10的组合，其中所述肿瘤相关抗原选自人末端酶逆转录酶，survivin，MAGE-1，MAGE-3，人绒膜***，癌胚抗原，α胎蛋白，胰腺癌胚抗原，MUC-1，CA125，CA15-3，CA19-9，CA549，CA195，***特异性抗原；***特异性膜抗原，Her2/neu，gp-100，突变K-ras蛋白，突变p53，截断的上皮生长因子受体，嵌合蛋白^p210BCR-ABL；HPV E6，HPV E7；EB病毒EBNA3蛋白，及其组合或片段。

12.实施方案1的组合，其中作为分开的组合物来提供所述第一和第二缀合物。

13.实施方案1的组合，其中作为单个组合物来提供所述第一和第二缀合物。

14.实施方案13的组合，其中所述组合物包括药物学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

15.实施方案13的组合，其中，在所述组合物中提供的，所述第一缀合物通过所述第一个和第二个结合对成员之间的结合与所述第二缀合物结合。

16.实施方案1的组合，其中所述第一免疫共刺激多肽没有包括免疫共刺激分子的跨膜结构域。

17.实施方案1的组合，其中所述第一免疫共刺激多肽包括免疫共刺激分子的跨膜结构域，或其受体结合部分。

18.实施方案1的组合，进一步包括第三缀合物，包括(i)包括第二免疫共刺激多肽和结合对的第一个成员的缀合物成员和(ii)包括第二抗原和结合对的第二个成员的缀合物成员，其中：

所述第二免疫共刺激多肽与所述第一免疫共刺激多肽相同或不同；所述第二抗原与所述第一抗原相同或不同；所述第三缀合物的第一个和第二个结合对成员与所述第一和第二缀合物的所述第一个和第二个结合对成员相同或不同，和

所述第一缀合物成员通过所述第一个和第二个结合对成员之间的结合与所述第二缀合物结合。

19.一种组合，包括：

(a)第一缀合物，包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的缀合物成员；和

(b)第二缀合物，包括(i)包括感染剂的缀合物成员和(ii)包括所述结合对的第二个成员的缀合物成员。

20.产生或增强对抗表达肿瘤相关抗原的肿瘤的免疫应答的方法，包括将以下物质给予带有所述肿瘤的患者：

(a)第一缀合物，包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的缀合物成员，和第二缀合物，包括(i)包括所述第一肿瘤相关抗原的缀合物成员和(ii)包括所述结合对的第二个成员的缀合物成员；或

(b)已经用所述第一缀合物和第二缀合物在体外处理过的免疫细胞。

21.实施方案20的方法，其中将所述第一和第二缀合物给予所述患者。

22.实施方案21的方法，其中分开给予所述第一和第二缀合物。

23.实施方案21的方法，其中同时给予所述第一和第二缀合物。

24.实施方案20的方法，其中在单个组合物中提供所述第一和第二缀合物。

25.实施方案24的方法，其中，在所述组合物中提供的，所述第一缀合物通过所述第一个和第二个结合对成员之间的结合与所述第二缀合物结合。

26.实施方案21的方法，其中通过肿瘤内注射来给予所述第一和第二缀合物中的至少一个。

27.实施方案20的方法，其中所述第一肿瘤相关抗原选自人末端酶逆转录酶，survivin，MAGE-1，MAGE-3，人绒膜***，癌胚抗原，α胎蛋白，胰腺癌胚抗原，MUC-1，CA125，CA15-3，CA19-9，CA549，CA195，***特异性抗原；***特异性膜抗原，Her2/neu，gp-100，突变K-ras蛋白，突变p53，截断的上皮生长因子受体，嵌合蛋白^p210BCR-ABL；HPV E6，HPV E7；EB病毒EBNA3蛋白，及其组合或片段。

28.实施方案20的方法，进一步包括给予第三个组合物，其包括(i)包括第二免疫共刺激多肽和结合对的第一个成员的缀合物成员和(ii)包括第二肿瘤相关抗原和结合对的第二个成员的缀合物成员，其中：

所述第二免疫共刺激多肽与所述第一免疫共刺激多肽相同或不同；所述第二抗原与所述第一抗原相同或不同；所述第三缀合物的第一个和第二个结合对成员与所述第一和第二缀合物的所述第一个和第二个结合对成员相同或不同，和

