CN101361717B - 巴曲酶冻干粉针制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种巴曲酶冻干粉针制剂及其制备方法。所述巴曲酶冻干粉针制剂包含巴曲酶和药学上可接受的冻干保护剂及赋形剂，所述巴曲酶与冻干保护剂之比为10BU：0.01～10mg，所述巴曲酶与赋形剂之比为10BU：2～200mg。本发明的巴曲酶冻干粉针制剂制备工艺简单，适合规模化生产，并且稳定性高，可长期保存，同时由于未添加防腐剂，可用于静脉注射，扩大了临床适用范围。
Description
技术领域
本发明涉及巴曲酶冻干粉针制剂及其制备方法。
背景技术
巴曲酶(Batroxobin)系采用现代生物技术手段，从矛头蝮蛇蛇毒中提取纯化的类凝血酶。本品为糖蛋白，其肽链由231个氨基酸残基组成，分子量36000D，它能专一作用于纤维蛋白原分子的Aα链N末端精氨酸与甘氨酸之间，释放血纤维蛋白肽A，此与凝血酶相似，但对凝血因子XIII无活化作用，不会使纤维蛋白交联成不溶凝块。这种纤维蛋白不稳定，极易被纤溶酶降解，从血液循环中清除。所以本品无凝血酶样凝血作用但具有降低纤维蛋白原和抗凝作用。大量研究表明，巴曲酶降解纤维蛋白原作用十分明显，而对血液凝固因子、血小板功能、凝血酶原、出凝血时间则影响很小，对肝肾功能亦无明显影响。
巴曲酶在临床上可用作溶栓药物，可治疗缺血性脑血管病、突发性耳聋、肺栓塞导致的缺血性疾病，并具有出色的有效性和安全性。
目前，国内外只有巴曲酶的水针剂上市，而尚未有关于巴曲酶粉针制剂的文献报道。巴曲酶水针剂有以下两个明显缺陷：
1、稳定性较差，保存条件苛刻：水溶液中主药不稳定，为保持制剂的稳定性，巴曲酶水针剂的保存条件较为苛刻，只能在0～5℃条件下(不可冻结)避光保存，所以在运输过程中必须以冰袋保护，增加了运输难度和运输成本，也增加了患者的经济负担，同时由于在贮存中易降解，只能在18个月内使用；
2、加入了抑菌剂：由于本品热稳定性差，制剂不能采取最终灭菌工艺，上市的巴曲酶水针剂制剂处方中加入了一定量的抑菌剂—三氯叔丁醇，根据《中国药典》2005版的规定，“静脉输液与脑池内、硬膜外、椎管内用的注射液均不得加抑菌剂。”，因此该添加抑菌剂的巴曲酶水针剂不能用于静脉输液，这极大地限制了巴曲酶的临床适用范围。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种安全、稳定、有效的巴曲酶冻干粉针制剂及其制备方法，该巴曲酶冻干粉针制剂工艺简单，适合规模化生产，解决了有效药物成分巴曲酶在常规条件下(包括贮存和运输)稳定性的难题，降低了运输成本和运输难度，同时由于未加入抑菌剂，可用于静脉输液，扩大了临床适用范围，还消除了因抑菌剂带来的安全隐患，提高了用药的安全性。
根据本发明的一个方面，本发明所述巴曲酶冻干粉针制剂包含巴曲酶和药学上可接受的冻干保护剂，所述巴曲酶与冻干保护剂之比为10BU∶0.01-10mg，优选为10BU∶0.05～1mg，更优选为10BU∶0.1～1mg。本发明所用冻干保护剂用于防止巴曲酶被制剂生产设备和容器吸附，并可防止在冷冻干燥过程中巴曲酶变性失活，并可降低制剂在运输及贮存过程中的活性损失。
由于所述巴曲酶冻干粉针制剂的剂量较小，因此还可加入赋形剂，所述巴曲酶与赋形剂之比为10BU∶2～200mg，优选为10BU∶5～100mg，更优选为10BU∶10～80mg。
由于在巴曲酶冻干粉针制剂的制备过程中，通常需要首先将巴曲酶溶解于适宜pH的溶液中，例如药学上可接受的缓冲液中，因此该制剂中可以含有适量的缓冲盐。
