CN101339153B - 一种示踪食品致病性细菌生长的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种低选择性、非特异性、交互敏感性为特点的准确、灵敏、简便、经济和快速示踪食品致病性细菌生长及其代谢综合信息的快速检测方法，包括菌种接种，分别培养不同时间后，对培养液进行灭活；用多频大幅脉冲智能化学分析***对灭活后的培养液进行检测，采集响应信号并对该信号进行分析等步骤。用基于多频大幅脉冲伏安法为原理的智能多频脉冲扫描仪为仪器结合一个包括工作电极阵列的三电极体系，能够低选择性、非特异性、交互敏感性的采集食品致病性细菌生长过程的综合信息，再结合主成分分析方法处理采集的信息，能简便、准确、灵敏地示踪食品致病性细菌的生长与代谢。

Description

一种示踪食品致病性细菌生长的检测方法

技术领域

本发明涉及示踪细菌生长状况的快速检测技术领域，特别是多频大幅脉冲智能化学分析***在监测液体培养基中食源性致病菌生长情况的方法。

背景技术

近年来，食品致病性细菌引发的食物中毒等疾病受到社会高度关注。大肠杆菌O157:H7(E.coli O157:H7)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus Aureus)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)等被认为是几种危害最大的食源性致病菌，它们不但造成了巨大的经济损失，也严重威胁到人类健康与安全。因此，在食品生产、加工、储藏和销售等过程中，示踪食品致病性细菌生长状况及其规律和有毒代谢产物产生规律的综合信息，对指导食品的安全生产和卫生检测具有重要意义。

目前，所有示踪食品致病性细菌生长状况及其趋势的检测方法，包括传统的国标法和其他的快速检测方法和新技术，都只能对菌体数量或对某一种成份如ATP等含量的变化规律进行测定，不能反应菌体生长过程中对营养基质的消耗状况、代谢变化规律的综合信息。因此，建立一种准确、灵敏、简便且经济的示踪食品致病性细菌生长代谢状况综合信息的快速检测方法尤为重要。

菌种不同，自身所含酶***不同，代谢方式和代谢途径就不相同，对营养物质的分解利用和产生的产物亦不相同。即使是同一种菌体，乃至同株甚至克隆菌体的不同生长时期，在同一个限定的环境中，对基质的利用程度和代谢产物也是不尽相同的，利用多频大幅脉冲传感***可以分析和示踪这些变化的综合信息，并具有不受样品颜色、浊度的影响，样品可以不经处理，检测前后无损耗，所用仪器设备相对简单等优点。

目前，有用免疫传感器、石英晶体压电传感器其他生物传感器监测食品微生物的研究报道，这些方法均存在一些关键技术问题没有得到解决，从而限制了其发展和应用。用高灵敏度的电子舌快速评价食品质量安全性是为国内外研究的前沿，目前仅应用于检测食品和农产品中重金属污染、农药残留和产品真伪辨识等领域。

智能化学分析***(通常称作电子舌)，通过传感器阵列(相当于生物***中的舌头)感受不同的化学物质，采集各种不同的信号信息输入电脑。电脑代替了生物***中的大脑功能，通过软件进行分析处理，区分辨识不同性质物质的整体特征。

专利申请号为200710068869.X的专利申请公开了一种用于液体样品的智能化学分析***，包括传感器阵列、信号激励采集装置和智能分析单元，信号激励采集装置将预定的激发脉冲序列加到辅助电极，同时采集工作电极产生的响应信号；智能分析单元包括信号激励采集装置上位机和数据智能分析软件，用于对响应信号进行处理和分析；该智能化学分析***的信号激励采集装置为多频脉冲信号激励采集装置，能产生多频率段的大幅脉冲电势；它的动作步骤如下：1.通过单片机控制DAC数/模转换模块，激励信号输入恒电位仪后加至辅助电极；2.工作电极产生的电流由程控电流跟随器转换为电压信号，进入反相放大器；3.由低通滤波去除信号中的噪声，输入ADC模/数转换模块转换成数字量反馈给单片机。

