CN101353644B - 一种血管内皮细胞及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种血管内皮细胞及其制备方法与应用。本发明公开的分离血管内皮细胞的方法，是用II型胶原酶消化离体脐带的脐静脉，收集细胞，再进行培养，获得的贴壁细胞即为血管内皮细胞。本发明分离方法操作简单、方便实用，所得到的内皮细胞纯度高、数量多、体外增殖旺盛、可多次传代，不仅具有吞噬和成管能力，还具抑制前体细胞发育成为树突状细胞的功能。因此，本发明建立了稳定的血管内皮细胞的分离和培养技术体系，为内皮细胞的研究应用奠定了基础。

Description

一种血管内皮细胞及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种血管内皮细胞及其制备方法与应用。

背景技术

血管内皮细胞不仅参与调节血管通透性和凝血过程，而且在免疫调节、移植排斥、肿瘤转移等许多过程中都具有重要作用。在这些研究应用中，内皮细胞的分离及体外培养是关键。

目前，多从人脐带静脉中分离内皮细胞。但是获得的人脐静脉内皮细胞体外生长能力较差，增殖缓慢，原代培养不易成功，传代培养也只能传3-4代。

内皮细胞的获取多采用机械刮取法和酶消化法。机械刮取法是将脐静脉剪开，用手术刀背等刮取内皮细胞或使用带有尼龙筛的分离管，但这一方法很难掌握力度，易损伤内皮细胞，而且多混有其它细胞如成纤维细胞等。现多采用酶消化法，而选用合理的消化酶并掌握好消化时间，是成功获取内皮细胞的关键之一。胰蛋白酶、胶原酶均可作为消化血管内皮细胞的酶，胶原酶较温和，效果较好。细胞营养液血清的选择也是决定血管内皮细胞是否存活的关键因素。高质量的各种血清才能保证内皮细胞的正常生长。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种分离血管内皮细胞的方法。

本发明所提供的分离血管内皮细胞的方法，是用II型胶原酶消化离体脐带的脐静脉，收集细胞，再进行培养，获得的贴壁细胞即为血管内皮细胞。

其中，所述II型胶原酶与所述离体脐带的配比可以是85U-342U：1cm长脐带，优选为171U：1cm长脐带；所述消化的时间可以为10-30min，优选为10min。

用所述II型胶原酶的溶液进行消化，所述II型胶原酶溶液的初始浓度可以为171U/ml-684U/ml，优选为342U/ml。

所述培养中使用的培养基是向IMDM培养基中添加马血清、胎牛血清、牛血清白蛋白、肝素钠、血管内皮生长因子和碱性成纤维生长因子，使马血清的终浓度为5-15％(体积百分含量)、胎牛血清的终浓度为5-15％(体积百分含量)、牛血清白蛋白的终浓度为0.5-2％(质量百分含量)、肝素钠的终浓度为10-20ug/ml、血管内皮生长因子的终浓度为5-20ng/ml、碱性成纤维生长因子的终浓度为1-5ng/ml，得到的培养基。

所述培养基优选为向IMDM培养基中添加马血清、胎牛血清、牛血清白蛋白、肝素钠、血管内皮生长因子和碱性成纤维生长因子，使马血清的终浓度为10％(体积百分含量)、胎牛血清的终浓度为10％(体积百分含量)、牛血清白蛋白的终浓度为1％(质量百分含量)、肝素钠的终浓度为10ug/ml、血管内皮生长因子的终浓度为10ng/ml、碱性成纤维生长因子的终浓度为1ng/ml，得到的培养基。

其中，IMDM培养基既可以直接从公司购买，也可以自己配制。

IMDM培养基的组成：1L IMDM培养基含17.7g IMDM粉末、终浓度为2mmol/L的L-谷氨酰胺(L-glutamine)和终浓度为25mmol/L的HEPES buffer和3.024gNaHCO₃。

