CN101386856A - 水稻抗病相关基因OsWRKY45-2和它在改良水稻抗病性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及包含水稻抗病相关基因OsWRKY45－2的DNA片段的分离克隆和功能验证。OsWRKY45－2基因编码WRKY类蛋白质。它能够赋予水稻抵抗由细菌性病原菌－白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)和真菌性病原菌-稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)引起的病害。将该片段与其外源调节序列直接转入水稻，超量表达OsWRKY45－2的转基因水稻对白叶枯病和稻瘟病的抵抗能力显著增强。

Description

水稻抗病相关基因OsWRKY45-2和它在改良水稻抗病性中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一个水稻抗病相关基因OsWRKY45-2的分离克隆、功能验证和应用。本发明分离克隆的OsWRKY45-2基因是水稻抗病反应中的正调控因子。超量表达OsWRKY45-2基因的转基因植株的抗白叶枯病和抗稻瘟病能力显著提高。

背景技术

植物在生长的过程中，受到多种病原物的侵害。植物病原物的种类繁多，包括病毒、细菌、真菌和线虫等。病原物侵入植物导致两种结果：(1)病原体成功的在寄主植物内繁殖，引起相关的病症；(2)寄主植物产生抗病反应，杀死病原物或阻止其生长。利用抗性基因资源改良植物的抗病性，是预防病害同时又保护环境的根本出路。

植物的抗病反应是多基因参于调控的复杂过程。参于植物抗病反应的基因分为两类：(1)抗病基因，又称R(resistance)基因和(2)抗病相关基因。

根据目前人们对抗病基因功能的认识，R基因的产物主要是作为受体，直接或间接与病原蛋白相互作用，启动植物体内的抗病信号传导路径(Tang等，1996；Baker等，1997；Jia等，2000；Dangl和Jones，2001；Nimchuk等，2001)。R基因介导的抗病反应抗性强，是很好的基因资源。但由于下述原因，使利用抗病基因改良植物抗性受到限制：(1)R基因的资源有限，如目前知道的抵抗水稻重要病害白叶枯病的抗病基因大约只有30个，抵抗另一水稻重要病害—稻瘟病的R基因也只有大约50个；(2)R基因具有病原种类和病原生理小种特异性，抗病范围有限；(3)因为病原的快速突变，一个R基因的作用往往几年或者十几年后就丧失了。

抗病相关基因是指除抗病基因外所有参于抗病反应的基因，它们的编码产物参于合成植物体内抗病信号分子、参于信号传导、阻止信号传导或参于防卫反应等。这类基因的共同特点是病原诱导后它们的表达量升高或减少，因此人们可以根据病原诱导前后基因的表达量的差异大规模地鉴定植物抗病相关基因(Schenk等，2000；Zhou等，2002；Chu等，2004)。目前，人们对抗病相关基因的认识有限。根据已有报道，绝大多数抗病相关基因单独作用时的抗性能力可能比R基因小。但根据下述原因，它们是值得大力开发的基因资源：(1)由于绝大多数抗病相关基因的产物不需要直接与病原物相互作用，这类基因是具有持久抗性的基因资源；(2)大多数抗病相关基因参于的抗病反应没有病原特异性，因此它们是具有广谱抗性的基因资源；(3)这类基因的资源丰富。但是，水稻中虽然鉴定了很多抗病相关基因(Zhou等，2002；Chu等，2004)，这些基因在水稻抗病反应中的作用机理、以及单个抗病相关基因是否会引起水稻抗病表型的改变都不清楚。

水稻是世界上重要的粮食作物，但病害的影响常常造成其产量和品质的下降。水稻白叶枯病由白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)引起，是世界上对水稻危害最大的细菌性病害(过崇俭，1995)。稻瘟病由稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)引起，是世界上对水稻危害最大的真菌性病害之一(Zeigler等，1994)。发掘和利用优良抗性基因资源改良水稻是控制病害的发生、减少或避免水稻病害所带来的损失最经济有效的措施。

与R基因的应用相比，抗病相关基因的应用能提供植物更为广谱及长效的抗性。通过超量表达作为抗病反应正调控因子的抗病相关基因进行水稻品种的改良，将进一步增强植物的抗病性，拓宽植物的抗谱。这些方面是采用常规植物育种和改良技术所不能达到的。

