CN101386843A - 维生素b6磷酸盐磷酸酶 - Google Patents

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CN101386843A CNA2008101320016A CN200810132001A CN101386843A CN 101386843 A CN101386843 A CN 101386843A CN A2008101320016 A CNA2008101320016 A CN A2008101320016A CN 200810132001 A CN200810132001 A CN 200810132001A CN 101386843 A CN101386843 A CN 101386843A
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Abstract

本发明涉及维生素B6磷酸盐磷酸酶(VB6PP)，制备VB6PP的方法以及利用VB6PP从维生素B6－磷酸盐(VB6P)和能生产VB6PP的特定微生物的无细胞提取物生产维生素B6的方法。

Description

维生素B6磷酸盐磷酸酶
本申请是申请日为2002年6月14日的题为“维生素B6磷酸盐磷酸酶”的申请02812553.3的分案申请。
技术领域
本发明涉及新的酶，即维生素B6磷酸盐磷酸酶(vitamin B6-phosphatephosphatase)(此后称为VB6PP)，生产VB6PP的方法，和利用VB6PP及能生产VB6PP的特定微生物的无细胞提取物从维生素B6-磷酸盐(后文指VB6P)生产维生素B6的方法。
背景技术
本发明“维生素B6”包括吡哆醇，吡哆醛和吡哆胺。维生素B6是人，动物和植物和微生物营养的重要维生素之一。
已知非特异性磷酸单酯酶如碱性和酸性磷酸酶水解各种磷酸-单酯化合物，包括VB6P，为对应的无酯化合物[Glenn and Dilworth，Arch.Microbiol.126：251-256(1980)]。没有有关除纯化自人红细胞的磷酸酶外的VB6P特异性磷酸酶的报道[Fonda，J.Biol.Chem.267：15978-15983(1992)]。
发明内容
本发明目的是提供新的VB6PP，其作用于VB6P生产维生素B6。本发明VB6PP具有如下物化性质：
a)分子量：29,000±5,000(由具有分子量29,000±5,000的单体组成)
b)辅助因子(Co-factor):Mn2+，Mg2+，Co2+，Sn2+，或Ni2+
c)底物特异性：对吡哆醇5′-磷酸盐(下文指PNP)，吡哆醛5′-磷酸盐(下文指PLP)和吡哆胺5′-磷酸盐(下文指PMP)有活性
d)最适温度：在pH 7.5下30-40℃
e)最适pH：7.0-8.0.
本发明另一目的是提供生产如上所述新的VB6PP的方法，其包括在水性营养培养基通气(aerobic)条件下，培养能生产具有上述物化性质的VB6PP的属于中华根瘤菌(Sinorhizobium)属微生物，破碎微生物细胞，从微生物的破碎细胞的无细胞提取物分离并纯化VB6PP。
本发明另一方面是提供从VB6P生产维生素B6的方法，其包括将VB6P与(i)在Mn2+，Mg2+，Co2+，Sn2+，或Ni2+存在下的如上所述VB6PP接触，或(ii)属于中华根瘤菌属微生物的无细胞提取物，所述微生物能生产具有上述物化性质的VB6PP，在(i)和(ii)每一情况下，从反应混合物分离所得的维生素B6。
实施例制备的VB6PP纯化样品的物化性质如下：
1)酶活性
在二价金属离子存在下，即Mn2+，Mg2+，Co2+，Sn2+或Ni2+，本发明新的VB6PP催化VB6P水解为维生素B6，参照下式：
VB6P+H2O→维生素B6+H3PO4
如下进行标准酶检测：总体积125μl的基本(basal)反应混合物，组成为50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)，1mM MnCl2，1.35μg酶，水加至总体积118.5μl，37℃下温育1分钟。然后6.5μl 800uM PNP溶液加入得到40μM终浓度，全部在37℃温育。温育30分钟后，反应混合物冰浴冷却。如下两种方法测定活性。(i)生产的维生素B6按照Osbone和Voogt的采用卡拉斯伯糖酵母(Saccharomyces carlsbergensis)ATCC 9080，通过浊度方法进行微生物检测[The Analysis of Nutrients in Foods，Academic Press，London，224-227(1978)]。一个单位酶活性定义为在如上的检测***中，30分钟合成1μmole维生素B6的酶量。(ii)从推定底物释放的磷酸盐采用Geladopoulos等的malachite green方法进行比色检测[Analytical Biochemistry 192：112-116(1991)]，此方法用于测定底物特异性和米氏常数(Km)以及最大速度(maximum velocity)(Vmax)值。
Lowry方法[Lowry et al.，J.Biol.Chem.193：265-275(1951)]测定蛋白浓度。
2)分子量
酶分子量(下文指MW)采用凝胶过滤柱HiPrep Sephacryl S-200HR(Amersham Pharmacia Biotech(Uppsala，Sweden)测定。与MW标记蛋白相比较酶表观MW计算为29,000±5,000：凝胶过滤标准试剂盒，Bio-RadLaboratories(Bio-Lad Laboratories，Richmond，California，USA)；甲状腺球蛋白(MW 670,000)，牛血清丙种(gamma)球蛋白(MW 158,000)，鸡卵白蛋白(MW 44,000)，马肌红蛋白(MW 17,000)和维生素B12(MW 1,350)。与标记蛋白相比较SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(下文指SDS-PAGE)得到MW为29,000±5,000的单一条带：采用Low MW Electrophoresis calibration kit(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)；牛血清白蛋白(MW67,000)，卵白蛋白(MW 43,000)，碳酸酐酶(MW 30,000)，大豆胰蛋白酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor)(MW 20,100)和α-乳白蛋白(MW 14,400)。这表明酶由单体单位组成。需要的话，酶MW值(MW 29,000±5,000)可采用如下方法分别准确测定，即凝胶过滤柱方法和SDS-PAGE方法。
3)辅助因子
研究了酶转化VB6P为维生素B6对辅助因子的需要。
结果发现，二价金属离子即Mn2+，Mg2+，Co2+，Sn2+或Ni2+可以作为此转化的辅助因子。
表1
 