所述培养的条件可以为温度为35-38℃、CO₂浓度为5-8％(体积百分含量)、饱和湿度、培养的时间是3-4天；所述温度优选为37℃，所述CO₂浓度优选为5％。

在每代的培养过程中，从培养开始时计起，培养24h后，换一次新鲜的上述细胞培养基，以及时去掉非贴壁细胞，而留下贴壁的内皮细胞。

所述培养还可包括继代培养。

上述方法中所述脐静脉具体可以为人脐静脉。

用上述任一所述方法获得的血管内皮细胞也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种培养上述细胞的方法。

本发明所提供的细胞培养方法，是在温度为35-38℃、CO₂浓度为5-8％(体积百分含量)、饱和湿度的条件下培养所述细胞，培养所用的培养基可以是向IMDM培养基中添加马血清、胎牛血清、牛血清白蛋白、肝素钠、血管内皮生长因子和碱性成纤维生长因子，使马血清的终浓度为5-15％(体积百分含量)、胎牛血清的终浓度为5-15％(体积百分含量)、牛血清白蛋白的终浓度为0.5-2％(质量百分含量)、肝素钠的终浓度为10-20ug/ml、血管内皮生长因子的终浓度为5-20ng/ml、碱性成纤维生长因子的终浓度为1-5ng/ml，得到的培养基。

培养条件中，所述温度优选为37℃、所述CO₂浓度优选为5％(体积百分含量)。

所述培养基优选为向IMDM培养基中添加马血清、胎牛血清、牛血清白蛋白、肝素钠、血管内皮生长因子和碱性成纤维生长因子，使马血清的终浓度为10％(体积百分含量)、胎牛血清的终浓度为10％(体积百分含量)、牛血清白蛋白的终浓度为1％(质量百分含量)、肝素钠的终浓度为10ug/ml、血管内皮生长因子的终浓度为10ng/ml、碱性成纤维生长因子的终浓度为1ng/ml，得到的培养基。

上述细胞在抑制树突状细胞的前体细胞发育成为树突状细胞中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明分离方法操作简单、方便实用，所得到的内皮细胞纯度高(传代培养2代后，纯度可达95％、96％或97％)、数量多(20厘米长的脐带获得3-4×10⁶个细胞)、体外增殖旺盛、可多次传代(最多可传8-10代，仍然保持原来的活性)，不仅具有吞噬和成管能力，还具有抑制前体细胞发育成为树突状细胞的功能。而树突状细胞是免疫反应的始动者，通过抑制树突状细胞的发育可降低免疫反应，从而有助于降低移植物抗宿主反应及有利于一些自身免疫病的治疗。

因此，本发明建立了稳定的血管内皮细胞的分离和培养技术体系，为内皮细胞的研究应用奠定了基础。

附图说明

图1为内皮细胞培养过程中形态观察结果。

图2为内皮细胞的流式检测结果。

图3为内皮细胞的吞噬和成管实验结果。

图4为内皮细胞的抑制前体细胞发育成为树突状细胞的结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。

实施例1、内皮细胞的分离和培养

本实验中从健康足月产新生儿新鲜脐带静脉中分离内皮细胞。操作时先将新生儿新鲜脐带剪下。

本实验中用到的原料如下：II型胶原酶(Gibco)、IMDM培养基(Gibco，Cat.No.12200-036))、胎牛血清(Hyclone)、马血清(Gibco)、牛血清白蛋白BSA(Fluka)、血管内皮生长因子VEGF(Prepro Tech)、碱性成纤维生长因子bFGF(Prepro Tech)、肝素钠(上海国药集团化学试剂有限公司)。

II型胶原酶溶液是用IMDM培养基溶解II型胶原酶干粉进行配制。

一、在条件I下分离和培养

所述条件I为如下：所用的II型胶原酶溶液的初始浓度为342U/ml，消化10分钟；细胞培养条件为37℃、CO₂浓度5％、饱和湿度；所用的内皮细胞培养基是向IMDM培养基中添加马血清、胎牛血清、牛血清白蛋白、肝素钠、血管内皮生长因子和碱性成纤维生长因子，使马血清的终浓度为10％(体积百分含量)、胎牛血清的终浓度为10％(体积百分含量)、牛血清白蛋白的终浓度为1％(质量百分含量)、肝素钠的终浓度为10ug/ml、血管内皮生长因子的终浓度为10ng/ml、碱性成纤维生长因子的终浓度为1ng/ml，得到的培养基。