由于该智能化学分析***采用多频脉冲伏安法为信号激发采集模式，相比现有技术响应信号强，信噪音比高，信息量更丰富；同时采用了适合其自身数据结构特点使用的，方便、智能化的智能分析软件，具有响应信号强、信号稳定，信噪音比高，信息量丰富、分辨率高、易于操作等特点。

利用该智能化学分析***具有非专一性、弱选择性、对溶液中不同组分(有机和无机，离子和非离子)具有高度交叉敏感的特性，对不同生长时期的菌群培养液进行检测，结合适当的模式识别算法和多变量分析方法对阵列数据进行处理，获得培养液样本定性定量信息，从而可以监测菌群的生长情况。

发明内容

本发明的目的在于提供一种准确、灵敏、简便、高效、经济的示踪食品致病性细菌生长和代谢综合信息的检测方法，即一种用多频大幅脉冲智能化学分析***监测菌群生长的方法。

本发明的上述目的通过以下技术方案实现的：

一种示踪食品致病性细菌生长的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

a.将待测菌种接种于1％葡萄糖肉汤培养基中，静止培养18小时，制备种子液；

b.将种子液分别等量转接于装有50ml1％葡萄糖肉汤培养基的三角瓶中，分别培养0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、24h、30h后，对培养液进行灭活；

c.在多频大幅脉冲智能化学分析***的信号激励采集装置上位机上选择信号激励采集装置所需的电压、脉冲频率、脉冲间隔时间；

d.把多频大幅脉冲智能化学分析***的传感器阵列浸入培养液中，所述的传感器阵列以铂电极、金电极、钯电极、镍电极、钨电极、钛电极等非修饰金属电极作为工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极；

e.在工作电极上施加电压，对传感器阵列中的每个工作电极进行一次脉冲序列；

f.采集电流响应信号，提取顶点和拐点值作为检测样品的变量，用多频大幅脉冲智能化学分析***的数据智能分析软件进行分析处理。

进一步地，本发明所述的食品致病菌可以是金黄色葡萄球菌，所述多频大幅脉冲智能化学分析***的传感器阵列和脉冲激发频率段为：Wu电极的100Hz频率段、Pt电极的1Hz频率段、Ag电极的10Hz频率段、Ti电极的10Hz频率段。

本发明所述的食品致病菌还可以是大肠杆菌O157:H7，所述多频大幅脉冲智能化学分析***的传感器阵列和脉冲激发频率段为：Au电极的100Hz频率段、Pt电极的1Hz频率段。

本发明所述的食品致病菌还可以是枯草芽孢杆菌，所述多频大幅脉冲智能化学分析***的传感器阵列和脉冲激发频率段为：Ba电极的1Hz、10Hz、100Hz三个频率段。

更进一步地，每个脉冲频率段的脉冲幅度均从1.0V开始，然后每次变化0.2V一直到-1.0V，在两个不同的频率段之间***5s时间间隔。

本发明采用多频大幅脉冲作为激发扫描信号，检测食品致病性细菌生长过程的整体响应信号，用多种不同的非修饰金属电极组成三电极阵列***的多频大幅脉冲传感***，示踪各种菌的生长与代谢规律。

本发明采用的多频大幅脉冲智能化学分析***，传感器电极阵列可以包括铂电极、金电极、钯电极、镍电极、钨电极、钛电极作为工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极，组成的多个标准三电极***。

信号激励采集装置采用多频大幅脉冲伏安法。多频大幅脉冲激发电位由1Hz、10Hz和100Hz三个脉冲频率段组成，分别相当于脉冲时间间隔为1s，0.1s，0.01s的大幅脉冲伏安法。每个脉冲频率段的大幅脉冲的脉冲幅度均采用相同脉冲幅度变化，从1.0V开始，然后每次变化0.2V一直到-1.0V。在两个不同的频率段之间***5s时间间隔，可以消除各个频率间响应迟滞的干扰。

