CN101304759A - 使用模式识别的受体-配体:脂质复合物的疫苗 - Google Patents
使用模式识别的受体-配体:脂质复合物的疫苗 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101304759A CN101304759A CNA2004800237863A CN200480023786A CN101304759A CN 101304759 A CN101304759 A CN 101304759A CN A2004800237863 A CNA2004800237863 A CN A2004800237863A CN 200480023786 A CN200480023786 A CN 200480023786A CN 101304759 A CN101304759 A CN 101304759A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tlr
- compositions
- liposome
- cell
- antigen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
- A61K2039/543—Mucosal route intranasal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明涉及用于免疫激活的疫苗和方法,所述疫苗和方法能有效引发哺乳动物的全身性、非抗原特异性免疫应答和强烈的抗原特异性免疫应答。该方法在保护哺乳动物免患疾病中特别有效,所述疾病包括癌症、过敏性炎症相关疾病、感染性疾病或与自身抗原的有害活性相关的疾病。本发明也披露了用于这种方法的治疗性组合物。
Description
本发明的合同起源
本发明部分受到国家卫生研究院(National Institutes of Health)资助的NIH基金号CA 86224-02的支持。政府对本发明享有一定权利。
相关申请
本申请要求2003年7月14日提交的美国专利申请系列号10/621,254的优先权,该申请全文纳入作为参考。
背景技术
技术领域
本发明涉及引发哺乳动物的全身性、非特异性(即,非抗原特异性的)免疫应答以及抗原特异性免疫应答(二者均用于免疫接种方案)与引发血管生成和纤维生成的组合物和方法。更具体地说,本发明涉及使用脂质体-toll样受体的配体复合物引发哺乳动物免疫应答的组合物和方法。
现有技术描述
对于用水卫生,通过疫苗接种来预防感染性疾病是最有效、成本效益好与实用的疾病预防方法。没有其它用药方案、即使是抗生素对死亡率降低和人口增长具有这种优异的作用。疫苗接种对全世界人民健康的影响不言而喻。疫苗接种至少在全球的一部分控制了以下9种主要疾病:天花、白喉、破伤风、黄热病、百日咳、脊髓灰质炎、麻疹、腮腺炎和风疹。疫苗的效力取决于其引发的概述于下文的保护性免疫应答的能力。
免疫应答是一种识别外来病原体的极其复杂极有价值的自我平衡机制。对外来病原体的最初应答称为“天然免疫力”,其特征是天然杀伤细胞、巨噬细胞、中性白细胞和其它白细胞快速迁移至外来病原体的(入侵)位。这些细胞能在短时间内吞噬、消化、裂解病原体或分泌能裂解病原体的细胞因子。天然免疫应答不是抗原特异性的通常认为构成了抵御外来病原体的第一道防线直至“适应性免疫应答”产生。T细胞和B细胞参与适应性免疫应答。适应性免疫应答的产生涉及各种机理。对所有产生适应性免疫应答的可能机理的讨论超出本章节的范围;然而,有一些机理已得到良好描述,包括B细胞识别抗原然后激活分泌抗原特异性抗体以及通过与抗原呈递细胞结合而激活T细胞。
B细胞识别涉及抗原与B细胞的表面免疫球蛋白受体结合,所述抗原例如有细菌细胞壁、细菌毒素或在病毒膜上发现的糖蛋白。与受体的结合将某种信号递送至B细胞内部。这是本领域通常所称的“第一信号”。在一些情况中,仅需要一种信号即可激活B细胞。这些能激活B细胞而不依赖T细胞辅助的抗原通常称为T非依赖性抗原(或胸腺不依赖性抗原)。其它情况需要“第二信号”这通常是由T辅助细胞与B细胞的结合而提供。当B细胞受某特定抗原的激活需要T细胞辅助时,该抗原称为T依赖性抗原(或胸腺依赖性抗原)。除了与B细胞的表面受体结合以外,抗原也可被B细胞内化摄入,然后在B细胞内消化为较小的片段并呈递至B细胞表面的抗原肽-MHC II类分子中。这些肽-MHC II类分子被T辅助细胞所识别,该T辅助细胞与B细胞结合来提供一些抗原所需的“第二信号”。一旦B细胞被激活,B细胞就开始分泌抵御该抗原的抗体并最终导致该抗原灭活。另一种激活B细胞的途径是通过与***和脾脏生发中心内的滤泡树突状细胞(FDC)接触。滤泡树突状细胞捕捉循环流经***和脾脏的抗原-抗体(Ag-Ab)复合物并将此复合物呈递至B细胞而激活它们。
对抗原的适应性免疫应答的另一种已清楚鉴定的机理是通过与抗原呈递细胞(例如,巨噬细胞和树突状细胞)结合来激活T细胞。巨噬细胞和树突状细胞是强有力的抗原呈递细胞。巨噬细胞具有识别微生物组分的各种受体,例如巨噬细胞的甘露糖受体和清除受体。这些受体能结合微生物,巨噬细胞吞噬这些微生物并在内体和溶酶体中将其降解。一些微生物以此种方式直接被破坏。其它微生物被消化成小肽转移至巨噬细胞表面的MHC II类-肽复合物呈递给T细胞。结合了这些复合物的T细胞被激活。树突状细胞也是强有力的抗原呈递细胞能呈递肽-MHC I类分子和肽-MHC II类分子而激活T细胞。
当B细胞与某新抗原结合时,诱导B细胞进入称为“同种型转换”的发育途径。在该发育变化期间,浆细胞从产生普通的IgM型抗体转变成为产生高度特异性的IgG型抗体。在浆细胞群中,一些细胞在称为“克隆扩增”的过程中反复***。这些细胞成熟后变成将免疫球蛋白释放入血液的抗体工厂。完全成熟后,它们变为每秒能释放约2,000个相同抗体分子直至死亡的浆细胞,死亡一般在达到成熟后的2或3天内。该克隆组中的其它细胞从不产生抗体,而成为记忆细胞,在遇到抗原后可识别并特异性结合抗原。
抗原初次攻击后,产生了许多与初始B细胞或亲代细胞相同的细胞,每种细胞能以相同于初始B细胞的方式对该抗原产生应答。因此,如果该抗原第二次出现,它会马上遇到已修正的一个B细胞,这些B细胞已经程序变化为特异性IgG抗体B细胞,免疫应答将立刻开始、更快加速、特异性更强并产生更多数量的抗体。该应答称为是继发性应答或记忆应答。由于记忆细胞可存活数月或数年,也由于引入的外来物质有时量虽极少但足够持久激发低水平的免疫应答,这种免疫力可维持数年。这样,记忆细胞可定期得到补充。
首次接触抗原后,抗体应答产生往往滞后并且产生的抗体量少,即,基础应答。第二次接触相同抗原后,应答(即,继发性应答)更快且强度更高,藉此实现与再次感染致病性微生物后的加速继发性应答相同的免疫状态,这正是疫苗接种所寻求的目的。