本发明所用巴曲酶的原料可以是通过从蛇毒中提取纯化而得到，也可以是通过基因重组的方法制备得到。从这两种途径获得巴曲酶原料的方法都已经有相关文献报道。例如，中国发明专利申请03116054.9公开了一种基因重组方法制备的巴曲酶。在本发明中，如无特别说明，用于制备冻干粉针制剂的巴曲酶均为纯化的巴曲酶。
在本发明的一个具体实施方式中，从蛇毒中提取巴曲酶的方法可包括DEAE-Sepharose Fast Flow层析、亲和层析、凝胶过滤层析、冷冻干燥等步骤。该方法具有工艺简单，适合大规模工业生产的优点。
本发明所用巴曲酶的纯度可以为95％以上，优选为98％以上，最优选100％。
所述蛇毒为可提取出巴曲酶的各种类型的蛇毒，例如矛头蝮蛇蛇毒等。
具体而言，从蛇毒中提取巴曲酶的方法，可包括下述步骤：
1)DEAE-Sepharose Fast Flow层析
称取蛇毒，用0.02mol/L pH7.4Tris-HCl缓冲液提取4小时，以4000rpm/min离心20分钟，取上清液；沉淀同法再提取一次，合并上清液，调整pH至7.4，得提取液。将提取液上于平衡好的DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱，先用0.02mol/L Tris-HCl缓冲液洗脱未吸附杂质，再用含有0～0.6mol/L NaCl的缓冲溶液进行梯度洗脱，收集巴曲酶活性峰，得到活性组分收集液A。
2)亲和层析
将上述活性组分收集液A上于平衡好的亲和层析柱，先用含1.0mol/LNaCl0.05mol/L Tris-HCl pH7.0缓冲液洗脱未吸附杂质，直至透过峰后检测器基线平稳；然后用含0.1mol/L洗脱剂1.0mol/L NaCl0.05mol/L Tris-HCl pH7.0缓冲液洗脱活性组分，并在280nm紫外检测器上检测蛋白峰，收集活性组分，得到活性组分收集液B。
3)凝胶过滤层析
取活性组分收集液B，用截留分子量10,000D的透析袋对聚乙二醇浓缩至20ml左右，倒入除热原试剂瓶中备用，即为浓缩液B。取浓缩液B上于用0.1mol/L NH4Ac缓冲液平衡好的凝胶过滤柱上，然后用0.1mol/L NH4Ac缓冲液洗脱，经280nm紫外检测器检测，收集活性蛋白峰，收集液装入除热原瓶中，严格无菌操作，得到活性组分收集液C。
4)冷冻干燥
取截留分子量为10,000D的透析袋先用注射用水煮沸30分钟，然后将透析袋取出，装入注射用水，封闭两端，在滤纸上检漏，取完好的透析袋用注射用水清洗三遍，将上述活性组分收集液C装入透析袋中，封闭两端。以上步骤应在超净台上无菌操作。最后，将装好的透析袋对聚乙二醇浓缩至约50ml，在对预冷至4℃的注射用水透析三次，每次2小时。将上述透析液用0.22μm滤器过滤除菌，分装冻干得冻干粉。
取上述冻干粉，按照巴曲酶质量标准检验，合格后即为巴曲酶原料药。
其中，所述冻干保护剂可为选自氨基酸、糖类、多羟基醇、蛋白质和辛烷磺酸钠中的一种或多种，优选多羟基醇。
所述氨基酸可为选自甘氨酸、脯氨酸、L-色氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、赖氨酸盐酸盐、肌氨酸、L-酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸中的一种或多种。
优选地，所述糖类可为选自葡萄糖、果糖、乳糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖、环糊精及其衍生物、右旋糖酐中的一种或多种。