所述第一缀合物成员通过所述第一个和第二个结合对成员之间的结合与所述第二缀合物结合。

29.实施方案28的方法，其中所述第二肿瘤相关抗原选自人末端酶逆转录酶，survivin，MAGE-1，MAGE-3，人绒膜***，癌胚抗原，α胎蛋白，胰腺癌胚抗原，MUC-1，CA125，CA15-3，CA19-9，CA549，CA195，***特异性抗原；***特异性膜抗原，Her2/neu，gp-100，突变K-ras蛋白，突变p53，截断的上皮生长因子受体，嵌合蛋白^p210BCR-ABL；HPV E6，HPV E7；EB病毒EBNA3蛋白，及其组合或片段。

30.实施方案20的方法，其中所述结合对的所述第一个成员包括抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，并且所述结合对的所述第二个成员包括生物素。

31.实施方案30的方法，其中所述结合对的所述第一个成员包括核心链霉抗生物素蛋白。

32.实施方案20的方法，其中所述第一缀合物包括融合多肽，该融合多肽包括所述第一免疫共刺激多肽和所述结合对的所述第一个成员。

33.实施方案20的方法，其中所述第一免疫共刺激多肽选自4-1BBL、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80和CD40L。

34.实施方案33的方法，其中所述第一免疫共刺激多肽是4-1BBL。

35.实施方案34的方法，其中所述第一缀合物包括融合多肽，该融合多肽包括SEQ ID NO：8的氨基酸序列。

36.实施方案20的方法，其中所述免疫共刺激多肽没有包括免疫共刺激分子的跨膜结构域。

37.实施方案20的方法，其中所述免疫共刺激多肽包括免疫共刺激分子的胞外结构域，或其受体结合部分。

38.实施方案20的方法，其中将已经用所述第一和第二缀合物在体外处理过的免疫细胞给予所述患者。

39.实施方案38的方法，其中所述免疫细胞包括所述免疫共刺激多肽的受体，并且其中所述第一缀合物通过所述免疫共刺激多肽和所述受体之间的结合与所述免疫细胞缀合，并且所述第二缀合物通过所述第一个和第二个结合对成员之间的结合与所述免疫细胞缀合。

40.实施方案38的方法，其中用所述第一和第二缀合物同时处理所述免疫细胞。

41.实施方案38的方法，其中用所述第一和第二缀合物分开处理所述免疫细胞。

42.修饰免疫细胞来产生或增强对表达肿瘤相关抗原的肿瘤或对感染剂的免疫应答的方法，包括将表达第一免疫共刺激多肽受体的免疫细胞接触：

(a)第一缀合物，包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的缀合物成员；和

(b)第二缀合物，包括(i)包括感染剂的缀合物成员和(ii)包括所述结合对的第二个成员的缀合物成员，

其中所述第一缀合物通过所述免疫共刺激多肽和所述受体之间的结合与所述免疫细胞缀合，并且所述第二缀合物通过所述第一个和第二个结合对成员之间的结合与所述免疫细胞缀合。

43.实施方案42的方法，其中将所述第一缀合物和第二缀合物分开接触。

44.实施方案42的方法，其中将所述第一和第二缀合物同时接触。

45.实施方案44的方法，其中在单个组合物中提供所述第一和第二缀合物。

46.实施方案45的方法，其中，在所述组合物中提供的，所述第一缀合物通过所述第一个和第二个结合对成员之间的结合与所述第二缀合物结合。

47.实施方案42的方法，其中所述通过将所述第一和第二缀合物给予含有所述免疫细胞的患者来实现所述接触。

48.实施方案47的方法，其中所述第二缀合物包括肿瘤相关抗原，所述患者进一步包括所述肿瘤，通过肿瘤内注射来给予所述第一和第二缀合物中的至少一个。

49.实施方案42的方法，其中所述免疫细胞是T细胞或嗜中性粒细胞。

50.实施方案49的方法，其中所述T细胞选自CD4+细胞、CD8+细胞、自然杀伤细胞、单核细胞和树突细胞。

51.实施方案42的方法，其中所述第二抗原包括肿瘤相关抗原。

52.实施方案51的方法，其中所述肿瘤相关抗原选自人末端酶逆转录酶，survivin，MAGE-1，MAGE-3，人绒膜***，癌胚抗原，α胎蛋白，胰腺癌胚抗原，MUC-1，CA125，CA15-3，CA19-9，CA549，CA195，***特异性抗原；***特异性膜抗原，Her2/neu，gp-100，突变K-ras蛋白，突变p53，截断的上皮生长因子受体，嵌合蛋白^p210BCR-ABL；HPV E6，HPV E7；EB病毒EBNA3蛋白，及其组合或片段。