发明内容

本发明的目的是分离克隆水稻中携带的一个抗病相关基因完整DNA片段，并利用超量表达技术通过使目标基因在转基因受体中超量表达鉴定该基因在抗病反应过程中所起作用，为利用这个基因改良水稻品种或其它植物抵御病害的能力奠定基础。申请人将这个基因被命名为OsWRKY45-2。

本发明涉及分离一种包含OsWRKY45-2基因的DNA片段并鉴定其功能，该片段赋予植物对由白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)和稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)所引起的病害产生抗病反应。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO：1所示，或者基本上相当于SEQ ID NO：1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO：1所示序列的亚片段。对其序列进行分析表明，它编码的蛋白质具有WRKY类蛋白质的保守结构域，表明其属于WRKY类蛋白质家族。超量表达序列表SEQ ID NO：1所示序列可以增强水稻对白叶枯病和稻瘟病的抗性。

可以采用已经克隆的OsWRKY45-2基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选到本发明的基因或同源基因。同样，采用PCR(polymerase chain reaction)技术，也可以从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的OsWRKY45-2基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含OsWRKY45-2基因的序列或者包含一段OsWRKY45-2基因的序列，将这一序列与合适的载体连接，可以转入植物细胞超量表达OsWRKY45-2基因，产生抗病转基因植物。采用这种转基因技术创造抗病植物是传统育种技术所不能达到的。

本发明为增强水稻对白叶枯病菌和稻瘟病菌的抗性提供了一种新的方法。这种方法包括将OsWRKY45-2基因完整编码区的基因组片段与能够超量表达目标基因的载体连接、转入感病水稻，通过超量表达OsWRKY45-2基因改良水稻对白叶枯病和稻瘟病的抗性。

在本发明的实施例部分，申请人阐述了OsWRKY45-2基因的分离、功能验证和应用过程以及该基因的特点。

附图说明

序列表SEQ ID No：1.：是本发明分离克隆的OsWRKY45-2基因的核苷酸序列和它编码的蛋白质的氨基酸序列。

图1：是本发明鉴定和分离克隆水稻抗病相关基因OsWRKY45-2以及验证OsWRKY45-2基因功能的流程图。

图2：是用定量RT-PCR技术分析白叶枯病菌PXO61侵染后抗病水稻品种明恢63和感病水稻品种珍汕97中OsWRKY45-2基因的表达变化。对照是接种PXO61前的样品；其他是接种PXO61后的样品。每个样品中OsWRKY45-2基因的表达量是相对于接种前珍汕97样品中OsWRKY45-2基因的表达量。

图3：PCR扩增产物和OsWRKY45-2基因的结构。“ATG”和“TAG”分别是翻译起始密码和终止密码。数字示每一种结构的核苷酸数目。

图4：是本发明采用的遗传转化载体pU1301的物理图谱。

图5：是本发明中部分T₀代遗传转化植株在接种白叶枯病菌PXO61两周后的表型。“牡丹江8”是遗传转化的受体(对照)，“D114UM4”和“D114UM6”是阳性转化植株，“D114UM15”是阴性转化植株。

图6：是本发明的T₀代遗传转化植株(D114UM)中的OsWRKY45-2基因表达量(图6中的B)与植株对白叶枯病菌株PXO61的抗性(图6中的A)增强相关。对照为水稻感病品种“牡丹江8”(遗传转化的受体)。遗传转化植株中OsWRKY45-2基因的表达量是相对于对照“牡丹江8”中OsWRKY45-2基因的表达量。星号(^*)表示与对照相比，转基因植株的病斑面积显著(P<0.01)减小。

图7：是本发明的T₁代遗传转化植株中的OsWRKY45-2基因的表达量与表型共分离。图7中：A为T₁代遗传转化植株D114UM4；B为T₁代遗传转化植株D114UM6；C为T₁代遗传转化植株D114UM10和D114UM11。对照为水稻感病品种“牡丹江8”(遗传转化的受体)。病斑面积为接种白叶枯病菌PXO61两周后的数据。遗传转化植株中OsWRKY45-2基因的表达量是相对于对照“牡丹江8”中OsWRKY45-2基因的表达量。

