CN111109248A - 一种杂交瘤细胞冻存液及96孔板冻存复苏方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种杂交瘤细胞冻存液及96孔板冻存复苏方法,涉及细胞生物学技术领域。所述杂交瘤细胞冻存液其组分按体积百分比包括:8%~12%二甲基亚砜、50%~60%胎牛血清和30%~40%含添加剂的基础培养基IMDM。本发明的杂交瘤细胞冻存液,可以在杂交瘤细胞筛选过程中,在96孔板内,每个孔的细胞数量较少时即对其进行冻存,并且可以进行批量冻存复苏,操作简单;同时保持了细胞高复苏活率,不影响细胞的特性,有助于细胞冻存技术的快速应用和推广。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域,特别涉及一种一种杂交瘤细胞冻存液 及96孔板冻存复苏方法。
背景技术
细胞冻存:是将细胞放在低温环境,减少细胞代谢,以便长期储存的一 种技术。细胞冻存是细胞保存的主要方法之一,起到了细胞保种的作用。
细胞复苏:是指将冻存在液氮或者-80℃冰箱中的细胞37℃解冻之后重新 培养,细胞恢复生长的过程。
现有冻存液基本配方基本为10%二甲基亚砜(DMSO)+90%胎牛血清, 冻存方法都是程序降温,即4℃,2h;然后转到-20℃,2h;-80℃,2h;最后 放入液氮罐。冻存过程比较繁琐和费时。细胞冻存与复苏后,细胞存活率不 高;并且需要冻存前至少5*106细胞数目才能保证复苏出来成活率。而杂交瘤 细胞一般都是在96孔板中筛选出来,细胞数目比较少,要单个孔的细胞冻存, 需要从96孔—48孔—24孔—6孔—10cm培养皿,不断扩大培养至可以冻存 的细胞数目,耗时比较长。而不同操作之间的批间差异较大;现有冻存液及 方法不适合96孔板杂交瘤细胞的冻存与复苏,对于批量细胞的短期冻存与复 苏,其操作繁琐。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种一种杂交瘤细胞冻存液及96孔板冻存复苏 方法,旨在现有冻存液不适合杂交瘤细胞筛选过程中的冻存复苏的问题。
为实现上述目的,本发明提出一种杂交瘤细胞冻存液,所述杂交瘤细胞 冻存液其组分按体积百分比包括:
二甲基亚砜 8%~12%
胎牛血清 50%~60%
含添加剂的基础培养基IMDM 30%~40%。
优选地,所述添加剂的组分包括:硫酸锌、对氨基苯甲酸、硫辛酸、亚 油酸、腐胺、乙醇胺和谷胱甘肽。
优选地,所述硫酸锌的质量浓度为0.0114mg/L、所述对氨基苯甲酸的质 量浓度为1mg/L、所述硫辛酸的质量浓度为0.2mg/L、所述亚油酸的质量浓度 为0.084mg/L,所述腐胺的质量浓度为0.161mg/L,所述乙醇胺的质量浓度为 0.16mg/L,所述谷胱甘肽的质量浓度为1mg/L。
优选地,所述杂交瘤细胞冻存液配制完成后,于-20℃保存。
此外,本发明还提出一种杂交瘤细胞的96孔板冻存复苏方法,包括以下 步骤:S10、取待冻存的孔内有杂交瘤细胞悬液的96孔板,吸掉所述96孔板 中待冻存孔内的杂交瘤细胞悬液的上清液;
S20、将如权利要求1~4任意一项所述的杂交瘤细胞冻存液和完全培养基 加入按1:1的体积比加入到所述待冻存孔内,轻拍96孔板,使所述冻存液和 完全培养基与所述杂交瘤细胞混合均匀,然后转入-80℃冰箱冷冻保存。
S30、将冻存杂交瘤细胞的96孔板从-80℃冰箱取出,于培养箱中解冻 30~40min,从培养箱中取出所述冻存杂交瘤细胞的96孔板,吸弃冻存孔内上 清液,加入所述完全培养基,于培养箱中培养,得到复苏细胞。
优选地,步骤S10中,所述杂交瘤细胞悬液中的细胞浓度为2×104~5×104个/ml。
优选地,所述完全培养基包括胎牛血清、谷氨酰胺、青链双抗、HT和 IMDM基础培养基。