53.实施方案42的方法，其中所述第二缀合物包括与感染剂相关的抗原或感染剂。

54.实施方案42的方法，其中所述感染剂是细菌。

55.实施方案54的方法，其中所述细菌选自结合分枝杆菌；炭疽杆菌；金黄色葡萄球菌。

56.实施方案42的方法，其中所述感染剂是病毒。

57.实施方案56的方法，其中所述病毒选自腺病毒；沙粒病毒；杯状病毒；冠状病毒；丝状病毒；黄病毒；肝病毒；疱疹病毒；正黏液病毒；***瘤病毒；微小病毒；痘病毒；呼吸孤病毒；逆转录病毒；棒状病毒；和披膜病毒。

58.实施方案42的方法，其中所述感染剂是寄生物。

59.实施方案58的方法，其中所述寄生物选自变形体和利什曼虫。

60.实施方案42的方法，其中所述感染剂是真菌。

61.实施方案60的方法，其中所述真菌选自曲霉属；假丝酵母属；球虫属；隐球菌；Geotricha；组织胞浆菌；微孢子虫；肺孢子虫。

62.实施方案47的方法，其中所述患者选自马、羊、公山羊、牛、猪、鸟类、狗、猫和灵长类物种。

63.实施方案47的方法，其中所述患者是人。

64.实施方案42的方法，其中所述免疫细胞包括第二免疫共刺激多肽的受体，该方法进一步包括将所述免疫细胞接触第三缀合物，其包括(i)包括所述第二免疫共刺激多肽和结合对的第一个成员的缀合物成员和(ii)包括第二个与所述肿瘤或感染剂相关的抗原或所述感染剂和所述结合对的第二个成员的缀合物成员，其中：

所述第二免疫共刺激多肽与所述第一免疫共刺激多肽相同或不同；所述第二抗原，如果存在，与所述第一抗原(如果存在)相同或不同；所述第三缀合物的第一个和第二个结合对成员与所述第一和第二缀合物的所述第一个和第二个结合对成员相同或不同，和

所述第一缀合物成员通过所述第一个和第二个结合对成员之间的结合与所述第二缀合物结合。

65.实施方案42的方法，其中所述结合对的所述第一个成员包括抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，而所述结合对的所述第二个成员包括生物素。

66.实施方案65的方法，其中所述结合对的所述第一个成员包括核心链霉素。

67.实施方案42的方法，其中所述第一缀合物包括融合多肽，该融合多肽包括所述第一免疫共刺激多肽和所述结合对的所述第一个成员。

68.实施方案42的方法，其中所述第一免疫共刺激多肽选自4-1BBL、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80和CD40L。

69.实施方案68的方法，其中所述第一免疫共刺激多肽是4-1BBL。

70.实施方案69的方法，其中所述第一缀合物包括融合多肽，该融合多肽包括SEQ ID NO：8的氨基酸序列。

71.实施方案42的方法，其中所述免疫共刺激多肽没有包括免疫共刺激分子的跨膜结构域。

72.实施方案42的方法，其中所述免疫共刺激多肽包括免疫共刺激分子的胞外结构域，或其受体结合部分。

73.通过实施方案42的方法制得的免疫细胞群，其中接触其他免疫细胞时，所述免疫细胞产生或增强对所述肿瘤的免疫应答。

74.表达第一免疫共刺激多肽受体的修饰免疫细胞，其中所述修饰的免疫细胞包括：

(a)第一缀合物，包括(i)包括所述第一免疫共刺激多肽的缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的缀合物成员；和

(b)第二缀合物，包括(i)包括第一抗原或感染剂的缀合物成员和(ii)包括所述结合对的第二个成员的缀合物成员，

其中所述第一缀合物通过所述免疫共刺激多肽和所述受体之间的结合与所述免疫细胞缀合，并且所述第二缀合物通过所述第一个和第二个结合对成员之间的结合与所述免疫细胞缀合。

75.实施方案74的免疫细胞，其中所述免疫细胞选自T细胞、嗜中性粒细胞、自然杀伤细胞、单核细胞和树突细胞。

76.实施方案75的免疫细胞，其中所述T细胞选自CD4+细胞和CD8+细胞。

77.实施方案76的免疫细胞，其中所述结合对的所述第一个成员包括抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，并且所述结合对的所述第二个成员包括生物素。

