CN101307103A - 一种***的纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种制备***FSH的方法，其包括步骤：(A)使含有FSH的原料与抗体接触，其中所述原料含有作为杂质的黄体生成激素LH和/或绒毛膜促性腺素CG，并且所述抗体是特异性结合LH和/或CG但基本上不与FSH发生交叉反应的抗体，从而使得所述抗体与LH和/或CG形成抗原－抗体复合物；(B)将形成的抗原－抗体复合物从所述原料中去除，从而获得纯化的FSH。还提供了含有FSH的药物组合物的制备方法。

Description

一种***的纯化方法

技术领域

本发明涉及蛋白质纯化和生物医药领域。具体而言，本发明涉及***(FSH)的纯化方法，以及含有它的药物组合物。

背景技术

***(Follicle-stimulating hormone，简称FSH)是由垂体产生的激素，它由α链和β链两个亚基组成。FSH的α亚基与黄体生成激素(leuteinizinghormone，简称LH)和绒毛膜促性腺素(chorionic gonadotropin，简称CG)的α亚基完全相同，具有92个氨基酸，分子量约为14500D，第52和78位置上的天冬酰胺是发生N-糖基化的氨基酸。

FSH的β亚基由111个氨基酸组成，分子量约为18000D，其中第7和24位置上的天冬酰胺是发生N-糖基化的氨基酸。而LH的β亚基由121个氨基酸组成，分子量约为14800D；CG的β亚基则有145个氨基酸，分子量22000-39000D。

临床上FSH主要用于治疗不育症以及体外的辅助生殖。FSH可以从垂体或绝经期妇女的尿液中提取出来，也可通过DNA重组技术而制备。

含有FSH的第一代产品是尿促性素(HMG)，如Serono公司的Pergonal，它是FSH与LH比例约为1的混合物。但是，对于体内有较多量的LH而不需加用外源性LH的患者，LH水平过高会影响卵泡的正常发育，不合时机的抑制减数***抑制因子会导致卵子的老化，从而降低受精和着床的机会。因此对这部分患者而言，更适合于使用纯FSH制剂。另一方面，过多的LH容易导致多囊卵巢综合症(Polycystic Ovarian Syndrome，POOS)，研究表明，LH过多对生殖功能有不利的作用，如引起月经稀发、无***、***及流产。因此对POOS患者用纯FSH治疗比HMG更为安全，可减少卵巢过度刺激综合症(OvarianHyperstimulation Syndrome，OHSS)危险。

由于上文所述的原因，本领域迫切需要开发出完全不含LH活性的FSH制剂，以满足患者的治疗所需。

Serono公司推出的Metrodin是一种含有极少量LH的FSH制剂，其后的Metrodin-HP则是高纯度的FSH制剂。

另外，近年来市场上也开发出一种高纯度的尿促性素(pHMG)，如Ferring公司的Menopur，它是将纯化后的高纯度FSH与高纯度LH或者是高纯度hCG(人绒毛膜***，human chorionic gonadotropin)按1∶1的比例调配而成的产品，主要用于替代普通的HMG产品，并克服普通HMG产品中因大量杂蛋白而造成的对人体的过敏反应。

美国专利号3,674,865描述了从尿提取物中纯化FSH的方法，该方法总共包括21个不同步骤，得到是FSH和LH的混合物，FSH和LH比例在3∶1～6∶1之间。其纯化工艺较为复杂，且所得FSH的比例也较低。

美国专利号6,162,905描述了用离子交换层析、染料层析等多步方法纯化FSH的方法，但其FSH与LH的免疫效价之比最高也只有313∶1，其中还是有少量的LH存在。

近年来，通过免疫反应纯化目标物的手段已渐趋成熟。免疫反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应，两者之所以能够进行特异性结合是基于两种分子间的结构互补性与亲和性，这两种特性是由抗原与抗体分子的一级结构决定的。抗体是由人或动物体内产生的一种球蛋白，一般由4条肽链组成，可通过链内二硫键折叠成若干球形功能区，其中的超变区与相应抗原的表位在空间结构上呈专一性互补关系，如同钥匙和锁的关系，因而两者可发生专一性的结合反应。

