CN101418347A

CN101418347A - 黄颡鱼性染色体特异分子标记及遗传性别鉴定方法

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Publication number: CN101418347A
Application number: CNA2008102366500A
Authority: CN
Inventors: 桂建芳; 王达; 毛慧玲; 陈宏溪; 刘汉勤
Original assignee: Institute of Hydrobiology of CAS
Current assignee: Institute of Hydrobiology of CAS
Priority date: 2008-12-04
Filing date: 2008-12-04
Publication date: 2009-04-29
Anticipated expiration: 2028-12-04
Also published as: CN101418347B

Abstract

本发明公开了一种黄颡鱼性染色体特异分子标记及遗传性别鉴定方法，包括黄颡鱼XY性染色体特异AFLP标记的筛选和克隆，黄颡鱼XY性染色体特异SCAR标记的设计，黄颡鱼性染色体基因型(XX/XY/YY)PCR鉴定方法的建立。本发明建立了黄颡鱼性染色体特异AFLP标记筛选方法，从256个AFLP引物组合中筛选到3个引物组合能够产生4个X或Y染色体特异AFLP片段，创建了黄颡鱼性染色体基因型PCR鉴定方法。本发明首次筛选到黄颡鱼X和Y染色体特异分子标记，建立了黄颡鱼遗传性别鉴定方法，并将本方法应用到全雄黄颡鱼培育过程中的遗传性别鉴定。本发明具有高效，准确和稳定的特点，在黄颡鱼性别控制和全雄黄颡鱼苗种的持续规模化生产中具有重要的应用价值。

Description

黄颡鱼性染色体特异分子标记及遗传性别鉴定方法

技术领域

本发明属于水产生物技术领域中的鱼类遗传性别鉴定和性别控制技术，更具体涉及一种黄颡鱼性染色体特异分子标记及遗传性别鉴定方法。本发明在黄颡鱼的性别控制和全雄苗种的培育中具有重要的应用价值，同时在其它鱼类性别控制和单性苗种生产中也具有应用前景。

背景技术

黄颡鱼[Pelteobagrus fulvidraco(Richardson)]是具有较高经济价值的底栖鲶形目鲿科鱼类，广泛分布于江河、湖泊、水库等水域。其肉质鲜美，营养丰富，肌间刺少，因而深受消费者青睐。近年来价格较高，市场需求量日益增大。黄颡鱼雄鱼比雌鱼生长快。据调查，在相同养殖条件下，第一年雄性黄颡鱼比同胞雌鱼的生长速度快30％左右。在养殖的第二年，其雄鱼生长至150-200克，而雌鱼却只有50-75克，雌雄生长差异接近3倍。因此，如果能够在育种中人工控制黄颡鱼的性别，培育出全雄黄颡鱼，将大大提高产量，降低养鱼成本，提高经济效益。

生产单性雄鱼有几种方法可供选择：如人工挑选、雄性激素直接诱导性逆转、雄核发育、种间杂交、人工诱导三倍体以及遗传学方法等。目前，使用遗传学的方法生产XY全雄鱼在尼罗罗非鱼单性养殖使用过。这种称为GMT技术，适用于雄性配子异型的鱼类，方法可靠、稳定，而且对环境友好，无不良的影响。

最近刘汉勤等成功地从XY生理雌鱼雌核发育产生了YY超雄鱼，并且通过与XX雌鱼测交得到了全雄子代，验证了YY超雄鱼的存在，说明了该技术路线的可行性，也为全雄黄颡鱼的生产打下了坚实的基础。但当应用到大规模生产中时，该技术存在一些技术瓶颈，阻碍了全雄鱼的生产，比如：生产实践中发现，通过黄颡鱼XY雌鱼雌核发育产生YY超雄鱼的同时，也产生了XY正常雄鱼，其数量与YY超雄鱼不相上下，阻碍了YY超雄鱼在全雄鱼苗培育中的应用。因此如何准确快捷地鉴定开YY和XY雄鱼成为实现全雄黄颡鱼苗规模化生产中的一个关键点。传统的方法只有通过测交实验后，根据子代性别比例，才能判断出其父本为遗传YY或XY雄鱼；而在测交实验中，测交子代需要养殖3个月以上才能解剖根据组织学判断其性别，因此实验周期长，养殖成本高，不利于大规模生产；不仅如此，多年来的繁殖实验，还未发现YY超雄鱼具有和正常XY雄鱼一样的自然繁殖能力；而且黄颡鱼***为小叶型，在行人工繁殖时几乎是无法挤出***的，因此测交实验时，通常要杀掉雄鱼从***获得***进行人工授精。因此无法通过测交实验直接获得活的YY超雄鱼用于持续生产全雄鱼苗。

综上所述，要实现全雄黄颡鱼苗的规模化生产，急需一种经济、快捷、准确且不须杀害黄颡鱼的YY超雄鱼鉴定方法。

随着DNA分子标记技术的发展和成熟，利用DNA标记鉴定性别成为可能，为我们提供一种经济简捷并且准确的遗传性别鉴定手段，但前提是要先筛选到性别特异DNA标记。目前，在一些经济鱼类中，通过各种DNA分子标记技术(RAPDs，RFLPs，SSRs，AFLPs等)筛选性别特异标记已有许多报道，如：Kovacs等利用RAPD扫描非洲鲶鱼(Clarias gariepinus)雌、雄基因池，找到两个雄性性别相关的RAPD标记；Sakamoto等发现两个SSR标记(OmyFGT19 TUF和OmyRGT28 TUF)与雄性虹鳟(Oncorhynchusmykiss)的性别决定位点相连锁。同时，鱼类的性别特异DNA标记通常具有物种或者品系特异性，一种鱼类的性别特异标记通常不能跨物种使用，因此要利用分子标记实现黄颡鱼的遗传性别鉴定，首先要筛选到黄颡鱼的性别特异标记。

