CN101351736A - 发光测量装置及发光测量方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种新型发光测量装置，其能够从如组织、细胞以及生物个体的多个活体生物样品中测量发光量或发光强度，其中发光蛋白质的基因表达已被引入，该测量分别适用于相应的生物样品。本发明的发光测量装置包括：图像获取部分，其获取生物样品的发光图像；测量区域确定部分，其在该发光图像中确定至少一个测量区域；发光测量部分，其在确定的测量区域中测量发光量或发光强度；从而由该测量区域内的生物样品分别的测量发光量或发光强度。无论发光蛋白质到细胞等样品的基因传递效率如何，当观测具有基因表达的生物样品时，发光测量都可成功的进行。

Description

发光测量装置及发光测量方法

技术领域

本发明涉及一种用于从活体样本中测量发光量和/或发光强度的发光测量装置，该活体样本中表达发光蛋白质的基因(以下称之为“发光蛋白质基因”)已经被引入，以及一种用于测量该种活体样本的发光量和/或发光强度的发光测量方法，或用如上所述的装置和方法通过显微镜来实现发光量和/或发光强度的测量。

背景技术

在生命科学研究和制药开发阶段，某一特定基因在某一细胞的表达的测定和/或其表达数量的测量经常被实施。例如，在制药开发阶段，一系列的过程，如(a)化验的建立和优化有效的助于特定病原目标分子的识别和测定，(b)借助于建立化验通过筛除化合物库中的命中化合物和先导组合物从而识别它们，(c)种化合物的测定在命中化合物或先导组合物其中之一具有有效的代谢和/或安全性，且其被试用于药品，被实施的步骤要先于临床试验。在上述过程的化合物筛除过程中，除了生化化验外，在活体上某种化合物的加入后，测量其任意基因的表达的数量的目的是为了调查活体上化合物的效果和影响，和测试化合物在包括活体细胞的生物***中的有效性，并且这些结果被用做该化合物的一个信息。通常，基因表达的数量根据环境条件和/或其它情况时时刻刻都在变换，因此在基因表达加入组合物的测量中，基因表达数量随时间的变化也被测量。

在过去，细胞内基因的表达的存在与否和/或基因表达的数量随着时间的变化可以由Northern印记，Western印记，RT-PCR技术等来测量。然而，在这些传统方法中，通过任意方法对细胞的处理都需要基因表达数量的测量，且在同一个细胞中的基因表达的数量随着时间的变化而不能守恒，更进一步的，实验者要进行长时间的操作(他需要在每一个特定的时刻进行细胞的处理)，且在这些过程中操作者是很麻烦的。于是，最近，运用细胞中的发光蛋白质基因设法追踪在同一个细胞中的基因表达的数量随着时间的变化的方式被提出，该方式为″报告化验(Reporter assay)″，如此以发光蛋白质来表示涉及任意的特定蛋白质的表达的情况，举例来说，发光蛋白质可以表示为融合任意蛋白质的情况(例如，参见Sambrook，Russell(2001)，分子克隆法。实验室手册，第三版，Chapter.17，在培养的哺乳动物细胞中基因表达的分析：17.1-17.112)。

在所谓的报告化验中，由于荧光素酶基因之间通过密码有准备的连接，一个发光蛋白质(以下称之为“荧光素酶基因”)到蛋白质基因或到涉及与此的基因被观测，且引入细胞的最终基因被测试。则当荧光素酶表示连同蛋白质的表达被观测时，荧光素酶与荧光素反应发光(生物发光现象)，因此，由于蛋白质的表达可被观测到所以利用荧光素酶作为报告分子并且测定荧光素酶发出的光，观测蛋白质的表达是可被测定的。此外，通过从荧光素-荧光素酶反应测量发光量从而使蛋白质表达数量或强度的测量的观测变得可能。

在“报告化验”中通常通过药物发展法来完成化合物筛选过程，举例来说，荧光素酶基因(即，蛋白质基因附带的荧光素酶基因)表达的强度的测量在特定的时刻伴随有通过溶解细胞以获得细胞溶解溶液的反应，其中荧光素酶已经表示为包括荧光素的培养基溶液，ATP，镁离子等，且随后依靠使用光电倍增管的发光计量计从已经与培养基溶液反应的细胞溶解溶液中测量发光量，即从而使荧光素酶基因表达的数量的平均值能够测量，蛋白质表达的数量在整个细胞群中可被观测。更进一步，通过暂时获得荧光素酶基因表达的数量，具备了发光计量计，细胞培养器中的荧光素酶基因可被导入，因此培养的整个细胞群的发光量可通过发光计量计在每一个特定时刻被测量。则，关于发光计量计发光强度的测定，对于某一周期表达的规律等可被测量，从而能够记录在整个细胞群中的有关基因(荧光素酶基因)的发光表达的数量的时间变化。

进一步地，在细胞中的基因表达也设法通过对发光蛋白质发出的光成像来测定，例如光学显微镜下的荧光素酶。举例来说，这种使用发光蛋白质成像的方法，例如Rutter等，利用光子计数摄像机对在单个活细胞上荧光素酶基因表达成像，观测到MAP激酶包含于胰岛素信号传递(Rutter，White，Tavare(1995)“在胰岛素信号中MAP激酶通过单个活体细胞中荧光素酶基因表达的非侵入成像显示的研究。电流生物学vol.5：890-899)。Sternberg及其他人也报道了利用光子计数摄像机和冷却的CCD摄像机对生物发光的测定(Sternberg，Eberl Kongsbak，Molin(1997)，“从个体细菌细胞对生物发光的测定：两个不同的低照度成像***的比较。生物发光和化学发光杂志vol.12：7-13)。更进一步地，Takasuka及其他人报道说通过光子计数摄像机在单个活体细胞中的荧光素酶基因表达的成像可观测催乳激素助催化剂活化的动态变化(Takasuka，White，Wood，Robertson，Davis(1998)，“在个体活体催乳激素单元中催乳激素助催化剂活化的动态变化”，内分泌学vol.139：1361-1368)。

顺便来说，如上所述在报告化验中利用发光蛋白质，发光蛋白质基因被引入细胞并用来表达该细胞，但是，通常地，引入基因和基因表达的效率根据个体细胞而变化。固有地，在基因引入技术中，基因不是无疑的被引入所有细胞，并且，即使在基因被引入的细胞，基因表达也不一定成功(在适当的时候将会发生)。例如，即使在克隆的培养细胞中，诸如海拉细胞(HeLacell)，通过受体细胞膜表面对于试剂的反应可能随个体细胞而变化。因此，对于基因表达存在与否以及它在报告化验中随时间变化的精密测量，优选为可单独测量每一细胞发光量和/或发光强度。然而，在依靠发光计量计测量发光蛋白质的发光量的方法中，鉴于药物的开发用于化合物筛选的过程，发光量是从整体细胞群的发光量测量的，且相应的，测量个体单元的发光量和/或发光强度的测量要求是不能达到的。

通过测量在光学显微镜下测量每个细胞中发光量和/或发光强度，利用上述示例的光学显微镜观测细胞中的发光现象成像，来测量个体细胞中发光量和发光强度是可以实现的。然而，目前只有在实验室里相关专业方面的研究中发光现象成像可被实现，因此，例如，在药物发展过程中的化合物筛选阶段还没有设备或方法可被证实能够快速的并且容易的进行对某一特定的基因的测定及其表达数量的测量。事实上，利用超高灵敏度的测定元件来测定微弱的发光是能够实现的。然而在这种情况下，该得到的图像只是镶嵌图，因此当定义一区域测量其发光量时，则很难实现细部的分析。

发明内容

因此，本发明的一个目的在于提供一种发光测量装置或方法，其中细胞中发光量被测量，且用上述提到利用生物发光现象的报告化验的方式来处理该结果信息，其中在单个活体细胞中的发光量和/或其随时间变化的测量是通过光学显微镜等观测该活体细胞和/或其他的生物样品的发光图像而得到的。

本发明的另一个目的在于提供这样的一种装置和/或方法，在药物发展过程中的化合物筛选阶段等能够容易地实现某一特定的基因表达的测定以及其表达数量的测量。

本发明的进一步的目的在于提供一种计算机程序，使这样的装置和/或方法能够在任意计算机上实现。

根据本发明，提供一种新颖的发光测量装置，其能够测量多个活体生物样品的发光量或发光强度，诸如活体组织，细胞和生物学个体，其中发光蛋白质的表达基因已经被引入，分别地适用于各个生物样品。根据本发明的一个方面，本发明的发光测量仪器的特征在于：该装置包括图像获取部分，其获取包括多个生物样品的至少一部分的发光图像；测量区域确定部分，其确定通过该图像获取部分得到的该发光图像上的至少一个测量区域；以及发光测量部分，在测量区域确定部分确定至少一个测量区域时，该发光测量部分基于该图像获取部分得到的发光图像测量在至少一个已确定的测量区域的发光量或发光强度，从而由包含在至少一个测量区域的该生物样品单独的测量发光量或发光强度。在本发明装置中，典型地，该图像获取部分可以包括光学显微镜和显微镜图像采集装置，且由于光学显微镜下的该生物样品的发光现象，该发光图像可以是通过观测光发出而得到的发光显微镜图像。

根据上述的本发明的装置，首先，通过图像获取部分得到多个活体生物样品的发光图像，其中发光蛋白质的表达基因已经被引入了活体生物样品。其次，该得到的发光图像中的至少一个测量区域通过该测量区域确定部分而被确定，然后该测量区域内的发光量或发光强度从该采集的图像那里测量出来。也就是说，根据利用该测量区域确定部分，其可被设计成立刻测量仅在任意地确定区域内的发光图像，以得到其发光量或发光强度，因此，通过设置多个生物样品中的某一任意样本，诸如细胞或细胞中的特定区域，在测量区域中，特定样品的发光量或发光强度的测量将会变的可能。更进一步的说，上述本发明的装置中，通过如上所述的图像获取部分，测量区域确定部分以及发光测量部分的结合，多个生物样品内部的各个样品发光量或发光强度的测量变得简单易行，在随后会结合实施例对此进行描述。

此外，上述的本发明的装置可进一步包括在多个生物样品上施加或照射光线的照明部分，该图像获取部分从而可通过该照明部分获得在多个生物样品上施加光线的照明图像；以及设计为能产生重叠图像的测量区域确定部分，该重叠图像通过重叠由图像获取部分得到的发光图像和照明图像而产生，然后确定在该重叠图像上的至少一个测量区域。在这方面，该照明图像可是透射光显微镜图像，其是通过在光学显微镜下利用该照明部分上的照明光线进行透射光观测而得到的。

这里，可以理解，基于通过重叠按上述方法得到的照明图像和发光图像而产生的重叠图像，发光量或发光强度被测量的测量区域被确定，在该测量区域的确定操作变得非常的简单易行。通常，由于生物发光现象导致的发光量是十分微弱的，且生物样品的发光图像对于人眼的分辨力甚至在光学显微镜下观测来说也是非常暗的。此外，就发光观测来说，光线仅仅来自发光蛋白质存在的区域，所以很难确定生物样品的整体形态和其中发光部分的位置。然而，在对要测量区域的发光量和发光强度进行确定时，如果发光图像和照明图像重叠生成重叠图像，然后如上所述在该重叠图像上的测量区域被确定，则用户可以了解存在发光现象的区域位于哪一个生物样品，那就是说，存在于发光图像中生物样品(的图像)之中的区域存在基因表达，或上述的发光区域被定位，且更进一步的说，在某一特定单元中比较和分析发光量和/或发光地点的过程中，可以防止错误地选择其它的细胞。此外，鉴于不论发光存在与否，样品的形态都可被证实，在样品图像中没有观测到发光现象时，了解样品的形态和情况变成了可能。在这方面，根据本发明的发明人的调查研究，图像获取部分由光学显微镜和显微镜图像采集装置组成的情况下，更优选的，将形成显微镜图像采集装置的光接收面上的生物样品图像的光学显微镜的透镜组和物镜设计成，以使得物镜的数值孔径与投射到光接收面上的生物样品图像的放大倍率的比的平方值是0.01或0.01以上。