图8：是超量表达OsWRKY45-2基因的植株对白叶枯病菌具有广谱抗性。

图9：是超量表达OsWRKY45-2基因的植株显著增强对稻瘟病菌CHL358的抗性。

具体实施方式

本发明的前期研究工作结果显示水稻WRKY基因家族的一个成员可能参于抗病反应。根据Xie等(Xie等，2005)对水稻WRKY基因家族成员的命名，这个成员是OsWRKY45。本发明研究人员认为OsWRKY45可能参于抗病反应调控的主要依据是激活抗病相关基因OsWRKY13后，OsWRKY45基因的表达发生变化(Qiu等，2008)。OsWRKY13蛋白是水稻抗病反应的激活因子；超量表达OsWRKY13基因的转基因植株对白叶枯病和稻瘟病的抗性都显著增强(Qiu等，2007)。本发明的前期研究工作结果提示OsWRKY45可能是一个抗病相关基因。为了验证这一分析推测，产生了本发明。

以下实施例中进一步定义本发明，图1描述了鉴定和分离克隆OsWRKY45-2基因以及验证OsWRKY45-2基因功能的流程。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：OsWRKY45-2基因在不同水稻品种中的表达模式分析

用水稻全基因组序列中的OsWRKY45基因的序列[TIGR(The Institute for GenomicResearch，http://rice.tigr.org)数据库基因位点编号：LOC_Os05g25770]检索籼稻表达序列标签(expressed sequence tag，EST)数据库REDB(Rice EST DataBase，http://redb.ricefgchina.org，Zhang等，2005)，发现一条来源于籼稻品种明恢63(Oryza sativa ssp.indica)、长1437bp的cDNA序列EI77K16与OsWRKY45基因有98％的序列同源性，是OsWRKY45的等位基因，故将这个来源于明恢63的基因命名为OsWRKY45-2。

为了证实OsWRKY45-2基因是否参于抗病反应的调控，本发明采用定量反转录—PCR(quantitative reverse transcription-PCR，qRT-PCR)技术(Qiu等，2007)分析了OsWRKY45-2基因在不同水稻品种中接种白叶枯病菌株PXO61(菲律宾生理小种1)(Sun等，2004)后的表达模式。白叶枯病菌接种采用剪叶法对成株期的水稻进行接种(Sun等，2004)。白叶枯病菌菌株PXO61由菲律宾国际水稻研究所惠赠(Sun等，2004)。白叶枯病菌的培养遵循已经公开发表的方法(Sun等，2004)。接种后分不同时间点取接种叶片抽提总RNA(Zhou等，2002)。取1～5μg总RNA用DNaseI(美国Invitrogen公司)处理15分钟以去除基因组DNA污染，然后参照Zhou等(2002)的方法，使用oligo(dT)₁₅寡聚引物和M-MLV反转录酶(美国Promega公司)进行反转录。采用实时定量PCR分析试剂盒

Green PCR Master Mix(宝生物工程(大连)有限公司，Tokara)，并根据该试剂盒使用说明书，在ABI 7500 Real-TimePCR system(美国Applied Biosystems公司)仪器上进行实时定量PCR反应。用水稻内源肌动蛋白(actin)基因的表达量衡量、并均一化样品RNA含量(Qiu等，2007)。qRT-PCR分析中的Os WRKY45-2基因特异PCR引物是w45F(5＇-TTCCTTGTTGATGTGTCGTCTCA-3＇)和w45R(5＇-CCCCCAGCTCATAATCAAGAAC-3＇)，肌动蛋白基因PCR引物是actinF(5＇-TGCTATGTACGTCGCCATCCAG-3＇)和actinR(5＇-AATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3＇)。