优选地,步骤S30中,所述培养箱培养条件为:37℃、5%CO2。
本发明提供的杂交瘤细胞冻存液,可以在杂交瘤细胞筛选过程中,在96 孔板内,每个孔的细胞数量较少时即对其进行冻存,并且可以进行批量冻存 复苏,操作简单;同时保持了细胞高复苏活率,不影响细胞的特性,有助于 细胞冻存技术的快速应用和推广。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明 实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例仅仅是 本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。
需要说明的是,实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建 议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买 获得的常规产品。此外,各个实施例之间的技术方案可以相互结合,但是必 须是以本领域普通技术人员能够实现为基础,当技术方案的结合出现相互矛 盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在,也不在本发明要求的 保护范围之内。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创 造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
现有冻存液及冻存复苏方法,比较繁琐,并且需要细胞达到一定细胞总 数进行冻存才能保证复苏出来的细胞的一定存活率。而杂交瘤细胞一般都是 在96孔板中筛选出来,细胞数目比较少,要单个孔的细胞冻存,需要不断扩 大培养至可以冻存的细胞数目,耗时比较长。
鉴于此,本发明提出一种杂交瘤细胞冻存液,操作简单,同时保持了细 胞高复苏活率,并且不影响细胞的特性。所述杂交瘤细胞冻存液其组分按体 积百分比包括:二甲基亚砜(Sigma-Aldrich公司)8%~12%;胎牛血清(上 海博升生物科技有限公司)50%~60%;以及含添加剂的基础培养基IMDM(武 汉博士德生物工程有限公司)30%~40%。其中,所述添加剂的组分包括硫酸 锌、对氨基苯甲酸、硫辛酸、亚油酸、腐胺、乙醇胺和谷胱甘肽。
较优地,所述硫酸锌(Sigma-Aldrich公司)的质量浓度为0.0114mg/L、 所述对氨基苯甲酸(Sigma-Aldrich公司)的质量浓度为1mg/L、所述硫辛酸 (Sigma-Aldrich公司)的质量浓度为0.2mg/L、所述亚油酸(Sigma-Aldrich 公司)的质量浓度为0.084mg/L,所述腐胺(Sigma-Aldrich公司)的质量浓度 为0.161mg/L,所述乙醇胺(Sigma-Aldrich公司)的质量浓度为0.16mg/L, 所述谷胱甘肽(Sigma-Aldrich公司)的质量浓度为1mg/L。所述杂交瘤细胞 冻存液配置完成后,于-20℃保存备用。
此外,本发明还提出一种杂交瘤细胞的96孔板冻存复苏方法,包括以下 步骤:
步骤S10、取待冻存的孔内有杂交瘤细胞悬液的96孔板,吸掉所述96 孔板中待冻存孔内的杂交瘤细胞悬液的上清液;
其中,所述杂交瘤细胞悬液的细胞浓度为2×104~5×104个/ml。需要说明 的是,所述杂交瘤细胞是经ELISA间接法检测为阳性克隆的单克隆细胞,在 96孔细胞板中培养细胞调整其活力,待生长状态好后,转到新的96孔板,作 为待冻存的杂交瘤细胞。
步骤S20、将如权利要求1~4任意一项所述的杂交瘤细胞冻存液和完全培 养基加入按1:1的体积比加入到所述待冻存孔内,轻拍96孔板,使所述冻存 液和完全培养基与所述杂交瘤细胞混合均匀,然后转入-80℃冰箱冷冻保存。