在一个本发明上述的实施例中，本发明的装置可设置有控制部分，其控制图像获取部分以使图像获取部分重复地工作，以及发光测量部分，其可设计为基于在该控制部分的控制下该图像获取部分的重复操作来获取多个发光图像，当至少一个测量区域通过该测量区域确定部分确定时，发光测量部分从位于相应的发光图像中的至少一个测量区域测量发光量或发光强度。从而，图像中的特定区域的发光量或发光强度随时间的变化可被追踪，因此，一般与发光蛋白质或与此相关蛋白质融合的任意的特定蛋白质的表达数量随时间的变化可被得知。在这点上，该区域的确定的执行不仅仅是依靠发光图像，而是利用如上所述的照明图像和发光图像的重叠图像来实现，且该得到的数据是直观的，有可能连续地直观的显示特定的细胞而并不是错误选择其它的细胞，因此可以实现快速和实时的分析。

此外，以上本发明的装置可配有刺激施加设备以对生物学样本起到刺激作用。上述的刺激施加设备可为化合物添加设备，其添加某化合物到生物样品；温度调节设备，其校准生物样品的温度；和/或气体供应设备，其供应气体到生物样品。

此外，如背景技术部分中所述，例如，在报告化验用于进行某一特定基因的表达的测定和在药物发展过程该某一特定基因的表达随时间的变化的测量时，测试提供给生物样品的某化合物。因此，在上述发明装置的实施例中，尤其是研究上述的生物样品上的某一化合物的影响时，该装置可进一步的配置有添加预定的化合物到多个生物样本化合物添加设备，从而在获得发光图像过程中使化合物能够任意供给生物样品。并且，上述发明装置，可并入发光蛋白质表达判断部分，其判断某一化合物在生物样品上的影响，举例来说，根据发光测量部分来测量发光量或发光强度来判断的预定的化合物是否引起发光蛋白质的表达或定位或者是否起到抑制作用，使用户能够很快地认识到化合物在生物样品上的影响。关于这一点，更具体地说，在本发明的装置设计为可以研究某一化合物在生物样品上的影响的情况下，发光蛋白质表达判断部分可包括参数计算部分，其根据发光测量部分测量的发光量或发光强度来计算预定参数；以及参数阈值判断部分，其通过该参数计算部分计算的预定参数判断预定的化合物是否引起发光蛋白质的表达或定位或者是否起到抑制作用。该预定的参数可为任意的指示化合物在生物样品上的影响的指数，举例来说，IC 50、半值、以及速率常数(例如，很多情况下，试剂的效果是由“半值”指示，就是说浓度赋予该试剂的100％效果值的一半(50％))。此外，为了准确和实时的取得响应某一化合物的添加后的生物样品的发光变化，以及进行发光蛋白质表达的判断，本发明的装置可包括控制部分，其控制化合物添加设备和图像获取部分并控制化合物添加和图像获取的定时。

顺便而言，任意生物样品的发光量或发光强度的测量中，发光图像可从任意的外部装置获取，然后可测量在该发光图像的任意区域的发光量或发光强度。因此，根据本发明的另一个方面，提供用于该发光测量的信息处理设备，其基于生物样品的发光图像计算多个活体生物样品的发光量或发光强度，其中表达发光蛋白质的基因已经被引入活体生物样品，特征在于该设备包括测量区域确定部分，其在早先获得的包括生物样品图像的发光图像中确定至少一个测量区域；以及发光测量部分，其基于活体生物样品的发光图像，在早先获得的发光图像中测量至少一个测量区域的发光量或发光强度。在此设备中，尽管需要发光图像到该设备的传输，但是在一旦获取了发光图像的情况下，就可以分别测量或计算发光图像中采集的多个生物样品的发光量或发光强度。

应该知道，上述一系列方面和/或本发明各个实施例的操作，可以利用任意计算机用于操作控制来实现。因此根据本发明，提供一种计算机程序用于控制发光测量装置的操作，该测量装置从多个活体生物样品测量发光量或发光强度，其中表达发光蛋白质的基因已经被引入活体生物样品，特征在于该程序包括下面的过程：通过操作图像获取部分获取包括生物样品的至少一部分的发光图像，该图像获取部分获取包括生物样品的至少一个部分的发光图像；通过该图像获取部分确定在发光图像中的至少一个测量区域；以及基于由该图像获取部分得到的发光图像，计算在至少一个已确定的测量区域内发光量或发光强度，从而使得计算机执行包括在至少一个测量区域内(多个)生物样品发光量或发光强度的逐一测量。这种计算机程序可设计为重复地执行获取包括生物样品的至少一个部分的发光图像的过程，以获取多个发光图像，且在这种情况下，基于该多个发光图像，在计算该至少一个已确定的测量区域中发光量或发光强度的过程中，计算每个发光图像中的至少一个已确定的测量区域中的发光量或发光强度，借助上述的装置，可知发光量或发光强度随时间的变化。

此外，上述的计算机程序可进一步包括操作照明设备照射光线至多个生物样品的过程；操作图像获取部分获取照明图像，该照明图像包括由该照明设备的光线照射的该生物样品，其中，在确定在发光图像中的至少一个测量区域的过程中，该发光图像和照明图像可被重叠以生成重叠图像，可确定其上至少一个测量区域。在这种情况下，正如上述的发明的装置，典型地，发光图像可为通过观测在光学显微镜下的生物样品中的发光现象的光线的发出而由光学显微镜和显微镜图像采集设备得到的发光显微镜图像，且照明图像可为在光学显微镜下透射光观测的时候由光学显微镜和显微镜图像采集设备而得到透射光显微镜图像。然后，优选的是在显微镜图像采集装置的光接收面上形成生物样品图像的光学显微镜的透镜组和物镜被设计为，使得物镜数值孔径与投射到光接收面上的生物样品图像的放大率的比的平方值是0.01或以上。

而且，在上面的计算机程序中，为了研究任意刺激在生物样品上的影响，提供给生物样品刺激的过程可先于获取发光图像的过程而执行，这里在提供给生物样品刺激的过程中的提供给生物样品的刺激可为试剂或药物刺激、电刺激、气体刺激、加热刺激等等。此外，尤其是为了研究任意的化合物在生物样品上的影响，操作化合物添加设备的过程可先于获取发光图像的过程而执行，其能够添加某一预定化合物到生物样品中，给生物样品增加预定的化合物；以及根据已确定的测量区域的发光量或发光强度来判断的过程，判断预定的化合物是否引起发光蛋白质的表达或定位或者是否起到抑制作用的。在这种情况下，如在本发明装置中，预定化合物是否引起发光蛋白质的表达或定位或者是否起到抑制作用的判断过程通常包括根据发光量或发光强度计算预定参数的过程；以及根据计算出的预定参数判断确定的化合物是否引起发光蛋白质的表达或定位或者是否起到抑制作用的判断过程。

更进一步地，在该活体生物样品的发光图像中，可单独测量多个生物样品和可容易地测量单个生物样品的发光量或发光强度，如本发明装置的实例所示，这可通过用于发光测量的计算机程序来实现，该程序可计算多个活体生物样品的发光量或发光强度，其中的表达发光蛋白质的基因已经被引入活体生物样品，其特征在于该程序包括下面的过程：在早先获得的包括生物样品图像的发光图像中确定至少一个测量区域；以及基于活体生物样品的发光图像，在早先获得的发光图像中测量至少一个测量区域的发光量或发光强度。

因此，根据上述本发明的装置或计算机的操作，作为实现本发明目的的方法，进行从多个活体生物样品中测量发光量或发光强度的发光测量方法，其中表达发光蛋白质的基因已经被引入活体生物样品，其特征在于该方法包括下面的步骤：获得包括多个生物样品的至少一部分的发光图像；确定在该发光图像中的至少一个测量区域；以及基于该发光图像来测量在该已确定的测量区域的发光量或发光强度，从而由包含在该至少一个测量区域内的生物样品而单独测量发光量或发光强度。另外，本发明的方法可进一步包括下面的步骤：用照明设备照射光线于该生物样品上，以及获得包括该生物样品的照明图像，该生物样品上的光线是由该照明设备施加的，其中在确定该发光图像中至少一个测量区域的步骤中，可由重叠该发光图像和照明图像而生成重叠图像，且在该重叠图像中可确定该至少一个测量区域。此外，在上述方法中，可以通过重复执行获得包括生物样品的该至少一部分的发光图像的步骤而得到多个发光图像。在测量该已经确定的测量区域中的发光量或发光强度的步骤中，基于多个发光图像，测量各发光图像中至少一个已确定的测量区域的发光量或发光强度，由此可测量发光量或发光强度随时间的变化。

关于这一点，典型地，如上述的发明装置，发光图像可为发光显微镜图像，其是通过光学显微镜和显微镜图像采集设备观测光学显微镜下的生物样品中发光现象的光的发出而得到的，且照明图像可为透射光显微镜图像，其是通过在光学显微镜下执行透射光观测而用光学显微镜和显微镜图像采集设备得到的。优选的是，在显微镜图像采集装置的光接收面上形成生物样品图像的光学显微镜的透镜组和物镜，使得物镜数值孔径与投射到光接收面上的生物样品图像的放大率的比的平方值是0.01或以上。

而且，在上述的本发明方法中，为了研究任意的刺激在生物样品上的影响，给生物样品提供刺激的步骤可先于获取发光图像的步骤而执行，这里在给生物样品提供刺激的步骤中的提供给生物样品的刺激可为：试剂或药物刺激、电刺激、气体刺激、加热刺激等。此外，尤其在研究任意的化合物在生物样品上的影响的情况下，添加预定化合物到生物样品的步骤可先于获取发光图像的步骤而执行；并且则进行根据已确定的测量区域的发光量或发光强度的测量步骤中测量的发光量或发光强度，来判断预定的化合物是否引起发光蛋白质的表达或定位或者是否起到抑制作用的步骤。在该情况下，在一个实施例中，可依据加入化合物的定时来执行图像获取操作，且在判断预定的化合物是否引起发光蛋白质的表达或定位或者是否起到抑制作用的步骤中，通常包括基于发光量或发光强度计算预定参数的步骤；以及基于已计算出的预定参数来判断预定的化合物是否引起发光蛋白质的表达或定位或者是否起到抑制作用的判断步骤。

因此，根据上述的本发明的装置、计算机程序或方法，通常当对表达发光蛋白质的基因已引入其中的多个活体生物样品测量发光量或发光强度的时候，就可以有选择地测量任意观察的任意样本的发光量或发光强度。且通过测量每个生物样品的发光量或发光强度，无论发光蛋白质到细胞的基因传递效率以及在细胞中发光蛋白质基因表达的个体差异或变化，可以观察基因已经成功表达的细胞中的生物样品中的多个细胞或单个细胞，以及可以测定其中的发光量和发光强度。

本发明的特点在于能仅对其中基因成功表达的细胞或生物样品的发光量或发光强度进行测量，从而获得一影响的研究结果，其中确实提供某一化合物给生物样品产生影响，且除去涉及基因导入效率的任何假象等，因此，预计根据本发明的生物样品的发光量和/或发光强度的测量方式将作为一种有效的手段在报告化验中使用，其可用于在“背景技术”部分中描述的药物发展过程的化合物筛选过程中。更进一步的，在发明装置和/或计算机程序的某些实施例中，建立一种***，结合了从发光图像获得到发光量或发光强度的测量，或还结合任意预定化合物是否引起发光蛋白质的表达或定位或者是否起到抑制作用的判断，因此同现有技术相比，报告化验能够快速的并且容易地实现。

本发明的其它目的和优点将部分显而易见，且部分会在下面描述。

附图概述

图1A是用于描述根据本发明优选实施例中的发光测量装置基本结构示例的示意图。图1B是根据本发明实施例中的包括反转光学显微镜的发光测量装置结构的示意图，以及图1C是用于描述图1B的样品容器周边提供刺激至细胞的设备更多细节的示意图。图1D是用于说明发明的利用双图像采集设备的发光测量装置的另一个示例的示意图；

图2A是用于描述在发光测量装置的信息处理设备中控制结构形式的结构图，以及图2B是连接到信息处理设备150上的操纵板的示意图；

图3是用于描述在信息处理设备150中作为控制部分的CPU 150a和相关设备的功能框图；

图4A是用于描述说明重复照明图像的获得且实现发光图像情况的过程。期间T表示获得所有图像的持续时间，曝光时间t表示采集一组照明图像和发光图像所用的时间，以及图像捕获时间间隔ΔT表示在采集照明图像和发光图像过程的连续的起点之间的间隔时间。在每个曝光时间t，当水平线处于图上端时，在获得时期期间随着光源变亮照明图像被采集，且当水平线处于图下端时，光源变暗且完成发光图像的获得；