实验结果显示接种白叶枯病菌PXO61后诱导OsWRKY45-2基因在水稻品种明恢63和珍汕97(Oryza sativa ssp.indica)中表达(图2)。但是OsWRKY45-2基因在携带抗白叶枯病主效基因Xa25(t)和Xa3/Xa26的抗病水稻品种明恢63(Chen等，2002；Sun等，2004；Xiang等，2006)中的表达量显著高于其在感病水稻品种“珍汕97”的表达量(图2)。这一结果提示：OsWRKY45-2基因可能参于抗白叶枯病反应的调控，增强该基因表达可能可以提高水稻的抗病性，而抗病主效基因的存在有助于增强它的表达。

实施例2：分离克隆OsWRKY45-2基因和基因结构分析

1.OsWRKY45-2基因结构的预测

以OsWRKY45-2基因的cDNA序列EI77K16作模板，用BLAST方法(Altschul等，1997)检索粳稻全长cDNA数据库KOME数据库(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)，发现EI77K16序列与该数据库中一条来自粳稻品种日本晴、长1453bp的全长cDNA序列(注册号：AK066255)同源性达到98％。AK066255序列就是水稻全基因组序列中编号LOC_Os05g25770基因的cDNA序列，即OsWRKY45-2的等位基因(OsWRKY45)的cDNA序列。这两条序列的排列对比分析证实OsWRKY45-2基因的cDNA序列EI77K16包含了编码OsWRKY45蛋白的全长开放读码框。

2.从水稻品种明恢63中分离克隆OsWRKY45-2基因的全长DNA

本发明根据水稻全基因组序列(TIGR数据库http://rice.tigr.org)中OsWRKY45-2的等位基因OsWRKY45两侧的序列设计了一对PCR引物：w45F4(5＇-ATGGTACCGCCTACGCATCATCTCCTTC-3＇)(下划线代表用于载体连接的接头中的KpnI限制性内切酶消化位点)和w45R4(5＇-CAGGATCCTTATGGCACAACATTTAGCA-3＇)(下划线代表用于载体连接的接头中的BamHI限制性内切酶消化位点)。利用这对PCR引物从水稻品种明恢63中扩增包含OsWRKY45-2基因的DNA片段(图3)。利用PCR引物w45F4、w45R4和位于基因内部的PCR引物w45F6(5＇-ATCACAAAGCATAGCATCATCT-3＇)和w45R6(5＇-CTCAGCACCTCCTCCTGGTCGG-3＇)，以及美国Applied Biosystems公司的测序试剂盒，以双脱氧核苷酸末端终止法(美国Applied Biosystems公司)分别从PCR扩增片段两端测序。序列拼接后得到一长1778bp的DNA序列，它包含1762bp的水稻DNA序列(另外有16bp的接头序列)和完整的OsWRKY45-2基因序列(图3)。

3.OsWRKY45-2基因结构分析

比较分析OsWRKY45-2基因的基因组序列和cDNA序列，确定OsWRKY45-2基因由1629个核苷酸组成，包含三个外显子和两个内含子，基因的5’端非翻译区(untranslated region，UTR)由112个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的1—112bp处)，第一个外显子由309个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的113—421bp处)，第一个内含子由91个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的422—512bp处)，第二个外显子由105个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的513—617bp处)，第二个内含子由101个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的618—718bp处)，第三个外显子由552个核苷酸组成(位于序列表SEQID NO：1的719—1270bp处)，3’端UTR由359个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的1271—1629bp)。

4.OsWRKY45-2基因编码产物的分析

OsWRKY45-2基因的编码区由969个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的113—1270bp处)，编码一个长度为322个氨基酸的蛋白质。根据Eulgem等(2000)的WRKY蛋白质家族的分类，OsWRKY45-2蛋白属于典型的WRKY类转录因子。它属于WRKY蛋白中的第三亚类，具有一个保守的WRKY结构域，一个C2HC锌指结构。

实施例三：OsWRKY45-2基因的功能验证

1.遗传转化载体的构建

本发明所用载体是pU1301(图4)。pU1301是常用的水稻遗传转化载体(Cao等，2007；Qiu等，2007；Ding等，2008)。它是携带具有组成型和超量表达特征的玉米泛素启动子的农杆菌介导的遗传转化载体。

