CN101422170A - 一种防治烟草赤星病的球孢链霉菌菌剂及其制备方法 - Google Patents

一种防治烟草赤星病的球孢链霉菌菌剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种防治烟草赤星病病害的生物制剂。该生物制剂的生产菌株分类命名为球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)AM6，保藏号为CGMCCNo.1701。所述菌株的液体和固体培养基配方如下：①试管斜面培养基配方为：新鲜马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂17－20g，蒸馏水1000ml，pH自然；②液体发酵培养基配方为：黄豆粉10.0g，蔗糖20.0g，磷酸氢二钾2g、硫酸亚铁0.02g、碳酸钙0.5g、硫酸镁0.05g、自来水1000ml、pH自然。本发明经菌株的试管培养，摇床发酵培养，制备为生物制剂。试验结果表明，本发明提供的生物制剂对烟草赤星病具有良好的防治效果。

Description

一种防治烟草赤星病的球孢链霉菌菌剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物农药，更具体地说，本发明涉及一种防治烟草赤星病的菌剂及其制备方法。
背景技术
烟草是我国重要的叶用经济作物，是病害危害最严重的作物之一，从播种到收获，整个过程都可受到病原物的侵染。烟草赤星病(Tobacco BrownSpot Disease)是烟叶成熟后期重要的叶部病害，在各烟区普遍发生，是我国烟草的主要病害。近年来，我国的湖南、安徽、贵州、云南、陕西、辽宁、浙江、广东、福建、黑龙江、吉林等省的赤星病也有所发展，成为为害最大的一种叶斑病，一般年份发病率为20％～30％，严重的发病率达90％、减少产值达50％以上，对产量、质量影响较大。
烟草赤星病是一种典型的气传病害，目前国内在防治时主要以保健栽培等农业措施和大剂量的化学农药等防治措施，缺乏可供区域栽培的抗性品种；多年使用菌核净进行防治，导致用药成本在逐年攀升，防治效果在逐步减弱，一些病原真菌已产生抗药性，防治难度也随之加大。
由于化学药剂极易形成药害，施药时也易受雨水的冲刷而失效，而且缺乏高效低毒化学防治药剂，连续用药易造成农药残留，对环境造成的恶劣影响，污染水源，造成人畜中毒、死亡，同时也使病原菌产生抗药性，致使其使用受到一定限制。另一方面，烟草赤星病是烟草成熟期病害，由于对烟草安全性的要求越来越高，对烟草栽培本身来说，就提出了更高的要求，特别是对于烟草赤星病这种成熟期病害的防治不大适宜采用有残留的化学药剂。这是本领域一个急待解决的技术难题。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足之处，提供一种有效、无毒、安全、无残留、使用简便的防治烟草赤星病的菌剂。同时，本发明还提供一种所述菌剂的制备方法。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
A.本发明提供了一种防治烟草赤星病的菌剂，该菌剂采用的放线菌是分类命名为球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)AM6，保藏编号为CGMCC No.1701。
本发明的生产菌株球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)AM6，分离自云南蒙自典型的烟草赤星病病斑上，室内离体叶片悬滴法测定发现100倍带菌培养液对赤星病的防效均达100％，平皿测定发现AM6100倍带菌培养液对强致病力病菌的抑制作用为100％，其灭菌滤液的抑制效果为81.8％，其抑菌机理主要是产生拮抗物质，显微镜观察表明AM6能使病菌孢子和菌丝畸变，细胞壁破裂，原生质泄露。该菌株具有以下特征：
①在高氏一号琼脂和天门冬素琼脂上28℃培养7～10天后，菌株AM6基内菌丝无横隔，不断裂，无孢囊；气生菌丝分枝较多；孢子丝直或弯曲，偶丛生；孢子球形或卵圆形，表面光滑。在8种培养基上生长的结果见表1。
表1.菌株AM6在8种培养基上的培养特征
Figure A200810233501D00041
②全细胞水解液含有LL-二氨基庚二酸(LL-DAP，LL-Diaminopimelicacid)，甘氨酸，糖无特征性(糖型C)；含有磷脂酰乙醇胺(PE)，磷酸类脂为II型。
③具有以下生理生化特性：氨酸酶阴性，可在纤维素上生长，产生类黑色素，不产生H2S，液化明胶，胨化牛奶，不凝固牛奶，水解淀粉，还原硝酸盐，利用L-***糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-木糖、半乳糖，不利用甘露糖、棉籽糖、肌醇。
B.本发明提供了球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)AM6生物制剂的制备方法，该法采用以下步骤：
1.试管种培养
试管斜面培养基配方为：新鲜马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂17-20g，蒸馏水1000ml，pH自然。
将球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)AM6划线接种到试管斜面培养基上，在28℃±1℃恒温培养4～5天，获得试管种。
2.液体发酵培养
液体发酵培养基配方为：黄豆粉10.0g，蔗糖20.0g，磷酸氢二钾2g、硫酸亚铁0.02g、碳酸钙0.5g、硫酸镁0.05g、自来水1000ml、pH自然。
将每支试管斜面加无菌水5-10ml，用接种环刮下分生孢子，摇匀，形成孢子悬液，以0.2％的体积比接入装培养液量为40％～60％(装培养液的容积与容器的容积比)的三角瓶中，于28℃±1℃恒温150～200转/分钟转速振荡培养7～8天，涂片，镜检，产生大量孢子，平板计数测定含孢量，当每毫升含孢量达100亿以上时，停止发酵，室温静置12小时。