分类学上的活性疫苗一般分为两类:亚单位疫苗和全生物体疫苗。亚单位疫苗从全生物体的成分制备并且通常开发来避免使用活的微生物而可能导致疾病或者避免全生物体疫苗中存在的有毒成分。使用b型流感嗜血杆菌(H.influenza)作为抗该微生物导致人脑膜炎的疫苗是抗原组分疫苗的例子。另一方面,全微生物疫苗可采用整个微生物。该微生物是死的还是活的(通常是减毒的)取决于要引发的保护性免疫。例如,白喉疫苗是用甲醛处理百日咳杆菌(Bordetella pertussis)细胞制备的死的全细胞疫苗。然而,因为灭活方法经常破坏或改变许多诱导宿主特异性抗体所需的表面抗原决定簇,使用处死的细胞通常伴有免疫原性丧失。
与死疫苗截然相反的是,活减毒疫苗与自然感染相似,由活生物体组成,这些生物体是良性的但通常可在宿主组织中复制并且估计可表达许多天然的靶免疫原,这些免疫原经过加工并呈递至免疫***。这种相互作用引发的保护性应答就如同免疫接种的个体此前接触过该疾病那样。理想的这些减毒微生物应完整保留诱导特异性抗体所需的细胞表面成分而不会导致疾病,这是因为,例如它们不能产生毒力因子、生长太慢或在宿主中根本不能生长。此外,这些减毒株应该基本上不能回复至有毒力的野生型菌株。
经典的疫苗理论表明用非致死性或减毒病原体预防性接种能提供具有保护作用的免疫应答,可抵御随后遭遇相同或类似病原体的感染。这种方法对病毒可行,对抗原数量有限的细菌稍差一些。然而,该方法对表达无限数量的抗原的肿瘤细胞行不通。此外,与经典免疫方案不同,抗癌疫苗诱导的免疫应答必需在接触抗原之后而非之前。如果抗癌疫苗想获得成功,它们必须诱导能根治现存疾病的免疫应答,这需要更加了解肿瘤抗原的性质以及宿主-肿瘤的相互作用。最新的疫苗构思(例如基因疫苗)致力于细胞免疫的诱导。
基因疫苗含有编码待产生的免疫应答的抗原的DNA序列。对要产生的抗原特异性免疫应答的基因疫苗而言,感兴趣的基因必须表达于哺乳动物宿主中。通过使用在疫苗接种患者中表达感兴趣外来基因并能诱导针对所编码蛋白的免疫应答的病毒载体(例如,腺病毒、痘病毒)而实现了基因表达。或者,可使用编码外来基因的质粒DNA来诱导免疫应答。这些称为“裸”DNA疫苗的基本施用途径是肌肉内或皮下。病毒载体***比裸DNA***能诱导更佳的免疫应答已普遍接受,可能是因为病毒递送***比裸DNA疫苗能诱导更强的炎症和免疫激活。病毒疫苗能诱导非特异性免疫应答的性能主要是由于补体级联反应***对病毒成分的识别从而引发针对该病毒载体的特异性成分的抗原特异性免疫应答,然而,由于这种免疫应答经常阻止疫苗的再次施用,这也代表了其潜在的缺陷。
虽然科学与临床研究有许多证据表明免疫***可摧毁癌性组织,但大多数情况中免疫***未能识别肿瘤,或者产生的应答太微弱以至于无效。参见Farzaneh等,Immunol.Today,19:294(1998)。尽管在许多情况中早期诊断可治愈肿瘤,但一旦肿瘤转移至远处器官,它几乎总是致命的。此外,单独或联合使用化疗、放疗和外科手术观察到的令人失望的结果使许多研究人员将注意力转为免疫或生物药物。参见Ockert等,Immunol.Today,20:63(1999)。因此,增强免疫***介导肿瘤消退的能力成为肿瘤免疫学的主要目标。近来,免疫原性肿瘤抗原的鉴定与对T细胞介导的免疫应答和肿瘤逃逸机理的更好理解有助于该目标的进展。参见Boon等,Immunol.Today,18:267(1998);Chen,Immunol.Today,19:27(1998)。
基于细胞和肿瘤免疫学的原理的更深入了解,对一些动物排斥肿瘤而其它动物显示肿瘤生长发展的机理的了解逐渐得到进展。虽然许多肿瘤细胞表达了靶抗原,但它们未能刺激免疫应答。参见Boon等,(1997);Boon等,J.Exp.Med.,183:725(1996)。细胞毒性T淋巴细胞(CTL)公认是肿瘤免疫应答的关键成分,参见Boon等,(1996);Chen等,J.Exp.Med.,179:523(1994)。CTL应答足以提供抗肿瘤的保护作用并甚至可消除小鼠模型(Mogi等,Clin.Cancer Res.,4:713(1998))和人中已发生的癌症,参见Gong等,Proc.Natl.Acad.Sci.美国,97:2715(2000)。诱导强烈的抗原特异性CTL应答是许多当前癌症疫苗方案的目标。
CTL依赖性抗肿瘤免疫接种方案的开发取决于CTL识别的肿瘤抗原的鉴定和有效的抗原递送方法的开发。CTL通过识别由自身MHC I类分子和合成于肿瘤细胞的蛋白质所产生的肽抗原组成的配体而靶向肿瘤。然而,对于CTL的诱导和扩增,抗原配体必须由专职性APC细胞以合适的共刺激方式提供给CTL。将外源性抗原递送至专职性APC的内源性MHC I类分子限制性加工途径是癌症疫苗设计中的关键难点。当前开发的抗原递送方案包括用有限数目的肽免疫接种,特别是能在体内进入专职性APC的MHC I类途径的蛋白质、分离自肿瘤细胞的热激蛋白或利用载有抗原的APC的过继性转移。此外,近来的研究表明病毒载体或脂质体递送的编码肿瘤抗原的DNA疫苗或者裸DNA疫苗能诱导强有力的抗肿瘤免疫力。
如上所述,由于转化和降解,给予肽或蛋白质所需的方法具有其固有的有限性。此外,从CTL前体细胞(CTL-P)产生CTL显示需要IL-2与高亲和力IL-2受体的相互作用,而导致抗原激活的CTL-P增殖和分化为效应CTL。IL-2不足则诱导Th1细胞和CTL细胞凋亡而发生程序性死亡。免疫应答即以这种方式快速终止,这可降低炎性反应所致的非特异性组织损坏。
为克服当前疫苗技术(包括用于癌症的方法)的缺陷,迫切需要开发新的改进的疫苗递送***。新的改进的疫苗的可能需要的一种成分是更强的疫苗佐剂。用于这些疫苗的佐剂必须模拟感染和/或诱导局部组织损伤以引发保护性免疫力。然而,对疫苗佐剂和它们如何起作用的现有知识仍不完整。据认为Toll-样受体(TLR)在天然和适应性免疫***与T细胞和抗体应答发展之间的联系中起着重要作用。然而,如何通过特异性TLR的激活来影响所导致的适应性免疫应答的类型仍不十分清楚。例如,激活不同的TLR实际上可导致不同类型的T细胞或B细胞应答。
包括Toll-样受体的模式识别受体是新发现的天然免疫***细胞表达的一个受体家族,所述细胞包括巨噬细胞、树突状细胞和NK细胞。这些受体识别在其配体表面的特异性结构模式,因此得名为模式受体。TLR的主要作用是识别致病性微生物或其产物并在结合配体后向细胞发出信号。TLR发出的信号激活细胞并触发抗微生物的防御体系,包括产生例如干扰素、TNF、IL-12、IL-1和IL-6的细胞因子。因此,TLR受体是作为身体抵御感染性物质主要的第一道防线。现已鉴定了该受体家族的12个成员,称为模式识别受体。这些受体具有某些共同的特征,包括:(1)主要限于在天然免疫***的抗原呈递细胞中表达;(2)与配体结合时能激活抗感染性病原体(病毒、细菌、真菌等)的免疫应答;和(3)与果蝇Toll受体结构类似。因此,可通过与TLR配体结合来触发TLR信号而激活细胞防御,可用作有效诱导免疫刺激的一种方法。