将实施例2第2节所述的包含OsWRKY45基因的DNA片段(图3)用限制性内切酶KpnI和BamHI消化，灭活酶后作为外源片段。同时，用限制性内切酶KpnI和BamHI消化携带玉米泛素启动子的遗传转化载体pU1301；酶切完毕，用氯仿：异戊醇(体积比为24:1)抽提，纯化酶切产物。用包含OsWRKY45-2基因的酶切片段和纯化好的载体做连接反应。通过测序验证阳性克隆，获得的重组质粒载体被命名为D114U。

2.遗传转化和T₀代遗植株分析

采用农杆菌介导的遗传转化方法(Lin和Zhang，2005)将D114U导入水稻感病品种牡丹江8(Oryza sativa ssp.japonica)。获得的遗传转化植株被命名为D114UM(其中前面部分即D114U为遗传转化载体名称，M代表水稻品种牡丹江8)。本发明共获得独立转化植株17株。对全部转化植株在成株期阶段接种白叶枯病菌株PXO61，与野生型对照牡丹江8及遗传转化阴性植株相比，所有的阳性遗传转化植株的抗性显著增强(P<0.01)(表1，图5)。

表1.T₀代遗传转化植株(D114UM)对白叶枯病菌株PXO61的反应

               水稻材料             病斑面积(％)⁽¹⁾        P值

               牡丹江8(对照)        54.8±5.9

               D114UM11             8.6±4.5              0.0000

               D114UM2              22.0±15.1            0.0033

               D114UM3              26.1±4.7             0.0001

               D114UM4              27.6±3.1             0.0006

               D114UM5              25.6±10.5            0.0010

               D114UM6              25.1±7.4             0.0001

               D114UM7              27.5±10.1            0.0007

               D114UM8              20.6±3.8             0.0001

               D114UM9              18.0±4.9             0.0000

               D114UM10             25.7±9.7             0.0004

               D114UM11             17.3±5.1             0.0000

               D114UM12             5.0±2.8              0.0001

               D114UM13             24.0±2.2             0.0003

               D114UM14             22.5±4.3             0.0001

               D114UM15⁽²⁾          57.3±5.5             0.2696

               D114UM16             21.2±6.1             0.0000

               D114UM               1714.0±7.2           0.0000

⁽¹⁾每株遗传转化基因植株接种3—5片叶，14天后调查病斑和病叶长度，每个数据来自于多个叶片的平均值。

⁽²⁾阴性转化植株，其它植株为阳性转化植株

为进一步验证遗传转化植株的抗病能力增强是否与OsWRKY45-2基因转入引起的表达量升高相关，本发明采用实施例1中所述的qRT-PCR分析方法检测遗传转化植株中OsWRKY45-2基因的表达量。结果显示OsWRKY45-2的表达量与植株的抗性密切相关(图6A和6B)。该结果提示遗传转化植株对白叶枯病菌的抗性增强是因为OsWRKY45-2基因的表达量增强。

3.遗传转化植株的共分离分析

为了进一步验证上述推测，对在T₀代抗性增强的4株遗传转化植株(D114UM4、D114UM6、D114UM10和D114UM11)的T₁代家系进行基因表达量和抗性共分离分析。在水稻孕穗期时于接种白叶枯病菌PXO61，接种14天后调查，同时取样抽取水稻新鲜叶片总RNA(Zhou等，2002)，采用上述qRT-PCR分析方法检测植株中OsWRKY45-2基因的表达量。结果显示遗传转化植株的OsWRKY45-2基因表达量与抗性共分离(图7A、7B和7C)；与对照牡丹江8相比所有抗性显著增强的植株中的OsWRKY45-2基因的表达量都增强，而抗性与对照相比无显著变化的植株目标基因的表达量无显著变化。进一步证明遗传转化植株的抗性增强是因为超量表达OsWRKY45-2基因所至。这些研究结果也说明OsWRKY45-2基因的编码产物在水稻抗白叶枯病反应中发挥正调控因子的作用。超量表达OsWRKY45-2基因，可增强水稻对白叶枯病的抗性。

