CN101321771A

CN101321771A - 青霉素钾盐的制备工艺

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Publication number: CN101321771A
Application number: CNA2006800452303A
Authority: CN
Inventors: 托马斯·杜斯凡德
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: Centrient Pharmaceuticals Netherlands BV
Priority date: 2005-12-02
Filing date: 2006-11-30
Publication date: 2008-12-10
Anticipated expiration: 2026-11-30
Also published as: CN101321771B

Abstract

本发明公开了从包含青霉素G钾盐(Pen G K)或青霉素V钾盐(PenV K)、有机溶剂和C₁至C₃的醇的悬浮液制备晶体形式的青霉素G钾盐(Pen G K)或青霉素V钾盐(Pen V K)的工艺。

Description

青霉素钾盐的制备工艺

本发明涉及制备晶体形式的青霉素G钾盐(Pen G K)或青霉素V钾盐(Pen V K)的工艺。

青霉素通常是用微生物菌株从发酵工艺生产的，所述菌株能在存在合适的侧链前体时生产青霉素。例如，青霉素G是通过在存在侧链前体苯乙酸时由Penicillium chrysogenum的选定菌株来生产的。发酵之后，取决于青霉素的类型，按照已知方法，从发酵培养液中回收青霉素。

在典型的现有技术青霉素G回收工艺中，对获得的发酵培养液进行过滤，洗涤滤渣，之后，在对滤出液酸化之后，将收集到的滤出液中存在的青霉素G萃取到有机溶剂(例如乙酸正丁酯或甲基异丁基甲酮)中。然后可在活性炭协助下对由此得到的萃取物进行脱色，并将青霉素G酸反萃取到水中，再用钾盐水溶液(例如乙酸钾)进行中和。将该溶液与足够量的的第二溶剂(例如正丁醇)混合，之后使用正丁醇-水共沸物的蒸发来降低水含量，再通过过滤和随后的洗涤及干燥，回收形成的青霉素G K晶体。该现有技术回收工艺的一个缺点在于，其正丁醇-水共沸物蒸发期间，由于Pen G K的降解，Pen G K会大量损失，导致Pen G K的产率显著降低(例如，＜92％)。

在另一种现有技术工艺中，直接从上述萃取物获得结晶Pen G K，这是通过加入乙酸钾或其它合适的钾源接着进行共沸物蒸发，再过滤形成的Pen G K晶体，将其悬浮于正丁醇中，过滤并干燥来实现的。该现有技术回收工艺的一个缺点在于，分离最终产物(Pen G K)之后，母液既包含正丁醇也包含乙酸正丁酯。两种溶剂都需要被回收；但是，鉴于正丁醇和乙酸正丁酯难于分离，该溶剂回收步骤需要昂贵的设备。此外，在该工艺中，通过在乙酸正丁酯中结晶接着将Pen G K晶体悬浮于正丁醇中来获得Pen G K晶体，需要对Pen G K晶体进行两次分离步骤，而非一次。

对于青霉素V而言，原则上可以使用相同的工艺。但是，由于青霉素V在酸性条件下稳定性更好，青霉素V还可以以酸形式而非钾盐形式结晶，不会导致经济上不可接受的损失。

本发明的目的是提供一种简单的、并且因此更具经济吸引力的工艺，用于：以足够高的(并且优选地，提高的)产率，来制备具有良好的质量(优选地，改进的质量)的晶体形式的青霉素钾盐，所述青霉素选自青霉素G和青霉素V的组。

“产率”在本文中被定义为：相对于萃取物中存在的青霉素而言，晶体形式的、选自青霉素G和青霉素V的组的青霉素的钾盐中青霉素的％产率。足够高在本文中被定义为：优选至少90％，更优选至少92％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，最优选至少98％。