然而,单独使用TLR配体进行免疫接种可能不是最好。例如,就抗某种抗原的疫苗接种而言,简单混合TLR配体与抗原可能是一种不足以引发免疫应答的方法。此外,施用纯化的TLR配体可导致其在血流中快速降解并且非常昂贵,特别是在较大的动物和人中。
还迫切需要提供能引发全身性、非特异性以及抗原特异性免疫应答的更好的疫苗,这些疫苗要安全、能反复施用并能通过引发免疫应答来有效预防和/或治疗疾病,例如感染性疾病、过敏和癌症。
发明概述
本发明的一个实施方案涉及一种疫苗。该疫苗含有以下成分:(a)至少一种可为模式识别分子(受体)识别的配体;和(b)一种递送载体。该配体可与递送载体形成复合物或位于递送载体内。
该配体优选被引发哺乳动物的细胞或体液免疫应答的天然免疫***的模式识别受体分子识别并结合。可选择能被Toll-样受体识别的配体。Toll-样受体包括(但不限于)TLR-1、TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5、TLR-6、TLR-7、TLR-8、TLR-9、TLR-10、TLR-11和TLR-12或其组合。TLR配体的例子包括(但不限于)革兰阳性细菌(TLR-2)、细菌内毒素(TLR-4)、鞭毛蛋白(TLR-5)、细菌DNA(TLR-9)、双链RNA和聚I:C(TLR-3)与酵母菌细胞壁抗原(TLR-2)。用于制备脂质体-TLR配体复合物(LTLC)的TLR配体可由能结合TLR的完整生物体(例如,革兰+细菌或酵母菌)、含有TLR配体的蛋白或糖类的部分纯化的混合物、含有TLR配体的纯化的蛋白或糖类或脂质、或能以天然配体相同的方式结合并激活TLR的肽与其它小分子组成。配体更具体说是糖蛋白、脂蛋白、糖脂、糖类、脂质和/或蛋白或衍生自真菌、病毒、立克次氏体、寄生虫、节肢动物或细菌某一部分的肽序列。在一个实施方案中,该疫苗含有多种配体。
本发明的一个实施方案涉及一种疫苗。该疫苗含有以下成分:(a)至少一种用于接种哺乳动物的免疫原;(b)至少一种为模式识别分子(受体)所识别的配体;和(c)递送载体。所述免疫原和配体可与递送载体形成复合物或位于其内部。
递送载体可是任何合适的脂质体,包括(但不限于)多层脂泡、阳离子脂质体、与阳离子脂质形成复合物的胆固醇,特别是(但不限于)DOTMA(N-[1-(2,3-二油酰氧)丙基]-N,N,N-氯化三甲基铵)和胆固醇;DOTAP(1,2-二油酰-3-三甲铵-丙烷)和胆固醇;DOTIM(1-(2-(油酰氧)乙基)-2-油基-3-(2-羟乙基)咪唑啉鎓)和胆固醇;与DDAB(二甲基双十八烷基铵);PEI(聚乙烯亚胺)、聚胺、脱乙酰壳聚糖、聚谷氨酸、硫酸鱼精蛋白、微球体和胆固醇。一方面,TLR配体可与荷电的脂质体混合以形成复合物,由于电荷-电荷相互作用该复合物基本上会自发装配。在大多数情况中,该复合物中递送载体与配体的摩尔比应大于1,通常是8∶1到16∶1。
一方面,该疫苗还含有药学上可接受的赋形剂。赋形剂优选含有(但不限于)5-10%的蔗糖。
本发明的另一个实施方案涉及在哺乳动物中引发全身性、非免疫原特异性免疫应答的方法。该方法包括向哺乳动物施用含有以下成分的疫苗的步骤:(a)至少一种可为模式识别分子(受体)所识别的配体;和(b)递送载体。该配体与递送载体形成复合物或位于其内部。施用步骤可通过任何途径,包括(但不限于)静脉内、腹膜内、皮下、真皮下、淋巴节内、肌肉内、透皮、吸入、鼻内、直肠、***、尿道、局部、口服、眼内、关节内、颅内、和脊髓内。在一个实施方案中,此施用步骤联合了静脉内和淋巴节内施用。另一方面,此施用步骤联合了腹膜内和淋巴节内施用。在还有的方面,此施用步骤联合了真皮下和淋巴节内施用。
一方面,本发明的组合物的给药剂量为每个哺乳动物约1μg-1mg。另一方面,本发明的组合物的给药剂量为每个哺乳动物约1μg-100μg。在还有另一方面,本发明的组合物的给药剂量为每个哺乳动物约1μg-10μg。向哺乳动物施用疫苗宜产生以下结果:抗该疾病的免疫力或刺激抗该疾病的效应细胞免疫力。
附图简述
加入说明书并成为其中一部分的附图阐述了本发明的优选实施方案,并且结合说明来解释本发明的主旨。
附图内容
图1图示说明了用模式识别受体的配体(PRRL)激活后脂质体极大提高了天然免疫力的激活和INF-γ的释放。
图2说明了用模式识别受体的配体(PRRL)激活后脂质体改变IL-10的释放。
图3图示说明了用模式识别受体的配体(PRRL)激活后脂质体提高TNF-α的释放。
图4图示说明了体外与模式识别受体的配体(PRRL)接触后脂质体改变了对树突状细胞激活的调节。
图5说明了与脂质-DNA复合物复合的肽或蛋白抗原。
图6说明LANAC和“交叉敏化”。
图7A和7B图示说明与其它常规疫苗相比,LANAC疫苗引发CTL应答的效力。
图8图示说明了作为疫苗佐剂的脂质体提高了PRRL引发CTL应答的能力。
图9图示说明了脂质体-PRRL复合物也可用作在肺部引发CTL应答的有效疫苗佐剂。
图10说明了有效的免疫接种是否需要3部分脂质体-抗原-核酸复合物的确定方法。
图11A和11B图示说明用脂质体-核酸复合物免疫接种引发功能性T细胞的能力。
图12图示说明了脂质体-核酸疫苗接种引发体液免疫的能力。
图13图示说明对用LANAC疫苗接种引发T细胞记忆应答的评价。
图14说明了对粘膜施用LANAC引发局部和全身性免疫应答的能力的评价。
图15说明了对LANAC分布至淋巴器官效率的评价和比较。
发明详述
本发明总体上涉及一种新颖的免疫接种方案和用于引发哺乳动物的免疫应答,特别是患适合于用引发免疫应答来治疗的疾病的哺乳动物的治疗性组合物。特别适合于用本发明的方法来治疗的疾病包括自身免疫疾病、癌症、过敏性炎症和感染性疾病。在一个实施方案中,本发明的方法和组合物特别可用于预防和治疗原发性肺癌、肺转移性疾病、过敏性哮喘和病毒性疾病。
在另一个实施方案中,本发明的方法和组合物可用于在损伤愈合时调节血管生成和纤维化形成以及心血管疾病和骨病的治疗。本发明的方法与组合物还可用于调节自身免疫疾病的对象的免疫应答。此外,按照本发明方法引发的免疫应答可用于免疫诊断和研究的工具以及试验的开发和实施。
更具体地说,本发明的基因免疫接种方法包括通过静脉内或腹膜内施用(即,全身性施用)治疗性组合物来引发哺乳动物的免疫应答,该组合物至少含有一种能被模式识别分子(模式识别受体的配体(PRRL))结合的配体和一种递送载体。免疫应答的引发或调节包括增强免疫应答或下调(抑制)免疫应答。
包括Toll-样受体的模式识别受体是新发现的天然免疫***细胞表达的受体家族,所述细胞包括巨噬细胞、树突状细胞和NK细胞。已知的TLR的配体的例子包括革兰阳性细菌(TLR-2)、细菌内毒素(TLR-4)、鞭毛蛋白(TLR-5)、细菌DNA(TLR-9)、双链RNA和聚I:C(TLR-3)与酵母菌(TLR-2)。能结合胞吞模式识别受体、清除受体或甘露糖结合受体的其它配体也可用。因此,本发明可利用任何模式识别受体的配体,然而,为了举例,将结合TLR配体描述本发明。
