CN101312941B

CN101312941B - 多核苷酸标记试剂

Info

Publication number: CN101312941B
Application number: CN2006800434199A
Authority: CN
Inventors: D·海因德尔
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2005-11-23
Filing date: 2006-11-21
Publication date: 2012-04-18
Anticipated expiration: 2026-11-21
Also published as: EP1801114A1; CN101312985B; JP2009516521A; KR101032008B1; DE602006016325D1; CN101312941A; CN101312985A; EP1954671A1; HK1126224A1; ES2349129T3; AU2006317195A1; JP5155177B2; EP1801114B8; KR20080056314A; EP1954671B1; CA2627208C; EP1954707A1; DE502005008153D1; CA2627216C; ES2332139T3

Abstract

本发明提供了一种用于制备修饰的寡核苷酸的新的标记试剂及其制备方法，其中这些寡核苷酸含有至少一次结构P＝N-SO₂-苯-L-M-X，其特征在于L是-(CH₂)n-或者聚乙二醇，M选自-NH-、-O-、-S-和-COO-，X是保护基或者可检测单元。L优选是-(CH₂)n-或者聚乙二醇。

Description

多核苷酸标记试剂

本发明涉及核苷酸化学领域的新物质及其制备方法。这些物质是所谓的磷酸酯模拟物，其中羟基被相应的模拟物置换。

具体而言，本发明涉及用于制备一类新的修饰寡核苷酸的标记试剂。

技术现状

本领域已知多种合成具有修饰的磷酸酯部分的核苷酸或寡核苷酸的方法。

通常，利用亚磷酰胺化学在固相上制备合成的(脱氧)寡核苷酸。具有确定尺寸的孔的玻璃珠(在下文中缩写为CPG＝定孔玻璃)通常用作所述固相。通过可裂解基团将第一单体连接于所述载体，从而在完成固相合成后，可以裂解掉游离的寡核苷酸。此外，第一单体含有保护羟基，在这种情况下，二甲氧基三苯甲基(DMT)通常用作保护基。可以通过酸处理除去保护基。然后，在5′端，将也具有DMT保护基的(脱氧)核糖核苷的3′亚磷酰胺衍生物连续地偶联到在循环过程中在各种情况的DMT保护基中释放的反应基。或者，3′二甲氧基三苯甲基-保护的5′亚磷酰胺用于反相寡核苷酸合成。H-膦酸酯方案还特别用于在磷酸酯主链上引入修饰，例如，以制备放射性同位素标记的硫代磷酸酯。制备修饰或标记的寡核苷酸的多种方案也是已知的：根据现有技术使用三功能载体物质制备在3′端标记的寡核苷酸(US 5,290,925，US5,401,837)。通常，使用通过C3-12接头将标记基团结合于亚磷酰胺的标记的亚磷酰胺，制备在5′端标记的寡核苷酸(US 4,997,928，US5,231,191)。此外，可以将修饰在各碱基上引入寡核苷酸(US 5,241,060，US 5,260,433，US 5,668,266)，或者通过引入内部非核苷接头来引入修饰(US 5,656,744，US 6,130,323)。

或者，可以通过硫代磷酸酯的合成后标记(Hodges，R.R.等，Biochemistry 28(1989)261-7)或通过后标记官能化的亚磷酰胺(Agrawal，S.，Methods in Mol.Biology 26(1994)Protocols forOligonucleotide Conjugates，第3章，Humana Press，Totowa，NJ)来标记核苷间磷酸酯。然而，这些方法由于亚磷酰胺和磷酸硫酯的不稳定性尚未被接受。

从现有技术也已经知道，在寡核苷酸的核苷间磷酸酯残基上可以引入修饰。最突出的例子是硫代磷酸酯(Burgers，P.M.，和Eckstein，F.，Biochemistry 18，(1979)592-6)、甲基膦酸酯(Miller，P.S.，等，Biochemistry 18(1979)5134-43)或硼烷合(borano)磷酸酯(WO91/08213)。为了制备甲基膦酸酯寡核苷酸，必须合成特殊单体。与此相反，惯用的亚磷酰胺或H-膦酸酯可用于合成硫代磷酸酯和硼烷合磷酸酯，在这种情况下，通过使用与H-膦酸酯或膦酸三酯反应的特殊试剂，可以在寡核苷酸合成过程中或之后直接地引入硼烷合或硫代修饰。虽然所有这些方法都产生修饰寡核苷酸，但是用于此的合成化学的条件不允许在寡核苷酸合成过程中在寡核苷酸链的磷酸酯骨架上直接地引入在所述方法中可检测的标记或官能团。