图4B用流程图的形式描述了在设置观测区域中的过程；

图4C是用示意图的方式描述了测量样品的发光图像和照明图像的重叠图像，并说明随时间的发展怎样确定测量区域；

图4D是用于描述在图4C的测量区域中发光强度预期变化的示例的曲线图。在该图中T1-T4示意性的表示图4C的对应影像点的测量区域中的各自的发光强度；

图5A示意性的描述了发光量的变化的示例，其在本发明的发光测量装置的发光量测量中，随着在测量样品中加入不同浓度的化合物而预期的进行。图5B说明了基于图5A的结果执行反应速度常数的计算过程。图5C是当不同种类的化合物A和B添加至测量样品时发光量的预期变化的说明图；

图6A是本发明发光测量装置的一个实施例中的TV监视器上的屏幕显示开始菜单的示例图；图6B是参数输入屏幕的示例图，该参数输入屏幕用于在该开始菜单屏幕中输入参数；图6C和6D是本发明发光测量装置的一个实施例中的TV监视器上的屏幕显示图像监视器菜单的示例图；图6E是数据分析菜单屏幕的示例图，该数据分析菜单屏幕用于执行结果分析和图像监视器菜单屏幕显示设置；图6F是用于描述已在图6D图示法中描绘的发光量连同表示半值的辅助线(虚线)的曲线图；

图7A是用于描述当任意的化合物添加至测量样品时的发光测量和分析中操作步骤的流程图；以及图7B是用于描述在一个图像获取过程中获得和储存发光图像和/或照明图像的步骤的流程图；

图8用于描述在发光测量装置1中报告化验的操作示例的流程图；

图9是作为样品被引入海拉细胞的质粒的预期分子状态的说明示例，其中质粒为荧光素酶基因通连具有四环素操纵基因的表达媒介(TetO2)。如图9A所示，当TetR同型二聚体与TetO2区域结合时，该荧光素酶基因连接到TetO2区域而不被表达。另一方面，当四环素被给予该细胞，如图9B所示，该TetR同型二聚体在结构上起变化并从该TetO2区域分离出去，从而导致荧光素酶的表达；

图10是在该示例中海拉细胞的照明图像(A)，发光图像(B，C)，以及重叠图像(D)；

图11A是被确定的测量区域中照明图像和发光图像的重叠图像；

图11B描述了图11A的ROIs中的荧光素酶发光强度随时间变化的测量结果。

发明最佳实施例

在下文中，将参照附图对本发明的实施例进行详细描述，其中相同元件用相同的参考标记表示。

本发明装置的结构

基本结构

图1A示意性地描述了根据本发明的该发光测量装置1优选实施例的大致结构，其用于测量诸如生物机体的活体组织、细胞以及生物个体的任意生物样品中的生物发光现象导致的发光量或强度。

参考该图，本发明的发光测量装置包括：容器11，诸如实验皿和微板玻璃，该容器作为基础部件，其中加入了包含测量样品10和发光培养基的培养液；台面30，由其上设置容器11的器皿构件形成，两个在二维方向上调节台面30的平台移动设备50，其附在台面预定位置，并彼此垂直(沿90°方向)；物镜70，用于对测量样品成像；照明设备90，用于在测量样品10上照射光线；化合物添加设备110，用于向该测量样品10中添加预定的化合物；图像采集设备130，用于采集由物镜70形成的测量样品10的图像；以及信息处理设备150，用于控制上述的相应设备的操作，并处理在各个设备中获得的或从各个设备传送的信息。

在此基本结构中，台面30可设置为垂直于物镜70光轴(以下称之为Z轴)，且在该信息处理设备150的控制下通过台面控制器(没有显示)驱动该移动设备50，可使台面在垂直于该光轴(Z轴)的方向(例如，X方向和Y方向)上移动。更进一步的，为了将光线照射到测量样品10，该照明设备90可包括可见光波长的非相干光源，诸如卤素灯，LED光源，钨丝灯，汞灯以及金属卤化物灯。在这点上，诸如激光的相干光源，在其光线通过扩散板等变成非相干光的情况下，可以作为该光源来使用。此外，尽管在通常情况下使用具有可见光波长的光，但是也可以使用红外光。可以理解，当不采集照明图像时，该装置上可不装备照明设备90。

该图像采集设备130通常包括具有图像传感器的高灵敏度CCD(电荷耦合器件)摄像机，且如下文所详述，并在该信息处理设备150的控制下采集发光图像(根据测量样品10中的组织或细胞等的生物发光现象而发出的光线，通过该物镜观测得到的该测量样品10的图像)和照明图像(通过该物镜在照明设备90的照明光线下观测该测量样品10而得到的该测量样品10的图像)。该CCD摄像机可优选为装备冷却***的冷却CCD，该冷却***具有用于冷却和保持0℃左右温度以抑制暗电流的Peltier器件，但是CMOS图像传感器、SIT摄像机等也是可被应用的。三片式彩色摄像机也可用于该图像采集设备130以便采集彩色照明图像。

在这点上，在上述的发明中为了获得优良的发光图像，选择在该图像采集设备130上形成的该测量样品图像的物镜70，以便实现(数值孔径/放大倍率)²的值为0.01或0.01以上的情况。

更进一步的，为了研究该测量样品10中的生物样品上的任意化合物的影响，该化合物添加设备110可为定量精确分配设备，其在信息处理设备150的控制下在容器11中添加预定的化合物(例如，四环素等)。

且该信息处理设备150可为任意普通的个人计算机，其能控制上述的发光测量装置的一系列组合操作，详情如下所述。

该发光测量装置结构的示例

本发明上述的发光测量装置可由反向显微镜构成。在图1B和1C中，用示意图的方式描述了前述的示例性的结构。

在图1B中描述的该发光测量装置包括反向显微镜，该反向显微镜包括用于将光线从光源(照明设备)90引导至测量样品10的照明光学***；光学观测***，其用于生成该测量样品10的图像；目镜75，其用于为目测放大该测量样品的图像；CCD摄像机130(图像采集设备或显微镜图像采集设备)，其具有用于采集该测量样品10的显微镜图像的图像传感器130a；以及计算机150(信息处理设备)，其与CCD摄像机130相连并具有TV监视器150g。

上述的光学显微镜的结构可为普通的反向型显微镜，其中的该照明光学***构建有聚光透镜91和偏转镜92，该偏转镜92用于从该光源90开始按上述次序偏转照明光和聚光透镜93的光轴。另一方面，该观测光学***构建有物镜70、第一中继透镜72、偏转镜73和第二中继透镜74，其中该物镜70用于形成该测量样品10的图像，该偏转镜73用于偏转来自该物镜70的光线，该第二中继透镜74协同第一中继透镜72，在成像平面上形成来自物镜70的图像(测量样品10的图像)。第二中继透镜74和成像平面之间，可设置转换镜76，以在通过该目镜75的目测和通过该CCD摄像机130的观测之间，使其能够按该测量样品10的图像的观测方式实现一个或多个变化。关于这一点，对于该转换镜76，取代使用机械转换类型，可用半反光镜来将该光路分成两条。

在上述结构中的该测量样品的透射光观测中，该测量样品10的照明是通过正常光学显微镜的透射光观测情况中的Koehler照明来实现的。因此，来自该光源90的光线首先由该聚光透镜91转变为平行光束，且当该光源90的图像在该聚光透镜93的光孔位置形成时，该光线将测量样品10照亮。然后，照亮该测量样品10的该光线穿透该测量样品10进入物镜70，依靠第一中继透镜72和第二中继透镜74在该成像平面上形成该测量样品10的图像，最后观察者通过该目镜75观测到在该成像平面上的该测量样品10的结果图像。更进一步的，在该CCD摄像机130对该测量样品10的图像的采集过程中，穿过第二中继透镜74的光线被该转换镜76反射，从而在该CCD摄像机130的图像传感器130a上形成该测量样品10的图像。在此过程中，该物镜放大倍率可为例如20倍。

如图1C中的详情所示，该容器11，其中将该测量样品10同培养液一起放置，其优选的可为样品容器11，该样品容器11如实验皿，具有随着铰链19转动的盖18。样品容器11由具有显微镜透明盖板玻璃相同的光学特性的材料构成，且该材料具有0.17mm的厚度，以便在样品容器11底部的样品通过常规物镜就能观察到(关于这一点，样品容器11并不只限于诸如实验皿，并且可以使用玻璃载片，微型板等)。更进一步的，为了保持该样品容器11中的湿度，该样品容器11位于水槽13内，且通过喷嘴14对水槽13进行纯水供给，且更进一步同该槽13一同设置有盖的保温箱12以保持湿度。然后，如图1C中的详情所示，在该槽13的顶面，通过气体供应管16从气罐15中供应CO₂气体，该气罐15设置在该测量装置的外部。在气罐15中的气体是如5％的CO₂和95％的O₂的混合气体。供应给保温箱12的该CO₂气体的流速可为大约50mL/min。此外，优选为，加热板17可放置于该样品容器11的底部。该加热板17，通常通过温度控制器(没有显示)按0.5℃的不进间隔调整该样品容器中的温度。

此外，用作化合物添加设备的自动分配设备110在该信息处理设备150的控制下，向该容器11中添加预定的化合物，预定量的试剂溶液由泵110b从试剂容器110a中抽取，且从喷嘴110c注入该容器11。如图所示，当该样品容器11放进有盖的保温箱12中，优选为，利用马达(没有显示)，与该自动分配设备110的操作协调一致开启该保温箱12的盖20以及该样品容器11的盖18，且先于从该喷嘴110c处注入试剂溶液，并在注入该溶液之后，利用该马达关闭该盖20和该样品容器的盖18。在这点上，随后会对计算机的控制做出说明，该自动分配设备110可在显微镜图像的获得前后和/或在其间的任意的时间进行操作。

而且，如本发明的装置基本结构的说明所描述，优选为在该样品台面30上设置台面调节设备，其可沿水平方向(在X轴方向和Y轴方向)任意移动该样品台面30。该台面调节设备可由两个步进马达构成，该两个步进马达可由样品台面控制器(没有显示)根据该信息处理设备150的命令来驱动，以便该样品台面30的位置可以自动地移动和调整。

另外，优选为，该样品台面30下方，在物镜70四周的位置，物镜加热器81可接触该物镜70设置，以便该物镜70的温度可通过该物镜加热器81在温度调节器(没有显示)的控制下按0.5℃的步进间隔来调整，因此该物镜70的外部将维持在任意的温度。同时，在该物镜加热器81的四周设置了焦点位置变化设备80。该焦点位置变化设备80是用于在该Z轴上驱动该物镜的机构，且通过齿条-齿轮机构(没有显示)来上下移动该物镜70。随着计算机控制的步进马达(没有显示)执行转动该齿条-齿轮机构的旋钮的操作。或者，该Z轴物镜驱动机构可为摩擦辊机构。

在该CCD摄像机130的光接收面上的、采集该测量样品10的发光图像和照明图像的该图像传感器130a可以具有，例如，1360×1024的像素数目。在本发明装置中，从该测量样品10的透射光观测中得到的该透射光显微镜图像(照明图像)，和从该测量样品10的发光观测中得到的该发光显微镜图像(发光图像)，即通过观测该测量样品10的细胞中该发光现象的微弱光线，上述的两者可由该CCD摄像机130采集。因此，如所描述的那样，为了改善发光观测中的信噪(S/N)比，该CCD摄像机130可装备冷却***29，在该冷却***的底部具有用于冷却***和保持0℃左右温度以抑制摄像机的暗电流的Peltier器件。另外，优选为，在该CCD摄像机130的光接收面上方设置红外线截止滤镜77，该红外线截止滤镜77截断可能成为背景光的红外辐射。CCD摄像机130采集的图像通过信号电缆传送至该信息处理设备150，并显示在TV监视器上。更进一步的，该CCD摄像机130可为能够采集彩色照明图像的三片式彩色摄像机。对于显微镜图像的图像采集设备，也可应用例如CMOS图像传感器、SIT摄像机等。

此外，在图1A的基本结构和图1B-C的示例中，尽管为了获得该测量样品10的图像的装置采用反向光学显微镜，但是该光学显微镜也可为竖直型的显微镜，并且可装备多个图像采集设备130。例如，如图1D所示，该物镜70可自放置在该台面30的该容器11的上端朝向该测量样品10(在该情况下，该保温箱12的结构可适当的修改，以便该物镜70可以朝向该测量样品10)。