用于制备脂质体-TLR配体复合物(LTLC)的TLR配体包括结合TLR的完整生物体(例如,革兰阳性细菌或酵母菌)、含有TLR配体的蛋白或糖类的部分纯化的混合物、含有TLR配体的纯化的蛋白或糖类或脂质、或能以天然配体相同的方式结合并激活TLR的肽与其它的小分子。PRRL可与荷电的脂质体混合而形成复合物,由于电荷-电荷相互作用该复合物基本上会自发装配。在大多数情况中,该复合物中脂质体与PRRL的摩尔比大于1,通常是8∶1-16∶1
本发明的治疗性组合物也含有一种递送载体。按照本发明,该递送载体含有能与细胞的质膜融合的脂质组合物,藉此使脂质体能递送模式识别受体的配体(PRRP)和/或核酸进入细胞。脂质体也可在其表面掺入免疫原或将掺入其内部。本发明使用的合适载体包括任何脂质体。事实上,本发明人已证明脂质体和PRRL的组合其免疫刺激作用不限于脂质体的某具体类型。本发明的一些优选脂质体包括常规用于,例如本领域技术人员已知的基因递送方法的脂质体。一些优选的递送载体含有多层脂泡(MLV)脂质和挤压脂质,但是本发明不限于这种脂质体。
制备MLV的方法为本领域所熟知并描述于,例如美国专利申请系列号09/104,759,同前。按照本发明,“挤压的脂质”是用类似于MLV脂质的方法制备的脂质,如全文纳入作为参考的Templeton等,Nature Biotech.,15:647-652(1997)所述,该脂质接着要通过递减的过滤器挤压。单层小脂泡(SUV)脂质也可用于本发明的组合物与方法,与核酸组合显示可有效引发免疫应答(参见,美国专利申请系列号09/104,759同前)。其它优选的脂质体输送载体包括具有聚阳离子脂质组合物的脂质体(即,阳离子脂质体)。例如,阳离子脂质体组合物包括(但不限于)任何能与胆固醇形成复合物的阳离子脂质体,包括(不限于)DOTMA(N-[1-(2,3-二油酰氧)丙基]-N,N,N-氯化三甲基铵)和胆固醇;DOTAP(1,2-二油酰-3-三甲铵-丙烷)和胆固醇;DOTIM(1-(2-(油酰氧)乙基)-2-油基-3-(2-羟乙基)咪唑啉鎓)和胆固醇;PEI(聚乙烯亚胺)和胆固醇与DDAB(二甲基双十八烷基铵)和胆固醇。
本发明的脂质体可是任何大小,包括约10-1000纳米(nm)或其中的任何大小。本发明的脂质体成分最优选由荷电的脂质体组成,该脂质体包括荷电脂质与中性脂质,例如胆固醇的混合物。为使二者之间电荷-电荷相互作用最大,脂质体的净电荷可视TLR配体的净电荷而不同。例如,为制备使用细菌DNA作为TLR配体的复合物,由于其DNA带净负电,可使用阳离子脂质体。就无荷电的TLR配体而言,由于其可靶向抗原呈递细胞,优选阳离子脂质体。在大多数情况中,脂质体也可配制为具有适合于所需递送途径大小的改进的多层脂质体。为了清楚描述本发明的递送载体成分,本章节剩余的部分将使用术语脂质体。然而,应该理解所述的脂质体成分可用任何上述递送载体取代。
可修饰本发明的脂质体输送载体使其靶向哺乳动物的特定部位,藉此将本发明的核酸分子靶向于该部位并起作用。合适的修饰包括调整递送载体的脂质部分的化学成分。调整递送载体的脂质部分的化学成分能使该递送载体靶向胞外或胞内。例如,可将某化学成分加入脂质体的脂质配方中以改变脂质体的脂双层的电荷从而使该脂质体能与具有特定电荷特征的某些细胞融合。在一个实施方案中,当递送途径是静脉内或腹膜内时,由于该组合物已在免疫活性器官中提供了有效的免疫激活而无需其它靶向机理的帮助,例如不需要通过在脂质体中加入外源性靶向分子(即,抗体)使其,这不是本发明脂质体的必需成分。然而,在一些实施方案中,也可使用靶向物质使脂质体靶向特定的靶细胞或组织,所述物质是例如抗体、可溶性受体或配体,可将这些物质掺入脂质体使其靶向该靶向分子所能结合的特定细胞或组织。靶向性脂质体描述于,例如Ho等,Biochemistry,25:5500-6(1986);Ho等,JBiol Chem,262:13979-84(1987);Ho等,J Biol Chem,262:13973-8(1987)和授予Huang等的美国专利号4,957,735,每篇文献均全文纳入作为参考。在一个实施方案中,如果要避免注入的脂质体由于血浆蛋白或其它因子的调理作用而被网状内皮***细胞有效地摄取,可将亲水性脂质掺入常规脂质体的双层以形成称为空间稳定的或“密封”的脂质体(Woodle等,Biochim Biophys Acta,1113:171-99(1992)),所述亲水性脂质例如是神经节苷脂(Allen等,FEBSLett,223:42-6(1987))或聚乙二醇(PEG)-衍生的脂质(Klibanov等,FEBSLett,268:235-7(1990))。这种脂质体的变体描述于,例如授予Unger等的美国专利号5,705,187;授予Choi等的美国专利号5,820,873;授予Tirosh等的美国专利号5,817,856;授予Tagawa等的美国专利号5,686,101;授予Huang等的美国专利号5,043,164和授予Woodle等的美国专利号5,013,556,这些专利全文纳入作为参考。
如上所述,本发明的疫苗或治疗性组合物给予哺乳动物的方式应能将组合物有效递送至细胞、组织和/全身性递送至哺乳动物,由于该组合物的施用而引发免疫原特异性免疫应答。应该注意的是因为本发明人已发现了几种不同的施用方式可在无特异性靶向时也可有效地引发所需的免疫应答,所以尽管可以使本发明的治疗性组合物特异性靶向特定的细胞或组织,但这不是必需的。合适的施用方案包括体内或离体的施用方案。按照本发明,将本发明的疫苗或治疗性组合物施用至患者的合适方法包括适合于将该组合物递送给患者的任何体内施用途径。优选的施用途径对本领域的技术人员而言是显而易见的,这取决于有待预防或治疗的疾病的类型、所用的免疫原、和/或靶细胞群。优选的体内施用方法包括(但不限于)静脉内施用、腹膜内施用、肌肉内施用、淋巴节内施用、冠脉内施用、动脉内施用(例如颈动脉内)、皮下施用、透皮递送、气管内施用、皮下施用、关节内施用、心室内施用、吸入(例如,气溶胶)、颅内、脊柱内、眼内、鼻内、口服、支气管、直肠、局部、***、尿道、肺部施用、导管***和直接注射入组织。特别优选在粘膜组织中引发免疫应答的递送途径。这种途径包括支气管、真皮内、肌肉内、鼻内、其它吸入途径、直肠、皮下、局部、透皮、***和尿道途径。一些特别优选的施用途径包括,静脉内、腹膜内、皮下、真皮内、结节内、肌肉内、透皮、吸入、鼻内、直肠、***、尿道、局部、口服、眼内、关节内、颅内和脊髓内。如上所述,可联用多种递送途径,在一些实施方案中这种联用可提高疫苗或组合物的治疗效果。因此,本发明考虑了两种或多种施用途径的任何组合,包括按照免疫接种时间表同时进行、短时间内依次进行,或在不同时间进行(例如,初次免疫和加强免疫)。在一个实施方案中,优选的施用途径是静脉内、腹膜内或真皮内施用与淋巴节内施用的任何一种或多种相结合。在另一个实施方案中,当靶细胞位于肿瘤中或肿瘤附近时,优选的施用途径是直接注射进肿瘤或肿瘤周围的组织中。