所述多羟基醇可为选自甘油、甘露醇、山梨醇、肌醇和聚乙二醇中的一种或多种。
所述蛋白质可为选自牛血清白蛋白和人血清白蛋白中的一种或两种。
所述赋形剂可为选自甘露醇、右旋糖酐、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸和赖氨酸中的一种或多种。所述赋形剂浓度可为0.2％～20％，优选为1％～10％(g/ml)。
根据另一方面，本发明所述巴曲酶冻干粉针制剂的制备方法包括下述步骤：
1)取巴曲酶，将其加入到适量的缓冲溶液中溶解，得溶解液；
2)在溶解液中加入适量的冻干保护剂和赋形剂；
3)分装，冷冻干燥，即得巴曲酶冻干粉针制剂。所述冻干保护剂包括氨基酸、糖类、多羟基醇、蛋白质和辛烷磺酸钠中的一种或多种。
其中，其中，所述冻干保护剂可为选自氨基酸、糖类、多羟基醇、蛋白质和辛烷磺酸钠中的一种或多种。
所述氨基酸可为选自甘氨酸、脯氨酸、L-色氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、赖氨酸盐酸盐、肌氨酸、L-酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸中的一种或多种。
所述糖类可为选自葡萄糖、果糖、乳糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖、环糊精及其衍生物、右旋糖酐中的一种或多种。
所述多羟基醇可为选自甘油、甘露醇、山梨醇、肌醇和聚乙二醇中的一种或多种。
所述蛋白质可为选自牛血清白蛋白和人血清白蛋白中的一种或两种。
所述冻干保护剂在溶解液中的浓度为0.05～1mg/ml。
所述缓冲溶液可为药学上可接受的适当pH值的缓冲液，为了在制备粉针剂时，能溶解巴曲酶及附加剂并保持其稳定，所述缓冲溶液的浓度可为1mmol/L～20mmol/L，pH值可为4.8～6.0，例如醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液等。
所述赋形剂可为选自甘露醇、右旋糖酐、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸和赖氨酸中的一种或多种。
当制备5BU/支的巴曲酶冻干粉针制剂时，可取纯化的巴曲酶8000～ 13000BU，将其加入到1000ml的缓冲溶液中溶解，得溶解液，在每1000ml溶解液中加入冻干保护剂0.01～10g和赋形剂2～200g，无菌分装成2000支，每支含量5BU，冷冻干燥，即得巴曲酶冻干粉针制剂。
当制备10BU/支的巴曲酶冻干粉针制剂时，可取纯化的巴曲酶8000～12500BU，将其加入到1000ml的缓冲溶液中溶解，得溶解液，在每1000ml溶解液中加入冻干保护剂0.01～10g和赋形剂2～200g，无菌分装成1000支，每支含量10BU，冷冻干燥，即得巴曲酶冻干粉针制剂。
本发明的巴曲酶冻干粉针制剂具有稳定性好，方便运输及储存，未添加任何抑菌剂，可扩大临床适用范围等优点。该制剂具有降纤、溶栓、改善微循环等作用，在临床上用于治疗急性脑梗死，改善各种闭塞性血管病(如血栓闭塞性脉管炎、深部静脉炎、肺栓塞等)引起的缺血性症状，改善末梢及微循环障碍(如突发性耳聋、晕动病)等。
经室温放置2年的长期稳定性考察，结果表明巴曲酶水针制剂在第6个月效价测定结果已达不到质量标准的要求；而巴曲酶冻干粉针制剂，效价测定结果基本无变化，并且在放置2年后，其效价测定结果还可以达到质量标准的要求。