取健康足月顺产新生儿新鲜脐带20cm，用冷的PBS缓冲液(含终浓度为200ug/ml的肝素钠)清洗2次；用无菌止血钳夹住脐带的一端，用无菌注射器抽取10ml初始浓度为342U/ml的II型胶原酶溶液注入脐静脉(酶与脐带的配比是171U：1cm长脐带)，用无菌止血钳夹住脐带的另一端，放入灭菌平皿中，加入PBS(含终浓度为200ug/ml的肝素钠)保湿，37℃消化10min；将脐带一端放入含有2ml胎牛血清的离心管中，用无菌吸管吸取6ml IMDM培养基(不含马血清、胎牛血清、BSA、肝素、VEGF和bFGF)，冲洗脐静脉，将获得的细胞溶液以1000转/min的速度离心10min，收集细胞沉淀，用1mlIMDM培养基(不含马血清、胎牛血清、BSA、肝素、VEGF和bFGF)重悬细胞，进行细胞计数，用IMDM培养基(不含马血清、胎牛血清、BSA、肝素、VEGF和bFGF)调整细胞浓度为1×10⁶个/ml。取24孔细胞培养板(costa)，每孔加入100μl IMDM培养基(不含马血清、胎牛血清、BSA、肝素、VEGF和bFGF)，每孔再补加900μl内皮细胞培养基，在37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养24h；然后吸去24孔板内液体，PBS洗2遍，每孔各加1ml内皮细胞培养基，在37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下继续培养3天，获得的贴壁细胞即为血管内皮细胞(即原代血管内皮细胞)；统计得到的原代细胞的数目，表明，20cm长的脐带分离得到4×10⁶个血管内皮细胞。

用0.125％胰蛋白酶消化上述贴壁细胞，传至6孔板中，用相同的内皮细胞培养基在相同的条件下继续培养(第一次传代)，至细胞生长至80％融合时，再用0.125％胰蛋白酶消化细胞，计数，将一部分细胞继续传代培养(第二次传代)，另一部分细胞按1×10⁶个/ml的浓度放入细胞冻存液(每毫升冻存液含有0.4ml IMDM培养基、0.5ml胎牛血清、0.1ml DMSO)中，再放入液氮罐中冻存；

将第二次传代培养得到的细胞再继续进行传代，共传10代。

取第二次传代培养(3代细胞)获得的细胞，用流式细胞仪检测其纯度。结果纯度为97％。

二、在条件II下分离和培养

所述条件II为如下：所用的II型胶原酶的浓度为171U/ml，消化20分钟；细胞培养条件为35℃、CO₂浓度6％、饱和湿度；所用的内皮细胞培养基是向IMDM培养基中添加马血清、胎牛血清、牛血清白蛋白、肝素钠、血管内皮生长因子和碱性成纤维生长因子，使马血清的终浓度为5％(体积百分含量)、胎牛血清的终浓度为5％(体积百分含量)、牛血清白蛋白的终浓度为0.5％(质量百分含量)、肝素钠的终浓度为15ug/ml、血管内皮生长因子的终浓度为5ng/ml、碱性成纤维生长因子的终浓度为3ng/ml，得到的培养基。