78.实施方案76的免疫细胞，其中所述结合对的所述第一个成员包括核心链霉抗生物素蛋白。

79.实施方案74的免疫细胞，其中所述第一缀合物包括融合多肽，该融合多肽包括所述第一免疫共刺激多肽和所述结合对的所述第一个成员。

80.实施方案74的免疫细胞，其中所述第一免疫共刺激多肽选自4-1BBL、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80和CD40L。

81.实施方案80的免疫细胞，其中所述第一免疫共刺激多肽是4-1BBL。

82.诱导或增强对抗感染剂的免疫应答的方法，包括将以下物质给予患有所述感染剂感染或处于所述感染剂传染风险中的患者：

(a)第一缀合物，包括(i)包括所述第一免疫共刺激多肽的缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的缀合物成员；和

(b)第二缀合物，包括(i)包括第一个与所述感染剂相关的抗原或包括所述感染剂的缀合物成员和(ii)包括所述结合对的第二个成员的缀合物成员。

83.实施方案82的方法，其中将所述第一和第二缀合物分开给予。

84.实施方案82的方法，其中将所述第一和第二缀合物同时给予。

85.实施方案84的方法，其中在单个组合物中提供所述第一和第二缀合物。

86.实施方案85的方法，其中，在所述组合物中提供的，所述第一缀合物通过所述第一个和第二个结合对成员之间的结合与所述第二缀合物结合。

87.实施方案82的方法，其中通过选自以下的途径来给予所述第一和第二缀合物中的至少一个：口服；舌下；经粘膜；经皮；直肠；***；皮下；肌内、静脉内；动脉内；鞘内；通过导管；通过植入；和直接至肿瘤中。

88.实施方案82的方法，其中所述感染剂是细菌。

89.实施方案88的方法，其中所述细菌选自结合分枝杆菌；炭疽杆菌；金黄色葡萄球菌。

90.实施方案82的方法，其中所述感染剂是病毒。

91.实施方案90的方法，其中所述病毒选自腺病毒；沙粒病毒；杯状病毒；冠状病毒；丝状病毒；黄病毒；肝病毒；疱疹病毒；正黏液病毒；***瘤病毒；微小病毒；痘病毒；呼吸孤病毒；逆转录病毒；棒状病毒；和披膜病毒。

92.实施方案82的方法，其中所述感染剂是寄生物。

93.实施方案92的方法，其中所述寄生物选自变形体和利什曼虫。

94.实施方案82的方法，其中所述感染剂是真菌。

95.实施方案94的方法，其中所述真菌选自曲霉属；假丝酵母属；球虫属；隐球菌；Geotricha；组织胞浆菌；微孢子虫；肺孢子虫。

96.实施方案82的方法，其中所述患者选自马、羊、公山羊、牛、猪、鸟类、狗、猫和灵长类物种。

97.实施方案96的方法，其中所述患者是人。

98.实施方案82的方法，其中所述感染是人或禽流感，并且所述抗原选自H、N、M1、M2e、NS1、NS2(NEP)、NP、PA、PB1和PB2。

99.实施方案82的方法，其中所述感染是HIV，并且所述第一抗原选自由Gag蛋白、Pol、Vif、Vpr、Rev、Vpu、包膜抗原决定部位、Tat和Nef构成的HIV抗原。

100.实施方案82的方法，进一步包括给予第三缀合物，其包括(i)包括第二免疫共刺激多肽和结合对的第一个成员的缀合物成员和(ii)包括第二个与所述感染相关的抗原或所述感染剂和所述结合对的第二个成员的缀合物成员，其中：

所述第二免疫共刺激多肽与所述第一免疫共刺激多肽相同或不同；所述第二抗原，如果存在，与所述第一抗原(如果存在)相同或不同；所述第三缀合物的第一个和第二个结合对成员与所述第一和第二缀合物的所述第一个和第二个结合对成员相同或不同，和

所述第一缀合物成员通过所述第一个和第二个结合对成员之间的结合与所述第二缀合物结合。

101.实施方案100的方法，其中所述感染是人或禽流感，并且所述第二抗原是H、N、M1、M2e、NS1、NS2(NEP)、NP、PA、PB1和PB2。

102.实施方案101的方法，其中所述感染是HIV，并且所述第二抗原选自由Gag蛋白、Pol、Vif、Vpr、Rev、Vpu、包膜抗原决定部位、Tat和Nef构成的HIV抗原。