AFLP分子标记技术是一种基于PCR技术的多位点分子标记技术，具有显示出很强多态性的能力。每对AFLP选择性扩增引物能够获得50-100个条带，通过有限的引物组合可以获得大量的扩增片段。因此AFLP分子标记特别适于对尚无分子遗传信息背景的物种进行研究。近五年来AFLP分子标记技术在筛选性别标记研究中得到了较广泛应用，并且有一些成功的报道，如Ezaz等用AFLP技术扫描尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus L.)基因组，找到3个Y染色体连锁(OniY425.OniY382.OniY227)和一个X染色体连锁(OniX420)的AFLP标记；Brunelli等应用AFLP也找到了一个新的大鳞***哈鱼Y染色体特异的标记。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种黄颡鱼性染色体特异分子标记及遗传性别鉴定方法，方法简单，操作方便，结合传统的YY超雄鱼培育路线，可以实现全雄黄颡鱼鱼苗的规模化生产，进而为黄颡鱼养殖业提供全雄鱼苗，最终达到提高黄颡鱼的产量，降低养鱼的成本，提高了经济效益的目的。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

如上所述，要实现全雄黄颡鱼的大规模生产，其关键点在于急需一种经济、快捷、准确且不须杀害黄颡鱼的YY超雄鱼鉴定方法。因此，本发明通过筛选获得黄颡鱼性染色体特异DNA标记，并利用该标记实现快捷准确地鉴定黄颡鱼的遗传性别，通过鉴定获得大YY超雄鱼用于全雄黄颡鱼苗的生产。

本发明的基本构思是：首先，采用AFLP分子标记技术，筛选获得黄颡鱼X和Y染色体特异AFLP标记，转化成简捷使用的SCAR标记后，建立黄颡鱼性染色体基因型(XX/XY/YY)PCR鉴定方法；其次，将本方法应用到全雄黄颡鱼培育中的遗传性别鉴定，为全雄黄颡鱼苗的生产提供可靠的YY超雄鱼。

本发明的方法是：采用AFLP分子标记技术筛选黄颡鱼X和Y性染色体特异AFLP标记，克隆这些X或Y性染色体特异AFLP标记并序列分析，通过染色体步移克隆这些特异标记DNA片段的侧翼DNA序列，通过序列分析比对，选择适合设计引物的性染色体特异位点，设计特异引物，将这些标记转化为方便使用的SCAR标记，结合X和Y染色体特异SCAR标记，建立黄颡鱼性染色体基因型(XX/XY/YY)PCR鉴定方法，将本方法应用到全雄黄颡鱼培育中各种繁殖组合的遗传性别鉴定，最终鉴定出YY超雄鱼用于全雄黄颡鱼的生产。

因此，本发明包括四大步骤：一)筛选和克隆黄颡鱼XY性染色体特异AFLP标记；二)转化为XY性染色体特异SACR标记；三)建立黄颡鱼性染色体基因型PCR鉴定方法；四)在全雄黄颡鱼培育中进行遗传性别鉴定。

上述的一)筛选和克隆黄颡鱼XY性染色体特异AFLP标记包括：

1.XY性染色体特异的AFLP标记筛选；2.性染色体特异AFLP标记的克隆与序列分析；

其中上述的1.XY性染色体特异的AFLP标记的筛选：

按照常规方法从黄颡鱼XX雌鱼、XY雄鱼和YY超雄鱼尾鳍样品中提取基因组DNA，通过琼脂糖电泳及分管光度计来检测DNA的浓度，最终将DNA浓度稀释成30ng/μl。

AFLP筛选包括以下步骤：1)使用商业上获得的MseI和EcoRI限制性内切酶(NEB公司)对DNA模板进行酶切，2)使用商业上获得的T4DNA连接酶(NEB公司)，将特异接头连接到酶切片段两端，3)进行预扩增，4)进行选择性扩增，5)电泳分析。

使用商业上获得的Taq DNA聚合酶进行选择性扩增，采用上海生物工程公司合成的AFLP引物(16个MseI序列引物分别与16个EcoRI序列引物进行组合，共256个引物组合)，对黄颡鱼8个XX雌鱼，8个XY雄鱼和8个YY超雄鱼个体的基因组进行AFLP扩增分析。其中3个引物组合扩增出2个X染色体特异AFLP片段和2个Y染色体特异AFLP片段。具体为：编号62引物组合(序列为SEQ ID NO.1的上游引物E6和序列为SEQ ID NO.2的下游引物M2)在所有XY和YY个体中均扩增出一个大小为233bp的特异片段，同时编号33引物组合(序列为SEQ ID NO.3的上游引物E3和序列为SEQ ID NO.4的下游引物M3)在所有XY和YY个体中均扩增出一个大小为226bp的特异片段，而这两个特异片段在所有XX个体的扩增产物中均不出现，因此将这类只在所有XY和YY个体中出现，而在XX个体中不出现的片段作为Y染色体特异AFLP片段；另外，编号62引物组合在所有XX和XY个体中均扩增出一个大小为239bp的特异片段，同时63号引物组合(序列为SEQ ID NO.1的上游引物E6和序列为SEQ ID NO.4的下游引物M2)在所有XX和XY个体中均扩增出一个大小为226bp的特异片段，而这两个片段在所有YY个体中均不出现，因此将这类只在所有XX和XY个体中出现，而在YY个体中不出现的片段作为X染色体特异AFLP片段。