其中,所述完全培养基包括胎牛血清、谷氨酰胺、青链双抗、HT和IMDM 基础培养基,具体地,所述完全培养基各组分按体积的配比为20%胎牛血清、 1%谷氨酰胺、1%青链双抗、2%HT、76%IMDM基础培养基。需要说明的是, 所述完全培养基为现配现用。
步骤S30、将冻存杂交瘤细胞的96孔板从-80℃冰箱取出,于培养箱中解 冻30~40min,从培养箱中取出所述冻存杂交瘤细胞的96孔板,吸弃冻存孔内 上清液,加入所述完全培养基,于培养箱中培养,得到复苏细胞。
其中,所述培养箱培养条件均为:37℃、5%CO2。此外,所述完全培养 基配制与步骤S20中配制一样,且同样为现配现用。
以下结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明,应当理解, 以下实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例1
(1)杂交瘤细胞冻存液的配制:吸取3ml基础培养基IMDM(并向内加 入0.0342ug硫酸锌、3ug的对氨基苯甲酸、0.6ug的硫辛酸、0.252ug的亚 油酸、0.483ug的腐胺,0.48ug的乙醇胺、3ug的谷胱甘肽)于15ml离心管 中,再向内加入6ml胎牛血清和1ml二甲基亚砜,混匀,于-20℃保存备 用。
(2)取孔中杂交瘤细胞悬液的密度约占孔的80%的96孔板,各个孔的 细胞由一株杂交瘤细胞株扩大培养到96孔板不同孔中,取样计数,选4株杂 交瘤细胞悬液的细胞浓度为2×104~5×104个/ml的细胞来冻存,分别标记为A1、 A2、A3、A4,分别吸掉这4个待冻存孔内的上清液。
(3)取步骤(1)配制的杂交瘤细胞冻存液100μL和完全培养基100μL (完全培养基配制:20%胎牛血清+1%谷氨酰胺+1%青链双抗 +2%HT+76%IMDM基础培养基)加入到4个待冻存孔内,轻拍96孔板,使 所述冻存液和完全培养基与所述杂交瘤细胞混合均匀,然后转入-80℃冰箱冷 冻保存。
(4)将冻存杂交瘤细胞的96孔板从-80℃冰箱取出,于37℃、5%CO2培养箱中解冻40min,吸弃冻存孔内上清液,加入200μL完全培养基(完全 培养基配制:20%胎牛血清+1%谷氨酰胺+1%青链双抗+2%HT+76%IMDM基 础培养基),分别取样计数,于培养箱(培养箱条件:37℃、5%CO2)中培 养,得到复苏细胞。
实施例2
(1)杂交瘤细胞冻存液的配制:吸取4ml基础培养基IMDM(并向内加 入0.0456ug的硫酸锌、4ug的对氨基苯甲酸、0.8ug的硫辛酸、0.336ug的 亚油酸、0.644ug的腐胺,0.64ug的乙醇胺、4ug的谷胱甘肽)于15ml离心 管中,再向内加入5.2ml胎牛血清和0.8ml二甲基亚砜,混匀,于-20℃保 存备用。
(2)从实施例1中96孔板的其余未冻存孔中选4株杂交瘤细胞悬液的 细胞浓度为2×104~5×104个/ml的细胞来冻存,分别标记为B1、B2、B3、B4, 分别吸掉这4个待冻存孔内的上清液。
(3)取步骤(1)配制的杂交瘤细胞冻存液100μL和完全培养基100μL (完全培养基配制:20%胎牛血清+1%谷氨酰胺+1%青链双抗 +2%HT+76%IMDM基础培养基)加入到4个待冻存孔内,轻拍96孔板,使 所述冻存液和完全培养基与所述杂交瘤细胞混合均匀,然后转入-80℃冰箱冷 冻保存。
(4)将冻存杂交瘤细胞的96孔板从-80℃冰箱取出,于37℃、5%CO2培养箱中解冻30min,吸弃冻存孔内上清液,加入200μL完全培养基(完全 培养基配制:20%胎牛血清+1%谷氨酰胺+1%青链双抗+2%HT+76%IMDM基 础培养基),分别取样计数,于培养箱(培养箱条件:37℃、5%CO2)中培 养,得到复苏细胞。