而且，在提供两个图像采集设备130的情况下(可以理解采用的是反向显微镜)，该测量样品10发出的光线穿过该物镜70和分色镜71，该分色镜71根据光的波长(即，光的颜色，诸如红、绿)分离该光线，且这些分离的光线由不同的图像采集设备130根据相应的波长所采集，因此，该测量样品10的图像将能够根据波长有选择地被采集。这些功能允许在一个测量样品中具有不同波长发光蛋白质的发光观测和/或在一个测量样品中不同于发光蛋白质的发光波长的荧光波长的荧光物质的观测。在这点上，为了选择被采集图像的波长，可使用有选择地通过任意波长的滤光器(为选择颜色，多个滤光器可被交替的交换)。

信息处理设备的结构

该信息处理设备150可由包括CPU的、能够执行任意类型的本领域技术人员所公知的多种图像处理的计算机构成。如所述的，该信息处理设备150控制本发明的发光测量装置中的相应部分的操作，以获得作为图像数据的显微镜图像，并还进行获取图像的该处理和分析，以及进行该发光测量装置中的相应设备的操作控制。

图2A以功能图的形式描述了该信息处理设备150的结构以及配置于该发光测量装置中的相应设备。参照该图，该信息处理设备150包括CPU 150a；存储器155，其储存用于控制CPU 150a操作的控制程序；信号处理电路151和数字变焦电路152，该数字变焦电路152用于将该CCD摄像机130采集的图像转换为图像数据；显示控制电路153和TV监视器150g，该TV监视器150g用于显示该CCD摄像机130采集的图像；录放控制电路156和记录介质驱动器157，该记录介质驱动器157用于记录和/或在TV监视器150g上显示由该CCD摄像机130采集的图像和/或通过处理该采集的图像而得到的图像；以及操纵板154，该操纵板154用于用户指令的输入。如图2B所示，在该操纵板154上设置多种按钮，诸如再现按钮154a，记录按钮154b，快门按钮154c，变焦放大按钮154d，变焦缩小按钮154e，十字光标按钮154f以及运转模式开关154g，因此通过连接到该CPU 150a的该操纵板154，用户指令可输入到该信息处理设备150。

在上述的结构中，该CCD摄像机130的图像传感器130a上的测量样品10的显微镜图像转化成模拟电信号，即通过该图像传感器转变成模拟图像信号。得到的图像信号在CPU 150a的控制下传送到信号处理电路151，在信号处理电路151中对于图像信号的放大处理、过滤处理和/或诸如轮廓增强的任何图像处理被执行。随后，已经处理的图像信号发送到该数字变焦电路152(数字信号处理部分)。该数字变焦电路152执行来自该信号处理电路151的模拟图像信号的A/D转化，以生成数字图像信号，且在诸如gamma校正的任何数字处理之后，根据其需要，该获得的图像信号被传送至该显示控制电路153和录放控制电路156，分别用于在TV监视器150g上显示图像，以及将图像数据录入设置在存储槽(没有显示)中的可拆卸记录介质157(例如，存储卡、硬盘、磁盘、磁光盘等等)。关于这一点，在本发明的装置中的该数字变焦电路152设计为能够仅截取任意区域，该单独任意区域位于由CCD摄像机130采集的整个像素区域中，并且当增大该数字变焦电路152的放大倍率时，传送该截取的图像区域至该显示控制电路153或该录放控制电路156。因此，当该部分被放大和/或仅记录该部分时，可以在TV监视器150g上显示的CCD摄像机130采集的显微镜图像的仅一部分。

而且，在上述的结构中，该录放控制电路156可设计为通过响应从CPU150a发出的再现控制信号，从而以读出记录在该记录介质157中的数字图像信号，且读出的数字图像信号可通过显示控制电路153输入到TV监视器150g，以便在监视器150g的屏幕上显示测量样品10的记录图像。

在上述的信息处理装置的操作中，当用户开启位于该操纵板上的该记录按钮154时，本发明的设备执行记录模式，其中CPU 150a提供记录控制信号给该录放控制电路153。然后，响应于该记录控制信号，该录放控制电路153在记录介质中记录由数字变焦电路152提供的图像信号。更进一步的，当再现按钮154b开启时，该发明的装置进入再现模式，其中CPU 150a提供再现控制信号至该录放控制电路156，并在TV监视器150g上显示上述记录的图像。此外，当记录按钮154a和快门按钮44同时被按下，来自CPU 150a的控制信号被输出到该数字变焦电路34，且该CCD摄像机130在此时拍摄的图像帧被进行该数字处理信号处理，并合并到存储器155中。然后，合并到存储器155中的该图像数据通过任意压缩电路压缩，并通过卡读/写设备的方式将其记录到存储卡中。

在数字变焦电路152中执行的在由CCD摄像机130合并的整个像素区域中截取单独的任意区域的设置，通过利用变焦放大按钮154d，变焦缩小按钮154e以及十字光标按钮154f来完成。在截取图像区域的设置中，显示“变焦中心位置”表示显示通过数字变焦电路152截取的图像区域的中心，且同时显示在该TV监视器150g上被截取该区域的框。在观察该TV监视器150g时，用户通过操作十字光标按钮154f来设置该变焦中心位置位于任意方位，以及通过变焦放大按钮154d和变焦缩小按钮154e来确定图像截取区域的尺寸。通过该截取步骤产生的该图像的放大率可在M＝1.00(由该CCD摄像机采集的整个区域)到4.00(由该CCD摄像机采集的整个区域的1/4)之间的范围内随意设置。

关于这一点，如上所述图像的放大可通过在调节该显微镜(光学变焦)上的光学***来实现，从而代替该数字变焦电路152的使用。例如，诸如通过步进马达的马达驱动沿着光轴改变该CCD摄像机130和第二中继透镜74之间的焦距，从而实现光学变焦。并且，在用实现光学变焦的镜头(变焦镜头)结构中，利用三个可变放大率的镜头组，该镜头的焦距在10步内可手动地或自动地改变，补偿镜头组实现像差补偿等，且对焦镜头实现调焦(没有显示)。根据从CPU 150a输出的该控制信号通过设置在该变焦镜头***的变焦马达(超声马达等)的操作，驱动变焦镜头可使该变焦镜头沿光轴移动。

进一步的，作为重要结构的信息处理设备150，为了控制该些设备的操作，其可与自动分配装置110以及照明设备90相连，以便该CCD摄像机130图像信号的采集与该自动分配设备110的分配操作可以同时执行。

CPU中的处理

对本发明的装置中的相应设备与电路的操作控制，是由作为发光测量装置的控制部分的上述该信息处理设备150的CPU 150a按照读入CPU 150a中的控制程序来完成。图3用功能框图的方式显示CPU 150a执行的处理的示例，其作为该发光测量装置的控制部分在该信息处理设备150中运行。在这点上，CPU 150a在下文被称为控制部分。

由该图得知，在信息处理设备150中，该控制部分150a与该存储部分150b连接，该时钟发生部分150c记录***时间，通信接口部分150d和输入/输出接口部分150e穿过总线。

在上述的结构中，通信接口部分150d位于控制部分150a和多个设备之间，诸如该台面调整装置50，照明设备90，化合物添加设备110，图像采集装置130，设置在如上说明的该发光测量装置中，且在该发光测量装置中从该控制部分150a到相应设备传送指令，从各个设备获取数据并将其传送到控制部分150a。该数据通信电路可为有线或无线***。进一步的，输入/输出接口部分150e是该控制部分150a与输入设备150f(其可为用于发光测量设备中用户指令输出的任意设备，如键盘以及鼠标，或配合麦克风和鼠标实现定点设备功能的监视器)，和输出设备150g(该装置可使任意的用户能够识别信息，如通过发光测量设备得到的测得图像和/或测量结果以及装置的状态，例如，TV监视器(可包括家庭电视)，扬声器以及打印机)之间通信的媒介接口。

存储部分150b可为储存介质，如RAM和ROM之类的存储设备，如硬盘、软盘以及光盘的固定硬盘设备等，其中图像数据库150b1、发光测量结果存档150b2、以及诱导/抑制判断结果存档150b3被存储。在图像数据库150b1中，存储了用于特定识别一对发光图像和照明图像的“图像识别信息”；一对发光图像和照明图像；在一对发光图像和照明图像中的每个发光图像和照明图像被采集的采集时间内，该些数据彼此之间相互关联(相当于在图2A中的记录介质157)。在发光测量结果存档150b2中，有存储图像设定识别信息，采集时间，以及当该些数据彼此相互关联时通过下文描述的发光测量部分150a11来测量的测量区域中的发光量或发光强度。同样，在诱导/抑制判断结果存档150b3中，存储下文描述的诱导/抑制判断结果部分150a12中的判断结果。

该控制部分150a具有用于存储控制程序的内部存储器(图2A中的存储器155)，该控制程序如OS(操作***)，根据该些程序确定多种过程、任何必要的数据以及执行多个过程。

该过程部分可被设置于该控制部分150a的操作中，例如，如下所示：

化合物添加指令部分150a1-通过该通信接口部分150d命令该化合物添加设备110进行化合物的添加。

照明开/关指令部分150a2-通过该通信接口部分150d对该照明设备90执行开启(曝光ON)以及停止(曝光OFF)的命令。

图像采集指令装置150a3-通过该通信接口部分150d命令该图像采集装置130执行图像的采集。

图像获取部分150a4-通过该通信接口部分150d得到从图像采集装置130传输的图像(发光图像或照明图像)。

图像重复采集指令部分150a5-通过重叠该图像获取部分150a4获得的发光图像和照明图像生成重叠图像，且引用该重叠图像的用户判断该图像的重复采集是否有必要。在这点上，该图像重复采集指令部分150a5可设置为根据图像获取部分150a4得到的发光图像的采集区域中是否覆盖所需的发光测量样品10，从而判断该图像的重复采集是否有必要。

观测区域定义部分150a6-通过重叠该图像获取部分150a4获得的发光图像和照明图像生成重叠图像，且要求用户在重叠图像中定义所需观察区域。在这点上，当位于图像重复采集指令装置150a5中的图像重复采集的命令执行时，在图像重复采集之后的通过该图像获取部分150a4获得的发光图像和照明图像的重叠图像中，该观测区域定义部分150a6可使用户确定想要的观测区域。

位移量计算部分150a7-当观测区域由观测区域定义部分150a6确定得到时，其计算平台30的位移量，以便该图像采集装置130视场的中心与定义的观测区域的中心重合。

位移指令部分150a8-通过该通信接口部分150d基于由位移量计算部分150a7计算的位移量命令该平台移动设备50移动平台30。

图像存储部分150a9-在图像数据库150b1的预定的存储区域中，储存由图像获取部分150a4采集到的发光图像和照明图像(包括当图像重复采集指令部分150a5中没有图像重复采集指令时所涉及的该发光图像和照明图像)以及发光图像和照明图像的采集时间。

测量区域确定部分150a10-要求观测者(用户)确定在存储在图像数据库150b1的发光图像或者由重叠发光图像和照明图像生成的存储在该图像数据库150b1中的重叠图像中所需测量区域。

发光测量部分150a11-从由测量区域确定部分150a10已确定的测量区域测量发光量或发光强度，其分别储存在该图像数据库150b1中。

诱导/抑制判断部分150a12-用于该相关测量区域的判断，由该发光测量部分150a11分别测量的位于测量区域内的发光量或发光强度来判断预定化合物是否诱导或抑制了发光蛋白质的表达或定位。

在这点上，该诱导/抑制判断部分150a12可由以下处理部分构成：

参数计算部分150a121-通过该发光测量部分150a11测量位于每个测量区域内的发光量或发光强度，从而为相应的测量区域计算预定的参数(例如，IC50、半值、速率常数等)。

参数阈值判断部分150a122-根据该参数计算部分150a121所计算的该相应的测量区域的参数，判断对于该相关测量区域预定化合物是否诱导或抑制了发光蛋白质的表达或定位。该判断可这样的实现，如当不同种类和/或浓度的化合物提供的刺激被应用时，可确定随不同种类和/或浓度的化合物而定的发光量的变化或差别，或根据该已确定的测量区域中的发光量数据来确定合适种类和/或浓度的化合物。