以下将结合具体实施方式详细阐述本发明，以下实施例完全是例证性的，仅用于对本发明进行具体描述，而不应当理解为对本发明的限制。
附图的简要说明
图1为由本发明实施例1制备得到的巴曲酶的电泳图；
图2A为由本发明实施例1制备得到的巴曲酶的HPLC图；
图2B为巴曲酶对照品的HPLC图。
具体实施方式
本发明所用试剂和辅料，如无特别说明，均为市售购买产品。
巴曲酶的制备
实施例1
1、DEAE-Sepharose Fast Flow层析
称取矛头蝮蛇蛇毒(Bothrops atrox moojeni，Sigma试剂目录编号：V5500) 6g，用0.02mol/L pH7.4Tris-HCl缓冲液200ml提取4小时，以4000rpm/min离心20分钟，取上清液；沉淀用0.02mol/L pH7.4Tris-HCl缓冲液50ml同法再提取一次，合并上清液，调整pH至7.4，得提取液。将提取液上于平衡好的DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱，先用0.02mol/L Tris-HCl缓冲液洗脱未吸附杂质，再用含有0～0.6mol/L NaCl的缓冲溶液进行梯度洗脱，收集巴曲酶活性峰，得到活性组分收集液A300ml。
2、亲和层析
将上述活性组分收集液A上于平衡好的亲和层析柱，先用含1.0mol/LNaCl0.05mol/L Tris-HCl pH7.0缓冲液洗脱未吸附杂质，直至透过峰后检测器基线平稳；然后用含0.1mol/L Arg1.0mol/L NaCl0.05mol/L Tris-HCl pH7.0缓冲液洗脱活性组分，并在280nm紫外检测器上检测蛋白峰，收集活性组分，得到活性组分收集液B100ml。
3.凝胶过滤层析
取活性组分收集液B，用截留分子量10,000D的透析袋对聚乙二醇浓缩至20ml左右，倒入除热原试剂瓶中备用，即为浓缩液B。取浓缩液B上于用0.1mol/L NH4Ac缓冲液平衡好的凝胶过滤柱上，然后用0.1mol/L NH4Ac缓冲液洗脱，经280nm紫外检测器检测，收集活性蛋白峰，收集液装入除热原瓶中，严格无菌操作，得到活性组分收集液C150ml。
4.冷冻干燥
取截留分子量为10,000D的透析袋先用注射用水煮沸30分钟，然后将透析袋取出，装入注射用水，封闭两端，在滤纸上检漏，取完好的透析袋用注射用水清洗三遍，将上述活性组分收集液C装入透析袋中，封闭两端。以上步骤应在超净台上无菌操作。最后，将装好的透析袋对聚乙二醇浓缩至约50ml，再对预冷至4℃的注射用水透析三次，每次2小时。将上述透析液用0.22μm滤器过滤除菌，分装冻干得冻干粉。
取上述冻干粉，按照巴曲酶质量标准检验，合格后即为巴曲酶原料药。
用SDS-PAGE法和HPLC法对所得巴曲酶进行检测。HPLC色谱条件为：用凝胶色谱柱；以0.1mol/L磷酸盐缓冲液(取Na2HPO4·12H2O16.58g、NaH2PO4·2H2O8.38g、Na2SO414.20g，加水溶解并稀释至1000ml)为流动相；流速为每分钟1ml；检测波长为280nm。理论板数按巴曲酶峰计算应不得低于 3000。测定法为：取本品用流动相稀释成每1ml中含10BU的溶液作为供试品溶液，取供试品溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按面积归一化法计算，供试品中主峰相对百分含量不得低于90.0％。