103.实施方案82的方法，其中所述结合对的所述第一个成员包括抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，并且所述结合对的所述第二个成员包括生物素。

104.实施方案103的方法，其中所述结合对的所述第一个成员包括核心链霉抗生物素蛋白。

105.实施方案82的方法，其中所述第一缀合物包括融合多肽，该融合多肽包括所述第一免疫共刺激多肽和所述结合对的所述第一个成员。

106.实施方案82的方法，其中所述第一免疫共刺激多肽选自4-1BBL、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80和CD40L。

107.实施方案106的方法，其中所述第一免疫共刺激多肽是4-1BBL。

108.实施方案107的方法，其中所述第一缀合物包括融合多肽，该融合多肽包括SEQ ID NO：8的氨基酸序列。

109.实施方案82的方法，其中所述免疫共刺激多肽不包括免疫共刺激分子的跨膜结构域。

110.实施方案82的方法，其中所述免疫共刺激多肽包括免疫共刺激分子的胞外结构域，或其受体结合部分。

111.基本上由免疫共刺激多肽和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白构成的缀合物，其中所述免疫共刺激多肽选自4-1 BBL、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80和CD40L。

112.实施方案111的缀合物，包括核心链霉抗生物素蛋白。

113.实施方案111的缀合物，其中所述免疫共刺激多肽选自4-1BBL、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF和APRIL。

114.诱导动物中免疫刺激应答的方法，基本上包括将缀合物给予动物，该缀合物基本上由免疫共刺激多肽和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白构成。

115.实施方案114的方法，其中所述缀合物包括核心链霉抗生物素蛋白。

116.实施方案114的方法，其中所述免疫共刺激多肽选自4-1BBL、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80和CD40L。

117.实施方案116的方法，其中所述免疫共刺激多肽选自4-1BBL、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF和APRIL。

118.包括免疫共刺激多肽和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的缀合物，其中所述免疫共刺激多肽选自4-1 BBL、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80和CD40L。

119.诱导动物中免疫刺激应答的方法，包括将缀合物给予动物，该缀合物包括免疫共刺激多肽和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，其中所述免疫共刺激多肽选自4-1 BBL、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80和CD40L。

120.实施方案119的方法，进一步包括将抗原给予动物。

121.实施方案120的方法，其中作为包括所述抗原和结合对成员的缀合物来给药所述抗原。

序列表

<110>UNIVERSITY OF LOUISVILLE RESEARCH FOUNDATION，INC.

<120>免疫刺激组合物和方法

<130>060592-0139

<140>PCT/US06/046662

<141>2006-12-07

<150>60/748,177

<151>2005-12-08

<150>60/771,179

<151>2006-02-06

<150>60/799,643

<151>2006-05-12

<150>60/863,173

<151>2006-10-27

<160>22

<170>PatentIn Ver.3.3

<210>1

<211>1213

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的核苷酸构建体

<400>1

<210>2

<211>307

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的融合蛋白

<400>2

<210>3

<211>1268

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的核苷酸构建体

<400>3

<210>4

<211>368

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的融合蛋白

<400>4

<210>5

<211>1294

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的核苷酸构建体

<400>5

<210>6

<211>358

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的融合蛋白

<400>6

<210>7

<211>1295

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的核苷酸构建体

<400>7

<210>8

<211>357

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

      人工序列的描述：合成的融合蛋白

<223>

<400>8

<210>9

<211>1334

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的核苷酸构建体

<400>9

<210>10

<211>376

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

     人工序列的描述：合成的融合蛋白

<223>

<400>10

<210>11

<211>158

<212>PRT

<213>人***状瘤病毒

<400>11

<210>12

<211>151

<212>PRT

<213>人***状瘤病毒

<400>12

<210>13

<211>98

<212>PRT

<213>人***状瘤病毒

<400>13

<210>14

<211>1303

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的核苷酸构建体

<400>14

<210>15

<211>364

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的核融合蛋白

<400>15

<210>16

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的肽

<400>16

<210>17

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的肽

<400>17

<210>18

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的肽

<400>18

<210>19

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的6x His标记物

<400>19

<210>20

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的肽

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<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的肽

<400>21

<210>22

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的肽

<400>22

Claims (20)