Baschang，G.和Kvita，V.，“Angewandte Chemie”85(1)(1973)43-44描述了核苷酸磷酸三酯与叠氮化物(例如甲磺酰叠氮化物)反应制备三烷基(芳基)亚氨基磷酸脂，然而其不稳定并分解。

Nielsen，J.和Caruthers，M.H.，J.Am.Chem.Soc.110(1988)6275-6276描述了在烷基叠氮的存在下提供有2-氰基-1，1-二甲基乙基保护基的脱氧核苷亚磷酸酯的反应。此外，作者提议该原则适于制备在磷酸酯残基上修饰的核苷酸，但没有说明利用所披露的方法制备的何种类型的修饰可以具有特殊的优点。特别地，作者提议引入烷基残基。

WO 89/09221披露了N-烷基亚磷酰胺、更精确地说在至少一个磷酸酯残基上被N-烷基取代的寡核苷酸，其通过在合适的烷基胺的存在下用碘氧化核苷亚磷酸酯(具有保护基)进行制备。

WO 03/02587披露了修饰的寡核苷酸的制备，其中通过氨基化将H-磷酸酯改变为氨基磷酸酯。

因此，所有这些出版物描述了含有氨基磷酸酯而不是磷酸酯残基的分子的制备。然而，含有氨基磷酸酯的分子易受水解，因为胺基在酸性环境中被质子化，然后被水取代。

此外，WO 01/14401提出其中磷酸酯残基被N-ClO₃、N-NO₂或N-SO₂R取代的核苷酸结构单元或寡核苷酸。根据WO 01/14401的教导，可以通过在吡啶的存在下使脱氧核苷的自由羟基与酰氨基膦酰氯反应来制备所述物质。然而，这种类型的制备是复杂的、耗时的并且不适于核苷酸或寡核苷酸的常规合成。

Acc叠氮化物(例如酰基叠氮和磺酰叠氮)的制备是简单的且得知已久(综述：Brase，S.等，Angewandte Chemie 117(2005)5320-5374，3.4和3.5.2)。它们优选地使用叠氮化钠自酰氯或磺酰氯制备或使用亚硝酸自酰肼制备。

例如，染料磺酰叠氮也用于染色法(例如DE 19650252)。叠氮化氰可以通过使叠氮化钠与溴化氰在乙腈中反应简易地制备(McMurry，J.E.，等，J.Organic Chemistry 38(16)(1973)2821-7)。杂芳基叠氮化物可以通过用叠氮化物亲核取代卤素制备，也可以自杂芳基肼制备。条件是吸电子氮处于叠氮基的对位或邻位，因为只有这样才会形成共振稳定的磷酸酯模拟物。在这方面，邻位和对位N-烷基吡啶鎓叠氮化物是特别合适的。一些酰基叠氮、磺酰叠氮和吡啶叠氮也是在市场上可买到的。

因此，形成本发明的基础的技术目的是提供改进的标记寡核苷酸和提供可以用于其制备的简单过程中的标记试剂。

发明简述

因此，本发明涉及一种具有化学结构N₃-SO₂-苯-L-M-X的试剂，其特征在于L是接头，优选为-NH-CO-聚乙二醇或-NH-CO-(CH₂)n，n为1-18的自然数。

M选自-NH-、-O-和-S-，

X是保护基或者可检测单元。

在一个实施方案中，X选自DMT、TFA、Fmoc和S-烷基，其中烷基是1-6个碳原子的链。或者，X是标记化合物，例如荧光化合物。

在第二方面，本发明涉及如上披露的具有X作为保护基的化合物用于修饰核酸、优选单链寡核苷酸的用途。在一个优选实施方案中，所述修饰包括以下步骤：

-使3′亚磷酰胺与初生寡核苷酸链的5′OH端反应，以及

-使该中间产物与如上披露的试剂反应。

在第三方面，本发明涉及制备如上述披露的试剂的方法，其特征在于

具有化学式N₃-SO₂-苯-NH₂的化合物与具有式A-CO-L-M-X的活化碳酸反应，

其中

L是接头，优选为-(CH₂)n-(n为1-18的自然数)或聚乙二醇，

M选自-NH-、-O-和-S-，

X是保护基或者可检测单元，

并且A选自氯化物、酸酐和N-羟基-琥珀酰亚胺。

或者，根据本发明，所述试剂可以通过使具有化学式N₃-SO₂-苯-(CH₂)n-COCl(n＝0-6)的化合物与具有式NH₂-(CH₂)m-M-X的化合物反应来合成，其特征在于

m是0或1-10的自然数，

M选自-NH-、-O-和-S-，

X是保护基或者可检测单元。

发明详述

发明基本思想

本发明的目的是提供标记试剂，其可以用于以简单的方式制备含有修饰的磷酸酯残基、因此也优选可检测标记的寡核苷酸。

本发明的中心思想是从三价磷原子开始，使其与一种试剂反应，形成稳定的磷酸酯模拟物。根据本发明，为了该目的，使含有至少一个具有保护基的羟基残基的磷原子与具有结构N＝N＝N-Acc(其中Acc是电子受体或以残基R取代的电子受体，R是任一有机取代基)的叠氮化物反应。这样形成了五价磷原子，通过N原子将强吸电子电子受体基团共价连接于该五价磷原子。该基团保证以这种方式制备的化合物，不同于现有技术中已知的氨基磷酸酯化合物，是共振稳定的，并且不易受水解。