取健康足月顺产新生儿新鲜脐带20cm，用冷的PBS缓冲液(含终浓度为200ug/ml的肝素钠)清洗2次；用无菌止血钳夹住脐带的一端，用无菌注射器抽取10ml171U/ml的II型胶原酶溶液注入脐静脉(酶与脐带的配比是85U：1cm长脐带)，用无菌止血钳夹住脐带的另一端，放入灭菌平皿中，加入PBS(含终浓度为200ug/ml的肝素钠)保湿，37℃消化20min；将脐带一端放入含有2ml胎牛血清的离心管中，用无菌吸管吸取6ml IMDM培养基(不含马血清、胎牛血清、BSA、肝素、VEGF和bFGF)，冲洗脐静脉，将获得的细胞溶液以1000转/min的速度离心10min，收集细胞沉淀，用1mlIMDM培养基(不含马血清、胎牛血清、BSA、肝素、VEGF和bFGF)重悬细胞，进行细胞计数，用IMDM培养基(不含马血清、胎牛血清、BSA、肝素、VEGF和bFGF)调整细胞浓度为1×10⁶个/ml。取24孔细胞培养板(costa)，每孔加入100μl IMDM培养基(不含马血清、胎牛血清、BSA、肝素、VEGF和bFGF)，每孔再补加900μl内皮细胞培养基，在35℃、6％CO₂、饱和湿度条件下培养24h；然后吸去24孔板内液体，PBS洗2遍，每孔各加1ml内皮细胞培养基，在37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下继续培养2天，获得的贴壁细胞即为血管内皮细胞(即原代血管内皮细胞)；统计得到的原代细胞的数目，表明，20cm长的脐带分离得到3×10⁶个个血管内皮细胞。

用0.125％胰蛋白酶消化上述贴壁细胞，传至6孔板中，用相同的内皮细胞培养基在相同的条件下继续培养(第一次传代)，至细胞生长至80％融合时，再用0.125％胰蛋白酶消化细胞，计数，将一部分细胞继续传代培养((第二次传代))，另一部分细胞按1×10⁶个/ml的浓度放入细胞冻存液(每毫升冻存液含有0.4ml IMDM培养基、0.5ml胎牛血清、0.1ml DMSO)中，再放入液氮罐中冻存；

将第二次传代培养得到的细胞再继续进行传代，共传8代。

取第二次传代培养(3代细胞)获得的细胞，用流式细胞仪检测其纯度。结果纯度为95％。

三、在条件III下分离和培养

所述条件III为如下：所用的II型胶原酶的浓度为684U/ml，消化30分钟；细胞培养条件为38℃、CO₂浓度8％、饱和湿度；所用的内皮细胞培养基是向IMDM培养基中添加马血清、胎牛血清、牛血清白蛋白、肝素钠、血管内皮生长因子和碱性成纤维生长因子，使马血清的终浓度为15％(体积百分含量)、胎牛血清的终浓度为15％(体积百分含量)、牛血清白蛋白的终浓度为2％(质量百分含量)、肝素钠的终浓度为20ug/ml、血管内皮生长因子的终浓度为20ng/ml、碱性成纤维生长因子的终浓度为5ng/ml，得到的培养基。

取健康足月顺产新生儿新鲜脐带20cm，用冷的PBS缓冲液(含终浓度为200ug/ml的肝素钠)清洗2次；用无菌止血钳夹住脐带的一端，用无菌注射器抽取10ml684U/ml的II型胶原酶溶液注入脐静脉(酶与脐带的配比是342U：1cm长脐带)，用无菌止血钳夹住脐带的另一端，放入灭菌平皿中，加入PBS(含终浓度为200ug/ml的肝素钠)保湿，37℃消化30min；将脐带一端放入含有2ml胎牛血清的离心管中，用无菌吸管吸取6ml IMDM培养基(不含马血清、胎牛血清、BSA、肝素、VEGF和bFGF)，冲洗脐静脉，将获得的细胞溶液以1000转/min的速度离心10min，收集细胞沉淀，用1mlIMDM培养基(不含马血清、胎牛血清、BSA、肝素、VEGF和bFGF)重悬细胞，进行细胞计数，用IMDM培养基(不含马血清、胎牛血清、BSA、肝素、VEGF和bFGF)调整细胞浓度为1×10⁶个/ml。取24孔细胞培养板(costa)，每孔加入100μl IMDM培养基(不含马血清、胎牛血清、BSA、肝素、VEGF和bFGF)，每孔再补加900μl内皮细胞培养基，在38℃、8％CO₂、饱和湿度条件下培养24h；然后吸去24孔板内液体，PBS洗2遍，每孔各加1ml内皮细胞培养基，在37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下继续培养3天，获得的贴壁细胞即为血管内皮细胞(即原代血管内皮细胞)；统计得到的原代细胞的数目，表明，20cm长的脐带分离得到3.5×10⁶个个血管内皮细胞。