图1为所得巴曲酶的电泳图，图2A和图2B分别为所得巴曲酶及巴曲酶对照品(购于National Institute for Biological Standards and Control，英国，标准品号为93/526)的HPLC图谱。
所得巴曲酶经SDS-PAGE法测定分子量为36000±5000D，HPLC法测定纯度为100％，比活大于1000BU/mgPr。
巴曲酶冻干粉针制剂制各(5BU/支)
实施例2
取巴曲酶原料药(由实施例1制备得到，下同)10000BU，将其加入到5mmol/L柠檬酸盐缓冲液(pH5.0)1000ml中溶解，得溶解液，在溶解液中加入蔗糖1g，甘露醇80g，搅拌溶解并摇匀，除菌过滤，滤液无菌分装成2000支，每支含量5BU，冷冻干燥，即得巴曲酶冻干粉针制剂。
本制剂室温放置2年，测定效价4.5BU。
实施例3
取巴曲酶原料药10000BU，将其加入到10mmol/L柠檬酸盐缓冲液(pH5.4)1000ml中溶解，得溶解液，在溶解液中加入甘氨酸0.5g，右旋糖酐50g，搅拌溶解并摇匀，除菌过滤，滤液无菌分装成2000支，每支含量5BU，冷冻干燥，即得巴曲酶冻干粉针制剂。
本制剂室温放置2年，测定效价4.4BU。
实施例4
取巴曲酶原料药10000BU，将其加入到20mmol/L柠檬酸盐缓冲液(pH5.8)1000ml中溶解，得溶解液，在溶解液中加入环糊精0.1g，右旋糖酐10g，搅拌溶解并摇匀，除菌过滤，滤液无菌分装成2000支，每支含量5BU，冷冻干燥，即得巴曲酶冻干粉针制剂。
本制剂室温放置2年，测定效价4.7BU。
实施例5
取巴曲酶原料药10000BU，将其加入到5mmol/L醋酸盐缓冲液(pH5.0)1000ml中溶解，得溶解液，在溶解液中加入蔗糖1g，甘露醇50g，搅拌溶解 并摇匀，除菌过滤，滤液无菌分装成2000支，每支含量5BU，冷冻干燥，即得巴曲酶冻干粉针制剂。
本制剂室温放置2年，测定效价4.6BU。
实施例6
取巴曲酶原料药10000BU，将其加入到10mmol/L醋酸盐缓冲液(pH5.4)1000ml中溶解，得溶解液，在溶解液中加入甘氨酸0.5g，右旋糖酐30g，搅拌溶解并摇匀，除菌过滤，滤液无菌分装成2000支，每支含量5BU，冷冻干燥，即得巴曲酶冻干粉针制剂。
本制剂室温放置2年，测定效价4.2BU。
实施例7
取巴曲酶原料药10000BU，将其加入到20mmol/L醋酸盐缓冲液(pH5.8)1000ml中溶解，得溶解液，在溶解液中加入环糊精0.1g，右旋糖酐10g，搅拌溶解并摇匀，除菌过滤，滤液无菌分装成2000支，每支含量5BU，冷冻干燥，即得巴曲酶冻干粉针制剂。
本制剂室温放置2年，测定效价4.6BU。
实施例8
取巴曲酶原料药10000BU，将其加入到5mmol/L醋酸盐缓冲液(pH5.0)1000ml中溶解，得溶解液，在溶解液中加入蔗糖0.05g，甘露醇200g，搅拌溶解并摇匀，除菌过滤，滤液无菌分装成2000支，每支含量5BU，冷冻干燥，即得巴曲酶冻干粉针制剂。
本制剂室温放置2年，测定效价4.6BU。
实施例9
取巴曲酶原料药10000BU，将其加入到10mmol/L醋酸盐缓冲液(pH5.4)1000ml中溶解，得溶解液，在溶解液中加入甘氨酸10g，右旋糖酐5g，搅拌溶解并摇匀，除菌过滤，滤液无菌分装成2000支，每支含量5BU，冷冻干燥，即得巴曲酶冻干粉针制剂。
本制剂室温放置2年，测定效价4.2BU。
巴曲酶冻干粉针制剂制备(10BU/支)
实施例10