其中上述的2.性染色体特异AFLP标记的克隆与序列分析包括以下步骤：1)黄颡鱼XY性染色体特异AFLP片段的回收；2)性染色体特异AFLP片段的克隆；3)性染色体特异AFLP片段的序列分析；

上述的1)黄颡鱼XY性染色体特异AFLP片段的回收：

AFLP扩增产物经电泳分离后，从聚丙烯酰胺凝胶切下XY性染色体特异片段，用50μl单蒸水漂洗后，加入50μl单蒸水，并将凝胶捣碎，于95℃中加热15min，使目标DNA片段从凝胶中释放出来。短暂离心后，上清溶液作为选择性扩增的模板，用每个特异片段所对应的选择性扩增引物以及同样的PCR条件分别进行再次AFLP选择性扩增。

扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离检测，紫外灯照射下从凝胶中切下特异片段，通过凝胶回收试剂盒(Omega公司)回收纯化特异片段备用。

上述的2)性染色体特异AFLP片段的克隆：

将回收的4个特异片段连接到商业上获得的pMD18-T载体(Takara公司)后，采用标准方法转化感受态大肠杆菌DH5α(购自武汉大学菌种保藏中心)，采用常规PCR法筛出含有目标片段的阳性克隆。

上述的3)性染色体特异AFLP片段的序列分析：

选取阳性克隆，送至上海联合基因公司测序。测序结果通过DNAMAN4.0软件分析(Lynnon公司)。克隆了上述2个黄颡鱼Y染色体特异AFLP片段和2个X染色体特异AFLP片段，分别命名为Pf-Y62、Pf-Y33、Pf-X62和Pf-X63，其序列分别为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。序列分析显示：性染色体特异AFLP片段Pf-X62和Pf-Y62为黄颡鱼X和Y染色体上的一对等位序列，它们的序列差异在于6个碱基的***或缺失以及1个碱基的替换；性染色体特异AFLP片段Pf-X33和Pf-Y63也是黄颡鱼X和Y染色体上的一对等位序列，它们的序列差异在于1个碱基的替换。

上述的二)转化为XY性染色体特异SACR标记包括：

1.染色体步移获得性染色体特异片段的侧翼序列；2.序列分析比对，选择性染色体特异位点设计引物；3.转化为SCAR标记；

上述的1.染色体步移获得性染色体特异片段的侧翼序列：

使用商业上获得的染色体步移试剂盒(Genome Walking Kit，Takara公司)，通过三轮扩增，克隆黄颡鱼XY性染色体特异的2对等位序列的侧翼序列，按照试剂盒说明书的要求，其过程包括：

1)SP1引物分别与本试剂盒中的AP1、AP2、AP3、AP4引物组合，以黄颡鱼XX和YY个体基因组DNA为模板，进行第一轮扩增；

2)SP2引物分别与本试剂盒中的AP1、AP2、AP3、AP4引物组合，以第一轮扩增产物为模板，进行第二轮扩增；

3)SP3引物分别与本试剂盒中的AP1、AP2、AP3、AP4引物组合，以第二轮扩增产物为模板，进行第三轮扩增；

4)第三轮扩增产物通过1％琼脂糖凝胶电泳分离，切下清晰条带，通过琼脂糖凝胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit，Omiga公司)回收，并连接到商业上获得的pMD18-T载体(Takara公司)后，采用标准方法转化感受态大肠杆菌DH5α(购自武汉大学菌种保藏中心)，采用常规PCR法筛出含有目标片段的阳性克隆。

上述的2.序列分析比对，选择性染色体特异位点设计引物：

选取阳性克隆，送至上海联合基因公司测序。测序结果通过DNAMAN4.0软件(Lynnon公司)与原特异片段拼接和分析，最终获得2对性染色体特异的等位序列各约1.5Kb。从染色体步移获得的侧翼序列中选择X和Y染色体差异位点较为丰富的大小为311bp-624bp的片段用于序列分析，其序列分别为SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12和SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列，其中SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10为同一个基因在X染色体上存在的2种大小的拷贝；通过分析比对性染色体特异等位序列分别在黄颡鱼X和Y染色体上拷贝的序列差异，发现一批稳定的X和Y染色体序列差异位点，可以用来区分X或Y染色体；从中选择部分X和Y性染色体存在序列差异且适合设计引物的位点，设计了4对特异引物，分别为：

1)Y染色体特异标记Pf-Y62引物：

由序列为SEQ ID NO，14的上游引物Pf-XY62L和序列为SEQ IDNO，15的下游引物Pf-Y62R组合；

2>X染色体特异标记Pf-X62引物：

由序列为SEQ ID NO，14的上游引物Pf-XY62L和序列为SEQ IDNO.16的下游引物Pf-X62R组合；

3)Y染色体特异标记Pf-Y33引物：

由序列为SEQ ID NO.17的上游引物Pf-Y33L和序列为SEQ ID NO.18的下游引物Pf-Y33R组合；

4)X染色体特异标记Pf-X63引物：

由序列为SEQ ID NO.19的上游引物Pf-X63L和序列为SEQ ID NO.20的下游引物Pf-X63R组合；

上述的3.转化为SCAR标记：

采用上一步设计的4对性染色体特异标记引物，在黄颡鱼XX，XY和YY个体基因组DNA中扩增，PCR反应体系为25μl：2，5μl 10×PCRbuffer，2.0μl 25mM Mgcl₂，1U TaqDNA聚合酶，0.5μl 10mM dNTP，0.5uM上下游引物，20ng DNA，加水至25μl；扩增条件分别为：