实施例四：超量表达OsWRKY45-2基因的应用前景分析

1.超量表达OsWRKY45-2基因的植株对白叶枯病具有广谱抗性

对遗传转化家系D114UM4-8(T₂代)及对照牡丹江8在孕穗期接种不同白叶枯病菌，分析遗传转化植株的抗谱。接种采用上述或常规的剪叶法。白叶枯病菌包括菲律宾生理小种2(PXO86)、菲律宾生理小种3(PXO79)、菲律宾生理小种6(PXO99)、菲律宾生理小种10(PXO341)、中国生理小种Zhe174和KS-1-21。所有白叶枯病菌株都是常用的菌株(Yang等，2003；Sun等，2004；Yang等，2007)。超量表达OsWRKY45-2基因显著(P<0.01)增强水稻对这些白叶枯病菌的抗性(图8)。与对照相比，超量表达OsWRKY45-2基因植株的病斑面积减小了51％—94％。这些结果说明超量表达OsWRKY45-2基因的水稻对白叶枯病菌具有广谱抗性，OsWRKY45-2是一个在抗白叶枯病育种中有应用前景的基因。

2.超量表达OsWRKY45-2基因的植株对稻瘟病的抗性显著增强

本发明对两个超量表达OsWRKY45-2基因的T1家系(D114UM13和D114UM16)、遗传转化的受体材料牡丹江8(对照)和国际上常用的稻瘟病感病水稻CO39(Jaing等，2002；Wen等，2003)在水稻4—5叶期接种稻瘟病菌CHL358。CHL358菌株由中国华南农业大学潘庆华教授惠赠，是潘庆华教授研究中的常用稻瘟病菌株。稻瘟病菌接种采用常规喷雾法，接种5天后检测发病情况(Chen等，2003)。与感病对照CO39相比，牡丹江8也感CHL358(图9)，这与牡丹江8对其它稻瘟病菌株也感病的报道是一致的(Qiu等，2007)。而与牡丹江8相比，具有同样遗传背景的D114UM13和D114UM16植株却高抗CHL358(图9)，说明本发明的超量表达OsWRKY45-2基因也可以增强水稻对稻瘟病的抗性，该基因也是一个在抗稻瘟病育种中有应用前景的基因。

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<110>华中农业大学

<120>水稻抗病相关基因OsWRKY45-2和它在改良水稻抗病性中的应用

<130>

<141>2008-10-12

<160>2

<170>PatentIn version3.1

<210>1

<211>1629

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1629)

<223>

<220>

<221>5’UTR

<222>(1)..(112)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(113)..(421)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(513)..(617)

<223>

<220>

<222>(719)..(1270)

<220>

<221>Intron

<222>(422)..(512)

<223>

<220>

<221>Intron

<222>(618)..(718)

<223>

<220>

<221>3’UTR

<222>(1271)..(1629)