离体给药指在患者体外进行的调节步骤的一部分,例如将本发明组合物加入到取自某患者的细胞群并在该组合物接触细胞和/或进入细胞的条件下培养,再将脂质转染的细胞返回给该患者。当靶细胞可容易地从患者取出并返回时,离体方法特别适用。
为提高对某抗原的免疫应答,本发明的治疗性组合物或疫苗可使用上述PRRL-脂质体复合物加上该抗原(即,疫苗)来制备。因此,在该实施方案中PRRL∶脂质体复合物用作疫苗佐剂。对于本发明的此目的,免疫接种的抗原可包括整个微生物或细胞、部分破裂的微生物或细胞、从微生物或细胞制备的裂解物、纯化的蛋白、衍生自微生物或细胞的糖类或脂质或其复合混合物,或者衍生自微生物或细胞的肽抗原。出于制备肿瘤疫苗的目的,本文中的术语“细胞”主要表示自体的或同种异体的肿瘤细胞。“微生物”表示病毒、细菌、真菌、原虫或寄生病原体。
单用PRRL进行免疫接种可能不是最好。例如,就某种抗原的疫苗接种而言,简单混合TLR配体和该抗原可能不足以引发免疫应答,参见图1-4。此外,施用纯化的TLR配体可导致其在血流中快速降解并且非常昂贵,特别是在较大的动物和人中。本发明的组合物利用递送载体,例如(但不限于)脂质体,可作为非常有效的方法来加强TLR配体的效力,特别是用于免疫激活(局部与全身性)和引发T细胞应答。结合TLR配体施用脂质体有两个目的。其一,脂质体与TLR配体的组合可通过与脂质体的协同免疫刺激相互作用而大大加强TLR配体固有的免疫刺激性能。其二,就疫苗而言,脂质体的物理作用可使TLR配体和抗原紧密接触。这进而保证了被TLR配体激活的同一抗原呈递细胞也可将该抗原呈递至T细胞和B细胞。
用于免疫激活而施用的脂质体-TLR配体复合物(LTLC)。基于以前用一种TLR配体(细菌DNA)配制的LTLC的研究,预计用其它TLR配体制备的LTLC将具有高度免疫刺激性。特别是,脂质体与TLR的组合比单用任一成分的刺激性强得多。然而,使用不同TLR配体可能刺激不同的TLR将导致数量和质量不同的免疫应答。因此,可使用不同的LTLC制剂来选择性调节所引发的免疫应答类型。根据需要全身性还是局部性免疫刺激,可通过各种途径施用LTLC。例如,通过静脉内或腹膜内施用LTLC可实现最大的全身性免疫激活,而吸入LTLC可用于在肺部诱导局部免疫激活。优选的施用途径是吸入、静脉内、口服和腹膜内。
LTLC导致的免疫激活可用于治疗可通过天然免疫的强激活而可缓解的各种疾病。LTLC的一种治疗性应用是治疗各种部位,包括肺部、皮肤、肝脏、腹膜腔和骨髓的癌症。第二种应用是治疗或预防感染性疾病,包括肺或气道,或其它部位的病毒、真菌和细菌感染。另一种应用是预防或治疗过敏性疾病,包括哮喘和过敏性鼻炎。另一种应用是用作或协助疫苗和/或免疫治疗来产生造血细胞分化或造血细胞改造。
使用LTLC和抗原的疫苗接种。LTLC的免疫刺激性能也使得它们作为非常有效的佐剂来增强针对疫苗中抗原的免疫应答。LTLC的佐剂性能增强对疫苗抗原的T细胞应答和抗体应答。为使用LTLC制备疫苗,可将免疫接种的抗原加入预制的LTLC中,或者可先掺入脂质体,然后与LTR配体混合。
LTLC加上抗原制备的疫苗可以各种途径施用,包括常规途径(IM、SC、ID)。此外,该疫苗可应用于粘膜表面来诱导局部免疫应答。例如,吸入LTLC疫苗可用于引发对抗原的肺部免疫应答。用LTLC制备的疫苗也可反复施用而不诱导有害的针对疫苗中LTLC成分的免疫反应。用于LTLC疫苗中的抗原包括蛋白质、肽、糖类、脂蛋白或上述任何或所有物质的复合混合物。这些抗原可得自细胞裂解物、病原生物的裂解物或这些细胞或生物的纯化或合成的组分。此外,也可使用正常细胞或细胞蛋白来制备疫苗以引发抗正常细胞蛋白的治疗***叉反应性免疫应答。后一种应用的例子包括用于治疗性调节早老性痴呆的抗β淀粉样蛋白的免疫接种。该疫苗也可用于抵御机体某特定部位,例如(但不限于)大脑、肾脏或关节中异常蛋白产生所导致的疾病。
使用递送载体,例如(但不限于)脂质体,是一种加强TLR配体的效力,特别是免疫激活(局部与全身性)和引发T细胞应答的有效方法。与TLR配体结合的脂质体有两个目的。其一,脂质体与TLR配体的组合可通过与脂质体的协同免疫刺激相互作用而大大加强TLR配体固有的免疫刺激性能。其二,就疫苗而言,脂质体的物理作用可使TLR配体和抗原紧密接触。进而保证了被TLR配体激活的同一个抗原呈递细胞也可将该抗原呈递至T细胞和B细胞。
本发明人出乎意料地发现当PRRL与脂质体联合经静脉内或腹膜内注射施用时,在体内具有高度免疫刺激性。所引发的免疫应答的强度远大于单用配体或脂质体(参见实施例1-4)所诱导的应答,并且取决于该复合物是静脉内还是腹膜内施用。因此,当本发明的PRRL-脂质复合物经静脉内或腹膜内施用时,可诱导强的、全身性非抗原特异性的免疫应答从而导致体内多种不同的免疫效应细胞的激活。本发明人还发现通过本发明方法施用的LTLC所产生的免疫应答具有强有力的抗肿瘤、抗过敏和抗病毒性能。本发明治疗性组合物所诱导的免疫激活在数量上强于LPS(内毒素)或聚I/C(一种典型的抗病毒免疫应答诱导剂)所诱导的。此外,所诱导的免疫刺激类型(例如,由诱导的细胞因子模式分析所示的特征)在质上也不同于LPS或聚I/C所诱导的。最后,该作用看来与使用病毒递送***所产生的补体级联反应的问题无关。
然而现在我们对这些LTLC佐剂发挥效力的免疫学机理知之甚少。荷电脂质体的胞吞很可能将抗原和TLR-配体引入抗原呈递细胞的发生抗原加工和TLR激活的内体区室中。可探索将该独特佐剂***引发强有力T细胞应答的性能用作研究不同TLR对抗原呈递细胞的激活和诱导适应性免疫应答的工具。首先评价不同LTLC对天然免疫力的作用,然后使用模型抗原和耶尔森菌蛋白来引发抗耶尔森鼠疫的适应性和保护性免疫力。这些研究提高了我们对疫苗佐剂和TLR激活总体作用的基础知识,并且也有助于开发更有效的抗气溶胶病原体,例如耶尔森氏菌的粘膜疫苗。
当施用途径是静脉内时,免疫接种(即,免疫应答的引发)的基本部位是肺部,肺是含有大量效应细胞(例如,T细胞、B细胞、NK细胞)和抗原呈递细胞(例如,巨噬细胞、树突状细胞)的免疫学非常活跃的器官。类似地,当施用途径是腹膜内时,免疫接种的基本部位是脾脏和肝脏,二者也是免疫学非常活跃的器官。
由于通过本发明方法施用的TLR配体∶脂质体复合物的出乎意料的免疫刺激性能,因为可避免使用传统佐剂,本发明的基因免疫接种方法在人类治疗中特别有用。既然一些传统佐剂可能有毒(例如,弗氏佐剂和其它细菌细胞壁成分)并且其它佐剂效果较差(例如,铝盐和钙盐),这是本发明方法的独特优点。此外,当前美国唯一批准可用于人的佐剂是铝盐、氢氧化铝和磷酸铝,它们均不刺激细胞介导的免疫力。此外,如以下实施例所示,宣称具有佐剂作用的传统裸DNA递送在刺激非抗原特异性免疫应答的效率方面远低于本发明的组合物。最后,与施用基于病毒载体的基因疫苗不同,本发明的方法可反复递送本文所述的治疗性组合物而不会产生与免疫应答的某些非特异性作用相关的结果,例如补体级联反应。