Pf-Y62或Pf-X62：94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，循环数为36；

Pf-Y33或Pf-X63：94℃ 30s，65℃/-0.5℃ 30s，72℃ 30s，循环数为10；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，循环数为25；

扩增结果显示：Pf-Y62引物组合可以从黄颡鱼XY雄鱼和YY超雄鱼基因组中扩增出一个片段大小为568bp的特异片段，pf-Y33引物组合可以从黄颡鱼XY雄鱼和YY超雄鱼基因组中扩增出一个片段大小为462bp的特异DNA片段，而这两个引物组合从XX雌鱼个体基因组中则均不能扩增出该特异片段。Pf-X62引物组合可以从黄颡鱼XX雌鱼和XY雄鱼基因组中扩增出一个片段大小为598bp或285bp的特异DNA片段，Pf-X63引物组合可以从黄颡鱼XX雌鱼和XY雄鱼基因组中扩增出一个片段大小为462bp的特异DNA片段，而这两个引物组合从YY超雄鱼个体基因组中则均不能扩增出该特异片段。

上述的三)建立黄颡鱼性染色体基因型PCR鉴定方法包括：

1.取样和DNA提取：

采集黄颡鱼尾鳍样品，贮存于无水乙醇中，按照常规方法提取基因组DNA。

2.PCR反应：

选用所设计的4个SCAR标记中的任意一个X染色体特异SCAR标记和一个Y染色体特异SCAR标记作为组合，分别在待鉴定黄颡鱼样品基因组DNA中扩增。PCR反应体系和扩增条件均如步骤二)转化为XY性染色体特异SACR标记中的3.转化为SCAR标记中所述的PCR反应体系和扩增条件。

3.结果判断：

根据每个样品的扩增结果来判断其性染色体基因型：只能够扩增出X染色体特异SCAR特异标记片段，而扩增不出Y染色体特异SCAR标记片段的个体为遗传XX个体；既能扩增出X染色体特异SCAR标记片段，又能扩增出Y染色体SCAR标记片段的个体为遗传XY个体；只能扩增出Y染色体特异SCAR标记片段，而扩增不出X染色体特异SCAR标记片段的个体为遗传YY个体。

上述的四)在全雄黄颡鱼培育中进行遗传性别鉴定包括：1.XX雌鱼×XY雄鱼交配组合子代遗传性别鉴定；2.XY雌鱼雌核发育组合子代遗传性别鉴定；3.YY生理雌鱼×XY雄鱼交配组合子代遗传性别鉴定；4.YY生理雌鱼×YY超雄鱼交配组合子代遗传性别鉴定；5.XX雌鱼×YY超雄鱼交配组合子代遗传性别鉴定。

上述步骤四)的1.XX雌鱼×XY雄鱼交配组合子代遗传性别鉴定：

待子代长至性成熟，从外观判断待鉴定黄颡鱼性别后，分别剪取雌、雄黄颡鱼尾鳍样品，按常规方法提取基因组DNA。采用上述步骤三)所述的黄颡鱼性染色体基因型PCR鉴定方法，选用Y染色体特异SCAR标记Pf-Y62引物扩增各样品DNA，根据扩增结果判断样品的遗传性别：能够扩增出一个大小为568bp特异片段的个体为遗传XY鱼，不能扩增出该特异片断的个体为遗传XX鱼。结果显示：所有从外观判断为雄鱼的个体均能扩增出一个大小为568bp特异片段，而从外观判断为雌鱼的个体均不能扩增出该特异片段。因此，分子标记鉴定出的遗传性别与其性别表型完全一致(图2)。

上述步骤四)的2.XY雌鱼雌核发育组合子代遗传性别鉴定：

采集黄颡鱼XY雌鱼雌核发育子代XX雌鱼、XY雄鱼和YY超雄鱼各12尾(已通过测交实验鉴定个体遗传性别)，剪取尾鳍样品，按照常规方法提取基因组DNA。采用上述步骤三)所述的黄颡鱼性染色体基因型PCR鉴定方法：选用所设计的4个SCAR标记所对应的引物组合，分别在以上36个黄颡鱼样品基因组DNA中扩增。如步骤三)所述的方法，根据扩增结果判断各样品的遗传性别，结果显示：所有12个XX雌鱼样品均能够扩增出两个X染色体特异SCAR标记片段，不能扩增出Y染色体特异SCAR标记片段；所有12个XY雄鱼样品均既能扩增出两个X染色体特异SCAR标记片段，又能扩增出两个Y染色体SCAR标记片段；所有12个YY超雄鱼样品均能扩增出两个Y染色体特异SCAR标记片段，扩增不出X染色体特异SCAR标记片段。因此，由性染色体特异SCAR标记鉴定出的各样品遗传性别与测交实验鉴定出的结果完全一致(图3)。

上述步骤四)的3.YY生理雌鱼×XY雄鱼交配组合子代遗传性别鉴定：

从YY雌鱼×XY雄鱼交配组合子代中抽取114尾鱼，剪取小片尾鳍，用常规方法提取基因组DNA后，采用上述步骤三)所述的黄颡鱼性染色体基因型PCR鉴定方法：选用Pf-Y62和Pf-X63标记进行遗传性别鉴定。结果显示Pf-Y62引物组合在所有114个样品中均能扩增出一个片段大小为568bp的特异片段；与此同时Pf-X63引物则只在57个样品中能够扩增出一个片段大小为462bp的特异片段，其余57个样品无扩增产物，说明在114尾子代中有57尾(50％)YY超雄鱼和57尾XY雄鱼(图4)。