金属盐 相对活性(％)
无 0
MnCl2 100
MgCl2 88
CoCl2 65
SnCl2 11
NiCl2 7
4)底物特异性
酶底物特异性如1)使用相同方法测定，除使用不同底物溶液(160μM，反应混合物终浓度)。
表2
 
底物 相对活性
 
PNP 100
PLP 40
PMP 0.1
磷酸对硝基苯酯(P-nitrophenyl phosphate) 29
1-磷酸萘酯(1-naphtyl phosphate) 9
D-葡萄糖6-磷酸盐(D-glucose 6-phosphate) 0
D(-)3-磷酸甘油酸 0
2-phosphoglycolic acid 0
腺苷三磷酸 0
腺苷二磷酸 0
腺苷一磷酸 6
O-磷-L-丝氨酸 0
5)最适温度
酶活在5-45℃下测定。酶活性最适温度是30-40℃。
表3
 
温度(℃) 相对活性(％)
5 12
10 21
15 34
20 49
25 74
30 91
35 100
40 89
45 53
6)最适pH
酶活性与反应混合物pH值的关系采用如1)相同酶检测方法测定。酶反应最适pH为7.0-8.0。
表4
Figure A200810132001D00081
7)温度稳定性
酶溶液用不同温度处理10分钟，残余酶活采用如上1)相同酶检测方法测定。发现酶活性随温度提高降低，在50℃完全失活。
表5
 