智能分析单元采用多元统计分析中比较常用的统计方法，即主成分分析方法(principal component analysis，PCA)对多频大幅脉冲传感***采集的数据进行处理，提取电流采集信号的顶点和拐点值作为检测样品的变量，通过主成分分析方法获得的得分图，对不同的检测样品进行区分、识别。首先，以行向量代表样品，纵向量代表变量把不同电极不同频率段的数据分别保存成数据表格，进行主成分分析。然后，比较不同电极的主成分得分图，在二维和三维平面上比较各个电极在不同频率下对样品的区分效果，把主成分得分图具有互补作用的电极数据横向叠加，重新组成以行向量代表样品，纵向量代表变量的数据阵列，最终寻找具有最好区分效果的主成分得分图和电极数据叠加方式，寻找区分这类样品最适合的电极阵列组合方式以及电极最适合的多频脉冲频率段，最终确定适宜的2-3个电极及其脉冲频率段作为监测目的菌生长状况的监测***。

本发明采用多频大幅脉冲智能化学分析***对不同生长时期的菌群培养液进行实时检测，采集液体培养基内不断变化的复杂成分多项综合指标的响应信息，结合多元统计分析中的主成分分析方法进行相关信息分析，选择出了适于监测细菌、特别是金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7和枯草芽孢杆菌生长情况的传感器阵列和频率段，大大增强了分析结果的准确性。适于监测金黄色葡萄球菌生长情况的传感器阵列和频率段为：Wu电极的100Hz频率段、Pt电极的1Hz频率段、Ag电极的10Hz频率段、Ti电极的10Hz频率段等。大肠杆菌O157:H7的适宜传感器阵列和频率段为：Au电极的100Hz频率段、Pt电极的1Hz频率段。适于监测枯草芽孢杆菌的传感器阵列和频率段为：Ba电极的1Hz、10Hz、100Hz三个频率段。

本发明是由一种可以检测溶液整体品质特征综合信息为特点的现代化分析检测仪器——基于电极阵列的多频大幅脉冲传感***，结合多元统计分析方法中的主成分分析方法，对食品致病性细菌生长代谢综合信息及其变化规律进行示踪检测构成的。具有低选择性、非特异性和交互敏感性、准确、灵敏、经济和快速等特点和优点。

附图说明

图1是多频大幅脉冲智能化学分析***检测金黄色葡萄球菌不同时期培养液的主成分得分图；其中，(a)Wu电极在100Hz频率段的主成分得分图；(b)Pt电极在1Hz频率段的主成分得分图；(c)Ag电极在10Hz频率段的主成分得图；(d)Ti电极在10Hz频率段的主成分得分图。

图2是多频大幅脉冲智能化学分析***检测大肠杆菌O157:H7不同时期培养液的主成分得分图；其中，(a)Pt电极在1Hz频率段的主成分得分图；(b)Au电极在100Hz频率段的主成分得分图；

图3是多频大幅脉冲智能化学分析***检测枯草芽孢杆菌不同时期培养液的主成分得分图；其中，(a)Ba电极在1Hz频率段的主成分得分图；(b)Ba电极在10Hz频率段的主成分得分图；(c)Ba电极在100Hz频率段的主成分得分图。

具体实施方式

实施例1：金黄色葡萄球菌生长情况分析

将金黄色葡萄球菌菌种接种于1％葡萄糖肉汤培养基中，静止培养18～24h，制备种子液。

将种子液分别等量转接于装有50ml1％葡萄糖肉汤培养基的三角瓶中，37℃下分别培养0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、24h、30h后，对培养液100℃、40min水浴灭活。

用多频大幅脉冲智能化学分析***对灭活后的培养液进行检测。传感器阵列选用Wu电极、Pt电极、Ag电极、Ti电极为工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极。

多频大幅脉冲激发电位由1Hz、10Hz和100Hz三个脉冲频率段组成，分别相当于脉冲时间间隔为1s，0.1s，0.01s的大幅脉冲伏安法。每个脉冲频率段的大幅脉冲的脉冲幅度均采用相同脉冲幅度变化，从1.0V开始，然后每次变化0.2V一直到-1.0V。在两个不同的频率段之间***5s时间间隔，可以消除各个频率间响应迟滞的干扰。

将智能化学分析***的传感器阵列放入培养0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、24h、30h后并已灭活的培养液中，在工作电极上施加电压，对传感器阵列中的每个工作电极进行一次脉冲序列。连续测试三次，数据求平均值，每检测完一个被测液体后，对电极阵列打磨，蒸馏水冲洗；参比电极用蒸馏水清洗，然后用滤纸吸干。