“良好的质量”在本文中被定义为：最终得到的、晶体形式的、选自青霉素G和青霉素V的组的青霉素的钾盐含有非常少的杂质或者不含杂质，例如，杂质含量少于5％(w/v)，更优选地，少于4％，更优选地，少于3％，更优选地，少于2％，更优选地，少于1％，更优选地，少于0.5％，更优选地，少于0.25％，进一步更优选地，少于0.1％。杂质可以例如是6-氨基-青霉烷酸(6-APA)、苯乙酸(PA)、对羟基青霉素G、青霉素G的青霉酸(penicillic acid)、青霉素G的青霉噻唑酸(penicilloicacid)和青霉素G的去羧青霉噻唑酸(penilloic acid)和相应的针对青霉素V的杂质。

在一个方面，本发明提供了一种工艺，用于：从下述悬浮液来制备晶体形式的、选自青霉素G和青霉素V的组的青霉素的钾盐，所述悬浮液包含选自青霉素G和青霉素V的组的青霉素的钾盐、有机溶剂和选自C₁、C₂和C₃醇构成的组的醇。优选地，所述青霉素是青霉素G。令人吃惊地，我们发现，在根据本发明的工艺中，晶体形式的、选自青霉素G和青霉素V的组的青霉素的钾盐的产率是前文所定义的足够高的，并且等于或者甚至高于本领域已知的工艺，同时获得的晶体的质量是如前文定义的良好的。本发明的工艺的另一优点在于，仅需要一步分离步骤，这不仅带来了足够高的产率，还带来了相当大的经济优点。

根据本发明的工艺中，有机溶剂可以是本领域技术人员已知的任何合适的有机溶剂。此类合适的有机溶剂的例子是乙酸戊酯、乙酸正丁酯、乙酸乙酯、甲基异丁基甲酮、环己酮、异丁醇或正丁醇。优选地，有机溶剂是乙酸正丁酯。

根据本发明的工艺中的醇选自C₁、C₂和C₃醇构成的组，其优选是甲醇、乙醇、正丙醇或异丙醇。最优选地，所述醇是甲醇。

在根据本发明制备晶体形式的、选自青霉素G和青霉素V的组的青霉素的钾盐的工艺中，青霉素可从本领域已知的任何合适的生产工艺获得。青霉素G可例如是根据本领域已知的方法通过在存在侧链前体苯乙酸时发酵青霉素G生产微生物，例如Penicillium chrysogenum的菌株来生产的。可使用任何合适的技术，例如离心或过滤，从发酵培养液分离生物质，由此产生含有青霉素的发酵流体。优选地，应用过滤步骤来从培养液分离生物质。可选地，对残余固体加以洗涤。

通过加入至少一种酸，例如硫酸、氢氯酸或硝酸或它们的任何组合，将发酵培养液或流体酸化至2至4的范围内的pH，优选地，2.5至3的范围内的pH。然后通过萃取到有机溶剂中，将青霉素与经酸化的水相分开。可以使用任何合适的有机溶剂，例如，乙酸戊酯、乙酸正丁酯、乙酸乙酯、甲基异丁基甲酮、环己酮、异丁醇或正丁醇。优选地，有机溶剂是乙酸正丁酯。合适的去乳化剂的加入可能显著改善萃取。

“萃取物”在本文中被定义为下述有机溶剂，选自青霉素G和青霉素V的组的青霉素已被萃取到所述有机溶剂中。可选地，可按照本领域已知的方法，用活性炭处理包含青霉素的萃取物，以除去杂质。

在本发明的一种实施方式中，可选地被活性炭处理过的、按照前文定义的、包含选自青霉素G和青霉素V的组的青霉素的萃取物随后可与合适的钾源混合，以将选自青霉素G和青霉素V的组的青霉素转化为相应的青霉素钾盐，由此获得包含有机溶剂和青霉素钾盐的混合物。