温度(℃) 相对活性(％)
0 100
30 64
35 57
40 51
45 41
50 0.1
55 0
7)米氏常数(Km)和最大速度(Vmax)值
酶Km值采用PNP和PLP作底物测定。基本酶检测方法与1)相同，但是底物浓度不同。Km和Vmax值对PNP分别是330μM和92nmol/min/mg。另一方面，Km和Vmax值对PLP分别是1.22mM和46nmol/min/mg。
Km和Vmax值基于已知Michaelis-Menten方程计算。Km是得到酶反应50％ Vmax时的底物浓度。这些值指示涉及底物的酶的催化性质。
8)纯化过程
VB6PP纯化原则上可采用已知纯化方法的任意组合，如沉淀剂分级，如硫酸铵，聚乙二醇等，离子交换层析，吸附层析，疏水作用层析，凝胶过滤层析，凝胶电泳和盐析和透析。
如上所述，本发明VB6PP可采用在通气条件下水性营养培养基中采用合适的微生物培养制备，破碎微生物并从微生物破碎细胞的无细胞提取物中分离和纯化VB6PP。
本发明微生物是本文所述能生产维生素B6的属于中华根瘤菌属的微生物。本发明可用微生物包括S.meliloti，费氏中华根瘤菌(S.fredii)，新疆中华根瘤菌(S.xinjiangense)，萨赫勒中华根瘤菌(S.saheli)，S.terangae和S.medicae。所述微生物的突变体也可用于本发明。
优选菌株是Sinorhizobium meliloti。最优选用于本发明的具体菌株，作为Sinorhizobium meliloti IFO 14782，保藏在发酵研究所，Osaka，17-85，Juso-honmachi 2-chome，Yodogawa-ku Osaka 523-8686 Japan，并按照布达佩斯条约保藏于DSM，德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DeutscheSammlung Von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)，MascheroderWeglb，D-3300 Braunschweig，Germany，DSM No.10226。
微生物可培养在营养培养基中，其中可含有糖，如葡萄糖和蔗糖，醇如乙醇和甘油，脂肪酸如油酸和硬脂酸，或其酯，或油如菜子油(rapeseed oil)和豆油作碳源；尿素，硫酸铵，氯化铵，硝酸钠，蛋白胨，氨基酸，玉米浆(corn steep liquor)，麸，酵母提取物等作氮源；硫酸镁，硫酸锰，硫酸铁，氯化钠，碳酸钙，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，等无机盐；麦芽提取物，肉提取物等作其它营养源。培养基的pH为约5到9，优选从约6到8。适宜的培养温度范围为约10℃到约45℃，优选约25℃到约40℃。培养时间通常是约1到约5天，优选约1到约3天。通气和搅拌培养通常会得到有利结果。
培养后从微生物分离和纯化VB6PP的实施方式如下：
从液体培养基通过离心或过滤收获细胞。
用水，生理盐水或具有适宜pH的缓冲液洗涤收获的细胞。
洗涤的细胞在含EDTA/溶菌酶的缓冲液进行预处理，并通过匀浆器，超声器，French press等等破碎得到破碎细胞溶液。
从破碎细胞的无细胞提取物分离纯化VB6PP。
本发明得到的VB6PP可用于从VB6P生产维生素B6的催化剂。
VB6PP催化的VB6P水解为维生素B6可便利的在二价金属离子存在下的溶剂中，在pH值约5.5到约9.0进行15分钟到5小时。更优选的pH范围从约6.5到约8.0。作为溶剂，任何可维持pH约5.5到约9.5的缓冲液都是适合的，如Tris-HCl缓冲液，Tris-马来酸盐(maleate)缓冲液，Bis-tris缓冲液，HEPES(Dojindo Laboratories，Kumamoto prefecture，Japan)缓冲液等。
优选的pH范围进行反应是在约15℃到约45℃，更优选的温度范围约25℃到约40℃。当pH和温度设定为约6.5到约8.0和约37℃时反应通常得到最佳结果。
溶剂中VB6P浓度取决于其它反应条件，但通常是1μM到1M，优选的从10μM到100mM。
适合存在于反应混合物中的二价金属离子量与其它反应条件有关，但通常是在各种情况下独立地为约1μM到100mM。
反应中VB6PP也可用于采用合适载体的固定状态。可以采用本领域已知的任何固定酶方法。如可将酶直接结合到具有一或多个功能基团的树脂的膜，颗粒等，或通过具有一或多个功能基团的桥连化合物(bridgingcompounds)结合到树脂，如戊二醛。这样的酶固定方法可参见MicrobialEnzymes and Biotechnology，Elsevier Applied Science(1990)2nd版；Ed.Fogarty and Kelly)369-394页实施例。
具体实施方式
如下的实施例进一步说明本发明。
实施例1：制备VB6PP
所有操作4℃下进行，除非特别指出，缓冲液是10mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)，其中含有1mM二硫苏糖醇，0.1mM苯基甲基磺酰氟化物(phenylmethylsulfonyl fluoride)和15％蔗糖。
(1)培养Sinorhizobium meliloti IFO 14782(DSM No.10226)：微生物培养在种子培养基中，其中含有1％葡萄糖，0.5％蛋白胨(NihonPharmaceutical Co.，Osaka，Japan)，0.2％酵母提取物(Difco Laboratories，Detroit，Michigan，USA)，0.05％ MgSO4·7H2O，0.001％ MnSO4·5H2O和0.001％FeSO4.7H2O，28℃下17小时。将种子培养基移到500ml烧瓶中，其中含200ml发酵培养基，其中含有4％葡萄糖，2％蛋白胨，0.2％酵母提取物，0.05％ MgSO4·7H2O，0.05％ MnSO4·5H2O，0.001％ FeSO4·7H2O和一滴消泡剂CA115(Nippon Yushi Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)。烧瓶摇床上28℃下振荡培养。72小时培养后，从3.4升培养基通过离心，10，400xg下10分钟得到59.5g湿细胞。
(2)EDTA-溶菌酶处理：进行溶菌酶/EDTA处理到除去细胞周质部分(periplasmic fraction)，其是参照Glenn等方法，[J.Gen.Microbiol.112：405-409(1979)]。湿细胞(59.5g)悬浮在340ml的30mM TriHCl缓冲液(pH8.0)中，其中含有20％蔗糖和1mM EDTA。170mg溶菌酶(Sigma ChemicalCo.，St.Louis，Missouri，USA)室温下搅拌加入到悬浮液，搅拌持续20分钟。10,400xg下离心10分钟回收细胞
(3)制备无细胞提取物：细胞悬浮在340ml缓冲液中，以800kg/cm2经过弗氏压碎器(French pressure cell)。处理后，34,000xg下离心90分钟匀浆物。结果，得到280ml无细胞提取物，其中含8,570mg蛋白。
(4)Q Sepharose HP层析：前述步骤得到的无细胞提取物(280ml)上柱到Q Sepharose HP柱(直径44mm，高度17cm；Amersham PharmaciaBiotech，Uppsala，Sweden)，其用缓冲液平衡。用同样的缓冲液冲洗柱后，酶在0.4M KCl中洗脱。收集活性部分(350ml)，并对4升缓冲液透析过夜。
(5)Q Sepharose HP再层析：前述步骤得到的透析样品(5,700mgprotein)用Q Sepharose HP柱(直径44mm，高度12.5cm)再次层析，柱用缓冲液平衡。用同样的缓冲液冲洗柱后，酶用具有线性梯度KCl(0-0.5M)浓度0.25M KCl洗脱。收集活性部分，并对4升缓冲液透析过夜。
(6)Ether Toyopearl层析：加入硫酸铵到前述步骤得到的透析酶溶液(316mg蛋白)，以得到浓度为1.3M。所得样品上样到Ether Toyopearl柱(直径2.5，高度15cm；Tosoh Co.，Tokyo，Japan)，其用含1.3M硫酸铵缓冲液平衡。冲洗含1.3M硫酸铵缓冲液后，酶用具有硫酸铵线性梯度(1.3-0.5M)的浓度0.86M硫酸铵洗脱，收集活性部分。
(7)Resource ISO层析：加入硫酸铵到前述步骤得到的活性酶溶液(74mg蛋白)，得到浓度1.2M。然后活性酶溶液上柱到Resource ISO 6ml柱(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)，其用含1.2M硫酸铵的缓冲液平衡。用1.2M硫酸铵冲洗缓冲液后，用0.74M硫酸铵线性梯度(1.2-0.5M)洗脱酶.收集活性部分，并对4升缓冲液透析过夜。
(8)HiPrep 16/60 Sephacryl S-200HR柱：前述步骤得到的透析样品通过超滤浓缩(Centriplus YM-10然后是Microcon YM-10 concentrators，AmiconInc.，Beverly，Massachusetts，USA)到300μl。样品(4.2mg蛋白)上柱到HiPrep16/60 Sephacryl S-200HR柱(直径16mm，高度60cm；Amersham PharmaciaBiotech，Uppsala，Sweden)，其用50mM Tris-HCl(pH 7.5)含15％蔗糖，1mMDTT和150mM KCI平衡。用70.5ml缓冲液洗脱酶。酶在SDS-PAGE分析上得到均一的带。
表6：纯化酶步骤总结
 