用主成分分析方法(principal component analysis，PCA)对多频大幅脉冲传感***采集的数据进行处理，提取电流采集信号的顶点和拐点值作为检测样品的变量，通过主成分分析方法获得的得分图，对不同的检测样品进行区分、识别。首先，以行向量代表样品，纵向量代表变量把不同电极不同频率段的数据分别保存成数据表格，进行主成分分析。然后，比较不同电极的主成分得分图，在二维和三维平面上比较各个电极在不同频率下对样品的区分效果，把主成分得分图具有互补作用的电极数据横向叠加，重新组成以行向量代表样品，纵向量代表变量的数据阵列，最终寻找具有最好区分效果的主成分得分图和电极数据叠加方式，寻找区分这类样品最适合的电极阵列组合方式以及电极最适合的多频脉冲频率段，最终确定Wu电极100Hz频率段、Pt电极1Hz频率段、Ag电极10Hz频率段、Ti电极10Hz频率段作为监测金黄色葡萄球菌生长状况的监测***。

如图1所示，(a)Wu电极在100Hz频率段的主成分得分图；(b)Pt电极在1Hz频率段的主成分得分图；(c)Ag电极在10Hz频率段的主成分得图；(d)Ti电极在10Hz频率段的主成分得分图。

从图1中(a)，可以看出Wu电极在100Hz频率段主要是在成分二上体现出来的一个生长趋势。(d)中显示Ti电极的10Hz频率段在成分二上有明显的生长趋势；(b)和(c)，表明Pt电极的1Hz频率段和Ag电极的10Hz频率段在成分一上有显著的生长趋势。0h时的样品是刚接种未培养就灭活的，它与其它生长时期的样品有较大的离散度，这表明了金黄色葡萄球菌的生长代谢对培养基产生了很大的影响；从1h到8h左右，样品的离散度也很大，这主要是因为金黄色葡萄球菌在培养2h后逐渐进入了对数期，生长代谢特别旺盛所造成的；9h后金黄色葡萄球菌生长进入了稳定期，生长与衰亡基本保持平衡，所以后面到30h时的样品的离散度较小。在这些主成分得分图中很容易看到金黄色葡萄球菌的生长。与传统的浊度法测得结果进行比较，完全吻合，同是在8h-9h逐渐进入稳定期，而且都可以表明之前的生长及代谢很旺盛。因此多频大幅脉冲传感***在监测液体培养基里的金黄色葡萄球菌生长情况是可行的。

实施例2：大肠杆菌0157:H7生长情况分析

将大肠杆菌O157:H7菌种接种于1％葡萄糖肉汤培养基中，静止培养18～24h，制备种子液。

将种子液分别等量转接于装有50ml1％葡萄糖肉汤培养基的三角瓶中，分别培养0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、24h、30h后，对培养液进行灭活。

用多频大幅脉冲智能化学分析***对灭活后的培养液进行检测。传感器阵列选用Pt电极、Au电极为工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极。

脉冲电压、脉冲频率、脉冲间隔时间、检测方法和信号分析方法与具体实施例1相同。

最终确定Pt电极1Hz频率段、Au电极100Hz频率段作为监测大肠杆菌O157:H7生长状况的监测***。

如图2所示，多频大幅脉冲智能化学分析***检测大肠杆菌O157:H7不同时期培养液的主成分得分图；其中，(a)Pt电极在1Hz频率段的主成分得分图；(b)Au电极在100Hz频率段的主成分得分图。

在图2中Pt电极的1Hz频率段、Au电极的100Hz频率段的主成分得分图是比较相似的。都是在前6h的时候在主成分得分图上的离散度是较大的，而在6h和7h有一个拐点，且7h后它们的离散度较小。这说明了大肠杆菌O157:H7的生长在前五个小时对培养的影响特别大，也就是说大肠杆菌O157:H7的生长在这个阶段特别活跃；而7h后它的生长逐渐进入稳定期。从得分图中可以了解到大肠杆菌O157:H7的生长一般在培养6h-7h左右达到了顶峰，培养基里的菌体繁殖最快，代谢最旺盛。