装置的操作

上述的本发明的装置的各种操作的执行方式将在下文中描述。

(1)测量样品图像的获取

如从上述说明得知，在该照射设备90的关闭(曝光OFF)的情况下，随着测量样品由于发光现象而导致的光线的出射，通过物镜采集该图像采集设备130的光接收面上形成的图像而得到测量样品的发光图像。在该发光图像的获取中，当在照明开/关指令部分150a2的控制下该照明设备90关闭的情况时，该图像采集设备130在图像采集指令装置150a3的控制下采集测量样品10的图像，且该获得的发光图像在图像获取部分150a4的控制下被传送至该信息处理设备150，并与该时钟发生部分150c提供的时间相关联。另一方面，测量样品的发光图像，如所述的，其通过该图像采集设备130的采集而得到，当在照明开/关指令部分150a2(曝光ON)的控制下该照明设备90开启的情况时，在该测量样品10上照射光线，并响应该图像采集指令部分150a3的控制从物镜70得到测量样品10的图像。然后，该获得的发光图像在图像获取部分150a4的控制下被传送至该信息处理设备150，并与该时钟发生部分150c提供的图像获取时间相关联。

在这点上，如已被描述的那样，在发光蛋白质发光现象测量的情况中，该发光强度太微弱从而导致图像采集设备例如CCD摄像机不能充分的测定光信号，这样细胞的内部结构通常不能被观测。因此，当在该样品中观测细胞或观察对象时，难如一般显微镜方法一样调节物镜的焦点。所以，在该发光观测中，可根据在清楚的光线观测中获得的该测量样品的显微照明图像，来确定物镜焦点位置，即由诸如卤素灯的光源发出的光经由照明光学***来照明该测量样品。例如，通过在该物镜的光轴上设置该物镜的焦点位置到大致中心位置，在先于发光观测的透射光观测中确定高对比图像的两个位置之间，当生物发光蛋白质的发光强度增大时，得到聚焦在该CCD摄像机上的清楚的发光图像。

根据本发明的装置随后的说明，在某些发光测量和分析中，照明图像和发光图像被成对的获取。进一步的，为了跟踪测量样品中的发光量或发光强度随时间的变化，例如，如图4A所示，随着图像获取周期T、曝光时间t以及图像-捕获时间间隔ΔT设置的程序，照明图像和发光图像可多次的交替采集。

然后，与由该图像存储部分150a9的进程，与得到的采集时间一起，该得到的发光图像和照明图像可被储存在该图像数据库150b1中的预定存储区。

(2)化合物的添加

当测量样品加入任意的预定化合物时，由在该控制部分150a中的该化合物添加指令部分150a1的进程，通过该通信接口部分150d对该化合物添加设备110给出该化合物添加的执行指令，作为对此的响应，由该化合物添加设备110使预定数量的化合物加入容器11。

(3)观测区域的定义

在本发明的装置中，先于用于发光测量的图像获取，可设置位于该平台的该容器11中的该测量样品内的观测区域，即用于随后发光测量的该测量样品中用户想要观测的地方。当观测区域被确定时，在用于发光测量的图像获取中，移动该平台以使该确定的观测区域位于该图像采集设备130大致的视场中心。如本领域技术人员得知那样，通常，在光学显微镜的视场中，位于光轴上和周围的图像为明亮的和较少失真的，因此，通过产生到该视场中心的被观测的区域，可获取优良的显微镜图像。进一步的，可以理解，通过观测区域的这种确定，可以在发光测量中获取有意义的图像，即，用于发光量或发光强度测量区域的图像中的发光是可见的。

例如，观测区域的设置可按照图4B中流程图的进程而实现。参照该图，在观测区域的设置中，首先，该测量样品10的照明图像和发光图像的获取步骤是通过上述方法实现的(SB-1)。在该照明图像的获取中，该照明设备90被开启，且在该照明图像的获取完成之后，关闭该照明设备90然后实现该发光图像的获取。在这点上，发光图像的获取只有当该测量样品中存在发光时才被执行，例如通过上述化合物的添加(因此，如果通过化合物的添加发光被抑制，发光图像的获取将在没有添加化合物的情况下执行)。

当该发光图像和照明图像的获取完成时，经由该观测区域定义部分150a6的处理操作而生成该照明图像和该发光图像的重叠图像，其要求用户在该图像中确定至少一个或多个观测区域(SB-2)。在这个处理操作过程中，重叠图像，由显示在该输出装置150g上的该观测区域定义部分150a6的处理操作而生成，且该信息处理设备150将处于待命状态直到由该输入设备150f定义观测区域为止。当用户通过该输入设备150f在该输出装置150g的图像显示中输入至少一个或多个要求的观测区域，该定义区域作为观测区域被设置。在这点上，可定义如矩形、圆形、椭圆形、多边形等的观测区域。

当至少一个观测区域被定义时，通过该位移量计算部分150a7的处理操作，在该重叠图像上获取用于每个观测区域的该定义观测区域的位置坐标数据，并计算该观测区域中心的位置坐标值到该重叠图像区域中心的位置坐标值的方向矢量(SB-3)。在随后的处理操作中，先于用于发光测量的发光图像和照明图像的图像获取，此方向矢量被用于移动该平台，以便该图像采集设备130视场的中心与每个定义的观测区域的中心一致。

然后，用于上述的观测区域设置所获取的图像，通过该图像存储部分150a9的处理存储在图像数据库150b1的预定存储区(SB-4)，且完成了该(多个)观测区域设置的过程。

当如上确定观测区域时，用于发光测量的该测量样品的图像获取过程中，在采集图像之前，在偏移命令部分150a8的控制之下，该平台移动设备50根据在步骤SB-3中计算的位移或方向矢量来操作该平台30的移动，以使该定义观测区域定位在该图像采集设备130视场的大致中心位置。当多个观测区域被定义时，在用于该相应观测区域的发光测量的测量样品图像采集之前，移动该平台以使每个观测区域位于该图像采集设备视场的中心位置。(4)测量区域的确定

本发明的装置设计为使在该获取的发光图像中仅计算特定区域(“测量区域”：ROI)的发光量或发光强度，从而可以允许用户测定在发光图像中观测到的生物样品(如细胞或细胞的局部等)的发光量或发光强度，以及追踪该发光量或发光强度随时间的变化。

在测量区域的确定过程中，首先，通过在该控制部分150a中的该测量区域确定部分150a10的处理操作，重叠存储在该图像数据库150b1中的多组发光图像和照明图像中的至少一组(例如，最早时间获得的该组发光图像和照明图像)从而生成重叠图像，且在该输出装置150g上显示该得到的重叠图像。在该重叠图像生成过程中，调节照明图像或发光图像的亮度可以优化重叠图像。

参照该显示的重叠图像，用户通过该输入设备150f在其上确定要测量的区域。可确定如矩形、圆形、椭圆形、多边形等的测量区域。此外，在测量区域的确定中，测量样品10的形态信息(如突出物、纤毛等)可被使用。同时在测量区域的确定中，重叠图像可同时间进程一起显示，或如图4C所示在该输出装置150g上直观的显示。在图4C的该示例中，例如，存储照明图像和发光图像的该重叠图像随该获取时间(T1，T2，T3，T4)显示，且按照这样的直观显示，可检测在该第一区域中细胞的发光量随时间增加，从而使发光量或发光强度的测量的区域的确定变得容易。在这点上，可确定多个测量区域。

当图像中的(多个)测量区域被确定时，用于每个测量区域的区域范围的位置坐标可被确定。

(5)发光量或发光强度的测量

当如上所述测量区域被确定时，通过该发光测量部分150a11的处理操作，利用该测量区域的位置坐标，由在发光图像上相关区域的像素的亮度计算出发光量或发光强度，并保存在发光测量结果存档150b2的预定存储区。当确定多个测量区域时，计算每个测量区域中的发光量或发光强度。进一步的，当存在多个发光图像时，可计算该各图像中的对应于该测量区域的区域发光量或发光强度，且该结果值以图表形式在屏幕上显示(见如下所述的操作屏幕的说明)。例如，在图4C的示例中，当细胞1为测量对象时(该细胞1已被指定)，发光强度可由在一系列图像中的围绕在图中虚线内区域的像素亮度计算得出，且如图4D所示该发光强度随时间的变化在图表中显示。从上述的图表可知，可以获得发光蛋白质基因的转录随时间的变化。

(6)测量结果的分析

在本发明的装置中，通过诱导/抑制判断部分150a12的处理过程，利用如上所述随时间的变化，不同的分析可被实施，如由某一化合物的刺激或其他的刺激物来判断发光蛋白质基因的表达和定位的诱导或表达的抑制。

在发光量或发光强度测定结果的分析中，诸如IC50、半值、发光强度随时间变化的速率常数、发光时间的差异等的预定参数，可以根据发光量或发光强度通过该诱导/抑制判断部分150a12中的该参数计算部分150a121的处理过程计算得到，且比较该计算参数与预定阈值，发光蛋白质基因的表达和/或定位的诱导或表达的抑制通过该参数-阈限判断部分150a122的处理过程来判断。

例如，为了某一化合物诱导或抑制发光蛋白质表达的速率的研究，在添加该化合物到测量样品之后的时间计算发光量或发光强度最大值的半值，该时间为发光量或发光强度处于由上述的发光量或发光强度的当前测量结果的半值的时候，且通过该参数阈值判断部分150a122中预定阈值与计算结果值的对比，判断发光蛋白质表达的诱导或抑制的存在与否。

而且，为了对于某一化合物，从反应速度常数来判断发光蛋白质表达的诱导或抑制，例如如图5A所示，当该添加的化合物浓度变化时，在参数计算部分150a121中通过用本发明的装置测量该发光量的结果计算在多种浓度下的该反应速率(V)。然后，按照米-曼氏方程(Michaelis-Mentenequation)(Lineweaver-Burk图；1/V＝Km/Vmax×1/S+1/Vmax)的倒数作图，如图5B所示以“1/V”为Y轴，“1/S”为X轴作图，以使该速率常数Km能由该直线递归式得到的该溶液浓度在1/V＝0的情况下被计算。且通过该参数阈值判断部分150a122的处理过程，根据预定阈值与计算的速率常数的对比执行诱导或抑制的判断。

或者，如图5C所示，不同浓度的两种不同化合物引起的该发光量随时间的变化可通过本发明的装置分别测量，且诱导或抑制的判断可根据该些测量结果而实现。

如上所述的该不同判断结果可以存储在该诱导/抑制判断结果存档150b3的预定存储区中。

操作屏

在该TV监视器或输出装置150g上，操作屏如图6A-E所示，通过选择下面说明的操作屏上的区域或按钮，分别允许用户提供指令至该发光测量装置。进一步的在操作屏上，发光图像、照明图像和它们的重叠图像在其上显示，关于该测量样品10的发光量或强度的测量结果和该结果的分析在其上直观显示，因此用户被允许确认不同的测量结果。在下文中，会详细的说明某些作为示例的该TV监视器或输出装置150g上显示的操作屏。在这点上，用于可容易的操作如下说明的相应操作屏，其提供GUI(图形用户界面)，以使适当达到本发明的构思。

开始菜单屏幕-图6A和6B

在开始菜单屏幕上，显示以下区域，以使用户能够输入发光测量的条件参数。

MA1区域-用于该容器11的菜单项：

MA11区域-使用实验皿的指令的按钮；

MA12区域-使用微板玻璃的指令的按钮，其设定微板玻璃的井道的个数(如8个、12个、24个、96个等)；

MA13区域-确认MA11和MA12区域被按下与否的状态以及确认已经设定的参数的按钮。

MA2区域-用于该分配设备110的菜单项：

MA21区域-分配量(试剂的量(μ1，m1))设定的指令的按钮；

MA22区域-分配时间设定的指令的按钮；

MA23区域-试剂浓度设定的指令的按钮；

MA24区域-确认MA21和MA23区域被按下与否的状态以及确认已经设定的参数的按钮。

在这点上，如果预计试剂的反应比较慢，该分配时间可在如测量开始后马上、测量样品培养开始的时候、或在显微镜观察之前的时候被设定。同样，当培养液已经被确定时，如果分配的量在MA21区域中输入，由于试剂的浓度将被自动地确定，则MA23区域的设定是可选的。

MA3区域-用于该保温箱12的菜单项：

MA31区域-开始加热器操作的指令的按钮；

MA32区域-结束加热器操作的指令的按钮；

MA33区域-注入CO₂混合气体的指令的按钮；

MA34区域-确认MA31至MA33区域被按下与否的状态的按钮。

在这点上，加热器可设置在该物镜上、该容器上和该水槽上，该容器被放置，透明的盖子盖在该容器上。

MA4区域-用于该观测图像的菜单项：

MA41区域-设定该物镜放大率的指令的按钮；

MA42区域-确认MA41区域被按下与否的状态以及确认已经设定的参数的按钮。

在这点上，该物镜的放大率是可选的，如10倍、20倍、40倍、100倍等。MA5区域-用于通过颜色发光的菜单项：

MA51区域-设定颜色滤光片的指令的按钮；

MA52区域-使用分色镜的指令的按钮；

MA53区域-确认MA51和MA52区域被按下与否的状态以及确认已经设定的参数的按钮。

颜色滤光片可从如红色滤光片、绿色滤光片等中选择。在发光量或发光强度的测量中使用两种基因，MA51区域或MA52区域的按钮将被按下。MA6区域-用于CCD摄像机130的菜单项：