步骤 总活性(单位) 总蛋白(mg)   比活(单位/mg蛋白) 产量(％)
无细胞提取物 4.1 8570 0.00048 100
Q Sepharose(1) 3.4 5700 0.0006 83
Q Sepharose(2) 2.5 316 0.0079 62
Ether Toyopearl 1.6 74 0.022 39
Resource ISO 1.2 4.2 0.29 28
Sephacryl S-200 0.74 0.71 1.0 18
(9)反应产物的鉴定：总体积5ml反应混合物，组成为50mMTris-HCl缓冲液(pH 7.5)，640μM PNP，1mM MnCl2和108μg酶，于37℃温育。温育1小时后，反应混合物沸水浴3分钟，离心除去所得反应混合物中变性蛋白。上清上柱到Amberlite CG-120(Rohm and Haas Company，Philadelphia，Pennsylvania，USA)柱(直径16mm，长度11cm)。柱用40ml水冲洗，并用5％铵溶液展开。汇集铵溶液洗脱的级分，并减压浓缩。残余物溶解在少量甲醇中，在高压液相层析分析，分析条件：柱，Capcell pakC18 SG120柱(直径4.6mm，高度250mm，Shiseido Co.，Tokyo，Japan)；流动相，0.1M高氯酸钠，0.1M磷酸钾和2％乙腈(pH 3.5)；流速，1ml/分钟；设定UV探测器为292nm。结果，与标准吡哆醇样品相比较，样品证实为吡哆醇。