用0.125％胰蛋白酶消化上述贴壁细胞，传至6孔板中，用相同的内皮细胞培养基在相同的条件下继续培养(第一次传代)，至细胞生长至80％融合时，再用0.125％胰蛋白酶消化细胞，计数，将一部分细胞继续传代培养((第二次传代))，另一部分细胞按1×10⁶个/ml的浓度放入细胞冻存液(每毫升冻存液含有0.4ml IMDM培养基、0.5ml胎牛血清、0.1ml DMSO)中，再放入液氮罐中冻存；

将第二次传代培养得到的细胞再继续进行传代，共传9代。

取第二次传代培养(3代细胞)获得的细胞，用流式细胞仪检测其纯度。结果纯度为96％。

实施例2、内皮细胞的鉴定

取实施例1一中原代至第10次传代获得的细胞、实施例1二中原代至第8次传代获得的细胞、实施例1三中原代至第9次传代获得的各代细胞，分别进行下列鉴定实验。

1、细胞形态观察

各内皮细胞在生长过程中，在24孔板中均形成几个克隆，细胞呈梭状，待细胞铺满24孔板时，细胞***变短，呈鹅卵石状，例如实施例1一中获得的原代细胞的形态如图1所示(图1A为梭状，图1B为鹅卵石状)。表明，从形态上看，本发明获得的细胞符合血管内皮细胞的形态特征。

2、流式细胞仪检测其表面标志

本实验中使用如下鼠抗人单克隆抗体：CD31-PE、CD73-PE、CD166-PE、CD34-FITC、HLA-DR-FITC、HLA-ABC-FITC、CD45-FITC、CD29-PE，均是BD公司产的。

细胞计数，各分成5管，每管5×10⁵个细胞，离心，收集细胞沉淀，每管再用200μl PBS缓冲液重悬，将其中一管细胞作为对照，其余四管作为实验组，向4个实验管中分别10μl每种抗体，具体如下：

第一管：CD31-PE和CD34-FITC；

第二管：CD73-PE和HLA-DR-FITC；

第三管：CD166-PE和HLA-ABC-FITC；

第四管：CD29-PE和CD45-FITC；

将各管细胞均置于避光处，室温孵育20min，加PBS缓冲液离心洗一遍，每管再加300μl0.5％多聚甲醛固定，4℃保存，第二天进行流式细胞检测。

实验设3次重复。结果表明，所有被检测的细胞中，有90-95％以上细胞表现为CD31-PE、CD73-PE、HLA-ABC-FITC和CD29-PE阳性，CD34-FITC、HLA-DR-FITC、CD166-PE和CD45-FITC阴性，符合血管内皮细胞的特征。实施例1一中第二次传代获得的细胞的检测结果如图2所示。

3、内皮细胞的吞噬和成管

(1)准备一块48孔细胞培养板(costa)和20-200μl的Tip头置于-20℃冷冻；Matrigel(Sigma)置于4℃解冻。

(2)48孔板取一孔用30μl Matrigel铺胶，用预冷的Tip头，动作迅速，以防Matrigel在室温下凝固过快导致胶面不平。37℃放置30min，使胶凝固。

(3)细胞计数，取2×10⁴细胞加入铺完Matrigel胶的孔中，补加内皮细胞培养基至200μl，37℃，5％CO₂饱和湿度培养，4h后，加入5μl Dil-Ac-LDL(Sigma)，37℃，5％CO₂饱和湿度培养8h，荧光显微镜观察吞噬和成管结果。