MA61区域-设定CCD摄像机灵敏度的指令的按钮；

MA62区域-设定CCD摄像机增益的指令的按钮；

MA63区域-设定CCD摄像机曝光时间的指令的按钮；

MA64区域-确认MA61至MA63区域被按下与否的状态以及确认已经设定的参数的按钮。

MA7区域-用于图像获取情况的菜单项：

MA71区域-设定图像获取周期T的指令的按钮；

MA72区域-设定在一对发光图像和照明图像采集中总的曝光时间t的指令的按钮；

MA73区域-设定从一对发光图像和照明图像采集的开始到一对发光图像和照明图像采集的下一个开始的时间间隔ΔT的指令的按钮；

MA74区域-确认MA71至MA73区域被按下与否的状态以及确认已经设定的参数的按钮。

图4A中阐述了该图像获取周期T、该曝光时间t以及该时间间隔ΔT。

MA81区域-测量开始指令的按钮。

在上述的开始菜单屏幕的按钮中，当控制参数输入的按钮被按下时，如图6B所示的参数输入屏幕显示在该输出装置150g上。在这个参数输入屏幕上，当用户使用该输入设备150f输入文本至MB1区域且MB21区域被开启时，输入MB1区域的文本被确认。因此，按照如上所述的该开始菜单屏幕，用于任意的选择或决定刺激方法和图像获取情况的指令按扭全面的显示在该GUI表现形式中，以在该屏幕上可以容易地命令用于测量项目的最优的刺激方法和图像数据的获得。

图像监控菜单屏幕-图6C和6D

在图像监控菜单屏幕中，诸如直观图和曲线图(图6D)的图像(图6C)和分析结果，显示在该图的MC4区域。在发光测量期间，在显微镜视场中观测到的测量样品图像显示在MC4区域上，以便能确认想要的图像是否可以得到，因此在两天、三天的长期持续的测量期间的该初始阶段，用户可以检查是否可以得到该想要的图像，且实验效率可被改良。此外，通过下述的按钮的选择该用户可提供不同的指令至该发光测量装置。

在图像监控菜单屏幕中，以下项目被显示并可被选择：

MC11区域-MC4区域上的图像显示指令的按钮；

MC12区域-发光图像显示指令的按钮；

MC13区域-照明图像显示指令的按钮；

MC14区域-发光图像和照明图像的重叠图像显示指令的按钮；

MC15区域-确认MC12区域至MC14区域被按下与否的按钮；

MC21区域-观测区域和测量区域位置的确定指令的按钮；

MC22区域-确认显示在MC区域上的区域位置的按钮；

MC31区域-发光量或发光强度随时间的变化的曲线图(分析)显示的指令的按钮；

MC32区域-发光量显示指令的按钮；

MC33区域-发光强度显示指令的按钮；

MC34区域-确认MC32区域和MC33区域被按下与否的按钮；

MC51区域-在MC4区域上即时显示的图像的形状数量的显示指令的按钮；

MC61区域-用于水平(在屏幕的上下左右方向)移动该平台的十字操作按钮(因此，该平台上的容器11中的观测位置是可移动的)。

MC71区域-在MC4区域上显示的图像前进或后退指令的按钮(通过形状的前进，进行图像的前进或后退)；

MC81区域-转入数据分析菜单屏幕指令的按钮(图6E)；

在上述的图像监控菜单屏幕，当MC12至MC14的任一按钮被开启时；MC15区域的按钮随后被开启，且最后开启MC11区域的按钮，则对应MC12区域至MC14区域中一个开启区域的图像如图6C所示随着图像形状的数量将在MC4区域上显示。例如，在图6C中，一个照明图像和两个发光图像显示在MC4区域上。关于这一点，当如图1D的***中通过两种颜色(绿色：510nm，红色：610nm)观测测量样品时，可显示两个发光图像。进一步的，当用单色完成观测时，将显示一个发光图像。另外，当MC21区域的按钮被开启时，形状图形(如矩形、圆形、椭圆形、多边形等)显示在MC4区域的预定位置上，且确定将被计算发光量或发光强度的“测量区域”。此时，可确定多个测量区域。

在“测量区域”被确定以后，当MC32区域或MC33区域的按钮开启时；MC32区域或MC33区域的按钮开启与否可通过MC34区域的按钮的开启与否来确认；且31区域的按钮被开启，则在测量期间利用该图像数据库150b1中的图像存储区，对于每个确定的测量区域，确定为测量区域之处的发光量或发光强度显示在如图6D所示的形成在MC4区域上的曲线图中(该曲线图可为相关的发光量或发光强度随时间的变化)。因此，通过确定测量区域和命令数据显示，在图6C所示的屏幕上，获取图像持续进行时，其可被读出并在该图像数据库150b1中分析图像。此外，由于从获得的图像中指定和截取用户想要观测区域的测量样品，且发光量随时间的变化在曲线图中被描述，可在较早的阶段检查该测量是否成功地实现。因此，在如上所述的该图像监控菜单屏幕中，用于按照刺激方法任意选择显示格式的指令按钮可全面的显示在GUI形式中，以便用于每个测量项的最优结果轻易的显示在该屏幕上。

数据分析菜单屏幕-图6E

在数据分析菜单屏幕中，利用该获得的图像中的发光量或发光强度的多种分析方法和显示方法可被指定。在这个屏幕上的该表示的选择或确定被显示在该图像监控菜单屏幕上，和/或输出到如打印机的输出装置。在该数据分析菜单屏幕中，显示以下项目并可被选择。

MD11区域-在该图像监控菜单屏幕上的MD12区域至MD14区域中的任一区域选取图像显示指令的按钮；

MD12区域-照明图像显示指令按钮；

MD13区域-发光图像显示指令按钮；

MD14区域-照明图像和发光图像的重叠图像显示指令的按钮；

MD15区域-确认MD12区域至MD14区域被按下与否的状态的按钮(在开启MD12区域至MD14区域中的任一区域之后MD15区域的按钮被开启，且最后开启MD11的按钮，则在MD12区域至MD14区域中的任一区域的指定图像将被显示在该输出装置150g上)；

MD21区域-根据MD22区域至MD23区域中的指定方式命令直观图像设置的按钮，如图像的快进(帧/分)等；

MD22区域-所有图像显示存储在该图像数据库150b1中的指令的按钮；

MD23区域-周期性的图像显示存储在该图像数据库150b1中的指令的按钮(例如，显示每5帧或每10帧连续选取的图像)；

MD24区域-确认MD22至MD23区域被按下与否的状态以及确认已经设定的参数的按钮(在开启MD22至MD23区域按钮之后MD24区域的按钮被开启，且最后开启MD21的按钮，则在MD22区域或MD23区域中的指定图像将被直观的显示在该输出装置150g上)；

MD31区域-观测区域或测量区域确定指令的按钮；

MD32区域-确认该区域的位置正在该输出装置150g上显示指令的按钮；

MD41区域-线显示指令的按钮，该线显示在图6D的MC4区域上的曲线图中，且在MD42区域或MD43区域中任一区域选取该线；

MD42区域-用于半值的线显示指令的按钮；

MD43区域-用于IC50的线显示指令的按钮；

MD44区域-确认MD42和MD43区域被按下与否的状态(在开启MD42至MD43区域按钮之后MD44区域的按钮被开启，且最后开启MD41的按钮，则如图6F中表示半值的线(该发光量的线表示半值且该时间的线也表示半值)显示在图6D的MC4区域的曲线图中)。

MD51区域-确定的测量区域中的发光量随时间变化的曲线图输出(如显示、打印)指令的按钮，输出半值、速率常数等至该输出装置150g(当MD51区域开启，如确定区域的发光量随时间变化的曲线图、半值、速率常数被输出(显示、打印)至该输出装置150g，并被村春在该存储部分150b的预定存储区)。

因此，在该数据分析菜单屏幕中，用于数据分析的指令按扭可全面的显示在GUI形式中，所以每个测量项的最优数据分析可轻易的在该屏幕上指示操作。

可以知道，从上述的描述屏幕结构的不同的操作屏(图6A到6E)可在该发光测量装置的TV监视器150g上显示，且操作屏可由本领域普通技术人员任意设计，同时，可实现如上所述的发光量或发光强度的任意分析。

发明装置的发光测量和分析

根据上面说明的发明装置，如“发明内容”栏中记载的，如活体组织、细胞、生物个体等的任意生物样品中生物发光现象的发光量或强度的测量变得可能，其中发光蛋白质的表达基因已被引入预定地点，分别在相应的特定组织的区域、细胞或特定生物个体中被观测。而且，在发明装置实施例的描述中，配置用于添加任意的化合物至测量样品的设备，且在该信息处理设备的控制下，添加化合物的定时以及采集测量样品图像的定时是可以控制的，以使可以获得从该化合物添加以来由于化合物导致基因表达随时间的变化。此外，在发明装置的实施例中，从发光量或发光强度的测量中基于该测量结果来判断某一化合物是否会引起发光蛋白质的表达或定位或它们的抑制，该方式可被完整的实现。在下文中，将阐述生物样品发光测量的实施例以及通过发明装置的方法根据本发明对生物样品发光测量的分析。

测量样品

根据本发明的生物样品的发光测量中，测量样品10可为如活体组织、细胞、生物个体等任意的生物样品，其中发光蛋白质基因已被引入预定地点。发光蛋白质基因引入生物样品可由引入细胞、质粒媒介来实现，其包括至少一个融合基因，该融合基因根据任意基因转染技术的发光蛋白质基因融合而形成。在进行所谓的报告化验中，通常细胞中的报告媒介包括位于目标基因位置的荧光素酶基因，该荧光素酶基因已被引入用于测量样品10(举例来说，对于该种细胞，如海拉细胞已被表示，该海拉细胞中的质粒包括具有四环素操纵基因(TetO2)“pcDNA4/TO”(来自于体外培养)和持续表达四环素阻遏物(TetR)的媒介“pcDNA6/TR”(来自于体外培养)且与表达媒介相连的荧光素酶基因，参见示例)。进一步的，该测量样品10可为这样的一个，其中除该荧光素酶基因、管家基因以及SV40启动基因外，其它不受引入的试剂的影响。

当荧光素酶作为发光蛋白质被使用时，荧光素，荧光素酶的基材，被加入容器11的培养液中。在这点上，为了避免在测量期间该测量样品10的灭绝，优选的，该容器11置于温度、湿度、N₂气压等被调节的环境下，以产生在该测量中的有活性的生物样品。

发光测量和分析程序

图7A显示在流程图中示例的程序，根据本发明发光测量中的该示例的程序从当某一任意化合物被加入测量样品时到判断样品中化合物的添加导致该发光蛋白质表达的诱导或抑制存在与否。

参照该图，首先，根据本发明的发光测量开始时(开始)，包括培养液中测量样品的容器11置于该平台30上，其中该培养液包含发光基材，以及如上述的各种测量条件经由该输入设备150f在该TV监视器或输出装置150g的开始菜单屏幕上设置。然后，当用户在该操作屏上选择该起动按钮时，该发光测量装置开始操作。

在该流程图的描述中，首先，通过该化合物添加设备110实现该容器11中预定数量的预定化合物的添加(步骤SA-1)。关于这一点，可以理解该化合物的添加可在平台30上的该容器11设置以前完成，或者在该测量样品图像获取操作开始以后完成。

其次，在该流程图描述中，在该发光测量图像获取之前，该平台上的该容器11中的测量样品10的观测区域，即该测量样品的随后发光测量中用户希望观测的地方可被设置(SA-2)。在关于图4B的发明装置操作的说明中完成观测区域的设置。

然后，当观测区域的设置完成时，进行获取和存储用于检测或测量测量样品10的发光量或发光强度的发光图像和/或照明图像(步骤SA3：用于每个观测区域的图像获取和存储处理)。如所述的，当该测量样品10的发光量或发光强度随时间的变化被追踪时，如图4A中描述的，该图像获取过程以设定的时间间隔而重复，该时间间隔由任意的次数和任意条件设定在该开始菜单中。同样，当多个观测区域被定义时，在一个图像获取过程中对于所有定义观测区域中的每个区域，实现照明图像和发光图像的获取。