本发明的这种思想可以用于形成三价磷作为中间产物的所有方法。

在使用亚磷酰胺的常规的寡核苷酸合成中，形成具有三价磷原子的膦酸三酯作为中间产物。第一和第二酯键代表核苷间键合。通过第三酯键将所述磷原子连接于保护羟基，例如，连接于β-氰基乙氧基。不是用碘氧化，根据本发明，初生的寡核苷酸可以与适当的叠氮化物反应，在这一过程中，通过将-N-Acc共价连接于磷原子同时裂解氮将三价磷原子氧化为五价原子。

随后，可以如现有技术已知的继续合成寡核苷酸。获得稳定的寡核苷酸作为最终产物，其在一个或多个核苷酸间磷酸酯残基上以几乎任一方式被修饰。

定义

在本发明范围内，一些所用术语定义如下：

反应基表示能够在合适的条件下与另一分子反应同时形成共价键的分子的基团。反应基的实例为羟基、氨基、硫醇、肼基、羟氨基、二烯、炔烃和羧酸基。

保护基表示与分子的一个或多个反应基进行反应的分子，从而，作为多步合成反应的部分，仅有一种特殊的、未保护的反应基可以与目标反应配偶体反应。常用的保护羟基的保护基的实例为β-氰基-乙基、β-氰基甲基、三烷基甲硅烷基和烯丙基。用于保护氨基的保护基是三氟乙酰基和Fmoc。其他可能的保护基概括在标准教科书中(Greene，T.W.，Protective groups in organic synthesis，Wiley IntersciencePublications，John Wiley&Sons(1981)New York，Chichester，Brisbane，Toronto；Souveaux，E.，Methods in Mol.Biology 26(1994)Protocols forOligonucleotide Conjugates，Humana Press，Totowa，NJ，Chapter 1，ed.S.Agrawal).

接头定义为长度为0-40个碳原子的碳链。所述接头链还可以具有一个或多个内部氮、氧、硫和/或磷原子。接头还可以是分支的，例如还可以是树枝状的。接头连接核苷酸或核苷酸链与可检测单元或任选地被保护基保护的反应基。

在本发明中，接头优选具有至少6个原子。也优选，所述链由C原子组成，其可含有至多20个杂原子。在具体实施方案中，所述接头可含有以下结构中的一种或多种：

-NR-(C＝O)-，

-C(＝O)-NR-，

-S(＝O)₂-NR-，

-NR-S(＝O)₂-

(R＝H或C₁-C₆烷基)

或O-CH₂CH₂-O。可检测单元理解为表示利用分析方法可以检测的物质。例如，它们可为可以通过质谱学、免疫学或借助于NMR进行检测的单元。特别地，可检测单元也是通过光学法(例如荧光和UV/VIS光谱学)可检测的物质，例如荧光素、若丹明和金颗粒。它们还包括插层剂和小沟粘合剂，其也对熔融行为产生影响，并且其荧光通过杂化而改变。

亚磷酰胺表示含有可以偶联于核苷或核苷衍生物的5′末端的三价磷原子的分子。因此，亚磷酰胺可用于寡核苷酸合成。除了用于链延长的(脱氧)核糖核苷酸亚磷酰胺之外，也存在用标记衍生化的亚磷酰胺，所述标记也可以在寡核苷酸合成期间或结束时以类似的方法标记所述寡核苷酸(Beaucage，S.L，Methods in Molecular Biology 20(1993)33-61，ed.S.Agrawal；Wojczewski，C，等，Synlett 10(1999)1667-1678)。

在本发明中，术语“寡核苷酸”不仅包括(脱氧)寡核糖核苷酸，也包括含有一个或多个核苷酸类似物的寡核苷酸，所述核苷酸类似物在磷酸酯骨架(例如甲基膦酸酯、硫代磷酸酯)上、糖(例如2′-O-烷基衍生物、3′和/或5′氨基核糖、LNA、HNA、TCA)或修饰碱基(例如7-脱氮嘌呤)上具有修饰。在这方面，本发明还包括含有非核苷类似物(例如PNA)的缀合物和嵌合体或其他的生物聚合物例如肽。此外，本发明的寡核苷酸在各位置还含有一个或多个非核苷单元如间隔区，例如六甘醇或Cn(n＝3.6)间隔区。