<223>

<400>1

tgctttgagc tccatcacca gctgagctgc gaggaagaga gagtgcgaga gtgcgcggca  60

gcggcagtgt agtgtcagtc actgggtgtg cgcttgcttg cttggattga gg atg acg  118

                                                          Met Thr

                                                          1

tca tcg atg tcg ccg gcg ccg gcg ccg gcg tac gcg cag gtg atg gag    166

Ser Ser Met Ser Pro Ala Pro Ala Pro Ala Tyr Ala Gln Val Met Glu

        5                   10                  15

gac atg gag aag ggg aag gag ctg gcg gcg cag ctg cag ggg ctc ctc    214

Asp Met Glu Lys Gly Lys Glu Leu Ala Ala Gln Leu Gln Gly Leu Leu

    20                  25                  30

cgc gac tcg ccg gag gcc ggc cgc ttc gtc gac cag att ctc cac acc    262

Arg Asp Ser Pro Glu Ala Gly Arg Phe Val Asp Gln Ile Leu His Thr

35                  40                  45                  50

ttc tcc cgg gcg atg cgg gcg ctc gac aag gcg gcg gtc tcc gcc gcc    310

Phe Ser Arg Ala Met Arg Ala Leu Asp Lys Ala Ala Val Ser Ala Ala

                55                  60                  65

gga gga gaa ggg tcg gag gtg cag agc gag gtc acc tgc ggg ggc ggg    358

Gly Gly Glu Gly Ser Glu Val Gln Ser Glu Val Thr Cys Gly Gly Gly

            70                  75                  80

gcc agc gcc ggc ggg aag agg aaa gcc ccc gcc gcc aac cgg aag gcc    406

Ala Ser Ala Gly Gly Lys Arg Lys Ala Pro Ala Ala Asn Arg Lys Ala

        85                  90                  95

aac tgc cgc agg agg tgagaacgaa ggccagagca tagctcatca caaagcatag    461

Asn Cys Arg Arg Arg

    100

catcatctgt gtgtaattaa tgtactaaga tttgtgtgta cgtattgcag g acg cag  518

                                                         Thr Gln

                                                             105

caa tcg tcc ggg aat acg gtg gtc gtc aag aac ctc gac gac ggc cag   566

Gln Ser Ser Gly Asn Thr Val Val Val Lys Asn Leu Asp Asp Gly Gln

                110                 115                 120

gca tgg cgc aag tac ggg cag aag gag atc caa aac tcc aag cac cca   614

Ala Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Glu Ile Gln Asn Ser Lys His Pro