1.一种组合，其包括：

(a)第一缀合物，其包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的缀合物成员；和

(b)第二缀合物，其包括(i)包括第一抗原的缀合物成员和(ii)包括所述结合对的第二个成员的缀合物成员。

2.权利要求1的组合，其中所述结合对的所述第一个成员包括抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，并且所述结合对的所述第二个成员包括生物素。

3.权利要求1的组合，其中所述第一免疫共刺激多肽选自4-1BBL、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80和CD40L。

4.权利要求1的组合，其中所述第一抗原选自与感染剂相关的抗原和肿瘤相关抗原。

5.一种组合，其包括：

(a)第一缀合物，其包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的缀合物成员；和

(b)第二缀合物，其包括(i)包括与感染剂相关的抗原或感染剂的缀合物成员和(ii)包括所述结合对的第二个成员的缀合物成员。

6.权利要求5的组合，其中感染剂选自细菌、病毒和寄生物。

7.产生或增强对抗表达第一肿瘤相关抗原的肿瘤的免疫应答的方法，所述方法包括将以下物质给予带有所述肿瘤的患者：

(a)第一缀合物，其包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的缀合物成员，和第二缀合物，其包括(i)包括所述第一肿瘤相关抗原的缀合物成员和(ii)包括所述结合对的第二个成员的缀合物成员；或

(b)已经用所述第一和第二缀合物在体外处理过的免疫细胞。

8.权利要求7的方法，其中所述结合对的所述第一个成员包括抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，并且所述结合对的所述第二个成员包括生物素。

9.权利要求7的方法，其中所述第一免疫共刺激多肽选自4-1BBL、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80和CD40L。

10.权利要求7的方法，其中所述患者选自马、羊、公山羊、牛、猪、鸟类、狗、猫和灵长类物种。

11.权利要求10的方法，其中所述患者是人。

12.修饰免疫细胞来产生或增强对表达肿瘤相关抗原的肿瘤或对感染剂的免疫应答的方法，所述方法包括将表达第一免疫共刺激多肽受体的免疫细胞接触：

(a)第一缀合物，包括(i)包括所述第一免疫共刺激多肽的缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的缀合物成员；和

(b)第二缀合物，包括(i)包括与所述肿瘤或感染剂相关的抗原或所述感染剂的缀合物成员和(ii)包括所述结合对的第二个成员的缀合物成员，

其中所述第一缀合物通过所述免疫共刺激多肽和所述受体之间的结合与所述免疫细胞缀合，并且所述第二缀合物通过所述第一个和第二个结合对成员之间的结合与所述免疫细胞缀合。

13.表达第一免疫共刺激多肽受体的修饰免疫细胞，其中所述修饰的免疫细胞包括：

(a)第一缀合物，其包括(i)包括所述第一免疫共刺激多肽的缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的缀合物成员；和

(b)第二缀合物，其包括(i)包括第一抗原或感染剂的缀合物成员和(ii)包括所述结合对的第二个成员的缀合物成员，

其中所述第一缀合物通过所述免疫共刺激多肽和所述受体之间的结合与所述免疫细胞缀合，并且所述第二缀合物通过所述第一个和第二个结合对成员之间的结合与所述免疫细胞缀合。

14.诱导或增强对抗感染剂的免疫应答的方法，所述方法包括将以下物质给予患有所述感染剂感染或处于所述感染剂感染风险中的患者：

(a)第一缀合物，其包括(i)包括第一免疫共刺激多肽的缀合物成员和(ii)包括结合对的第一个成员的缀合物成员；和

(b)第二缀合物，其包括(i)包括与所述感染剂相关的第一抗原或包括所述感染剂的缀合物成员和(ii)包括所述结合对的第二个成员的缀合物成员。

15.权利要求4的方法，其中所述患者选自马、羊、公山羊、牛、猪、鸟类、狗、猫和灵长类物种。

16.权利要求15的方法，其中所述患者是人。

17.包括免疫共刺激多肽和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的缀合物，其中所述免疫共刺激多肽选自4-1BBL、CD86、ICOSL、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、OX40L、CD27L、CD30L、LIGHT、BAFF、APRIL、CD80和CD40L。

18.诱导动物中免疫刺激应答的方法，所述方法包括将缀合物给予动物，该缀合物包括免疫共刺激多肽和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白。

19.权利要求18的方法，其中该方法进一步包括将抗原给予动物。

20.权利要求18的方法，其中所述动物选自马、羊、公山羊、牛、猪、鸟类、狗、猫和灵长类物种。

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