在专利WO98/20039中，描述了用抗FSH的单克隆抗体免疫层析法以及反相HPLC法来纯化FSH，但由于其免疫层析是吸附洗脱过程，洗脱剂是pH 11的1M氨水，洗脱时容易造成FSH的失活以及单克隆抗体的脱落，对产品存在一定的影响。

为此，本领域迫切需要开发出一种可用于简单、高效地纯化FSH的方法，并由此获得几乎不含LH活性的FSH制剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单高效的FSH纯化方法，并通过该方法获得几乎不含LH活性的FSH产品。

在本发明的第一方面中，提供了一种制备***FSH的方法，所述方法包括以下步骤：

(A)使含有FSH的原料与抗体接触，其中所述原料含有作为杂质的黄体生成激素LH和/或绒毛膜促性腺素CG，并且所述抗体是特异性地与LH和/或CG结合，从而使得所述抗体与LH和/或CG形成抗原-抗体复合物；

(B)将形成的抗原-抗体复合物从所述原料中去除，从而获得纯化的FSH。

在一个实施方式中，所述抗体是抗LH的抗体和/或抗CG的抗体。

在另一个实施方式中，所述***是人***或其变体。

在另一个实施方式中，所述人***或其变体是人尿来源的***或是重组的人***。

在另一个实施方式中，所述的抗LH的抗体是能与LH或LH β亚基或它们的变体发生免疫反应的抗体，包括抗人LH或其变体的抗体，抗人LH β亚基或其变体的抗体，抗动物LH或其变体的抗体，抗动物LH β亚基或其变体的抗体。

在另一个实施方式中，所述的抗LH的抗体包括使用多克隆抗体技术、单克隆抗体技术、或DNA重组技术制备的抗LH的抗体。

在另一个实施方式中，所述的抗LH的抗体包括：含有抗LH抗体的混合物、或纯化过的抗LH抗体。

在另一个实施方式中，所述的含有抗LH抗体的混合物包括：含有抗LH抗体的动物血清、动物腹水、或细胞培养液。

在一个优选例中，所述的纯化过的抗LH抗体包括：将含有抗LH抗体的动物血清、动物腹水、或细胞培养液进行纯化后的产物。

在另一个实施方式中，所述的抗CG的抗体是能与CG或CG β亚基或它们的变体发生免疫反应的抗体，包括抗人CG或其变体的抗体，抗人CG β亚基或其变体的抗体，抗动物CG或其变体的抗体，抗动物CG β亚基或其变体的抗体。

在另一个实施方式中，所述的抗CG的抗体包括：使用多克隆抗体技术、单克隆抗体技术、或DNA重组技术制备的抗CG的抗体。

在另一个实施方式中，所述的抗CG的抗体包括：含有抗CG抗体的混合物、或纯化过的抗CG抗体。

在一个优选例中，所述的含有抗CG抗体的混合物包括：含有抗CG抗体的动物血清、动物腹水或细胞培养液。

在一个优选例中，所述的纯化过的抗CG抗体包括：将含有抗CG抗体的动物血清、动物腹水或细胞培养液进行纯化后的产物。

在另一个实施方式中，所述的纯化过程包括使用免疫沉淀法和免疫层析法进行纯化。

在另一个实施方式中，所述的***中，FSH与LH的生物效价比例不低于100∶1；优选所述的***中，FSH与LH的免疫效价的比例不低于1000∶1；更优选所述的***中，FSH与LH的免疫效价的比例不低于10000∶1。

在本发明的第二方面中，提供一种含FSH的药物组合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(A)使含有FSH的原料与抗体接触，其中所述原料含有作为杂质的黄体生成激素LH和/或绒毛膜促性腺素CG，并且所述抗体是特异性结合LH和/或CG但基本上不与FSH发生交叉反应的抗体，从而使得所述抗体与LH和/或CG形成抗原-抗体复合物；

(B)将形成的抗原-抗体复合物从所述原料中去除，从而获得纯化的FSH；

(C)将治疗有效量的步骤(B)中制得的纯化的FSH、药学上可接受的载体、和任选的其它活性成分配制在一起，从而形成所述的药物组合物。

在一个优选例中，所述纯化的FSH的含量为所述药物组合物总重量的0.001-99.9重量％；优选0.01-99重量％，更优选0.02-95重量％。

在另一个优选例中，所述药物组合物不含LH。

在另一优选例中，步骤(C)中的其它活性成分选自：LH、和\或hCG。

在一个优选例中，所述药物组合物还包含纯化的LH，其中FSH与LH的生物效价比为0.01-100∶1，优选0.1-10∶1，更优选1-5∶1。

在另一优选例中，所述药物组合物是尿促性素(HMG)或高纯度尿促性素(pHMG)。

在另一优选例中，所述药物组合物为高纯度pHMG，其包含按所需比例混合的纯化的FSH和高纯度LH。所述纯化的FSH和高纯度LH的重量比为10∶1-1∶10，优选5∶1-1∶5，更优选1∶1。