术语“电子受体”包括倾向于吸引自由电子对的原子结构。一个量度是Hammett常数。本发明在具体实施方案中涉及的Hammett常数σp超过一定值0.30、优选0.45、特别优选0.60。

另外，所述电子受体必须与寡核苷酸合成中的所有化学反应相容，即

-它不应被碘氧化

-它必须对二氯乙酸和三氯乙酸具有惰性，并且

-它必须对碱、特别是对氨具有惰性

-它不应与三价氨基磷酸酯反应。

满足这些条件的电子受体的实例是：

-NO₂、SO₂-R、-CN、-CO-R、pyrinidinyl、吡啶基、哒嗪基、六氟苯基、苯并***基(Hansch，C，等，Chem.Reviews 91(1991)165-195)。此外，这些受体还可以乙烯基或苯基方式结合于氮原子。

术语“被取代的”表示被取代的结构在任一位置含有另一残基，条件是该位置没有更详细地定义。术语“任选取代的”表示这种方式所指的结构包括具有或没有另外残基的实施方案。

术语“氨基取代的烷基”包括C₁-C₃₀直链或支链烷基，其含有至少一个氨基，其中该氨基被保护或通过接头结合于可检测单元。

术语“缺电子六元N-杂环”包括在sp2氮上烷基化从而所述杂环的总电荷是正值的N-杂环。其实例为吡啶鎓、嘧啶鎓和喹啉鎓。

术语“核苷酸链”理解为含有至少两个通过磷酸酯部分5′-3′相互连接的核苷残基的分子或分子的部分。

本发明化学标记试剂

本发明涉及具有化学结构N₃-SO₂-苯-L-M-X的试剂，其特征在于

L是如上定义的接头结构。在一个实施方案中，L优选为-NH-CO-聚乙二醇或-NH-CO-(CH₂)n，n为1-18的自然数。在另一具体实施方案中，L为-CO-NH-聚乙二醇或-NH-CO-(CH₂)n，n为1-18的自然数。

M选自-NH-、-O-和-S-，

X是保护基或者可检测单元。

连接于苯的部分以间位构型或者对位构型布置。优选地，他们处于对位构型。此外，苯可在一个或多个位置上被如卤素(例如氯)的非大体积取代基取代。

在L是-(CH₂)n-的情况下，n为1-18、优选2-12、最优选3-6的自然数。

在L是聚乙二醇的情况下，优选链长可以为2(二甘醇)-6(六甘醇)。

优选M为-NH-。

在X是保护基的情况下，其选自DMT(二甲氧基三苯甲基)、TFA(三氟乙酰基)、Fmoc((芴-9-基)甲氧基羰基)和-S-烷基，其中所述烷基的链长为1-6个碳原子。根据M的性质，选择不同的保护基。对于-NH-，TFA和Fmoc是高度优选的。对于-O-和-S-，建议使用DMT。对于-S-，可使用-S-烷基。

在X是可检测单元的情况下，所述可检测单元可为彩色标记染料，例如荧光标记。另外的实例为质量标签、半抗原(如Digoxygenin或Biotin)、或小肽，它们都是通过抗体可检测的。优选地，X是荧光化合物，例如荧光素或用于实时PCR的任何其他荧光染料。

值得注意的是，X、M和L的定义和披露的具体实施方案也用于公开以下内容的章节：“本发明的化学标记试剂的合成”、“本发明的寡核苷酸的制备”、以及“用本发明的标记试剂产生的寡核苷酸”。

本发明的化学标记试剂的合成

本发明还提供了合成本发明的化合物的简单直接的方法。

具有化学式N₃-SO₂-苯-NH₂的化合物可以通过本领域的标准方法由市售合理廉价的N₃-SO₂-苯-NH乙酰基容易地获得。

该化合物与具有式A-CO-L-M-X的活化碳酸反应

其特征在于A选自氯化物、酸酐和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS酯)。优选地，A是N-羟基琥珀酰亚胺。

L是接头，优选-(CH₂)n-或者聚乙二醇。在L是-(CH₂)n-的情况下，n为1-18、优选2-12、最优选3-6的自然数。在L是聚乙二醇的情况下，优选链长可以为2(二甘醇)-6(六甘醇)。