与包含选自青霉素G和青霉素V的组的青霉素的萃取物混合的合适的钾源的用量优选是这样的：所述用量使得相对于青霉素而言加入0.4至3摩尔当量的钾。优选地，相对于青霉素而言加入0.6至2摩尔当量的钾，更优选地，0.7至1.6摩尔当量的钾，更优选地，0.8至1.4摩尔当量的钾，更优选地，0.9至1.2摩尔当量的钾。最优选地，相对于青霉素而言加入1摩尔当量的钾。合适的钾源是优选为弱酸的任何钾盐。此类合适的钾源的例子是乙酸钾或碳酸钾。钾源可以以固体形式使用，或者可以先溶于水，形成钾源的水溶液。水溶液中钾源的合适浓度是，例如，10至60％w/v之间，例如，15至55％w/v之间，例如20至50％之间。

随后，可从包含有机溶剂和选自青霉素G和青霉素V的组的青霉素的钾盐的混合物中除去水的一部分，或者包含水和有机溶剂的共沸物(例如水和乙酸正丁酯的共沸物)的一部分。存在于混合物中的水可能来自发酵培养液或者来自有机溶剂，或者是随着钾源的水溶液被引入的。优选地，水或共沸物的一部分被除去后，包含有机溶剂和选自青霉素G和青霉素V的组的青霉素的钾盐的混合物的水含量为＜10％(v/v)，更优选地，＜5％(v/v)，更优选地，＜2.5％(v/v)，更优选地，＜1％(v/v)，更优选地，＜0.5％(v/v)，最优选地，＜0.2％(v/v)。

按照上文所述，最初将水的一部分或水/有机溶剂的共沸物的一部分蒸发之后，向混合物中加入选自C₁、C₂和C₃醇构成的组的醇，以获得包含选自青霉素G和青霉素V的组的青霉素的钾盐、有机溶剂和醇的悬浮液。醇可以是甲醇、乙醇、正丙醇或异丙醇。优选地，所述醇是甲醇。

优选地，选自C₁、C₂和C₃醇构成的组的醇是干的(dry)。在本文中使用时“干”表示醇含有少于10％(v/v)的水，优选地，少于5％(v/v)的水，优选地，少于2％(v/v)。最优选地，干的醇含0％(v/v)的水。

在相互接触之后，可对包含选自青霉素G和青霉素V的组的青霉素的钾盐、有机溶剂和醇的悬浮液进行一定时间的搅动。优选地，对悬浮液进行时间为5分钟至24小时之间的搅动，优选地，10分钟至12小时之间，更优选地，20分钟至8小时之间，更优选地，0.5小时至6小时之间，更优选地，45分钟至3小时之间。优选地，对悬浮液搅动到选自青霉素G和青霉素V的组的青霉素的钾盐晶体形成为止。更优选地，对悬浮液搅动到选自青霉素G和青霉素V的组的青霉素的钾盐晶体形成且不结块为止。可在任何合适的温度下对悬浮液进行搅动，优选地，0至40℃之间的温度，更优选地，5至30℃之间，最优选地，10至25℃之间。

在根据本发明的工艺的悬浮液中，醇的体积和包含有机溶剂和选自青霉素G和青霉素V的组的青霉素的钾盐的混合物的体积之比可以是任何合适的比例。优选地，该比例为1∶20至1∶3之间，优选地，1∶15至1∶4之间，优选地，1∶10至1∶6之间。

在本发明的工艺期间，选自青霉素G和青霉素V的组的青霉素的钾盐可以部分或全部结晶。例如，向包含青霉素的萃取物加入合适的钾源后和/或在水的一部分或水/有机溶剂的共沸物的一部分从包含有机溶剂和选自青霉素G和青霉素V的组的青霉素的钾盐的混合物中蒸发期间，选自青霉素G和青霉素V的组的青霉素的钾盐可开始结晶。当包含有机溶剂和选自青霉素G和青霉素V的组的青霉素的钾盐(可选地，部分或全部结晶的)的混合物与选自C₁、C₂和C₃醇构成的组的醇接触时，和/或对包含选自青霉素G和青霉素V的组的青霉素的钾盐、有机溶剂和醇的悬浮液进行搅动期间，选自青霉素G和青霉素V的组的青霉素的钾盐还可进一步结晶或重结晶。