            125                 130                 135

aag tgagtagact tgtcccgaca aaaaacaatg tgttcgagac tgtacagttg        667

Lys

gatgcgttgc gcgctgacga ggagttgttt ggggtatgct acgtgtacag g gcc tac  724

                                                         Ala Tyr

                                                             140

ttc cgg tgc acg cac aag tac gac cag atg tgc acg gcg cag cgg cag   772

Phe Arg Cys Thr His Lys Tyr Asp Gln Met Cys Thr Ala Gln Arg Gln

                145                 150                 155

gtg cag cgc tgc gac gac gac ccg gcg agc tac agg gtc acc tac atc   820

Val Gln Arg Cys Asp Asp Asp Pro Ala Ser Tyr Arg Val Thr Tyr Ile

            160                 165                 170

ggc gag cac acc tgc cgg gac ccg gcc acc gcc ccc atc atc gcg gcg   868

Gly Glu His Thr Cys Arg Asp Pro Ala Thr Ala Pro Ile Ile Ala Ala

        175                 180                 185

cac gtc atc cac cag gtc gcc gcc ggc gac gac gac gac ggc tgc ggc   916

His Val Ile His Gln Val Ala Ala Gly Asp Asp Asp Asp Gly Cys Gly

    190                 195                 200

ggc ctc cac gcg ggg tcc cgc ctc atc agc ttc gtc gcc gcg ccg gcg   964

Gly Leu His Ala Gly Ser Arg Leu Ile Ser Phe Val Ala Ala Pro Ala

205                 210                 215                 220

gcg cca gta gac gct gcc gcg gcg ccg acg acc agc acg atc acc acg   1012

Ala Pro Val Asp Ala Ala Ala Ala Pro Thr Thr Ser Thr Ile Thr Thr

                225                 230                 235

gtc acc gcg ccg ggc ccg ctg ctg cag ccg ctc aag gtg gag ggc ggc   1060

Val Thr Ala Pro Gly Pro Leu Leu Gln Pro Leu Lys Val Glu Gly Gly

            240                 245                 250

atc ggc tcg tcc gac cag gag gag gtg ctg agc agc ctc acg ccc ggc      1108

Ile Gly Ser Ser Asp Gln Glu Glu Val Leu Ser Ser Leu Thr Pro Gly

        255                260                265

agc tcc gcg gcg cgc ggc ggc gga gtc gcg ggt ccc ttc ggg ccg gac      1156

Ser Ser Ala Ala Arg Gly Gly Gly Val Ala Gly Pro Phe Gly Pro Asp

    270                275                280

cag ggc gat gtc acg tcc tcc ctg cac tgg agc tac gac gcc gtc gcc      1204

Gln Gly Asp Val Thr Ser Ser Leu His Trp Ser Tyr Asp Ala Val Ala

285                290                295                300

ggc atg gag ttc ttc aag aac gac gag gtt gtc ttc gat ctg gac gac      1252

Gly Met Glu Phe Phe Lys Asn Asp Glu Val Val Phe Asp Leu Asp Asp

                305                 310                 315

att atg ggt ttg agc ttt tgatcaccga agaatcatgg atggacacgg            1300

Ile Met Gly Leu Ser Phe

            320

gccgggtaaa acgatcgaaa gaagatggat tccacgcgtg tgtacagaaa taattagcgg   1360

cagcgcggat cttaatttgg aacttgcaaa gatactccta attagcctgg ctagattagt   1420

ttgtaaattc cttgttgatg tgtcgtctca gctttaagct gcagacatgc tagcaagtaa   1480

caacacgatt agtacgtagt aatgtggttc ttgattatga gctgggggtc ttaacctttt   1540

ttgtgtgaca agcaagagaa gaggatttgg gtacaatgta atcctgttct tccgctttcg   1600

aaaaaaaaaa catatagctt cacgtgcct                                     1629

<210>2

<211>322

<212>PRT

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>2

Met Thr Ser Ser Met Ser Pro Ala Pro Ala Pro Ala Tyr Ala Gln Val

1              5                  10                  15

Met Glu Asp Met Glu Lys Gly Lys Glu Leu Ala Ala Gln Leu Gln Gly

            20                 25                 30

Leu Leu Arg Asp Ser Pro Glu Ala Gly Arg Phe Val Asp Gln Ile Leu

        35                 40                 45

His Thr Phe Ser Arg Ala Met Arg Ala Leu Asp Lys Ala Ala Val Ser

    50                 55                 60

Ala Ala Gly Gly Glu Gly Ser Glu Val Gln Ser Glu Val Thr Cys Gly

65                 70                 75                 80

Gly Gly Ala Ser Ala Gly Gly Lys Arg Lys Ala Pro Ala Ala Asn Arg

               85                 90                  95

Lys Ala Asn Cys Arg Arg Arg Thr Gln Gln Ser Ser Gly Asn Thr Val

            100                105                110

Val Val Lys Asn Leu Asp Asp Gly Gln Ala Trp Arg Lys Tyr Gly Gln

        115                120                125

Lys Glu Ile Gln Asn Ser Lys His Pro Lys Ala Tyr Phe Arg Cys Thr

    130                135                140

His Lys Tyr Asp Gln Met Cys Thr Ala Gln Arg Gln Val Gln Arg Cys

145                150                155                160

Asp Asp Asp Pro Ala Ser Tyr Arg Val Thr Tyr Ile Gly Glu His Thr

               165                170                175

Cys Arg Asp Pro Ala Thr Ala Pro Ile Ile Ala Ala His Val Ile His

            180                185                190

Gln Val Ala Ala Gly Asp Asp Asp Asp Gly Cys Gly Gly Leu His Ala

        195                200                205

Gly Ser Arg Leu Ile Ser Phe Val Ala Ala Pro Ala Ala Pro Val Asp

    210                215                220

Ala Ala Ala Ala Pro Thr Thr Ser Thr Ile Thr Thr Val Thr Ala Pro

225                230                235                 240

Gly Pro Leu Leu Gln Pro Leu Lys Val Glu Gly Gly Ile Gly Ser Ser

               245                250                 255

Asp Gln Glu Glu Val Leu Ser Ser Leu Thr Pro Gly Ser Ser Ala Ala

            260                265                270

Arg Gly Gly Gly Val Ala Gly Pro Phe Gly Pro Asp Gln Gly Asp Val

        275                280                285

Thr Ser Ser Leu His Trp Ser Tyr Asp Ala Val Ala Gly Met Glu Phe

    290                295                300

Phe Lys Asn Asp Glu Val Val Phe Asp Leu Asp Asp Ile Met Gly Leu

305                310                315                320

Ser Phe

Claims (2)

1、一个分离克隆的影响水稻对白叶枯病和稻瘟病产生抗性的核苷酸序列，它是序列表SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列，它包括完整的OsWRKY45-2基因。

2、OsWRKY45-2基因的编码区，它是序列表SEQ ID NO；1中第113—1270位所示的核苷酸序列或者是编码与SEQ ID NO：1编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列。

3、权利要求1—2任一项所述的核苷酸序列在增加水稻对白叶枯病菌和稻瘟病菌抗性中的应用。

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