取巴曲酶原料药10000BU，将其加入到5mmol/L柠檬酸盐缓冲液(pH5.0) 1000ml中溶解，得溶解液，在溶解液中加入蔗糖1g，甘露醇80g，搅拌溶解并摇匀，除菌过滤，滤液无菌分装成1000支，每支含量10BU，冷冻干燥，即得巴曲酶冻干粉针制剂。
本制剂室温放置2年，测定效价9.3BU。
实施例11
取巴曲酶原料药10000BU，将其加入到10mmol/L柠檬酸盐缓冲液(pH5.4)1000ml中溶解，得溶解液，在溶解液中加入甘氨酸0.5g，右旋糖酐50g，搅拌溶解并摇匀，除菌过滤，滤液无菌分装成1000支，每支含量10BU，冷冻干燥，即得巴曲酶冻干粉针制剂。
本制剂室温放置2年，测定效价9.0BU。
实施例12
取巴曲酶原料药10000BU，将其加入到20mmol/L柠檬酸盐缓冲液(pH5.8)1000ml中溶解，得溶解液，在溶解液中加入环糊精0.1g，右旋糖酐10g，搅拌溶解并摇匀，除菌过滤，滤液无菌分装成1000支，每支含量10BU，冷冻干燥，即得巴曲酶冻干粉针制剂。
本制剂室温放置2年，测定效价9.5BU。
实施例13
取巴曲酶原料药10000BU，将其加入到5mmol/L醋酸盐缓冲液(pH5.0)1000ml中溶解，得溶解液，在溶解液中加入蔗糖1g，甘露醇50g，搅拌溶解并摇匀，除菌过滤，滤液无菌分装成1000支，每支含量10BU，冷冻干燥，即得巴曲酶冻干粉针制剂。
本制剂室温放置2年，测定效价9.4BU。
实施例14
取巴曲酶原料药10000BU，将其加入到10mmol/L醋酸盐缓冲液(pH5.4)1000ml中溶解，得溶解液，在溶解液中加入甘氨酸0.5g，右旋糖酐30g，搅拌溶解并摇匀，除菌过滤，滤液无菌分装成1000支，每支含量10BU，冷冻干燥，即得巴曲酶冻干粉针制剂。
本制剂室温放置2年，测定效价9.1BU。
实施例15
取巴曲酶原料药10000BU，将其加入到20mmol/L醋酸盐缓冲液(pH5.8) 1000ml中溶解，得溶解液，在溶解液中加入环糊精0.01g，右旋糖酐2g，搅拌溶解并摇匀，除菌过滤，滤液无菌分装成1000支，每支含量10BU，冷冻干燥，即得巴曲酶冻干粉针制剂。
本制剂室温放置2年，测定效价9.6BU。
实施例16
取巴曲酶原料药10000BU，将其加入到20mmol/L柠檬酸盐缓冲液(pH5.8)1000ml中溶解，得溶解液，在溶解液中加入环糊精1g，右旋糖酐100g，搅拌溶解并摇匀，除菌过滤，滤液无菌分装成1000支，每支含量10BU，冷冻干燥，即得巴曲酶冻干粉针制剂。
本制剂室温放置2年，测定效价9.5BU。
实施例17
取巴曲酶原料药10000BU，将其加入到5mmol/L醋酸盐缓冲液(pH5.0)1000ml中溶解，得溶解液，在溶解液中加入蔗糖1g，甘露醇50g，搅拌溶解并摇匀，除菌过滤，滤液无菌分装成1000支，每支含量10BU，冷冻干燥，即得巴曲酶冻干粉针制剂。
本制剂室温放置2年，测定效价9.4BU。
巴曲酶冻干粉针制剂与水针制剂的稳定性比较
实施例18
将巴曲酶冻干粉针制剂(由实施例4制备)与水针制剂(日本东菱药品工业株氏会社生产，商品名DF-521)在常温下同时放置2年，进行稳定性考察，分别于0、1、2、3、6、9、12、18、24个月采用巴曲酶注射液国家药品标准效价测定项下方法测定效价。对比结果见表1。
结果表明巴曲酶水针制剂在第6个月效价测定结果已达不到质量标准的要求；而巴曲酶冻干粉针制剂，效价测定结果基本无变化，并且在放置2年后，其效价测定结果还可以达到质量标准的要求。