Claims (15)

1.维生素B6磷酸盐磷酸酶，其具有下述物化性质：
a)分子量：29,000±5,000(由分子量29,000±5,000的单体组成)
b)辅助因子：Mn2+，Mg2+，Co2+，Sn2+或Ni2+
c)底物特异性：对吡哆醇5′-磷酸盐，吡哆醛5′-磷酸盐和吡哆胺5′-磷酸盐有活性
d)最适温度：在pH7.5下30-40℃
e)最适pH：7.0-8.0
2.权利要求1的维生素B6磷酸盐磷酸酶，其中得自能生产所述的维生素B6磷酸盐磷酸酶属于中华根瘤菌属的微生物。
3.权利要求2的维生素B6磷酸盐磷酸酶，其中所述微生物是Sinorhizobium meliloti IFO 14782(DSM No.10226)或其突变体。
4.生产权利要求1的维生素B6磷酸盐磷酸酶的方法，其包括在水性营养培养基通气条件下，培养能生产具有上述物化性质的维生素B6磷酸盐磷酸酶的属于中华根瘤菌属微生物，破碎微生物细胞，从微生物的破碎细胞的无细胞提取物分离并纯化维生素B6磷酸盐磷酸酶。
5.权利要求4的方法，其中所述微生物是Sinorhizobium meliloti IFO14782(DSM No.10226)或其突变体。
6.权利要求4的方法，其中进行所述发酵的pH范围为5.0-9.0，温度范围10℃-45℃，进行1-5天。
7.权利要求4的方法，其中进行所述发酵的pH范围为6.0-8.0，温度范围25℃-40℃，进行1-3天。
8.从维生素B6磷酸盐生产维生素B6的方法，其包含在Mn2+，Mg2+，Co2+，Sn2+或Ni2+存在下，将维生素B6磷酸盐与权利要求1的维生素B6磷酸盐磷酸酶接触，并从反应混合物分离所得的维生素B6。
9.权利要求8的方法，其中维生素B6磷酸盐磷酸酶得自Sinorhizobiummeliloti IFO 14782(DSM No.10226)或其突变体。
10.权利要求8或9的方法，其中进行所述发酵pH范围为5.5-9.0，温度范围15℃-45℃，进行15分钟-5小时。
11.权利要求8-10的方法，其中进行所述发酵pH范围为6.5-8.0，温度范围25℃-40℃，进行30分钟-3小时。
12.从维生素B6磷酸盐生产维生素B6的方法，其包括将维生素B6磷酸盐与属于中华根瘤菌属微生物的无细胞提取物接触，其中所述微生物能生产权利要求1的维生素B6磷酸盐磷酸酶，从反应混合物分离所得的维生素。
13.权利要求12的方法，其中所述微生物是Sinorhizobium meliloti IFO14782(DSM No.10226)或其突变体。
14.权利要求12的方法，其中进行所述反应的pH范围为5.5-9.0，温度范围15℃-45℃，进行15分钟-5小时。
15.权利要求12的方法，其中进行所述反应的pH范围为6.5-8.0，温度范围25℃-40℃，进行30分钟-3小时。
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