上述步骤四)的4.YY生理雌鱼×YY超雄鱼交配组合子代遗传性别鉴定：

从YY生理雌鱼×YY超雄鱼交配组合中抽取42尾子代，剪取小片尾鳍，用常规方法提取基因组DNA。采用上述步骤三)所述的黄颡鱼性染色体基因型PCR鉴定方法：选用Pf-Y62和Pf-X62两个标记进行遗传性别鉴定。两个标记扩增结果显示，Pf-Y62引物组合在42个样品中均能扩增出一个片段大小为568bp的Y染色体特异片段，而Pf-X62引物组合在42个样品中均无扩增产物，表明所有42尾子代均为YY超雄鱼(图5)。

上述步骤四)的5.XX雌鱼×YY超雄鱼交配组合子代遗传性别鉴定：

从上述步骤3和4所鉴定得到的YY超雄鱼中各选取5尾YY超雄鱼，性成熟后分别与XX雌鱼进行交配。待测交子代长至4个月时，随机抽取400尾仔鱼，解剖后根据组织学判断性腺为***或卵巢来判断鱼的性别。解剖结果显示，所有400尾鱼均为雄鱼；同时从中随机抽取20尾鱼剪取尾鳍，按照常规方法提取基因组DNA，采用上述步骤三)所述的黄颡鱼性染色体基因型PCR鉴定方法，选用Pf-Y62标记于20个样品的基因组DNA中扩增。结果显示，所有个体均能扩增出一个片段大小为568bp的特异片段，说明它们均为遗传上的雄鱼，同时再次说明了上述步骤3和4鉴定的YY超雄鱼为遗传上的YY鱼(图6)。

本发明的特点是：

(1)首先筛选到黄颡鱼X和Y染色体特异AFLP标记，并将它们转化成方便使用的SCAR标记，从而建立了黄颡鱼性染色体基因型鉴定PCR方法；

(2)首先通过上述方法鉴定出YY超雄鱼，从而避免了通过测交实验鉴定YY超雄鱼所带来的人力和物力的消耗，也避免了进行测交实验时对YY超雄鱼的伤害；

(3)本发明所描述的分子标记辅助的全雄黄颡鱼培育方法目前在国内外均无报道，本方法具有高效、准确、稳定和经济的特点，推广后将有助于实现全雄黄颡鱼苗的规模化生产，显著提高黄颡鱼养殖业的生产效率。同时本方法也可推广到其它经济鱼类的性别控制育种中，具有重要的经济价值和社会价值。

附图说明

图1A.黄颡鱼性染色体特异标记片段的序列比对分析(Pf62XS和Pf62XL分别为Pf-X62标记在X染色体上两种不同大小拷贝的序列；Pf62Y为Pf-Y62标记在Y染色体上的序列)；黑色背景的碱基为三个序列相同位点，其余蓝白色背景的碱基为差异位点。方框内为设计的性染色体特异引物位点。

B.Pf-Y33和Pf-X33标记的DNA序列分析(33X为X染色体特异的拷贝，33Y为Y染色体特异的拷贝)。黑色背景的碱基为三个序列相同位点，其余蓝白色背景的碱基为差异位点。方框内为性染色体特异引物位点。

图2应用Y染色体特异SCAR标记Pf-Y62鉴定XX雌鱼×XY雄鱼交配组合子代的遗传性别。

图3利用X和Y性染色体特异SCAR标记鉴定XY生理雌鱼雌核发育组合子代的遗传性别。

图4利用性染色体特异SCAR标记Pf-Y62和Pf-X63鉴定YY生理雌鱼与XY正常雄鱼交配组合子代的遗传性别。

图5利用性染色体特异SCAR标记Pf-Y62和Pf-X62鉴定YY生理雌鱼与YY超雄鱼交配组合子代的遗传性别。

图6利用性染色体特异SCAR标记Pf-Y62鉴定YY超雄鱼与正常XX雌鱼交配组合子代的遗传性别。

具体实施方式

实施例1

一种黄颡鱼性染色体特异分子标记及遗传性别鉴定方法，其步骤是：

本发明包括四大步骤：一)筛选和克隆黄颡鱼XY性染色体特异AFLP标记；二)转化为XY性染色体特异SACR标记；三)建立黄颡鱼性染色体基因型PCR鉴定方法；四)在全雄黄颡鱼培育中进行遗传性别鉴定。

上述的一)筛选和克隆黄颡鱼XY性染色体特异AFLP标记，包括：

其中上述的1.XY性染色体特异的AFLP标记筛选：

AFLP筛选包括以下步骤：

1)基因组DNA模板酶切：

使用商业上获得的MseI和EcoRI限制性内切酶(NEB公司)各5U，同时对300ng基因组DNA进行双酶切，酶切条件为37℃，反应3小时后70℃对限制性内切酶灭活15min。

2)将特异接头连接到酶切片段两端：

商业上合成特异接头，

EcoRI接头：5-CTC GTA GAC TGC GTA CC-3

CAT CTG ACG CAT GG TTAA-5

MseI接头：5-GACG ATG AGT CCT GAG-3

TAC TCA GGA CTCAT-5

向上一步酶切产物中分别加入：MseI接头(50μM)和EcoRI接头(5μM)各1μl，商业上获得的T4 DNA连接酶(NEB公司)0.2μl，13.8μl单蒸水，4.0μl buffer。4℃反应过夜。