此外在本发明提供的制备***FSH的方法中，所述的LH和/或CG是哺乳动物的LH和/或CG。

在一个优选例中，所述哺乳动物为人。

在另一实施方式中，所述抗体选自下组：

(a)抗LH β亚基的抗体；

(b)抗CG β亚基的抗体；和/或

(c)它们的组合。

在另一个优选例中，所述的抗LH β亚基或抗CG β亚基的抗体选自：抗hCG单克隆抗体(例如可购自AntibodyShop的Monoclonal anti-βhcgHYB-093-05或Sigma的Monoclonal anti-βhcg C7659)、抗LH单克隆抗体(例如可购自Thermo Fisher的MS-1448-PABX)。

在另一优选例中，所述的抗体是采用多克隆抗体技术、单克隆抗体技术或DNA重组技术制备的。

在另一优选例中，所述的抗体为包含抗LH和/或CG β亚基的抗体的混合物或经纯化的抗LH和/或CG β亚基的抗体。

在另一实施方式中，所述的抗体包括：单克隆抗体以及含有抗体的抗血清、动物腹水或细胞培养液。

在一个优选例中，所述抗体的纯化是通过盐析、层析等常规纯化方法进行的。

在另一实施方式中，其中所述的纯化方法为免疫沉淀法或亲和层析法。

在另一优选例中，可对纯化过程中分离的LH和/或CG进行进一步的纯化和利用。

在另一实施方式中，所述含有FSH的原料选自：未经任何预纯化步骤的原料、经预纯化步骤去除了部分杂质的原料、或经预纯化步骤而基本上只含LH和/或CG的原料。

在另一实施方式中，所述纯化的FSH的比活为不低于500IU/mg蛋白。

在一个优选例中，所述的纯化的FSH的比活为500-15000IU/mg，优选600-12000IU/mg蛋白，更优选为700-10000IU/mg蛋白，最优选为750-8000IU/mg蛋白。

本发明还提供了一种抗体在从含有FSH的原料制备FSH中的用途，所述原料含有作为杂质的LH和/或CG，所述抗体特异性结合LH和/或CG但基本上不与FSH发生交叉反应。

在一个优选例中，所述抗体选自下组：

(a)抗LH β亚基的抗体；

(b)抗CG β亚基的抗体；和/或

(c)它们的组合。

本发明的纯化方法条件温和、操作简便、FSH得率高、纯度高和效价高。

附图说明

图1为hCG的蛋白质结构示意图。

图2为LH的蛋白质结构示意图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，惊奇地发现可通过免疫纯化法，利用抗LH或CG的β亚基的抗体去除FSH中的杂质LH和/或CG，从而在温和条件下简单而高效地获得高纯度、高效价的FSH纯化产物。在此基础上，发明人完成了本发明。

具体而言，如背景技术部分中所述，现有技术中采用了抗FSH的抗体结合FSH来纯化FSH。但该方法在洗脱时易于造成FSH失活和抗体的脱落，从而影响了纯化效果。

在探索改进现有技术方法的过程中，本发明人注意到FSH、LH和CG具有如下的特点：它们的α亚基完全相同，而β亚基却有各自的结构。其中，FSH的β亚基与LH和CG的β亚基分子结构差异较大，因此抗LH和/或CG的β亚基的抗体基本上与FSH不发生交叉反应。

而LH和CG的β亚基在分子结构上有较大的相似性，CG的β亚基只比LH的β亚基多24个氨基酸，且这24个氨基酸未参与链内二硫键的结合，因此在空间结构上两者很接近(见图1和图2)，所以一些抗体对这两者有一定的交叉反应。因此，使用抗LH的抗体，或者使用对LH有交叉反应性的抗CG抗体都可以与LH发生免疫结合，从而达到高效去除LH并同时去除可能存在的CG的目的。