M选自-NH-、-O-和-S-，

X是如上述披露的保护基或者可检测单元。

通式结构A-O-CO-L-M-X所覆盖的一些化合物也是作为为寡核苷酸的合成后标记提供的试剂在市场上可买到的。特别地，经常以NHS酯的形式提供荧光染料，正如LC Red 640和LC Red 610的情况(Roche Applied Science Cat.Nos：12 015 161 001，03，03 561 488 001)。然而，在本发明中，所述化合物首先与N₃-SO₂-苯-NH₂反应，这样所述化合物然后可以叠氮化物的形式获得。如下所述，所述叠氮化物随后可用于已经在寡核苷酸合成的过程中引入标记。

或者，可以根据如上所述的方法合成N₃-SO₂-苯-L-NH-X(X作为保护基)、然后去保护X来合成标记试剂，其中X必须选自在叠氮化物合理稳定的条件下可以被除去的保护基。合适的保护基是三苯甲基、Boc和苯基乙酰基。然后，所得的N₃-SO₂-苯-L-NH₂可与可检测基团的活化酯反应，例如与市场上可买到的染料的NHS酯反应。

在本发明的另一方面，所述合成可以始于化合物N₃-SO₂-苯-(L)n-C(＝O)Cl，n＝0-1。所述化合物易于自被羧酸取代的烷基磺酰氯合成，其中羧酸可以直接或通过连接部分连接到芳环。市售化合物为例如Cl-S(＝O)2-Ph-COOH或Cl-S(＝O)2-Ph-(CH2)2COOH。通过与叠氮化钠反应将磺酰氯转移到磺酰叠氮，然后可以通过标准方法(例如FR 1455154)将羧酸转变为酰基氯。或者，N3-S-(＝O)2-Ph-NH2可与二羧酸酐反应生成N3-S(＝O)2-Ph-NHC(＝O)(CH2)COOH，然后通过标准方法将该羧酸转变为酰基氯。然后，化合物N₃-SO₂-苯-(L)n-C(＝O)Cl可与NH2-L-M-X反应，其在市场上可买到，或者可以容易地通过使NHS酯与过量的NH₂-L-NH₂反应自可检测基团的NHS酯合成。

本发明的寡核苷酸的制备

通常，本发明涉及用于制备修饰的寡核苷酸的标记试剂，其特征在于以下化学结构的三价磷衍生物

其中PG代表保护基

A代表核苷酸或核苷酸链的5′端，或者它代表结合于固相的接头，

B代表核苷酸或核苷酸链的3′端，或者它代表接头

与以下结构N₃-SO₂-苯-L-M-X的叠氮化物反应，其特征在于

L是接头，优选为-NH-CO-聚乙二醇或-NH-CO-(CH₂)n，n为1-18的自然数。

M选自-NH-、-O-和-S-，

X是保护基或者可检测单元。

β-氰乙基、甲基、烷基或甲硅烷基特别优选作为保护基(PG)。或者，可以根据本发明制备甲基膦酸酯，其中-O-PG被CH₃置换。

本发明的方法通常也可以用于特别是常规的寡核苷酸合成。因此，本发明还涉及一种方法，所述方法包括以下步骤：

a)3′亚磷酰胺与初生寡核苷酸链的5′OH端反应

b)与以下结构N₃-SO₂-苯-L-M-X的叠氮化物反应，其特征在于

M选自-NH-、-O-和-S-，

X是保护基或者可检测单元。

在这种情况下，初生寡核苷酸链的5′OH端可为5′末端核苷酸的5′端或CPG的自由OH基。

常规的寡核苷酸化学在反应性固相载体物质上开始。固相载体物质是指形成在其上可固定化其它分子的含反应基的固相的聚合物。在寡核苷酸合成的情况下，所述载体物质通常是具有确定孔径的多孔玻璃珠，所谓的定孔玻璃颗粒(CPG)。或者，也可以使用聚苯乙烯残基及其他有机聚合物和共聚物(Ghosh，P.K.，等，J.Indian.Chem.Soc.75(1998)206-218)。如果所述寡核苷酸在基质上合成后仍保持固定化，玻璃以及半导体芯片可用作固相载体物质。所述固相载体物质是市场上可买到的。

所述载体可以通过所谓的含有可裂解键的接头基团连接于被保护基(例如DMT(二甲氧基三苯甲基))保护的末端反应性羟基残基。具有可裂解键的接头基团表示在三功能间隔区和固相载体物质之间并且可通过简单的化学反应裂解的基团。它们可以是琥珀酰或草酰或含有可裂解酯键的其他接头基团。其他接头基团是本领域技术人员已知的(Ghosh，P.K.，等，J.Indian.Chem.Soc.75(1998)206-218)。

所述接头基团是使用载体物质合成意于在完成合成后仍存在于水溶液中的寡核苷酸必不可少的。如果与此相反，对于制备核酸阵列，在合成之后，所述寡核苷酸应保留在所述载体物质的表面(US5,624,711；Shchepinov，M.S.，等Nucl.Acids.Res.25(1997)1155-1161)，那么可裂解接头基团就不是必要的，而优选不可裂解接头基团。