在本发明的其它实施方案中,本发明人利用上述方法可产生非抗原特异性免疫刺激作用的优点开发出更强有力的基因免疫接种策略,该策略使编码与LTLC形成复合物的免疫原和/或细胞因子的核酸序列(即,操作性连接于转录控制序列)表达于哺乳动物组织中。本发明人也发现通过表达的免疫原引发的抗原特异性免疫应答与LTLC引发的强非抗原特异性免疫应答相结合导致该疫苗的体内效力显著高于前述基因疫苗(参见实施例5、6b-c、9)。共同施用编码细胞因子的核酸分子还可再次提高该作用,这是因为细胞因子表达在组织中。
此外,就本发明组合物静脉内施用而言,在癌症患者中,肺是转移性肿瘤扩散的主要部位。因为本发明的方法能诱导足够强的免疫应答来缩小或消除原发性肿瘤并控制已存在的任何转移性肿瘤,包括大的转移性肿瘤,它在患有癌症的哺乳动物中特别成功。因此,不同于前述的基因免疫接种方法,本发明的基因免疫接种方法和组合物能引发全身性、非抗原特异性免疫应答(类似于传统佐剂)并且当该核酸编码肿瘤抗原时,可在哺乳动物中引发强的抗原特异性肺内(静脉内施用,参见实施例9)免疫应答,该应答能在体内有效地显著缩小或消除已有肿瘤。
本发明的一个实施方案是引发哺乳动物的全身性、非抗原特异性免疫应答的方法。该方法通过静脉内或腹膜内施用至哺乳动物含有以下物质的治疗性组合物:(a)递送载体;和(b)一种递送载体形成复合物或位于其内部的模式识别受体的配体(PRRL)。通过本发明的方法施用这种组合物可在哺乳动物中引发全身性、非抗原特异性免疫应答。如上所述,该免疫应答还具有强的、全身性抗肿瘤、抗过敏性炎症(即,保护性)和抗病毒性能。
用于本发明方法的治疗性组合物包含PRRL的组合物,所述PRRL含有TLR-配体,例如(但不限于)革兰阳性细菌或酵母菌、含有TLR配体的蛋白或糖类的部分纯化的混合物、含有TLR配体的纯化的蛋白或糖类或脂质、或能以天然配体相同的方式结合并激活TLR的肽与其它小分子。可将TLR配体与荷电的脂质体混合而形成复合物,由于电荷-电荷相互作用该复合物基本上会自发装配。
在本发明的另一个实施方案中,可改进引发免疫应答的本发明方法使之包括经静脉内或腹膜内施用哺乳动物的含有以下物质的治疗性组合物:(a)一种PRRL;(b)递送载体;和(c)含有编码某免疫原的核酸序列的重组核酸分子。根据本发明,虽然本文的术语“抗原”主要用于描述引发体液和/或细胞免疫应答(即,抗原性)的蛋白,而术语“免疫原”主要用于描述在体内引发体液和/或细胞免疫应答的蛋白,这样向哺乳动物施用此免疫原可提高哺乳动物组织对所遇到的相同或相似蛋白的免疫原的特异性(抗原特异性)免疫应答,因而术语“免疫原”和“抗原”可互换使用。根据本发明,免疫原或抗原可以是能引发体液和/或细胞免疫应答的天然存在或合成蛋白的任何部分。因此,抗原或免疫原的大小可小至约5-12个氨基酸或大至全长蛋白,包括多聚体和融合蛋白。本发明所用的术语“免疫原”和“抗原”不包括超抗原。超抗原在本文中定义为专用术语。更具体地说,超抗原是能与MHC分子的胞外部分(即,不在肽结合沟槽中)结合而形成MHC∶超抗原复合物的蛋白家族中的一种分子。当TCR与MHC∶超抗原复合物结合时可修饰T细胞的活性。在某些情况中,MHC∶超抗原复合物可具有促有丝***作用(即,刺激T细胞增殖的能力)或抑制作用(即,消除T细胞亚组)。
在优选的实施方案中,所述免疫原选自肿瘤抗原、过敏原或感染性疾病病原体的抗原(即,病原体抗原)。在该实施方案中,所述核酸序列操作性连接于转录控制序列,如此免疫原可在哺乳动物的组织中表达,藉此在该哺乳动物中引发上述非特异性免疫应答和免疫原特异性免疫应答。
在本发明方法的其它实施方案中,要施用至哺乳动物的治疗性组合物含有编码细胞因子的分离的核酸分子(本文中也称为“编码细胞因子的核酸分子”),其中该核酸分子操作性连接于一条或多条转录控制序列。当施用是经静脉内施用时,向哺乳动物施用这种治疗性组合物的结果是编码细胞因子的核酸分子在哺乳动物肺组织中表达;并且当施用是腹膜内施用时,编码细胞因子的核酸分子在哺乳动物的脾脏或肝脏组织中表达。应该注意的是术语“一种”实际表示一种或多种,例如一种细胞因子表示一种或多种细胞因子。因此,术语“一种”、“一种或多种”和“至少一种”在本文可互换使用。编码细胞因子的核酸序列可作为编码免疫原的核酸序列存在于同一个重组核酸分子上或不同的重组核酸分子上。
如下文将详细讨论的,用于本发明方法的组合物含有:(a)递送载体;(b)一种TLR配体。此外,该组合物还可含有核酸分子,这种核酸分子包含:(1)未操作性连接于转录控制序列的分离的核酸序列;(2)分离的非编码核酸序列;(3)编码操作性连接于转录控制序列的免疫原的分离重组核酸分子,其中所示复合物中脂质体与TLR摩尔比大于1,通常约是8∶1-15∶1,,复合物的核酸∶脂质体比例约1∶1-1∶64;和/或(4)编码细胞因子的分离的重组核酸分子。这种组合物的各种组分详述于下文。
引发哺乳动物的免疫应答可有效治疗各种医学疾病,特别是癌症、过敏性炎症和/或感染性疾病。本文使用的术语“引发”可与术语“激活”、“刺激”、“产生”或“上调”互换使用。根据本发明,在哺乳动物中“引发免疫应答”表示具体控制或影响免疫应答的活性,包括激活免疫应答、上调免疫应答、提高免疫应答和/或改变免疫应答,例如通过引发某种类型的免疫应答进而使哺乳动物免疫应答的主要类型从有害或效果差的类型变为有益或保护性的类型。例如,在Th2型应答(占优)的哺乳动物中引发Th1型应答可将免疫应答的整体效果从有害改变为有益,反之亦然。引发能改变哺乳动物整体免疫应答的免疫应答,在治疗过敏性炎症、分枝杆菌感染或寄生虫感染中尤其有用。根据本发明,与Th1型T淋巴细胞(或Th1淋巴细胞)的活性相比,以Th2型免疫应答(占优)为特征的疾病(或者称为Th2型免疫应答)可分类为与辅助T淋巴细胞亚组(本领域称为Th2型T淋巴细胞或Th2淋巴细胞)的活性占优相关的疾病。根据本发明,Th2型T淋巴细胞的特征在于其能产生一种或多种细胞因子,统称为Th2型细胞因子。如本文使用的Th2型细胞因子包括白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-6(IL-6)、白介素-9(IL-9)、白介素-10(IL-10)、白介素-13(IL-13)和白介素-15(IL-15)。相反,Th1型淋巴细胞产生的细胞因子包括IL-2和IFN。或者,有时Th1型免疫应答的特征在于能产生IgG2a或IgG3同种型抗体(人的等价抗体是IgG1、IgG2或IgG3),但是有时Th2型免疫应答的特征在于主要产生包括IgG1(人的等价物约是IgG4)和IgE的同种型抗体。