本发明采用的免疫纯化法，正是利用了抗LH或CG的β亚基的抗体能与目标物中的LH(或CG)发生专一性结合反应这一特性，既保证了LH(或CG)的高效去除，又保证纯化条件温和而不破坏FSH的活性。

因此，本发明采用针对杂质LH和CG的抗体，通过形成杂质-抗体结合物的方法去除FSH中的杂质，达到了纯化FSH的目的。同时发明人还惊喜地发现本发明的纯化方法具有纯化条件温和、操作简便、FSH得率高、纯度高和效价高等优点。

FSH、LH和CG

如本发明所用，术语“***”和“FSH”可互换使用，指一类用于促进***或卵泡产生、促进卵巢发育的激素或其变体，其可在天然情况下由垂体前叶分泌，可从绝经期妇女的尿液中提取或可通过重组技术获得的。所述FSH与天然FSH具有相同或类似的结构与功能。

本发明中所用的原料FSH可采用本领域常用的任何方式获得，例如天然产生、通过重组技术获得或合成，其中含有作为杂质的LH或CG。在本发明的一个实施方式中，所述***是人***或其变体，优选人尿来源的***或是重组的人***。

可用于本发明中的含有FSH且包含作为杂质的LH和/或CG的原料可为：未经任何预纯化步骤的原料、经预纯化步骤去除了部分杂质的原料、或经预纯化步骤而基本上只含FSH和杂质LH和/或CG的原料。

优选在采用本发明的方法纯化FSH前，采用本领域常规方法对原料FSH进行初步纯化，以分离除LH或CG以外的其它杂质。

如本文所用，术语“黄体生成激素”和“LH”可互换使用，指在含有FSH的原料制备或获取过程中掺杂于其中的与天然LH具有相同或相似结构和功能的激素。

类似地，术语“绒毛膜***”和“CG”可互换使用，指在含有FSH的原料制备或获取过程中掺杂于其中的与天然CG具有相同或相似结构和功能的激素。

抗LH和/或CG β亚基的抗体

如本文所用，术语“抗LH和/或CG β亚基的抗体”和“抗LH和/或CG的抗体”是指可与LH和/或CG的β亚基发生免疫结合反应，但基本上不与FSH发生免疫交叉反应或与FSH发生免疫反应的能力远低于其与LH和/或CG反应的能力的抗体。此处所用术语“远低于”是指以抗原抗体的亲和力或交叉反应率来表示，所述抗体与FSH发生免疫反应的能力为其与LH和/或CG发生免疫反应能力的1/10以下，优选1/100以下。

本发明过程中使用的抗体优选为哺乳动物抗体，更优选为抗人LH或其变体的抗体，或抗人CG或其变体的抗体。术语“变体”是指氨基酸序列与人LH或CG相比有一定差异，但仍具有与人LH或CG相同或类似结构和/或功能的蛋白质。

本发明所使用的抗体可以通过常规技术获得，例如采用多克隆抗体技术、单克隆抗体技术或重组DNA技术，或通过市售获得。用于本发明中的抗体可为现有技术文献中所记载的那些抗体，例如Schwarz，S的The antigenic surfaceof human chorionic gonadotropin as mapped by murine monoclonalantibodies(《通过鼠单克隆抗体作图的人绒毛膜促性腺素的抗原性表面》，Endocrinology，1986，118：189-97)中所记载的那些抗体。用于本发明中的抗体也可为通过市售购得的抗LH或CG抗体。

在本发明的优选实施方式中，所述抗体选自：抗hCG单克隆抗体(例如可购自AntibodyShop的Monoclonal anti-βhcg HYB-093-05或Sigma的Monoclonal anti-βhcg C7659)、抗LH单克隆抗体(例如可购自Thermo Fisher的MS-1448-PABX)。也可通过本领域已知的单克隆抗体技术获得表达所述单克隆抗体的细胞株。

可将直接使用所述抗体或可通过盐析、层析等常规方法进行纯化后用于本发明方法中。

在本发明的一个实施方式中，可采用以下形式的抗体：抗LH和/或CG β亚基的单克隆抗体、含有抗LH和/或CG β亚基抗体的动物血清、动物腹水、细胞培养液或它们的纯化产物。