图7B显示在流程图的一个图像获取程序中典型的获取过程以及(多个)照明图像和(多个)发光图像的存储。

参照该图，用于每个观测区域的图像获取和存储处理中，首先，如上所述，在移位指令部分150a8的操控下基于步骤SB-3中计算的位移或方向矢量，该移动设备50操作移动该平台30，使得将在SA-2中设置的观测区域设定在该图像采集设备130的大致的视场中心的位置(步骤SC-1)，然后，进行照明图像和发光图像的采集，以及在记录介质中图像数据的存储(步骤SC-2、步骤SC-3)。在这点上，从上述的描述可以理解，在图像采集和存储期间，测量的样品图像可显示在TV监视器150g上。

在确定多个观测区域的情况下，在某一观测区域的图像获取完成之后，不同的观测区域移动至该视场的中心，且按照如上所述的同样的方法实现图像的获取(步骤SC-4)。进行这种操作直到用于整个观测区域的图像获取完成。

在图7B中显示的已经描述的该图像获取过程以一定时间间隔重复，该时间间隔由任意的次数和任意条件设定在该开始菜单中。然后，当完成设定次数的图像获取；当自该测量时间的开始而经过了确定条件；或当发光图像的发光强度超出预定值，该整个图像获取过程完成(图7A：SA-4)。

如所述的，在该图像获取过程完成之后，发光量或发光强度将被测量的测量区域的确定(SA-5)；发光量或发光强度的测量(SA-6)；以及通过上述的发明装置的功能，在该获取的发光图像中进行发光蛋白质表达的诱导和抑制的判断(SA-7)。

因此，从以上说明可以理解，根据这里描述的该发明的发光测量装置的实施例，一系列过程的全部执行包括：添加预定化合物至测量样品10；重复获取和存储包括该测量样品10的照明图像和发光图像，如对于预定时间和超过预定周期的预定时间间隔；在该存储的照明图像和发光图像中确定所需的测量区域；基于该存储的发光图像从该确定的测量区域测量发光量和/或发光强度；以及从该结果判断化合物的加入是否导致该测量10中的发光蛋白质的表达或定位的诱导或抑制作用。应该注意到，即使测量样品10包括多个细胞、组织或生物个体，检测相应单个测量样品的位置和形态时，用户可在发光图像中确定所需的测量区域，所以不但一个特定细胞或其它细胞的发光量根据时间的进程变化，而且如发光蛋白质定位判断的任何要求的位置信息的判断，将变得可以实现。在常规技术的情况下，可以确定细胞液中发光信号的测量地点或没有发光的地点，而发光蛋白质定位的存在和其随时间的变化是不可测定的。

利用本发明装置的报告化验

如所述的，按照本发明的发光测量装置1，在单个生物样品的相应情况下利用发光蛋白质可以进行报告化验，该生物样本如细胞，组织或生物个体可被检测，不管引入的效率和发光蛋白质基因的表达如何，即可判断在生物样品中由化合物引起的基因表达的诱导或抑制。

图8显示在流程图中通过发光测量装置1执行的报告化验的示意性操作过程(这里描述的操作过程不同于图7A所描述的)。

参照该图，首先，准备测量样品10(步骤1)。该测量样品可为已经描述过的任意生物样品，其包括如一种或多种活体组织、一种或多种细胞、一种或多种生物个体等，其中发光蛋白质基因已经被引入至预定位置。然后，该准备的测量样品10放入已经提供培养液的实验皿11，且化合物的预定数量已被测试并加入至该实验皿中(步骤2)，由此刺激物被加至该实验皿11中的测量样品10中。另外，优选的，该预定图像数据库150b1中存储该刺激物的添加定时。

其次，图像采集和样品的培养的各种状态等列在该TV监视器或输出装置150g上显示的该开始菜单屏幕上，其通过该输入设备150f由用户设定(步骤3)。且当该开始菜单屏幕的起动按钮被开启时，如下所述的发光测量的过程和分析在该发光测量装置1中启动。关于这一点，样品的刺激(步骤2)可在输入图像采集和样品培养的状态(步骤3)之后进行。在这种情况下，从该刺激该样品到采集图像或获得照明图像的用时可以缩短，以便可以实时探测。

当发光测量和分析的过程开始时，在步骤4中，该实验皿11放置在发光测量装置1的平台30上的预定位置。在这点上，本发明的装置可配置可升降机器人，尽管没有显示，其操作根据控制部分150a的处理，在实验皿11放置在本发明的装置的预定位置时，移动实验皿11到该平台上的适当位置，因此，在这种情况下，在该发光测量装置1的发光测量和分析的过程开始时，根据来自该控制部分150a的指令执行可升降机器人将移动和放置该实验皿11到该平台30的预定位置的操作(步骤4)。

当该实验皿11如上设置在该平台上时，则执行观测区域的确定和平台的移动，使得确定的观测区域设置于该视场的中心(步骤5-11)。

在此过程中，根据该照明开/关指令部分150a2的处理开启该光源90，从而该照明光线施加在该测量样品10上(步骤5)，根据该图像采集指令部分150a3，CCD摄像机130采集包括测量样品10的照明图像。该采集的照明图像传送至该信息处理设备150，并通过该图像获取部分150a4的处理在该TV监视器上显示。

则根据该观测定义部分150a6的处理，在步骤6当用户的照明图像获取中定义想要的观测(监控)区域时，计算该平台30的位移，以使由观测区域定义部分150a6定义的观测区域的中心与通过该位移计算部分150a7处理得到的CCD摄像机130的视场中心相一致，且该平台移动设备50基于该位移量按照该移位指令部分150a8的指令驱动平台30的移动(步骤7)。然后，通过该图像存储部分150a9的处理，步骤6中采集和获取的照明图像存储在该图像数据库150b1的预定存储区(步骤8)。

在已经描述的该观测区域移动到基于该照明图像的视场中心之后，通过该照明开/关指令部分150a2的处理，该光源90被关闭(步骤9)，该CCD摄像机130根据该图像采集指令部分150a3发出的指令，采集包括没有照明的测量样品10的发光图像。该被采集的发光图像通过该图像获取部分150a4的处理传送至该信息处理设备150(步骤10)，并显示在该TV监视器150g上。在此过程中，优选的，该预定图像数据库150b1中存储与刺激时间相关联的发光图像的图像采集开始时间，从而可以进行由该刺激引起的发光变化的精确计算。

然后，根据该图像重新采集指令部分150a5的处理，在步骤10中该信息处理设备150要用户确认是否有所需发光测量样品10包括在该发光图像的采集和获取的图像捕获区域内(对应于CCD摄像机130的视场)，如果判断为“未包括在内”(步骤11：否)，则将进行该观测区域的重新定义、该平台的重新移动以及该发光图像的重新获取。该处理过程可重复进行直到该用户判断有所需测量样品10“进入”发光图像。

当用户判断有所需测量样品10“进入”发光图像时，在该发光图像确定为用于发光测量的第一个发光图像的情况下确定该观测区域，并且通过该图像存储部分150a9的处理保存在该图像数据库150b1的预定存储区中(步骤12)。该图像的采集或获取以及用于发光测量的发光图像的存储被重复执行，直到达到步骤3设置的图像采集次数或成像条件为止(步骤13，步骤10-12)。此外，当步骤12中存储的发光图像的发光强度超过预定值时，发光图像的获取可以终止。

而且，作为已被描述的上述发光图像获取步骤中，由于在本发明的装置中也可以得到照明图像，所以照明图像与发光图像可以成对采集、获取以及存储。在这种情况下，在步骤13中判断发光图像的连续获得之后，可以确认照明图像是否被获取，且如果确认为“被获取”(步骤14：是)，则该光源90开启(步骤15)且进行图像采集、获得以及照明图像的存储(步骤15-17)，在此之后，关闭该光源90(步骤9)，执行发光图像的采集和获取(步骤10)。在这点上，照明图像获取与否的判断(步骤14)可由开始时候的输入来预先确定，或者，当该测量的测量样品10的图像监控中观测到该样品的移动时，就可判断要获取照明图像。

当该发光图像(和照明图像)的获取完成时，利用该获取的图像可进行各种的图像处理和分析(步骤18-22)。

在这些处理过程中，首先，通过测量区域确定部分150a10的处理，在步骤12中发光图像被存储并以伪彩色、直观等形式显示在该输出装置150g，或者，生成存储在步骤12中的发光图像和存储在步骤17中的照明图像的重叠图像，且该生成的重叠图像以伪彩色、直观等形式显示在该输出装置150g上(步骤18)。

通过该测量区域确定部分150a10的处理，用户在步骤18显示的图像中确定至少一个测量区域(如发光区域(如测量样品10或测量样品10中的特定部分))。在这点上，在步骤19中，基于发光阈值或该图像的S/N可以自动的确定测量区域。

当测量区域被确定时，通过该发光测量部分150a11的处理，在相应发光图像中可以测量或计算该确定测量区域的发光量或发光强度，且可在该TV监视器150g上由时间序列通过图形表示来显示(步骤20)。从而，该用户可检测发光量或发光强度随时间的变化。

在步骤20中基于多个发光量和/或多个发光强度的计算，通过该诱导/抑制判断部分150a12的处理，分析在步骤2中化合物的加入是否导致该测量样品10中引入的发光蛋白质的表达或定位的诱导或抑制(步骤21)，以及步骤21中的分析结果显示在该TV监视器150g上。

从上述的如在细胞的报告化验执行中的该处理过程的示例可以看出，根据发光测量装置1，可以几乎自动进行化合物添加、发光量变化的测量、由化合物引起的基因转录的诱导或抑制的判断的一系列操作或处理。并且，通过定义观测区域和设置测量区域，可以避免进行基因转移和/或表达不成功的样品的发光测量，或避免上述样品的数据反应在结果中，因此可以更全面适当的研究化合物对生物样品的影响。

进一步的，当该终点测量和该动力学测量之间的变化容易时，该发光测量装置1通过该单个信息处理设备150能够进行动力学测量和终点测量。另外，利用该分配设备110在试剂添加之后立即进行动力学测量是可以实现的。信息处理设备150执行的上述一系列处理可以实现为程序。

此外，根据该发光测量装置1，当适用于GFP或YFP的基因被引入测量样品10中，在采集的照明图像中可附带采集荧光图像。那样的话，在照明图像采集中可以完成滤光片的调整。

对于研究本发明的益处，实施下列的实验。在这点上，可以理解本发明的益处将在下列示例中被描述，且其不限制本发明的范围。

示例

在此示例中，利用该发明的发光测量装置的实施例，在多个海拉细胞的某一细胞中由试剂刺激引起的发光被短暂的观测，其中的荧光素酶基因被引入细胞。

对于该样品，海拉细胞中的媒介，“pcDNA6/TR(来自于体外培养)”经常表示四环素阻抑物(TetR)，以及包括连接表达媒介“pcDNA4/TO(来自于体外培养)”的荧光素酶基因的质粒被使用，其具有已经遗传传递的四环素操纵基因(TetO2)。在该细胞中的这两种基因已被引入，如在图9A中示意性的显示，TetRs首先由该用于TetR的媒介(pcDNA6/TR)表达，然后该TetRs形成同型二聚体，与TetO2基因区域结合，从而抑制荧光素酶基因到TetO2区域的转录。然而，在图9B的示意图中，当四环素加入该细胞时(药物刺激)，引起该TetR同型二聚体结构的变化，致使该TetR同型二聚体从该TetO2区域分离，以便诱导该荧光素酶基因的转录和荧光素酶蛋白质的表达。因此，在此实验性的示例中，在上述基因被引入的细胞中，可以观测到四环素的刺激导致的细胞内部的荧光素酶表达和发光现象。

在随后的过程中进行试验的操作。

(1)准备海拉细胞的样品，其中已经共同表达媒介“pcDNA6/TR”(来自于体外培养)始终表达TetR，和包括连接具有TetO2的表达媒介“pcDNA4/TO”(来自于体外培养)的荧光素酶基因的质粒。对于培养基来说，使用的D-MEM培养基包含10mM HEPES，具有1mM荧光素。

(2)设置有如步骤(1)中的海拉细胞的实验皿11放置在该平台30上，且启动该发光测量装置1，添加四环素至该海拉细胞，然后在预定周期期间以预定间隔的每个预定时间中，照明图像和发光图像被采集并被存储。在该发光图像采集中的该曝光时间被设定为1分钟。