在另一实施方式中，向含有按照前文所述定义且获得的选自青霉素G和青霉素V的组的青霉素的萃取物中加入合适的钾源，以及包含有机溶剂和水的共沸物蒸发之后，例如通过过滤，收集获得的选自青霉素G和青霉素V的组的青霉素的钾盐的晶体。在与前述实施方式相同的条件下(例如，在醇/有机溶剂的比例、时间、温度等方面)，将由此获得的晶体重新悬浮于包含前文所述的有机溶剂和选自C₁、C₂和C₃醇构成的组的醇的混合物中。

在本发明的任何实施方式中，可通过本领域已知的任何合适的方法，从悬浮液中分离晶体形式的、选自青霉素G和青霉素V的组的青霉素的钾盐，例如通过离心或过滤来进行。然后可获得晶体形式的青霉素钾盐的湿滤饼。可选地，用有机溶剂或有机溶剂与选自C₁、C₂和C₃醇构成的组的醇的混合物来洗涤该湿滤饼。如果应用了洗涤步骤，优选地，有机溶剂与用于萃取物的有机溶剂相同，并且，选自C₁、C₂和C₃醇构成的组的醇与用于悬浮液中的醇相同。可使用本领域已知的任何合适的技术，来干燥晶体形式的、选自青霉素G和青霉素V的组的青霉素的钾盐的湿滤饼。在本发明的该实施方式中，青霉素优选是青霉素G。

可选地，将包含选自青霉素G和青霉素V的组的青霉素的钾盐的晶体的湿滤饼与水混合，获得选自青霉素G和青霉素V的组的青霉素的钾盐的水溶液。然后可抽提(strip)水溶液，以除去痕量的有机溶剂和/或选自C₁、C₂和C₃醇构成的组的醇。抽提包括水、有机溶剂和/或醇的蒸发。选自青霉素G和青霉素V的组的青霉素的钾盐的水溶液可用于通过本领域已知的方法(例如，EP 0977 883所述的)来进行到6-氨基青霉烷酸(6-APA)的酶促转化。可用合适的青霉素酰基转移酶来处理包含溶解的选自青霉素G和青霉素V的组的青霉素的钾盐的溶液，所述酶例如是合适的青霉素G酰基转移酶，以使得青霉素G脱酰基化，以及合适的青霉素V酰基转移酶，以使得青霉素V脱酰基化。已被发现能生产合适的青霉素酰基转移酶的生物是，例如，Acetobacter、Aeromonas、Alcaligenes、Aphanocladium、Bacillus sp.、Cephalosporium、Escherichia、Flavobacterium、Kluyvera、Mycoplana、Protaminobacter、Providentia、Pseudomonas或Xanthomonas的种。已特别证实，从Acetobacterpasteurioanum、Alcaligenes faecalis、Bacillus megaterium、Escherichia coli、Providentia rettgeri和Xanthomonas citrii获得的酶可成功用于根据本发明的方法。在文献中，青霉素酰基转移酶也被称为青霉素酰胺酶。青霉素酰基转移酶可作为游离的酶使用，也可以以任何合适的被固定的形式适用，例如，EP 0222462和WO 97/04086中描述的。通过青霉素酰基转移酶对溶解的Pen G K进行的酶促转化导致形成6-氨基青霉烷酸(6-APA)和苯乙酸。