实施例3：枯草芽孢杆菌生长情况分析

将枯草芽孢杆菌菌种接种于1％葡萄糖肉汤培养基中，静止培养18～24h，制备种子液。

将种子液分别等量转接于装有50ml 1％葡萄糖肉汤培养基的三角瓶中，分别培养0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、24h、30h后，对培养液进行灭活。

用多频大幅脉冲智能化学分析***对灭活后的培养液进行检测。传感器阵列选用Ba电极为工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极。

脉冲电压、脉冲频率、脉冲间隔时间、检测方法和信号分析方法与具体实施例1相同。

最终确定Ba电极1Hz频率段、10Hz频率段、100Hz频率段作为监测枯草芽孢杆菌生长状况的监测***。

如图3所示，多频大幅脉冲智能化学分析***检测枯草芽孢杆菌不同培养时期培养液的主成分得分图；其中，(a)、(b)、(c)分别是Ba电极在1Hz频率段、10Hz频率段、100Hz频率段上的主成分得分图。

从图3可以看出，由于0h时的样品未经培养，所以它与其他样品的离散度相对较大。Ba电极的10Hz频率段和100Hz的主成分得分图显示枯草芽孢杆菌在1％葡萄糖肉汤培养基中培养到4h左右进入生长对数期。在三张主成分得分图中，我们可以看出11h前的样品离散度都较大，即在这个时间段里枯草芽孢杆菌的生长对培养基的影响活跃。而后面的时间段的样品的离散度相对较小，说明枯草芽孢杆菌逐渐进入了稳定期。

本发明采用的多频大幅脉冲传感智能化学分析***将常规大幅脉冲拓展到三种频率，并且以主成分分析方法为数据处理手段，在监测食源性致病菌的生长趋势中所获得的结果与标准方法(浊度法)基本一致。并且和其它方法比较，它具有结构简单、性能稳定、信息量丰富、易智能化、使用寿命长、成本低廉、快速简便等独有特点。从多频大幅脉冲传感***监测液体培养基里的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7和枯草芽孢杆菌生长情况的研究结果表明，多频大幅脉冲传感***在监测、分析、区分以及快速检测食源性致病微生物方面有很大的应用前景。

当然，本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非作为对本发明的限定，只要在本发明的实质范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明权利要求书的范围内。

Claims (1)

1.一种示踪食品致病菌生长的检测方法，所述食品致病菌为金黄色葡萄球菌；其特征在于包括以下步骤：

a. 将金黄色葡萄球菌菌种接种于1%葡萄糖肉汤培养基中，静止培养18小时，制备种子液；

b. 将种子液分别等量转接于装有50ml 1%葡萄糖肉汤培养基的三角瓶中，分别培养0h、1h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、9 h、10 h、11 h、12 h、13 h、24 h、30 h后，对培养液100℃、40min水浴灭活；

c. 用多频大幅脉冲智能化学分析***对灭活后的培养液进行检测；传感器阵列采用钨电极、铂电极、钛电极、银电极为工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极；多频大幅脉冲激发电压的脉冲频率由1 Hz、10 Hz和100 Hz三个脉冲频率组成，分别相当于脉冲时间间隔为1 s、0.1 s、0.01 s的大幅脉冲伏安法；所述三个脉冲频率的大幅脉冲的脉冲幅度均采用相同脉冲幅度变化，从1.0 V开始，然后每次变化0.2V一直到-1.0 V；在所述三个脉冲频率的两个不同的频率之间***5s时间间隔；

d. 将多频大幅脉冲智能化学分析***的传感器阵列放入培养0h、1h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、9 h、10 h、11 h、12 h、13 h、24 h、30 h后并已灭活的培养液中，在工作电极上施加电压，对传感器阵列中的每个工作电极进行一次脉冲序列；所述脉冲序列的频率为1 Hz、10 Hz和100 Hz；

e. 用主成分分析方法对多频大幅脉冲智能化学分析***采集的数据进行处理，提取电流采集信号的顶点和拐点值作为检测样品的变量，通过主成分分析方法获得的得分图，对不同的检测样品进行区分、识别，确定钨电极100Hz频率、铂电极1Hz频率、银电极10Hz频率、钛电极10Hz频率作为监测金黄色葡萄球菌生长状况的监测***。

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