实验结果表明，本发明血管内皮细胞均能吞噬Dil-Ac-LDL，在Matrigel胶上均具有成管能力。实施例1一中第三次传代获得的细胞的检测结果如图3所示(A为吞噬结果，B为成管结果)。

4、内皮细胞能抑制前体细胞(CD14⁺细胞)向树突状细胞发育

(1)取离体的人外周血白细胞10ml，Fillco密度梯度离心法分离单个核细胞，按人单核细胞分离试剂盒(MACS)说明书操作，分离单核细胞即CD14⁺细胞(即树突状细胞的前体细胞)。

(2)内皮细胞接种于6孔板(Costa)中的一孔，细胞数为4×10⁵，37℃，5％CO₂饱和湿度培养12h，在此孔中加入4×10⁶单核细胞，另取一孔加入4×10⁶单核细胞，分别在每孔中加入GM-CSF(Prepro Tech)(10ng/ml)和IL-4(Prepro Tech)(10ng/ml)37℃，5％CO₂饱和湿度培养，每隔一天半换一次新鲜的内皮细胞培养基，同时补加相同浓度的GM-CSF和IL-4。

(3)细胞培养7d后，收集细胞，流式细胞术检测CD1a(BD)和CD14(BD)的表达。

正常树突状细胞能高表达CD1a(图4A)和CD83(图4B)，但是本发明中，将CD14⁺细胞(即树突状细胞的前体细胞)与本发明的血管内皮细胞共培养后，得到的细胞表达的CD1a(图4C)和CD83(图4D)明显降低，表明，本发明的血管内皮细胞能够抑制前体细胞发育成为树突状细胞。实施例1一中第三次传代获得的细胞的实验结果如图4C和图4D所示。

综上实验表明，本发明获得的细胞就是血管内皮细胞且有抑制前体细胞发育成为树突状细胞的功能。

Claims (9)

1.血管内皮细胞在体外抑制外周血单核细胞分化为树突状细胞中的应用；

所述血管内皮细胞按照如下方法分离：用II型胶原酶消化离体脐带的脐静脉，收集细胞，再进行培养，获得的贴壁细胞即为血管内皮细胞；

所述II型胶原酶与所述离体脐带的配比是85U-342U：1cm长脐带；所述消化的时间为10-30min；

用所述II型胶原酶的溶液进行消化，所述II型胶原酶溶液的初始浓度为171U/ml-684U/ml。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述II型胶原酶与所述离体脐带的配比为171U：1cm长脐带；所述消化的时间为10min。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：用所述II型胶原酶的溶液进行消化，所述II型胶原酶溶液的初始浓度为342U/ml。

4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述培养中使用的培养基是向IMDM培养基中添加马血清、胎牛血清、牛血清白蛋白、肝素钠、血管内皮生长因子和碱性成纤维生长因子，使马血清的终浓度为5-15％(体积百分含量)、胎牛血清的终浓度为5-15％(体积百分含量)、牛血清白蛋白的终浓度为0.5-2％(质量百分含量)、肝素钠的终浓度为10-20ug/ml、血管内皮生长因子的终浓度为5-20ng/ml、碱性成纤维生长因子的终浓度为1-5ng/ml，得到的培养基。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述马血清的终浓度为10％、所述胎牛血清的终浓度为10％、所述牛血清白蛋白的终浓度为1％、所述肝素钠的终浓度为10ug/ml、所述血管内皮生长因子的终浓度为10ng/ml、所述碱性成纤维生长因子的终浓度为1ng/ml。

6.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述培养的温度为35-38℃、CO₂浓度为5-8％(体积百分含量)、湿度为饱和湿度、培养时间是3-4天。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述培养的温度为37℃、所述CO₂浓度为5％。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述培养从开始起进行24h后，换一次新鲜的所述培养基。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述培养还包括继代培养。

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