实施例3
(1)杂交瘤细胞冻存液的配制:吸取3.8ml基础培养基IMDM(并向内 加入0.04332ug的硫酸锌、3.8ug的对氨基苯甲酸、0.76ug的硫辛酸、0.3192ug 的亚油酸、0.6118ug的腐胺,0.608ug的乙醇胺、3.8ug的谷胱甘肽)于15ml 离心管中,再向内加入5ml胎牛血清和1.2ml二甲基亚砜,混匀,于-20℃保 存备用。
(2)从实施例2中96孔板的其余未冻存孔中选4株杂交瘤细胞悬液的 细胞浓度为2×104~5×104个/ml的细胞来冻存,分别标记为C1、C2、C3、C4, 分别吸掉这4个待冻存孔内的上清液。
(3)取步骤(1)配制的杂交瘤细胞冻存液100μL和完全培养基100μL (完全培养基配制:20%胎牛血清+1%谷氨酰胺+1%青链双抗 +2%HT+76%IMDM基础培养基)加入到4个待冻存孔内,轻拍96孔板,使 所述冻存液和完全培养基与所述杂交瘤细胞混合均匀,然后转入-80℃冰箱冷 冻保存。
(4)将冻存杂交瘤细胞的96孔板从-80℃冰箱取出,于37℃、5%CO2培养箱中解冻解冻35min,吸弃冻存孔内上清液,加入200μL完全培养基(完 全培养基配制:20%胎牛血清+1%谷氨酰胺+1%青链双抗+2%HT+76%IMDM 基础培养基),分别取样计数,于培养箱(培养箱条件:37℃、5%CO2)中 培养,得到复苏细胞。
对比例
(1)从实施例3中96孔板的其余未冻存孔中选4株杂交瘤细胞悬液的 细胞浓度为2×104~5×104个/ml的细胞来冻存,分别标记为D1、D2、D3、D4, 分别吸掉这4个待冻存孔内的上清液。
(2)向待冻存的这4个孔中加入按体积比为10%DMSO+90%胎牛血清 配制的冻存液,然后程序降温(即4℃,2h;然后转到-20℃,2h;-80℃,2h), 最后放入液氮罐。
(3)将冻存细胞于37℃解冻之后,加入原细胞悬液的培养基,分别取样 计数,然后复苏培养。
一、计数结果分析:
实施例1至3以及对比例冻存前和复苏后计数结果如表1所示。
表1细胞冻存前和复苏后计数结果分析
从表1可以看出,A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3、B4、C1、C2、C3、 C4的细胞复苏活率较好,也就是本发明提供的杂交瘤细胞冻存液以及96孔 板冻存复苏方法,对96孔板中的杂交瘤细胞进行冻存复苏的效果较好,相比 于冻存前细胞,细胞活率下降较少,并且复苏后活率都在85%以上。而用现 有的冻存液以及冻存复苏方法的杂交瘤细胞D1、D2、D3、D4复苏后的活率 较低,相比于冻存前的细胞活率也下降较多,说明现有冻存液及冻存复苏方 法不适合96孔板中的杂交瘤细胞的批量冻存。
二、细胞特性检测
将复苏后的A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3、B4、C1、C2、C3、C4用 ELISA方法进行检测。
(1)待96孔复苏的杂交瘤细胞密度达到80%以上时吸取100ul细胞上清 液到包被好的酶标板中;放入到37℃温箱中孵育60分钟;
(2)洗板4次,每次300μl洗板液,静置10s,每次拍干。然后加羊抗 小鼠IgG-HRP工作浓度为1:1W,100μl/孔加样,37℃孵育45min;
(3)洗板5次,每次300μl洗板液,静置20s,每次拍干。将TMB A、 B液等体积混合,100μl/孔,37度避光孵育15min-20min。
(4)加2M硫酸,50μl/孔,酶标仪测定OD450,杂交瘤细胞冻存前的检 测与复苏后的检测方法相同,只是在冻存前吸取上清液检测,在此不做详细 说明。检测结果见表2。
表2ELISA检测结果