3.制剂化
球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)AM6的菌剂为液体发酵制剂，制备方法如下：发酵静置后的菌液加入0.5％羧甲基纤维素钠、0.2％的苯甲酸纳、5％的菌核净，50转/分钟转速渐渐加速搅拌至250转/分钟时，恒速连续搅拌15分钟，胶体磨破碎，过200目流体筛，装入塑料旋盖瓶中。
该液体发酵制剂保质期1年，施用时需要充分摇匀。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明利用生物防治技术，研制成功了一种高效、无毒、安全、无残留、使用简便的防治烟草赤星病的菌剂。这对减轻病害危害、减少化学农药的使用量、减少环境污染、降低农药残留都具有良好效果；
2.本发明对克服病原真菌的抗药性，提高烟叶品质，增强烟草农田生态***稳定性，保障烟草产业的可持续发展具有重要的现实意义和广阔的应用前景，将会在未来的进出口贸易竞争中占有有利的地位。
保藏生物材料的说明
本发明所采用菌株，已于2006年4月24日在位于中国北京中关村的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，分类命名为球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)AM6，保藏编号为CGMCC No.1701。
具体实施方式
通过下面给出的具体实施例和应用实施例，可以进一步清楚地了解本发明。但它们不是对本发明保护范围的限定。
实施例1
——液体发酵菌剂制备方法1
(1)菌种制备
将球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)AM6菌株划线接种到试管斜面培养基(新鲜马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂17-20g，蒸馏水1000ml，pH自然。)上，在28℃恒温培养4～5天，获得试管种。
(2)液体发酵培养
将每支试管斜面加无菌水10ml，用接种环刮下分生孢子，摇匀，形成孢子悬液，以0.2％的体积比接入装有300ml培养液(黄豆粉10.0g，蔗糖20.0g，磷酸氢二钾2g、硫酸亚铁0.02g、碳酸钙0.5g、硫酸镁0.05g、自来水1000ml、pH自然。)的500ml三角瓶中，于28℃恒温150～200转/分钟转速振荡培养7～8天，涂片，镜检，产生大量孢子，平板计数测定含孢量，当每毫升含孢量达100亿以上时，停止发酵，室温静置12小时。
(3)制剂化
本发明生防菌株球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)AM6的菌剂为液体发酵制剂，制备方法如下：
发酵静置后的菌液加入0.5％羧甲基纤维素钠、0.2％的苯甲酸纳、5％的菌核净，50转/分钟转速渐渐加速搅拌至250转/分钟时，恒速连续搅拌15分钟，胶体磨破碎，过200目流体筛，装入250ml塑料旋盖瓶中。即得本发明的液体菌剂。
实施例2
——液体发酵制剂制备方法2
(1)菌种制备
同实施例1。
(2)液体发酵培养
分为摇瓶发酵培养和发酵罐发酵培养。摇瓶发酵培养除培养发酵时间缩短至4～5天外，其余同上例中的液体发酵培养，观察菌丝较丰、菌丝上新生大量孢子，平板计数测定含孢量，当每毫升含孢量达60亿以上，获得发酵罐母种。再以此为母种按0.2％的体积比接入装有培养液(黄豆粉10.0g，蔗糖20.0g，磷酸氢二钾2g、硫酸亚铁0.02g、碳酸钙0.5g、硫酸镁0.05g、自来水1000ml、pH自然。)的发酵罐中，于28℃恒温150-200转/分钟转速培养6～7天，平板计数测定含孢量，当每毫升含孢量达100亿以上时，停止发酵，室温静置12小时。
(3)制剂化
同实施例1。
应用实施例1
——菌剂的同田对比试验
1.1材料与方法
试验田块及管理：选取地势较平整、肥力较一致，往年赤星病高发区田块。栽培的品种为当地主栽品种，株行距1.0-1.1×0.55-0.60米。除在烟苗移栽成活后，不施用叶面杀真菌剂以外，无特殊要求。其它按当地常规措施进行栽培管理。
处理设置：本发明菌剂(200倍)、多抗霉素(600倍)、菌核净(斯佩斯牌，40％可湿性粉剂500倍)、赤斑特(500倍)，1个清水空白对照，共5个处理，每处理面积0.5亩。
施药方法：各药剂在烟草赤星病发病初期(或大田生产发现轻微症状出现时)即开始喷药，用工农16型背负式喷雾器，按试验设计浓度要求兑水混合均匀，在烟株叶正反面均匀喷雾，隔7～10天喷1次，共施2次。
观察与记录：分别调查各处理的赤星病病情，在第1次喷雾用药前1天或当天进行调查，最后一次用药后的第7天调查1次。调查按(YC/T39-1996)烟草行业标准执行。调查取样时，按五点取样，即每个小区五点定株取样10株作定点调查，以叶片为单位，分别分级调查记载指定叶位叶片的发病情况。计算病情指数和防效。
1.2结果与分析
不同药剂的同田对比试验表明，供试的4种药剂对烟草赤星病的防治效果有较大的差异。施药2次后，以菌核净和本发明菌剂对赤星病的防治效果较好，分别为74.6％和73.6％，以多抗霉素的防效较差，为66.2％。从供试2种生物制剂对赤星病防效的比较表明，本发明菌剂具有较好的开发应用前景见表2。
表2.菌剂的的同田对比试验结果
应用实施例2
——菌剂的试验示范
采用多点小规模推广方式进行，在红塔区、蒙自县、宾川县、弥勒县等4地的烤烟种植区生产推广部门为依托，采用多抗霉素、本发明菌剂统一部署了200亩的试验示范，并以菌核净作对照，以同片面积约0.5亩的田块作空白对照。结果表明，在病害发生不严重的前提下，多抗霉素、链霉菌制剂与对照药剂菌核净差异不显著，见表3。在认真做好测报的条件下，病情不严重时，本发明的菌剂可大面积推广使用。
表3 防治烟草赤星病试验示范效果
Figure A200810233501D00091