3)进行预扩增：

使用商业上获得的Taq DNA聚合酶(Fermanta公司)进行预扩增；将上述的连接产物稀释10倍，作为预扩增的模板；预扩增引物为商业上合成的引物(E+1：5’GACTGCGTACCAATTCA3’，M+1：5’GATGAGTCCTGAGTAAC3’)进行扩增。

4)进行选择性扩增：

使用商业上获得的Taq DNA聚合酶进行选择性扩增；将上述预扩增产物稀释20倍，作为选择性扩增的模板；引物为预扩增引物3’末端加上2个随机碱基，通过商业合成的MseI和EcoRI选择性扩增引物各16个，共组合成256个引物组合进行选择性扩增。

16个EcoRI选择性扩增引物为：

E+3： 5’-GACTGCGTACCAATTCANN-3’

E-AAC E-AAG E-ACA E-ACT E-AAA E-AAT E-ACC E-AGAE-AGT

E-ACC E-ACG E-AGC E-AGG E-ATA E-ATC E-ATG E-ATT

16个MseI选择性扩增引物为：

M+3： 5’-GATGAGTCCTGAGTAACNN-3’

M-CAA M-CAC M-CAG M-CAT M-CCA M-CCC M-CCG M-CCT

M-CTA M-CTC M-CTG M-CTT M-CGA M-CGC M-CGG M-CGT

5)电泳分析：

往上述选择性扩增产物加入1/5体积的6X Loading buffer(Takara公司)上样液，94℃变性5分钟后，迅速置于冰上待用。将6％的聚丙烯酰胺凝胶预电泳，预电泳条件为：恒功率100W，1小时；然后将变性好的选择性扩增产物移到凝胶上电泳，电泳条件为：恒定功率90W，温度50℃，2.5小时。

电泳结束后采用银染法，对聚丙烯酰胺凝胶进行银染：将分离好的6％聚丙烯酰胺凝胶在2升1％乙酸中固定30min；单蒸水漂洗后，置于银染液(2000ml单蒸水+3ml甲醛+2g硝酸银)中银染30min；单蒸水漂洗后，放入预冷的显影液(2000ml单蒸水+3ml甲醛+10g NaOH)中显色至电泳条带清晰后，将凝胶取出用单蒸水漂洗，停止显色。将凝胶自然风干后通过肉眼进行条带分析筛选。

上述的1)黄颡鱼XY性染色体特异AFLP片段的回收：

扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离检测，紫外灯照射下从凝胶中切下特异片段，通过凝胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit，Omega公司)回收纯化特异片段备用。

上述的2)性染色体特异AFLP片段的克隆：

将回收的4个特异片段连接到商业上获得的pMD18-T载体(购自Takara公司)后，采用标准方法转化感受态大肠杆菌DH5α(购自武汉大学菌种保藏中心)，采用常规PCR法筛出含有目标片段的阳性克隆。

上述的3)性染色体特异AFLP片段的序列分析：

上述的二)转化为XY性染色体特异SACR标记包括：

上述的1.染色体步移获得性染色体特异片段的侧翼序列：

4)第三轮扩增产物通过1％琼脂糖凝胶电泳分离，切下清晰条带，通过凝胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit，Omega公司)回收，并连接到商业上获得的pMD18-T载体(购自Takara公司)后，采用标准方法转化感受态大肠杆菌DH5α(购自武汉大学菌种保藏中心)，采用常规PCR法筛出含有目标片段的阳性克隆。

上述的2.序列分析比对，选择性染色体特异位点设计引物：

选取阳性克隆，送至上海联合基因公司测序。测序结果通过DNAMAN 4.0软件(Lynnon公司)与原特异片段拼接和分析，最终获得2对性染色体特异的等位序列各约1.5Kb。从染色体步移获得的侧翼序列中选择X和Y染色体差异位点较为丰富的大小为311bp-624bp的片段用于序列分析，其序列分别为SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12和SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列，其中SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10为同一个基因在X染色体上存在的2种大小的拷贝；通过分析比对性染色体特异等位序列分别在黄颡鱼X和Y染色体上拷贝的序列差异，发现一批稳定的X和Y染色体序列差异位点，用来区分X或Y染色体；从中选择部分X和Y性染色体存在序列差异且适合设计引物的位点，设计了4对特异引物，分别为：

1)Y染色体特异标记Pf-Y62引物：

由序列为SEQ ID NO.14的上游引物Pf-XY62L和序列为SEQ IDNO.15的下游引物Pf-Y62R组合；

2)X染色体特异标记Pf-X62引物：

由序列为SEQ ID NO.14的上游引物Pf-XY62L和序列为SEQ IDNO.16的下游引物Pf-X62R组合；

3)Y染色体特异标记Pf-Y33引物：

4)X染色体特异标记Pf-X63引物：

上述的3.转化为SCAR标记：

采用上一步设计的4对性染色体特异标记引物，在黄颡鱼XX，XY和YY个体基因组DNA中扩增，PCR反应体系为25μl：2.5μl 10×PCRbuffer，2.0μl 25mM Mgcl₂，1U TaqDNA聚合酶，0.5μl 10mM dNTP，0.5uM上下游引物，20ng DNA，加水至25μl；扩增条件分别为：