杂交瘤细胞 | 冻存前ELISA OD值 | 复苏后ELISA OD值 |
A1 | 0.834 | 0.759 |
A2 | 1.235 | 1.184 |
A3 | 1.944 | 1.845 |
A4 | 1.665 | 1.579 |
B1 | 0.750 | 0.723 |
B2 | 1.328 | 1.249 |
B3 | 1.505 | 1.498 |
B4 | 1.955 | 1.943 |
C1 | 0.890 | 0.847 |
C2 | 1.356 | 1.305 |
C3 | 1.853 | 1.807 |
C4 | 1.489 | 1.408 |
ELISA检测结果显示,复苏的杂交瘤细胞,经ELISA间接法检测100% 都有OD值,说明本发明提供的杂交瘤细胞冻存液及96孔板冻存复苏方法在 保证复苏细胞成活率的情况下不会由阳转阴,也就是不会丢失阳性克隆。
综上所述,本发明提供的杂交瘤细胞冻存液以及96孔板冻存复苏方法可 以在杂交瘤细胞筛选过程中,在96孔板内,每个孔的细胞数量较少时即对其 进行冻存,并且可以进行批量冻存复苏,操作简单;同时保持了细胞高复苏 活率,不影响细胞的特性,有助于细胞冻存技术的快速应用和推广。
以上仅为本发明的优选实施例,并非因此限制本发明的专利范围,对于 本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神 和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包括在本发明的专 利保护范围内。
Claims (8)
1.一种杂交瘤细胞冻存液,其特征在于,其组分按体积百分比包括:
二甲基亚砜 8%~12%
胎牛血清 50%~60%
含添加剂的基础培养基IMDM 30%~40%。
2.如权利要求1所述的杂交瘤细胞冻存液,其特征在于,所述添加剂的组分包括:硫酸锌、对氨基苯甲酸、硫辛酸、亚油酸、腐胺、乙醇胺和谷胱甘肽。
3.如权利要求2所述的杂交瘤细胞冻存液,其特征在于,所述硫酸锌的质量浓度为0.0114mg/L、所述对氨基苯甲酸的质量浓度为1mg/L、所述硫辛酸的质量浓度为0.2mg/L、所述亚油酸的质量浓度为0.084mg/L,所述腐胺的质量浓度为0.161mg/L,所述乙醇胺的质量浓度为0.16mg/L,所述谷胱甘肽的质量浓度为1mg/L。
4.如权利要求1所述的杂交瘤细胞冻存液,其特征在于,所述杂交瘤细胞冻存液配制完成后,于-20℃保存。
5.一种杂交瘤细胞的96孔板冻存复苏方法,其特征在于,包括以下步骤:S10、取待冻存的孔内有杂交瘤细胞悬液的96孔板,吸掉所述96孔板中待冻存孔内的杂交瘤细胞悬液的上清液;
S20、将如权利要求1~4任意一项所述的杂交瘤细胞冻存液和完全培养基加入按1:1的体积比加入到所述待冻存孔内,轻拍96孔板,使所述冻存液和完全培养基与所述杂交瘤细胞混合均匀,然后转入-80℃冰箱冷冻保存;
S30、将冻存杂交瘤细胞的96孔板从-80℃冰箱取出,于培养箱中解冻30~40min,从培养箱中取出所述冻存杂交瘤细胞的96孔板,吸弃冻存孔内上清液,加入所述完全培养基,于培养箱中培养,得到复苏细胞。
6.如权利要求5所述的杂交瘤细胞的96孔板冻存复苏方法,其特征在于,步骤S10中,所述杂交瘤细胞悬液中的细胞浓度为2×104~5×104个/ml。
7.如权利要求5所述的杂交瘤细胞的96孔板冻存复苏方法,其特征在于,所述完全培养基包括胎牛血清、谷氨酰胺、青链双抗、HT和IMDM基础培养基。
8.如权利要求5所述的杂交瘤细胞的96孔板冻存复苏方法,其特征在于,步骤S30中,所述培养箱培养条件均为:37℃、5%CO2。
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