实施例1比较实施例

向1000ml经活性炭处理的萃取物中加入30％(w/w)的K₂CO₃水溶液，使得混合物含有相对于青霉素G而言大约1.0摩尔当量的钾，其中所述萃取物每ml含有大约100,000个Oxford单位的青霉素G，处于乙酸正丁酯中(1个Oxford单位等于大约0.6微克的青霉素G)。将该反萃取物与200ml正丁醇混合，使用旋转式薄膜蒸发仪(50-60℃温浴)在真空下对得到的混合物进行加热。在蒸发期间，逐份加入正丁醇，使得加入的正丁醇的总量为200ml。总共蒸发250ml的正丁醇/水，将残余物冷却至室温。通过过滤分离所形成的Pen G K晶体，用正丁醇洗涤并干燥。产率(按照前文所定义的)为91％。

实施例2

进行一系列实验，其中，向1000ml经活性炭处理的萃取物(每ml含有大约100,000个Oxford单位的青霉素G，处于乙酸正丁酯中)中加入50％(w/w)的K₂CO₃水溶液，使得混合物含有相对于青霉素G而言大约1.0摩尔当量的钾。旋转式薄膜蒸发仪(45-48℃温浴)在真空下对得到的混合物进行加热，由此使得一定量的混合物蒸发——关于针对每项实验的量，参见表1。随后，向残余物中加入甲醇，在25℃对混合物进行1小时搅动。过滤悬浮液，用70ml乙酸正丁酯洗湿滤饼，之后干燥湿滤饼。

表1：乙酸正丁醇中Pen G K的结晶+向残余物中加入甲醇

#	蒸发的体积(ml)	残余水含量(％)	加入的甲醇(ml)	母液体积(ml)	母液损失(％)	产率(％)
#	蒸发的体积(ml)	残余水含量(％)	加入的甲醇(ml)	母液体积(ml)	母液损失(％)	产率(％)	1	190(16)	nd	100	770	1.7	96.5
2	328(16)	nd	100	645	1.6	96.3	1	190(16)	nd	100	770	1.7	96.5
2	328(16)	nd	100	645	1.6	96.3	3	292(13)	0.04	100	620	1.2	98.0
4	334(18)	0.04	100	650	1.7	97.5	3	292(13)	0.04	100	620	1.2	98.0
4	334(18)	0.04	100	650	1.7	97.5	5	206(19)	0.18	150	720	2.3	94.5

蒸发的体积是蒸发的总体积，括号中的值代表馏出物中水层的体积。水含量一栏代表蒸发之后残余物的水含量。所有实验都以高产率(按照前文所定义的)产生了白色Pen G K晶体，所述产率相对于经碳处理的萃取物的青霉素含量而言(＝100％)，母液仅有非常有限的青霉素损失。来自实验1的晶体含有99.3％的Pen G K(即，良好的质量)。

Claims

1.一种工艺，用于：从下述悬浮液来制备晶体形式的、选自青霉素G和青霉素V的组的青霉素的钾盐，所述悬浮液包含选自青霉素G和青霉素V的组的青霉素的钾盐、有机溶剂和选自C₁、C₂和C₃醇构成的组的醇。

2.如权利要求1的工艺，其特征在于，所述青霉素是青霉素G。

3.如权利要求1或2的工艺，其特征在于，所述有机溶剂选自乙酸戊酯、乙酸正丁酯、乙酸乙酯、甲基异丁基甲酮、环己酮、异丁醇或正丁醇构成的组，优选是乙酸正丁酯。

4.如权利要求1至3中任意一项的工艺，其特征在于，所述醇选自甲醇、乙醇、正丙醇或异丙醇构成的组，优选是甲醇。

5.如权利要求1至4中任意一项的工艺，其特征在于，从所述悬浮液中分离晶体形式的青霉素的钾盐，以获得晶体形式的青霉素的钾盐的湿滤饼，以及可选地，对其进行洗涤和/或干燥。

6.如权利要求5的工艺，其特征在于，将所述湿滤饼与水混合，以获得青霉素钾盐的水溶液，随后将其用于向6-氨基青霉烷酸(6-APA)的酶促转化。