Pf-Y62或Pf-X62：94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，循环数为36；

上述的三)建立黄颡鱼性染色体基因型PCR鉴定方法包括：

1.取样和DNA提取：

2.PCR反应：

3.结果判断：

上述步骤四)的1.XX雌鱼×XY雄鱼交配组合子代遗传性别鉴定：

待子代长至性成熟，从外观判断待鉴定黄颡鱼性别后，分别剪取雌、雄黄颡鱼尾鳍样品，按常规方法提取基因组DNA。采用上述步骤三)所述的黄颡鱼性染色体基因型PCR鉴定方法，选用Y染色体特异SCAR标记Pf-Y62引物扩增各样品DNA，根据扩增结果判断样品的遗传性别：能够扩增出一个大小为568bp特异片段的个体为遗传XY鱼，不能扩增出该特异片断的个体为遗传XX鱼。结果显示：所有从外观判断为雄鱼的个体均能扩增出一个大小为568bp特异片段，而从外观判断为，雌鱼的个体均不能扩增出该特异片段。因此，分子标记鉴定出的遗传性别与其性别表型完全一致(图2)。

上述步骤四)的2.XY雌鱼雌核发育组合子代遗传性别鉴定：

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院水生生物研究所

<120>黄颡鱼性染色体特异分子标记及遗传性别鉴定方法

<130>黄颡鱼性染色体特异分子标记及遗传性别鉴定方法

<160>20

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

<210>5

<211>211

<212>DNA

<213>Pelteobagrus fulvidraco

<400>5

<210>6

<211>204

<212>DNA

<213>Pelteobagrus fulvidraco

<400>6

<210>7

<211>217

<212>DNA

<213>Pelteobagrus fulvidraco

<400>7

<210>8

<211>204

<212>DNA

<213>Pelteobagrus fulvidraco

<400>8

<210>9

<211>311

<212>DNA

<213>Pelteobagrus fulvidraco

<400>9

<210>10

<211>624

<212>DNA

<213>Pelteobagrus fulvidraco

<400>10

<210>11

<211>594

<212>DNA

<213>Pelteobagrus fulvidraco

<400>11

<210>12

<211>477

<212>DNA

<213>Pelteobagrus fulvidraco

<400>12

<210>13

<211>477

<212>DNA

<213>Pelteobagrus fulvidraco

<400>13

<210>14

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

<210>16、

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

<210>17

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

<210>18

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

<210>19

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

<210>20

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

Claims

1、一种黄颡鱼性染色体特异分子标记及遗传性别鉴定方法，它包括以下步骤：

A.筛选和克隆黄颡鱼XY性染色体特异AFLP标记，首先是XY性染色体特异的AFLP标记筛选，从黄颡鱼XX雌鱼、XY雄鱼和YY超雄鱼尾鳍样品中提取基因组DNA，通过琼脂糖电泳及分管光度计来检测DNA的浓度，最终将DNA浓度稀释成30ng/μl，AFLP筛选包括以下步骤：1)使用MseI和EcoRI限制性内切酶对DNA模板进行酶切；2)使用T4DNA连接酶，将特异接头连接到酶切片段两端；3)进行预扩增；4)进行选择性扩增；5)电泳分析；使用256个引物组合进行AFLP选择性扩增，其中3个引物组合扩增出2个X染色体特异AFLP片段和2个Y染色体特异AFLP片段，为：编号62引物组合，序列为SEQ IDNO.1的上游引物E6和序列为SEQ ID NO.2的下游引物M2，在所有XY和YY个体中均扩增出一个大小为233bp的特异片段，同时编号33引物组合，序列为SEQID NO.3的上游引物E3和序列为SEQ ID NO.4的下游引物M3，在所有XY和YY个体中均扩增出一个大小为226bp的特异片段，这两个特异片段在所有XX个体的扩增产物中不出现，将这类只在所有XY和YY个体中出现，在XX个体中不出现的片段作为Y染色体特异AFLP片段；另外，编号62引物组合，在所有XX和XY个体中均扩增出一个大小为239bp的特异片段，同时63号引物组合，序列为SEQ ID NO.1的上游引物E6和序列为SEQ ID NO.4的下游引物M2，在所有XX和XY个体中均扩增出一个大小为226bp的特异片段，这两个片段在所有YY个体中不出现，将这类只在所有XX和XY个体中出现，在YY个体中不出现的片段作为X染色体特异AFLP片段；其次是性染色体特异AFLP标记的克隆与序列分析，其步骤是：1)黄颡鱼XY性染色体特异AFLP片段的回收；2)性染色体特异AFLP片段的克隆；3)性染色体特异AFLP片段的序列分析；克隆了黄颡鱼X染色体特异AFLP片段和Y染色体特异AFLP片段，分别命名为Pf-Y62、Pf-Y33、Pf-X62和Pf-X63，其序列分别为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；序列分析显示：性染色体特异AFLP片段Pf-X62和Pf-Y62为黄颡鱼X和Y染色体上的一对等位序列，它们的序列差异在于6个碱基的***或缺失以及1个碱基的替换；性染色体特异AFLP片段Pf-X33和Pf-Y63是黄颡鱼X和Y染色体上的一对等位序列，它们的序列差异在于1个碱基的替换；

B.转化为XY性染色体特异SACR标记：首先是染色体步移获得性染色体特异片段的侧翼序列：通过三轮扩增，扩增到黄颡鱼XY性染色体特异等位序列的侧翼片段，将片段回收、克隆和测序；其次是序列分析比对：从染色体步移获得的侧翼序列中选择大小为311bp-624bp的片段用于序列分析，其序列分别为SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12和SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列；通过分析比对性染色体特异等位序列分别在黄颡鱼X和Y染色体上拷贝的序列差异，发现一批稳定的X和Y染色体序列差异位点，用来区分X或Y染色体；从中选择X和Y性染色体存在序列差异的位点，设计了引物，分别为：