结合本发明的结构的寡核苷酸合成详述如下：

在通过酸处理除去DMT保护基之后，形成在其上可以发生3′-5′方向链延长的反应性羟基。然后，在四唑的存在下，在5′端，将也具有DMT保护基的(脱氧)核糖核苷的3′亚磷酰胺衍生物连续地偶联于无DMT保护基的反应基。在该过程中，形成了含有三价磷原子的中间产物，其与通过所述反应连接在一起的各核苷形成酯键，并与已经存在于所用的亚磷酰胺中的保护羟基形成第三酯键。在完成寡核苷酸合成后，接着用氨裂解例如可由β-氰乙基、甲基、烯丙基或甲硅烷基形成的该保护基，在该过程中，碱基保护基和CPG的接头也被裂解。

不用碘氧化，根据本发明，初生寡核苷酸与以下结构N₃-SO₂-苯-L-M-X的叠氮化物反应，其特征在于

M选自-NH-、-O-和-S-，

X是保护基或者可检测单元。

在磷酸酯模拟物将被引入所述核苷酸链的位置。

特别地，如果X是保护基，X可以在寡核苷酸合成之后被除去，并按照本领域公知的方法用反应性可检测单元进行后寡核苷酸合成标记。

然而，优选X是可检测单元，例如荧光分子，从而在基于亚磷酰胺的寡核苷酸合成过程中已经发生初生寡核苷酸的标记。

本发明的某些实施方案涉及双标记寡核苷酸探针的制备，其中，优选将一标记根据本发明的方法在内部引入寡核苷酸中，而将另一标记根据现有技术已知的方法优选在5′或3′端引入寡核苷酸中。

在5′标记在5′末端核苷酸的5′位核糖的情况下，通过在寡核苷酸合成结束时使用染料标记的亚磷酰胺通过常规方法进行结合(Beaucage，S.L，Methods in Molecular Biology 20(1993)33-61，S.Agrawal Publishers)。

使用市场上可买到的除三苯甲基化羟基之外已经含有可检测标记的作为反应性固相载体的CPG进行3′端标记。裂解DMT保护基后，可以在现在游离的羟基处开始标准寡核苷酸合成。

或者，现有技术已知的后标记方法可用于另外的5′或3′标记(US5,002,885；US 5,401,837)。

本发明还涉及本发明的合成的中间产物，其可以在标准寡核苷酸合成前进行制备。在这种情况下，优选仍结合于固相、尚未去保护，并且可含有无碱基间隔区基团的中间产物。优选使用本领域技术人员所熟知的作为磷酸酯CPG的CPG用于所述制备，因为在寡合成后形成3′磷酸化寡核苷酸。脱三苯甲基作用后，所述磷酸酯CPG在活化剂的存在下与间隔区亚磷酰胺反应：然后，所形成的三价磷中间产物与如上披露的N₃-SO₂-苯-L-M-X反应，其中X是可检测单元。这些合成的中间产物可以贮藏，并如三功能CPG用于一般的3′标记。

三价磷中间产物也在甲基膦酸酯合成过程中形成，甲基膦酸酯可以与本发明的叠氮化物反应。甲基亚磷酰胺也是市场上可买到的。

在用于标准寡核苷酸以及特别是用于类似物、例如用于N3′-＞P5′寡核苷酸合成的反相合成方案(EP 1 155 027)中，也形成了可以根据本发明与本发明的叠氮化物反应的含有三价磷的中间产物。相应亚磷酰胺是市场上可买到的。