FSH的免疫纯化方法

在本发明中，可采用多种抗体免疫纯化方法，包括例如：免疫沉淀法和免疫层析法。

免疫沉淀法是指待纯化样品中的抗原、抗体在均相***中发生结合反应产生沉淀，然后通过离心、过滤或其它方法将抗原-抗体复合物分离，以达到纯化效果。

免疫层析法是近来发展出来的一种纯化方法，它是将抗体固定化到层析树脂上，然后将待纯化样品上样至该树脂上，使得其中的抗原被结合在固定化的抗体上，从而达到将抗原和目标物分离的效果，或者用适当的洗脱液进行洗脱收集抗原从而达到纯化抗原的效果。抗体可以通过常规的方法固定化到层析树脂(如琼脂糖)上，例如通过二乙烯基砜或溴化氢活化结合等方法。

本发明采用了使杂质(LH、CG)与抗体发生免疫反应，从而将杂质从所需产物(FSH)中分离出的方法，以温和的反应条件实现了FSH的高效纯化。在本发明的优选实施方式中，所述层析是用pH 7.0的温和层析液(0.1M Tris-HCl，0.2M NaCl)进行的，确保了所得FSH的高活性。

经免疫纯化后的产物随后可通过乙醇沉淀、真空干燥或冷冻干燥，或进行进一步的纯化，获得高纯度的FSH产品以及其制剂形式。

药物组合物

本发明还提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有治疗有效量的用本发明方法制备的高纯度FSH，以及药学上可接受的载体。

如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。如本文所用，术语“治疗有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，术语“药学上可接受的”或“食品学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和***反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。

所述的“药学上可接受的载体”可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、pH缓冲物质等。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

在本发明的优选实施方式中，所述药物组合物中的FSH占组合物总重量的0.001～99.9wt％；优选为组合物总重量的0.01～99wt％，较优选为0.02～95wt％，更优选0.05～90wt％。余量为药学上可接受的载体以及其它添加剂等物质。

如本文所用，术语“单位剂型”是指为了服用方便，将本发明的组合物制备成单次施用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂、胶囊剂、缓释剂、粉针剂。在本发明的另一优选实施方式中，所述组合物为单位剂型或多剂型，且其中FSH的含量为0.001～2000mg/剂，优选0.003-500mg/剂，更优选0.005-50mg/剂。在本发明的另一个优选例中，每天施用1～6剂本发明的组合物，优选施用1～3剂；最优选的，每天施用的剂量为1剂。

应理解，所用FSH的有效剂量可随待施用或治疗的对象的严重程度而变化。具体情况根据对象的个体情况(例如对象体重、年龄、身体状况、所需达到的效果)来决定，这在熟练医师或营养师可以判断的范围内。

本发明的药物组合物，可以为固态(如颗粒剂、片剂、冻干粉、栓剂、胶囊、舌下含片)或液态(如口服液、水针剂)或其它合适的形状。

高纯度尿促性素(pHMG)

在本发明的一个实施方式中，所述药物组合物是尿促性素(HMG)或高纯度尿促性素(pHMG)，更优选为pHMG。

所述pHMG是通过将高纯度LH与本发明的高纯度FSH按比例进行调配而制得的。

其中，所述纯化的FSH和高纯度LH的重量比为10∶1-1∶10，优选5∶1-1∶5，更优选1∶1。

施用方式

本发明的组合物可以通过常规途径施用，其中包括(但并不限于)：口服、肌注、皮下注射等。优选皮下注射施用。组合物形式应与施用方式相匹配。本发明组合物的施用量，按活性物质计算，通常为每天约0.00001-400mg/kg体重，较佳地约0.00006～10mg/kg体重，更优选为0.0001～1mg/kg体重。

本发明的组合物可直接使用，也可与其它治疗剂或辅剂联合使用。在本发明的优选实施方式中，本发明的组合物还可与有效量(如0.005-1000mg/kg体重/天)的选自下组的物质联合施用：hCG、黄体激素释放激素(LHRH)类似物。

当两种或两种以上的药物联合给药时，一般具有优于两种药物分别单独给药的效果。优选地，联合施用的药物或其它制剂不干扰本发明FSH有效成分的治疗活性。

本发明的优点

本发明的优点在于：

(1)提供了一种可简单而高效地去除含有FSH的原料中LH和/或CG杂质的方法，该方法成本低、步骤简便、条件温和，适合于工业化生成高纯度FSH；

(2)本发明方法获得的FSH得率高、纯度高且活性高，适用于制备含高纯度FSH的药物组合物。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件、或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