本发明的方法优选引发抗肿瘤、抗过敏原或抗感染性疾病病原体的免疫应答。具体地说在哺乳动物中引发免疫应答表示调节细胞介导免疫力(即,辅助T细胞(Th)活性、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性、NK细胞活性)和/或体液免疫(即,B细胞/免疫球蛋白活性),包括Th1型和/或Th2型细胞和/或体液免疫活性。在优选的实施方案中,本发明被能提高引发抗肿瘤、过敏原或感染性疾病病原体的效应细胞免疫力。本文使用的效应物细胞免疫力表示增加组合物所施用至的哺乳动物中效应细胞的数量和/或活性。具体说,T细胞活性表示增加肿瘤细胞或病原体区域中的T细胞数量和/或活性。类似地,NK细胞活性表示增加NK细胞的数量和/或活性。在本发明的方法中,效应细胞免疫力可是全身性或局限于哺乳动物中该治疗性组合物主要靶向的区域(即,虽然本发明的组合物在身体的其它位点也是有效的,静脉内施用就靶向肺内而腹膜内施用就靶向脾脏或肝脏内)中引发。根据本发明,效应细胞包括辅助T细胞、细胞毒性T细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞和/或天然杀伤细胞。例如,本发明的方法可用于增加哺乳动物中杀伤细胞的数量,当衍生自肿瘤细胞、过敏原或病原体的抗原一起呈递给所述杀伤细胞时,它们能杀死靶细胞或释放细胞因子。
根据本发明,引发非抗原特异性免疫应答(即,非特异性免疫应答)包括刺激非特异性免疫细胞(例如,巨噬细胞和中性白细胞),以及诱导细胞因子产生,特别是产生IFN,和非特异性激活效应细胞,例如NK细胞、B淋巴细胞和/或T淋巴细胞。更具体地说,本发明的方法和组合物所引发的全身性、非抗原特异性免疫应答可导致哺乳动物中天然杀伤(NK)细胞的功能和数量提高,其中NK功能的提高定义为NK细胞的功能水平与未用本发明组合物免疫接种的哺乳动物或经非全身性(即,非静脉内、非腹膜内)途径施用本发明组合物(其中所递送的TLR配体的量与TLR配体∶脂质体的比例是相同的)的哺乳动物的NK细胞功能水平相比,有可检测的提高。NK功能(即活性)可通过对合适的靶细胞的细胞毒性试验来测定。NK细胞的细胞毒性试验的例子见实施例1(图1)。可通过流式细胞术分析测量各种器官(包括脾脏、***、肺和肝脏)的细胞NK1.1/CD69分子的上调来衡量NK细胞的激活(参见实施例4,图4)。此外,本发明的方法和组合物引发的全身性非抗原特异性免疫应答可增加哺乳动物各种器官(包括脾脏和肺)中NK细胞产生的IFN-γ,其中IFN产生的增加定义为IFN产生的水平与未施用本发明组合物的哺乳动物或以非全身性途径施用本发明组合物(其中递送的TLR配体的量与TLR配体∶脂质体的比例是相同的)的哺乳动物NK细胞产生的IFNγ相比,有可检测的增加。IFN-γ的产生可通过IFN-γELISA(本领域已知,实施例1,图1)测定。通过本发明方法施用的本发明组合物优选能诱导血液、脾脏或肺的每5×106个单核细胞产生约100pg/ml的IFN-γ、更优选至少产生约500pg/ml的IFN-γ、还要优选至少产生约1000pg/ml的IFN-γ、再优选至少产生约5000pg/ml的IFN-γ、甚至更优选产生约10,000pg/ml的IFN-γ。
因此,本发明的方法优选能在易于引发免疫应答的哺乳动物中引发保护该哺乳动物免受疾病影响和/或预防疾病发生的免疫应答,其中该疾病包括癌症、过敏性炎症和/或感染性疾病。本文使用的短语“保护其免受疾病影响”表示减轻疾病的症状、降低疾病的发生率和/或降低疾病的严重性。当将本发明的组合物施用至哺乳动物时,保护哺乳动物指本发明的治疗性组合物预防疾病发生和/或治愈或缓解疾病症状、征兆或病因的能力。因此,保护哺乳动物免受疾病影响包括预防疾病发生(预防性治疗)和治疗患有疾病的哺乳动物(治疗性治疗)。具体说,保护哺乳动物免受疾病影响是一些情况下通过诱导有益或保护性免疫应答并抑制(例如,降低、抑制或阻断)过度活跃或有害的免疫应答从而在哺乳动物中引发免疫应答来实现。术语“疾病”表示哺乳动物正常健康状况的任何异常变化,包括疾病症状已存在以及异常(例如,感染、基于突变、遗传缺陷等)已发生但症状还未出现等情况。
更具体地说,当通过本发明的方法将本文所述治疗性组合物施用至哺乳动物时,宜产生以下结果:疾病缓解、疾病消除、肿瘤或疾病相关的损伤减少、肿瘤或疾病相关的损伤消除、防止原发性疾病导致的继发症(例如原发性癌症的转移)、预防了疾病和激或抵御该疾病的效应细胞免疫。
用于本发明方法的治疗性组合物中的一种成分是核酸序列,包括编码和/或非编码核酸序列与寡核苷酸(下述)和较大的核酸序列。虽然短语“核酸分子”主要从物理上指核酸分子,而短语“核酸序列”主要表示该核酸分子上的核苷酸序列,但该两短语可互换使用。本文使用的“编码的”核酸序列表示至少编码某肽或蛋白质一部分的核酸序列(例如一部分开放读框),更具体指可表示操作性连接于转录控制序列的编码某肽或蛋白质的核酸序列,从而可表达该肽或蛋白质。“非编码的”核酸序列表示不编码某肽或蛋白质任何部分的核酸序列。根据本发明,“非编码”核酸可含有转录单元的调节区域,例如启动子区域。术语“空载体”可与术语“非编码”载体互换使用,具体表示没有某肽或蛋白质的编码部分的核酸序列,例如没有基因***物的质粒载体。短语“操作性连接”表示将其核酸分子与转录控制序列相连,其连接方式可使该分子转染(即,转化、转导或转染)入宿主细胞中能表达。因此,“非操作性连接于转录控制序列”的核酸序列表示包含编码和非编码核酸序列二者的任何核酸序列,但所述序列与转录序列的连接方式不能使该分子转染入宿主细胞时可表达。应该注意的是该短语未排除在该核酸分子中存在转录控制序列。
在本发明的一些实施方案中,本发明的治疗性组合物中所含的核酸序列掺入重组核酸分子并编码免疫原和/或细胞因子。如下所详述的,优选的免疫原包括肿瘤抗原、过敏原或感染性疾病病原体的抗原(即,病原体抗原)。术语“重组分子”主要表示操作性连接于转录控制序列的核酸分子或核酸序列,但该短语可与施用于哺乳动物的“核酸分子”互换使用。
根据本发明,分离的,或生物学纯的核酸分子或核酸序列是从其天然环境中取得的核酸分子或核酸序列。因此,“分离的”或“生物学纯的”无需反映该核酸分子被纯化的程度。用于本组合物的分离的核酸分子可包括DNA、RNA或它们的衍生物。寡核苷酸的核酸序列一般约1-500个核苷酸,更常见至少长约5个核苷酸,或以整数(例如,6、7、8、9、10等)递增直至约500个核苷酸的任何长度。在一个优选的实施方案中,用于本发明的寡核苷酸包括含有在哺乳动物中具有免疫原性的胞嘧啶-鸟嘌呤(CpG)基序的寡核苷酸。在另一个实施方案中,该寡核苷酸(例如CpG)是脱甲基的。DNA中CpG基序的甲基化涉及基因表达的控制和其它几种渐成发育(epigenic)作用。甲基化抑制了含有CpG的细菌或病毒DNA的免疫刺激性能。本领域还知道在某特定序列中含有未甲基化的CpG基序的细菌DNA与合成的寡聚脱氧核苷酸可激活脊椎动物免疫细胞。
本发明的PRRL∶核酸∶脂质复合物的免疫激活作用可通过真核以及原核生物的核酸诱导,这表明不论核酸的来源,PRRL∶核酸∶脂质复合物具有的某些性能是固有的免疫激活。因此,由于本发明人发现核酸的来源对核酸-脂质复合物引发免疫应答的能力无显著影响,故核酸分子可衍生自任何来源,包括哺乳动物、细菌、昆虫或病毒来源。在本发明的一个实施方案中,用于本发明治疗性组合物的核酸分子不是细菌核酸分子。