使用本发明的标记试剂产生的寡核苷酸

本发明的合成方案允许制备多种在磷酸酯骨架上修饰的寡核苷酸。根据目的用途确定修饰度、修饰的多样性和电荷。

本发明包括至少一次含有以下结构的任何化合物

其中

A代表核苷酸或核苷酸链的5′端，或者OH

B代表核苷酸或核苷酸链的3′端，或者OH

Acc代表-SO₂-苯-L-M-X，其特征在于

M选自-NH-、-O-和-S-，

X是保护基或者可检测单元。

本领域技术人员也应理解，所述寡核苷酸的羟基通常以去质子化状态存在。

此外，本发明还包括以下结构的甲基膦酸酯

根据所述寡核苷酸的目的用途，上述结构可出现一次、两次、多次或甚至在所有存在于所述寡核苷酸的磷酸酯残基上。所述寡核苷酸内的磷酸酯残基是所谓的核苷间磷酸酯，其中

A代表第一核苷的5′端，

B代表所述核苷酸链内第二核苷的3′端。

此外，本发明的结构可以位于寡核苷酸的3′端或5′端。如果它们存在于所述寡核苷酸的5′端，那么

A代表所述核苷酸链的5′端，

B是羟基或可以任选地含有可检测基团或者另一反应基的接头，并且可用于合成所述寡核苷酸上的可检测基团。

如果电子受体含有也代表可检测单元的取代基，那么本发明寡核苷酸以在5′端具有双标记存在。如果本发明的结构位于核苷酸链的3′端，那么

B代表所述寡核苷酸的3′端

A是羟基或者结合于固相的接头，其中所述固相优选为定孔玻璃颗粒，例如用作常规寡核苷酸合成的原料的定孔玻璃颗粒。

本发明的寡核苷酸中各核苷可以含有任何类型的核苷或修饰核苷或核苷衍生物。糖单元通常是DNA寡核苷酸的脱氧核糖或RNA寡核苷酸的核糖。本发明的寡核苷酸中所含的核碱基可以是天然存在的碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞苷、尿苷、其衍生物或所谓的通用碱基例如硝基吲哚。

用本发明的标记试剂标记的寡核苷酸可有利地用于分子生物学中的许多不同应用，例如实时PCR。所述可检测标记优选是荧光染料或荧光淬灭分子。可以用作寡核苷酸的可检测单元的相应染料和分子是本领域技术人员公知的。不限制本发明的保护范围的染料和分子的实例是：荧光素、若丹明、花青、部花青、羰花青和偶氮化合物和多偶氮化合物。

本发明的标记试剂可用于合成具有如上的所述结构的实时PCR探针，其中，至少一个荧光标记通过酰胺/电子受体基团结合于所述寡核苷酸链的磷酸酯原子。所述探针的实例是FRET杂交探针(WO97/46707)或所谓的单标记探针(WO 02/14555)。在这方面，特别优选的是其中在核苷间磷酸酯残基上存在本发明的内部修饰的寡核苷酸探针。

在这方面，本发明的标记试剂特别适用于制备具有两个可检测单元的双标记寡核苷酸。所述探针的实例是TaqMan探针(US 5,804,375)、分子信标(US 5,118,801)。在这方面，本发明涉及双标记寡核苷酸的制备，其中第一荧光标记通过酰胺/电子受体基团结合于所述寡核苷酸链的核苷间磷酸酯原子，第二可检测单元存在于所述寡核苷酸的5′端或3′端。具有所述标记的分子及其制备方法在专家中是公知的。

通过以下实施例更详细地阐明本发明，其保护范围源自于本专利的权利要求书。所述方法应理解为即使在变化后仍然描述本发明的目的的实例。

提供以下实施例来帮助理解本发明，其真实范围在所附权利要求书中列出。应理解在不背离本发明的精神的情况下，可以对列出的方法作出变化。

实施例

实施例1：4-氨基苯磺酰叠氮(根据DE 2919823)

用4,0g(3.4mL)的32％盐酸搅拌2,0g(8mmol)对-乙酰氨基苯磺酰叠氮，并在20分钟内加热至95℃。形成透明溶液。冷却到室温时，盐酸化物沉淀，并通过过滤分离。晶体溶于20ml水，加入饱和碳酸钠溶液，然后用二氯甲烷萃取水相三次。水洗合并有机相，并用硫酸钠干燥。除去溶剂后，在真空中氯化钙上干燥所得的浅红色油过夜，产生1.04g(66％)粗品。

塑料片上TLC二氧化硅(甲苯∶乙酸乙酯∶甲醇＝4∶1∶1)Rf(产物)＝0.63，

实施例2：(2，2，2-三氟-乙酰氨基)-己酰氯

将735mg(3mmol)(2，2，2-三氟-乙酰氨基)-己酸溶于5mL干燥二氯甲烷，并在0℃氩流下搅拌。然后，在0℃滴加0.6mL(6.6mmol)草酰氯，还滴加数滴干燥二甲基甲酰胺，产生气体，先前白色混合物变黄。在室温下搅拌所述混合物70分钟。然后用二氯甲烷重复地蒸发所述混合物。粗品直接用在下一步。

实施例3：4-[6-(2，2，2-三氟-乙酰氨基)-己酰氨基]-苯磺酰叠氮

向溶于5mL二甲基甲酰胺的0.57g(3mmol)的对氨基苯磺酰叠氮加入0.9mL(6mmol)三乙胺，然后滴加溶于10mL二甲基甲酰胺的(2，2，2-三氟-乙酰氨基)-己酰氯。所述混合物转为褐色，并在氩下搅拌24小时。蒸发溶剂，将剩余油溶于10mL二氯甲烷，并置于室温1小时。过滤沉淀，蒸发溶液，产生1.10g粗油。获得的化合物直接用于寡核苷酸合成。