含FSH的原料

在本实施例中，将HMG(购自上海天伟生物制药有限公司)用作含FSH的原料，其中FSH的生物效价为521IU/mg，LH的生物效价为483IU/mg。

纯化方法

取10mL琼脂糖4B(购自GE Amersham)，用二乙烯基砜活化好后，悬浮于10mL 0.5M碳酸钠溶液中，加入10mL含有抗hCG单克隆抗体的溶液(购自AntibodyShop，HYB-093-05，1mg/mL)，使得抗体结合到活化的树脂上，从而得到免疫树脂。

将10mL免疫树脂抗hCG-琼脂糖装入层析柱，用平衡液(0.05M Tris-HCl，0.2M NaCl，pH 7.2)平衡。

将35mg HMG(其中FSH的生物效价为521IU/mg，LH的生物效价为483IU/mg)用10mL上述平衡液溶解，然后上样至免疫层析柱上，上样结束后用平衡液洗涤(2倍柱体积)，收集流出液共约20mL(直接用于免疫效价的测定中)，边搅拌边加入5倍体积的-10℃无水乙醇，离心收集沉淀，用无水乙醇脱水，真空干燥得30mg干燥品(直接用于生物效价的测定中)。

免疫效价的测定方法及其结果

采用双抗体夹心法(ABBOTT AXSYM，FSH和LH免疫测定试剂盒)，按照厂商说明书指示来测定所得样品的免疫效价。测定结果如表1所示：

表1.免疫层析收集液的免疫效价

生物效价的测定方法及其结果

生物效价的测定方法按中国药典2005版附录XII M、XII N的方法检验。比活测定中的蛋白质含量测定按Lowry法测定。

表2.免疫层析所得干燥品的生物效价

组分	FSH单位效价(IU/mg)	FSH比活(IU/mg蛋白)	LH单位效价(IU/mg)	FSH/LH
					含FSH的原料	521	742	483	1.1
经过免疫层析步骤的干燥品	536	763	＜5	＞100

上述结果表明：采用本发明的方法进行纯化，可去除HMG中绝大部分的LH，使得FSH的纯度大大提高。

实施例2.

含FSH的原料

在本实施例中，将HMG(购自上海天伟生物制药有限公司)用作含FSH的原料，其中FSH的生物效价为2251IU/mg，LH的生物效价为437IU/mg，FSH与LH的生物效价比例为5∶1。

纯化方法

取10mL琼脂糖4B(购自GE Amersham)，用溴化氢活化好后，悬浮于10mL0.1M碳酸氢钠溶液(pH8.5)中，加入10mL含有抗LH单克隆抗体的溶液(购自Thermo Fisher，MS-1448-PABX，1mg/mL)，调pH约8.5，使得其中的抗体结合到活化的树脂上，从而得到免疫树脂。

将10mL免疫树脂抗LH-琼脂糖装入层析柱，用平衡液(0.05M Tris-HCl，0.2M NaCl，pH 7.2)平衡。

将25mg HMG(其中FSH的生物效价为2251IU/mg，LH的生物效价为437IU/mg)用10mL上述平衡液溶解，然后上样至免疫层析柱上。上样结束后用平衡液洗涤(2倍柱体积)，收集流出液共约20mL(直接用于免疫效价的测定中)，边搅拌边加入5倍体积的-10℃无水乙醇，离心收集沉淀，用无水乙醇脱水，真空干燥得20mg干燥品。

免疫效价的测定方法及其结果

采用实施例1所用测定方法来测定所得收集液的免疫效价。测定结果如表3所示：

表3.免疫层析中收集的流出液的免疫效价

上述结果表明：采用本发明的方法进行纯化，可去除HMG中绝大部分的LH，使得FSH的纯度大大提高。

实施例3.高纯度尿促性素(pHMG)的制备方法

配制100mL 0.01M磷酸二氢钠溶液(用NaOH调整pH至约6.5)，加入4g乳糖，搅拌溶解后，用0.22μm过滤器过滤。取15mL滤过液，加入实施例2中获得的FSH干燥品10mg，再加入5mg高纯度LH(LH效价4592IU/mg，购自上海天伟生物制药有限公司)，完全溶解后，进行真空冷冻干燥，得570mg高纯度HMG(含乳糖作为赋性剂)。测得其FSH比活为2358IU/mg蛋白，LH比活为2114IU/mg蛋白。