表1、巴曲酶冻干粉针制剂与水针剂效价测定结果
| 冻干粉针制剂(BU/支) | 水针制剂(BU/支) | |
| 0个月 | 5.1 | 5.2 |
| 1个月 | 5.0 | 4.9 |
| 2个月 | 5.1 | 4.6 |
| 3个月 | 5.2 | 4.2 |
| 6个月 | 5.1 | 3.1 |
| 9个月 | 5.1 | 2.1 |
| 12个月 | 5.0 | --- |
| 18个月 | 4.9 | --- |
| 24个月 | 4.7 | --- |
尽管已通过具体实施例详细描述了本发明，但本领域技术人员很容易根据本发明做出某些修改或进行某些替换和等效处理，因此这些变化应包括在本发明的范围之内。
Claims (7)
1.一种巴曲酶冻干粉针制剂，其特征在于，所述巴曲酶冻干粉针制剂包含巴曲酶和药学上可接受的冻干保护剂，所述巴曲酶与冻干保护剂之比为10BU∶0.01～10mg，巴曲酶与赋形剂之比为10BU∶2～200mg；所述巴曲酶是从矛头蝮蛇蛇毒中提取纯化的一种类凝血酶；
所述巴曲酶冻干粉针剂通过下述方法制备：
1)取巴曲酶，将其加入到缓冲溶液中溶解，得溶解液；
2)在溶解液中加入冻干保护剂和赋形剂；
3)分装，冷冻干燥，即得巴曲酶冻干粉针制剂；
其中所述缓冲液的pH值为4.8～6.0。
2.根据权利要求1所述的巴曲酶冻干粉针制剂，其特征在于，所述巴曲酶是从蛇毒中通过DEAE-Sepharose Fast Flow层析、亲和层析、凝胶过滤层析、冷冻干燥而提取纯化得到。
3.根据权利要求1所述的巴曲酶冻干粉针制剂，其特征在于，所述冻干保护剂为选自氨基酸、糖类、多羟基醇、蛋白质和辛烷磺酸钠中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的巴曲酶冻干粉针制剂，其特征在于，
所述氨基酸为选自甘氨酸、脯氨酸、L-色氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、赖氨酸盐酸盐、肌氨酸、L-酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸中的一种或多种；
所述糖类为选自葡萄糖、果糖、乳糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖、环糊精及其衍生物、右旋糖酐中的一种或多种；
所述多羟基醇为选自甘油、甘露醇、山梨醇、肌醇和聚乙二醇中的一种或多种；
所述蛋白质为选自牛血清白蛋白和人血清白蛋白中的一种或两种。
5.根据权利要求1所述的巴曲酶冻干粉针制剂，其特征在于，所述赋形剂为选自甘露醇、右旋糖酐、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸和赖氨酸中的一种或多种。
6.一种权利要求1所述巴曲酶冻干粉针制剂的制备方法，包括下述步骤：
1)取巴曲酶，将其加入到缓冲溶液中溶解，得溶解液；
2)在溶解液中加入冻干保护剂和赋形剂；
3)分装，冷冻干燥，即得巴曲酶冻干粉针制剂；
其中所述缓冲液的pH值为4.8～6.0；所述巴曲酶与冻干保护剂之比为10BU∶0.01～10mg，巴曲酶与赋形剂之比为10BU∶2～200mg。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液为醋酸盐缓冲液和/或柠檬酸盐缓冲液。
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