实施例4：合成氨基修饰的寡核苷酸

5′Ap^*GG GAT CTG CTC TTA CAG ATT AGA AGT AGT CCTATT-p

p^*＝p＝N-SO2-Ph-NH-C(＝O)-(CH2)5-NH₂

在ABI 394合成仪上以1μmol规模进行寡核苷酸合成。市场上可买到的磷酸酯CPG(Glen Reserach)用作载体物质。所有其他的用于标准合成的化学试剂获自Glen Research。使用来自Proligo的具有叔丁基苯氧基-乙酰基保护基的亚磷酰胺(已知为″tac″或″Expedite″单体)。

标准流程用于所述合成。仅仅在最后的合成循环中，氧化剂被无水乙睛中的0.1 M 4-[6-(2，2，2-三氟-乙酰氨基)-己酰氨基]-苯磺酰叠氮溶液置换，并将“氧化”时间延长至16分钟。

在55℃用33％氨从所述载体裂解产物，并在Poros Oligo R3 4.6x50mm柱上通过反相色谱法进行纯化。色谱法：缓冲液A：0.1M水中乙酸三乙基铵，pH 6.8，缓冲液B：0.1M水/乙腈1∶1中乙酸三乙基铵，梯度2分钟，在45分钟内从0％B升至100％B。于260纳米测量洗脱剂的UV吸收。获得含有氨基修饰的寡核苷酸的主要部分。在真空离心机上除去溶剂。

MALDI：calc：11436.7实测11435.6

实施例5：用LightCycler Red 640后标记

5′Ap^*GG GAT CTG CTC TTA CAG ATT AGA AGT AGT CCTATT-p

p^*＝p＝N-SO2-Ph-NH-C(＝O)-(CH2)5-NH LC Red 640

将残余物置于1ml 0.1M硼酸钠缓冲液(pH＝8.5)。加入1000μlDMF中1mg LightCycler Red 640 NHS酯(Roche Applied Science)溶液，将混合物保持室温过夜。在如上所述相同的条件下蒸发混合物，并纯化。使用二极管阵列作为检测器，在260nm和625nm进行检测。收集具有双吸收的部分，并真空蒸发。剩余物溶于双蒸(bidest.)水，并再次真空蒸发。然后将残渣溶于双蒸水并冻干。

MALDI：calc：12438.35实测12435.5

实施例6：N-丹磺酰3氨基丙酰氯

将970mg(3mmol)丹磺酰β丙氨酸(alanin)溶于5mL干燥二氯甲烷，并在0℃氩流下搅拌。然后，在0℃滴加0.6mL(6.6mmol)草酰氯，随后，加入数滴干燥的二甲基甲酰胺，产生气体。在室温下搅拌所述混合物100分钟。使用旋转式蒸发器除去溶剂，然后用二氯甲烷蒸发剩余物两次。粗品直接用在下一步。

实施例7：N-丹磺酰(3氨基丙酰基)苯磺酰叠氮

向溶于5mL二甲基甲酰胺的152mg(0.8mmol)的对氨基苯磺酰叠氮加入0.11mL(6mmol)三乙胺，然后滴加溶于10mL二甲基甲酰胺的0.5mmol N-丹磺酰3氨基丙酰氯。所述混合物在氩下搅拌24小时。蒸发溶剂，在二氧化硅上通过色谱法(洗脱液甲苯/乙酸乙酯1∶1)纯化剩余的油。收集含有产物的部分并蒸发溶液。

1H NMR(Bruker DPX 300MHz)：d6 DMSO：2.53 m[2H]，2.82s[6H]，3.12 m[2H]，7.20 m[2H]，7.59 t[1H]，7.62 t[1H]，7.81 d[2H]，7.93 d[2H]，8.07 t[1H]，8.12 d[1H]，8.27 d[1H]，8.44[1H]，10.47 s[1H]，(质子化形式)IR(Nujol)2122 cm-1

Claims

1.一种具有化学结构N₃-SO₂-苯-L-M-X的试剂，其特征在于L是-NH-CO-聚乙二醇或-NH-CO-(CH₂)_n，n为1-18的自然数，

M选自-NH-、-O-和-S-，

X选自DMT、TFA、Fmoc和S-C_1-6-烷基。

2.权利要求1的化合物用于修饰核酸的用途。

3.权利要求2的用途，其中所述核酸为单链寡核苷酸。

4.权利要求2或3的用途，所述用途用于修饰单链寡核苷酸，包括以下步骤：

-使3′亚磷酰胺与初生寡核苷酸链的5′OH端反应，

-与权利要求1的试剂反应。