实施例4.FSH冻干针剂的制备

用于制造10000瓶FSH冻干针剂，且每瓶含75IU FSH的生产的典型例子如下：

计算出的一定量(以生物效价为单位)的FSH精品溶解于50mL注射用无热原水中，如果需要的话，用HCl或NaOH调节pH 6.5±0.2，然后用0.22μm过滤器进行无菌过滤。

将100g乳糖溶解于2L注射用无热原水中，如果需要的话，用HCl或NaOH调节pH 6.5±0.2，用0.22μm过滤器进行无菌过滤。然后加入到上述FSH溶液中，用注射用无热原水定容至7.5L，混匀。

将上述溶液分装入安瓿瓶中，每瓶0.75mL，进行冷冻干燥。

所得到的安瓿瓶中，每瓶含75IU FSH和10mg乳糖。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (17)

1.一种制备***FSH的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(A)使含有FSH的原料与抗体接触，其中所述原料含有作为杂质的黄体生成激素LH和/或绒毛膜促性腺素CG，并且所述抗体特异性地与LH和/或CG结合，从而使得所述抗体与LH和/或CG形成抗原-抗体复合物；

(B)将形成的抗原-抗体复合物从所述原料中去除，从而获得纯化的FSH。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗体是抗LH抗体和/或抗CG抗体。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述***是人***或其变体。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述人***或其变体是人尿来源的***或是重组的人***。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的抗LH抗体是能与LH或LH β亚基或它们的变体发生免疫反应的抗体，包括抗人LH或其变体的抗体，抗人LH β亚基或其变体的抗体，抗动物LH或其变体的抗体，抗动物LHβ亚基或其变体的抗体。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的抗LH抗体包括使用多克隆抗体技术、单克隆抗体技术、或DNA重组技术制备的抗LH抗体。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的抗LH抗体包括：含有抗LH抗体的混合物、或纯化过的抗LH抗体。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的含有抗LH抗体的混合物包括：含有抗LH抗体的动物血清、动物腹水、或细胞培养液。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的纯化过的抗LH抗体包括：将含有抗LH抗体的动物血清、动物腹水、或细胞培养液进行纯化后的产物。

10.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的抗CG抗体是能与CG或CG β亚基或它们的变体发生免疫反应的抗体，包括抗人CG或其变体的抗体，抗人CG β亚基或其变体的抗体，抗动物CG或其变体的抗体，抗动物CGβ亚基或其变体的抗体。

11.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的抗CG抗体包括：使用多克隆抗体技术、单克隆抗体技术、或DNA重组技术制备的抗CG抗体。

12.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的抗CG抗体包括：含有抗CG抗体的混合物、或纯化过的抗CG抗体。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的含有抗CG抗体的混合物包括：含有抗CG抗体的动物血清、动物腹水或细胞培养液。

14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的纯化过的抗CG抗体包括：将含有抗CG抗体的动物血清、动物腹水或细胞培养液进行纯化后的产物。

15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的纯化过程包括使用免疫沉淀法和免疫层析法进行纯化。

16.如权利要求1～15中任一项所述的方法，其特征在于，所述的***中，FSH与LH的生物效价比例不低于100∶1；优选所述的***中，FSH与LH的免疫效价的比例不低于1000∶1；更优选所述的***中，FSH与LH的免疫效价的比例不低于10000∶1。

17.一种含FSH的药物组合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(A)使含有FSH的原料与抗体接触，其中所述原料含有作为杂质的黄体生成激素LH和/或绒毛膜促性腺素CG，并且所述抗体是特异性结合LH和/或CG但基本上不与FSH发生交叉反应的抗体，从而使得所述抗体与LH和/或CG形成抗原-抗体复合物；

(B)将形成的抗原-抗体复合物从所述原料中去除，从而获得纯化的FSH；

(C)将治疗有效量的步骤(B)中制得的纯化的FSH、药学上可接受的载体、和任选的其它活性成分配制在一起，从而形成所述的药物组合物。

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