Claims (3)

1.一种防治烟草赤星病的菌剂，其特征在于：该菌剂的生产菌株为球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)AM6，保藏号为：CGMCCNo.1701。
2.根据权利要求1所述的菌剂，所述菌株的液体和固体培养基配方如下：①试管斜面培养基配方为：新鲜马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂17-20g，蒸馏水1000ml，pH自然；②液体发酵培养基配方为：黄豆粉10.0g，蔗糖20.0g，磷酸氢二钾2g、硫酸亚铁0.02g、碳酸钙0.5g、硫酸镁0.05g、自来水1000ml、pH自然。
3.一种防治烟草赤星病的菌剂的制备方法，其特征在于采用以下步骤：
(1)试管种培养
试管斜面培养基配方为：新鲜马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂17-20g，蒸馏水1000ml，pH自然；将球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)AM6划线接种到试管斜面培养基上，在28℃±1℃恒温培养4～5天，获得试管种；
(2)液体发酵培养
液体发酵培养基配方为：黄豆粉10.0g，蔗糖20.0g，磷酸氢二钾2g、硫酸亚铁0.02g、碳酸钙0.5g、硫酸镁0.05g、自来水1000ml、pH自然；将每支试管斜面加无菌水5-10ml，用接种环刮下分生孢子，摇匀，形成孢子悬液，以0.2％的体积比接入装培养液量为40％～60％(装培养液的容积与容器的容积比)的三角瓶中，于28℃±1℃恒温150～200转/分钟转速振荡培养7～8天，涂片，镜检，产生大量孢子，平板计数测定含孢量，当每毫升含孢量达100亿以上时，停止发酵，室温静置12小时；
(3)制剂化
球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)AM6的菌剂为液体发酵制剂，制备方法如下：发酵静置后的菌液加入0.5％羧甲基纤维素钠、0.2％的苯甲酸纳、5％的菌核净，50转/分钟转速渐渐加速搅拌至250转/分钟时，恒速连续搅拌15分钟，胶体磨破碎，过200目流体筛，装入塑料旋盖瓶中；即制得所需的防治烟草赤星病的菌剂。
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