图10A、B和C分别为添加四环素之前的海拉细胞的照明图像；从四环素添加9小时以后采集的该海拉细胞的发光图像；和另一小时以后采集的该海拉细胞的发光图像。图10D为重叠图10A的照明图像而获得的图像，且图10C的该发光图像被部分放大的显示。在这点上，在该重叠图像的形成中，调节照明图像和发光图像的亮度，以使该重叠图像最优化。从该图像可以理解，通过重叠照明图像和发光图像，在清楚的图像中，荧光素酶的位置存在可被观测的发光，以使可以方便地发现包含荧光素酶基因的细胞。(3)此外，通过该发光测量装置1，在照明图像和发光图像的重叠图像中确定用于测量发光强度的测量区域，以及在该测量区域中该发光强度随时间的变化被监控。

图11A为照明图像和发光图像的重叠图像，在这里确定测量区域ROI-1和ROI-2。进一步的，图11B表示由该相应测量区域ROI-1和ROI-2计算的发光强度随时间变化的曲线图。如图11B所示，在加入四环素2小时之后发现发光现象，并在6到7小时之间到达稳定水平。因此，根据本发明，通过该荧光素酶发光的位置的执行以及以时间序列对其进行追踪，可测量发光现象随时间的变化。

如上所述，本发明的发光测量装置和发光测量方法有助于活体测量样品中的发光量和发光强度的测量，且优选的使用于如生物技术、医药制造以及医学治疗的各种领域。

虽然在具体实施例中已对本发明进行了详细的描述，但是对于本领域技术人员来说，其它各种可行的实施例也可包含在本发明的范畴之内。

Claims (31)

1、一种发光测量装置，用于测量来自多个活体生物样品中的发光量或发光强度，其中表达发光蛋白质的基因被引入该活体生物样品，其特征在于该装置包括：图像获取部分，其获取包括该生物样品的至少一部分的发光图像；测量区域确定部分，其在通过该图像获取部分获取的发光图像中确定至少一个测量区域；发光测量部分，当通过该测量区域确定部分确定该至少一个测量区域时，该发光测量部分基于该图像获取部分获取的发光图像测量该至少一个测量区域中的发光量或发光强度；从而由该至少一个测量区域内包括的该生物样品分别测量发光量或发光强度。

2、如权利要求1所述的装置，其进一步包括：照明部分，其在该生物样品上照射光线，其中该图像获取部分获取包含该生物样品的照明图像，该照明部分发出的光线照射在该生物样品上；并且该测量区域确定部分通过重叠该图像获取部分获取的该发光图像和该照明图像生成重叠图像，并在该重叠图像中确定该至少一个测量区域。

3、如权利要求2所述的装置，其中该图像获取部分包括光学显微镜和显微镜图像采集设备；该发光图像为发光显微镜图像，其通过在该光学显微镜下观测该生物样品中的发光现象发出的光而获得，且该照明图像为透射光显微镜图像，其用该照明部分照射的光通过在该光学显微镜下观测透射光而获得，其中该显微镜图像采集设备具有光接收面，并且该光学显微镜包括物镜和透镜组，其在该显微镜图像采集设备的光接收面上形成该生物样品的图像，其中物镜的数值孔径与投射到光接收面上的样品图像的放大率的比的平方值为0.01或以上。

4、如权利要求1所述的装置，包括控制部分，其控制该图像获取部分重复进行图像获取；以及当该测量区域确定部分确定至少一个测量区域时，该发光测量部分基于该控制部分对图像获取部分的重复操作而获得的多个发光图像，测量每个发光图像中的该至少一个确定的测量区域的该发光量或发光强度。

5、如权利要求1所述的装置，其特征在于该装置包括刺激该生物样品的刺激施加设备。

6、如权利要求5所述的装置，其特征在于该刺激施加设备为从包括下面的设备的组中选出的至少一个：添加化合物至该生物样品的化合物添加设备；调节该生物样品温度的温度调节设备；以及供应气体至该生物样品的气体供应设备。

7、如权利要求1所述的装置，其特征在于该装置包括化合物添加设备，其添加预定化合物至该生物样品；以及发光蛋白质表达判断部分，其根据该发光测量部分测量的该发光量或发光强度，来判断该预定化合物是否引起该发光蛋白质的表达或定位或者该发光蛋白质的抑制作用。

8、如权利要求7所述的装置，其特征在于该发光蛋白质表达判断部分包括参数计算部分，其根据该发光测量部分测量的该发光量或发光强度来计算预定参数；以及参数-阈值判断部分，其根据该参数计算部分计算的预定参数，来判断该预定化合物是否引起该发光蛋白质的表达或定位或者该发光蛋白质的抑制作用。

9、如权利要求7所述的装置，其特征在于该装置进一步包括控制部分，其控制该化合物添加设备和该图像获取部分的至少一个，并指挥化合物添加和图像采集的定时。

10、一种用于发光测量的信息处理设备，该设备根据活体生物样品的发光图像计算来自多个活体生物样品的发光量或发光强度，其中表达发光蛋白质的基因已被引入该活体生物样品，其特征在于该设备包括测量区域确定部分，其在包括该生物样品图像的预先获取的发光图像中确定至少一个测量区域；以及发光测量部分，其根据该活体生物样品的发光图像，测量该预先获取的发光图像中的该至少一个测量区域的发光量或发光强度。

11、如权利要求1或10所述的装置，其特征在于该生物样品从包括生物组织、细胞以及生物个体的组中选取。

12、一种测量来自多个活体生物样品的发光量或发光强度的方法，其中表达发光蛋白质的基因已被引入活体生物样品，其特征在于该方法包括如下步骤：

获取包括该生物样品的至少一部分的发光图像；

在该发光图像中确定至少一个测量区域；以及

根据该发光图像测量该至少一个确定的测量区域中的该发光量或发光强度；

从而分别测量包括在该至少一个测量区域中的该生物样品的该发光量或发光强度。

13、如权利要求12所述的方法，进一步包括如下步骤：

用照明设备在该生物样品上照射光线；

获取包含该生物样品的照明图像，该照明设备发出的光线照射在该生物样品上；

其中在该发光图像的至少一个测量区域的确定步骤中，通过重叠该图像获取部分获取的该发光图像和该照明图像而生成重叠图像，且在该重叠图像中确定该至少一个测量区域。

14、如权利要求12所述的方法，其特征在于该发光图像为发光显微镜图像，其借助该光学显微镜和显微镜图像采集设备通过在该光学显微镜下观测该生物样品中的发光现象发出的光线而获得；且该照明图像为透射光显微镜图像，其借助该光学显微镜和显微镜图像采集设备通过在该光学显微镜下观测透射光而获得；其中该显微镜图像采集设备具有光接收面，并且该光学显微镜包括物镜和透镜组，其在该显微镜图像采集设备的光接收面上形成该生物样品的图像，其中物镜的数值孔径与投射到该光接收面上的样品图像的放大率的比的平方值是0.01或以上。

15、如权利要求12所述的方法，其特征在于该方法包括：重复进行获取包括至少一部分该生物样品的发光图像的步骤，以获取多个发光图像；以及基于该至少一个确定的测量区域中该发光量或发光强度的测量步骤中的该多个发光图像，测量每个发光图像中该至少一个确定的测量区域的该发光量或发光强度。

16、如权利要求12所述的方法，其特征在于该方法包括在获取该发光图像的步骤前刺激该生物样品的步骤。

17、如权利要求16所述的方法，其特征在于刺激该生物样品的步骤中施加到该生物样品上的刺激是从包括以下刺激的组中选择的至少一个刺激：试剂刺激、气体刺激、电刺激以及加热刺激。

18、如权利要求12所述的方法，其特征在于该方法进一步包括如下步骤：在获取该发光图像的步骤前添加预定化合物至该生物样品；以及根据该至少一个确定的测量区域中该发光量或发光强度的测量步骤中测量的该发光量或发光强度，来判断该预定化合物是否引起该发光蛋白质的表达或定位或者该发光蛋白质的抑制作用。

19、如权利要求18所述的方法，其特征在于判断该预定化合物是否引起该发光蛋白质的表达或定位或者该发光蛋白质的抑制作用的步骤包括如下步骤：根据该发光量或发光强度计算预定参数；以及根据该计算的预定参数，判断该预定化合物是否引起该发光蛋白质的表达或定位或者该发光蛋白质的抑制作用。

20、如权利要求18所述的方法，其特征在于根据添加该化合物的定时获取该发光图像。

21、如权利要求12所述的方法，其该生物样品从包括生物组织、细胞以及生物个体的组中选取。

22、一种计算机程序，用于控制操作测量来自多个活体生物样品的发光量或发光强度的发光测量装置，其中表达发光蛋白质的基因已被引入该活体生物样品，其特征在于该程序使得计算机执行下面的过程：

通过操作获取包括该生物样品的至少一部分的发光图像的图像获取部分，获取包括该生物样品的至少一部分的发光图像；

在该图像获取部分获得的发光图像中确定至少一个测量区域；以及

根据该图像获取部分获取的发光图像，在该至少一个确定的测量区域中测量该发光量或发光强度；

从而分别测量包括在该至少一个测量区域中的该生物样品的发光量或发光强度。

23、如权利要求22所述的程序，进一步包括以下过程：

通过操作照明部分在该生物样品上照射光线；

通过操作该图像获取部分获取包含该生物样品的照明图像，其中该照明部分发出的光线照射在该生物样品上；

其中在确定该发光图像的至少一个测量区域的过程中，包括重叠该图像获取部分获取的该发光图像和该照明图像而生成重叠图像，以及确定该重叠图像中至少一个测量区域。

24、如权利要求22所述的计算机程序，其特征在于该发光图像为发光显微镜图像，其借助该光学显微镜和显微镜图像采集设备通过在光学显微镜下观测该生物样品中发光现象发出的光线而获得；且该照明图像为透射光显微镜图像，其借助该光学显微镜和该显微镜图像采集设备通过在该光学显微镜下观测透射光而获得，其中该显微镜图像采集设备具有光接收面，并且该光学显微镜包括物镜和透镜组，其用于在该显微镜图像采集设备的该光接收面上形成该生物样品的图像，其中物镜的数值孔径与投射到该光接收面上的该生物样品图像的放大率的比的平方值是0.01或以上。

25、如权利要求22所述的计算机程序，其特征在于该程序包括重复进行获取包括至少一部分该生物样品的发光图像的过程，以获取多个发光图像；以及基于该至少一个确定的测量区域中该发光量或发光强度的计算过程中的该多个发光图像，计算每个发光图像中该至少一个确定的测量区域的该发光量或发光强度。

26、如权利要求22所述的计算机程序，其特征在于该程序包括在获取该照明图像的过程之前，执行刺激该生物样品的过程。

27、如权利要求26所述的计算机程序，其特征在于刺激该生物样品的过程中施加到该生物样品上的刺激是从包括以下刺激的组中选出的至少一个刺激：试剂刺激、气体刺激、电刺激以及加热刺激。

28、如权利要求22所述的计算机程序，其特征在于该程序进一步包括以下过程：在获取该发光图像过程之前，通过操作添加预定化合物至该生物样品的化合物添加设备，添加预定化合物至该生物样品中；以及根据该至少一个确定的测量区域中该发光量或发光强度的计算过程中算出的该发光量或发光强度，来判断该预定化合物是否引起该发光蛋白质的表达或定位或者该发光蛋白质的抑制作用。

29、如权利要求28所述的计算机程序，其特征在于判断该预定化合物是否引起该发光蛋白质的表达或定位或者该发光蛋白质的抑制作用的过程进一步包括如下过程：根据该发光量或发光强度计算预定参数；以及根据该算出的预定参数，判断该预定化合物是否引起该发光蛋白质的表达或定位或者该发光蛋白质的抑制作用。

30、一种计算机程序，用于根据活体生物样品的发光图像计算来自多个该活体生物样品的发光量或发光强度的发光测量，其中表达发光蛋白质的基因已被引入该活体生物样品，其特征在于该程序使得计算机执行下面的过程：在先前获取的包括该生物样品图像的发光图像中确定至少一个测量区域；以及根据该活体生物样品的发光图像，测量在该先前获取的发光图像中的至少一个测量区域的发光量或发光强度。

31、如权利要求22或30所述的程序，其特征在于其该生物样品从包括生物组织、细胞以及生物个体的组中选取。

Images