1)Y染色体特异标记Pf-Y62引物：

2)X染色体特异标记Pf-X62引物：

3)Y染色体特异标记Pf-Y33引物：

4)X染色体特异标记Pf-X63引物：

由序列为SEQ ID NO.19的上游引物Pf-X63L和序列为SEQ ID NO.20的下游引物Pf-X63R组合；第三是转化为SCAR标记：采用上一步设计的特异引物，在黄颡鱼XX，XY和YY个体基因组DNA中扩增，PCR反应体系为25μl：2.5μl 10×PCR buffer，2.0μl 25mM Mgcl₂，1U TaqDNA聚合酶，0.5μl 10mM dNTP，0.5uM上下游引物，20ng DNA，加水至25μl，扩增条件分别为：

Pf-Y62或Pf-X62：94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，循环数为36；

C.建立黄颡鱼性染色体基因型PCR鉴定方法包括：

1)取样和DNA提取：

采集黄颡鱼尾鳍样品，贮存于无水乙醇中，提取基因组DNA；

2)PCR反应：

选用所设计的4个SCAR标记中的任意一个X染色体特异SCAR标记和一个Y染色体特异SCAR标记作为组合，分别在黄颡鱼样品基因组DNA中扩增，PCR反应体系和扩增条件为步骤B转化为XY性染色体特异SACR标记中的第三转化为SCAR标记所述；

3)结果判断：

根据样品的扩增结果来判断其性染色体基因型：扩增出X染色体特异SCAR特异标记片段，扩增不出Y染色体特异SCAR标记片段的个体为遗传XX个体；扩增出X染色体特异SCAR标记片段，扩增出Y染色体SCAR标记片段的个体为遗传XY个体；扩增出Y染色体特异SCAR标记片段，扩增不出X染色体特异SCAR标记片段的个体为遗传YY个体；

D.在全雄黄颡鱼培育中进行遗传性别鉴定包括：a.XX雌鱼×XY雄鱼交配组合子代遗传性别鉴定：剪取黄颡鱼尾鳍样品，提取基因组DNA，采用步骤C所述的黄颡鱼性染色体基因型PCR鉴定方法，选用Y染色体特异SCAR标记Pf-Y62引物扩增各样品DNA，根据扩增结果判断样品的遗传性别，能够扩增出一个大小为568bp特异片段的个体为遗传XY鱼，不能扩增出该特异片断的个体为遗传XX鱼；b.XY雌鱼雌核发育组合子代遗传性别鉴定：采集XY雌鱼雌核发育组合子代XX雌鱼、XY雄鱼和YY超雄鱼尾鳍样品，提取基因组DNA，采用步骤C所述的黄颡鱼性染色体基因型PCR鉴定方法，选用4个SCAR标记所对应的引物组合，分别在各样品基因组DNA中扩增，根据扩增结果判断各样品的遗传性别，XX雌鱼样品能够扩增出X染色体特异SCAR标记片段，不能扩增出Y染色体特异SCAR标记片段；XY雄鱼样品均能扩增出X染色体特异SCAR标记片段，能扩增出Y染色体SCAR标记片段；YY超雄鱼样品能扩增出Y染色体特异SCAR标记片段，扩增不出X染色体特异SCAR标记片段；c.YY生理雌鱼×XY雄鱼交配组合子代遗传性别鉴定：从YY生理雌鱼×XY雄鱼交配组合子代中抽取114尾鱼，剪取尾鳍，提取基因组DNA，采用步骤C所述的黄颡鱼性染色体基因型PCR鉴定方法，选用Pf-Y62和Pf-X63标记进行遗传性别鉴定，结果显示Pf-Y62引物组合在所有样品中能扩增出一个片段大小为568bp的特异片段，Pf-X63引物在57个样品中能够扩增出一个片段大小为462bp的特异片段，在另57个样品无扩增产物，在114尾子代中有57尾YY超雄鱼和57尾XY雄鱼；d.YY生理雌鱼×YY超雄鱼交配组合子代遗传性别鉴定：从YY生理雌鱼×YY超雄鱼交配组合子代剪取尾鳍，提取基因组DNA，按照步骤C所述的黄颡鱼性染色体基因型PCR鉴定方法，选用Pf-Y62和Pf-X62两个标记进行遗传性别鉴定，扩增结果显示，Pf-Y62引物组合在所有样品中能扩增出一个片段大小为568bp的Y染色体特异片段，Pf-X62引物组合在所有样品中无扩增产物，表明所有子代为YY超雄鱼；e.XX雌鱼×YY超雄鱼交配组合子代遗传性别鉴定：从步骤c和d所鉴定得到的YY超雄鱼中选取YY超雄鱼，性成熟后与XX雌鱼进行交配，测交子代长至4个月时，抽取400尾仔鱼，解剖后根据组织学判断性腺形态为***或卵巢来判断鱼的性别，解剖结果显示，所有400尾鱼为雄鱼；同时从中随机抽取20尾鱼剪取尾鳍，提取基因组DNA，按照步骤C所述的黄颡鱼性染色体基因型PCR鉴定方法，选用Pf-Y62标记于样品中扩增，所有个体能扩增出一个片段大小为568bp的特异片段，为遗传上的雄鱼。