分离的编码免疫原(例如,肿瘤抗原、过敏原或病原体抗原)或编码细胞因子的核酸分子可得自其天然来源,所述核酸分子可以是能编码以下物质的整个(即完全的)基因或其一部分:具有B细胞和/或T细胞表位的肿瘤抗原、具有B细胞和/或T细胞表位的过敏原、具有B细胞和/或T细胞表位的病原体抗原、或者能与其互补受体结合的细胞因子蛋白。核酸分子也可使用重组DNA技术(例如,聚合酶链式反应(PCR)扩增,克隆)或化学合成来生产。核酸分子包括天然核酸分子及其同源物,包括(但不限于)天然等位基因变体和修饰的核酸分子,修饰包括核酸分子中的核苷酸***、删除、取代和/或反转,修饰的方式基本上不会影响核酸分子编码本发明方法所用的免疫原或细胞因子的能力。
核酸分子同源物可使用本领域的技术人员已知的许多方法来产生(参见,例如Sambrook等,《分子克隆:实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),冷泉港实验室出版社,1989),该文献全文纳入作为参考。例如,可使用各种技术修饰核酸分子,包括(但不限于)经典的诱变技术和重组DNA技术,例如定点诱变、化学处理核酸分子来诱导突变、核酸片段的限制性内切酶切割、核酸片段的连接、聚合酶链式反应(PCR)扩增和/或核酸序列所选择区域的诱变、寡核苷酸混合物的合成并连接各组混合物来“构建”核酸分子的混合物及这些方法的组合。核酸分子同源物可通过筛检该核酸所编码蛋白的功能(例如,合适的肿瘤抗原、过敏原或病原体抗原免疫原性、或细胞因子活性)从修饰的核酸混合物中选择。筛检免疫原性(例如肿瘤抗原、过敏原或病原体抗原的免疫原性、或细胞因子活性)的技术是本领域技术人员已知的,包括各种体外和体内试验。
如前所述,本发明的免疫原或细胞因子蛋白包括(但不限于)由具有全长免疫原或细胞因子编码区域的核酸分子所编码的蛋白;由具有部分免疫原区域的核酸分子编码的蛋白,所述区域含有至少一种T细胞表位和/或至少一种B细胞表位;由具有细胞因子编码区域的核酸分子编码的能与细胞因子互补受体结合的蛋白;融合蛋白和含有不同的免疫原和或细胞因子相组合的嵌合蛋白。
本发明的一个实施方案包括编码至少全长免疫原(包括肿瘤抗原、过敏原、病原体抗原或这种免疫原的同源物)一部分的分离的核酸。本文使用的“某免疫原的至少一部分”表示含有T细胞和/或B细胞表位的免疫原蛋白的一部分。在一个实施方案中,编码免疫原的核酸分子包括这种免疫原的整个编码区域。本文使用的免疫原同源物是具有的氨基酸序列充分类似于天然免疫原氨基酸序列(即,天然存在的、内源性或野生型免疫原)的蛋白,即编码该同源物的核酸序列所编码的蛋白能引发对该天然免疫原的免疫应答。
本发明的编码肿瘤抗原的核酸分子编码的抗原,可以是具有T细胞识别表位的肿瘤抗原、具有B细胞识别表位的肿瘤抗原、仅由肿瘤细胞表达的肿瘤抗原和肿瘤细胞和非肿瘤细胞都表达的肿瘤抗原。用于本发明方法的肿瘤抗原优选至少含有一种T细胞和/或B细胞表位。因此,在哺乳动物组织中表达该肿瘤抗原可引发哺乳动物组织产生对该肿瘤的肿瘤抗原特异性免疫应答。如上所述,本发明人发现施用本发明的核酸∶脂质复合物可在体内引发强烈的全身性、非抗原特异性、抗肿瘤应答,并且该作用提高了对该核酸分子表达的肿瘤抗原的抗原特异性免疫应答。
在优选的实施方案中,本发明的核酸分子编码选自以下癌症的肿瘤抗原:黑色素瘤、鳞状细胞癌、乳腺癌、头颈癌、甲状腺癌、软组织肉瘤、骨癌、睾丸癌、***癌、卵巢癌、膀胱癌、皮肤癌、脑癌、血管肉瘤、血管肉瘤、肥大细胞瘤、原发性肝癌、肺癌、胰腺癌、胃肠癌、肾细胞癌、造血瘤(hematopoietic neoplasias)和它们的转移性癌。
本发明的编码病原体抗原的核酸分子编码感染性疾病病原体的抗原,这些抗原包括含含有T细胞识别的表位病原体抗原、B细胞识别表位的病原体抗原、仅由病原体编码的病原体抗原和病原体和其它细胞都表达的病原体抗原。用于本发明的病原体抗原优选至少含有一种T细胞和/或B细胞表位并且仅由病原体表达(即受感染哺乳动物的内源性组织不能表达)。因此,病原体抗原在哺乳动物某组织中的表达可在哺乳动物该组织中及全身引发对该病原体的抗原特异性免疫应答。
本发明的病原体免疫原包括(但不限于)细菌、病毒、寄生虫、朊病毒、立克次氏体或真菌表达的免疫原。用于本发明方法的优选病原体免疫原包括导致哺乳动物慢性或急性感染性疾病的免疫原。例如,用于本发明方法的一些优选病原体免疫原是导致慢性感染的病原体的免疫原,包括(但不限于)免疫缺陷病毒(HIV)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、疱疹病毒、***瘤病毒、利氏曼虫、弓型虫(Toxoplasma)、隐球菌(Cryptococcus)、芽生菌(Blastomyces)、组织胞浆菌(Histoplasma)和假丝酵母(Candida)。也包括能导致慢性感染的抗生素耐药性细菌菌株,例如葡萄球菌(Staphylococcus)、假单胞菌(Pseudomonas)、链球菌(Streptococcus)、肠球菌(Enterococcus)和沙门氏菌(Salmonella)。此外,对于抗急性疾病的免疫接种,可从中获得免疫原的优选病原体包括(但不限于)炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、弗朗西斯氏菌(Francisella)、耶尔森氏菌(Yersenia)、巴斯德氏菌(Pasteurella)、天花痘病毒(small pox)与其它革兰氏阴性和***病原体。
在本发明的另一个实施方案中,用于本发明方法或组合物中的病原体抗原包括病毒的免疫原。如上所述,本发明人发现本发明的组合物和方法在抵御病毒感染的治疗和保护中特别有用。特别是当用本发明方法施用时可将核酸与PRRL∶脂质复合物进一步复合以在体内引发强烈的全身性、非抗原特异性、抗病毒应答而不管该核酸是否编码或表达某免疫原。当操作性连接于转录控制序列的核酸序列确实编码某病毒抗原从而在哺乳动物某组织中表达该病毒抗原时,本发明的组合物还可引发除上述全身性免疫应答外的强烈的病毒抗原特异性免疫应答。在优选的实施方案中,所述病毒的免疫原可选自人免疫缺陷病毒和猫免疫缺陷病毒。
本发明的另一个实施方案包括编码全长过敏原至少的一部分或该过敏原蛋白同源物的过敏原编码核酸分子,并且包括含有T细胞识别表位的过敏原、具有B细胞识别表位的过敏原与在过敏炎症相关疾病中作为致敏剂的过敏原。这些过敏原可经吸入、皮下或口服施用。用于本发明治疗性组合物的优选过敏原包括植物花粉、药物、食物、毒液、昆虫***物、霉菌、动物液体、动物毛发和动物皮屑。
本发明的另一个实施方案包括编码全长细胞因子的至少一部分或该细胞因子蛋白同源物的细胞因子编码核酸分子。本文使用的“细胞因子的至少一部分”表示具有细胞因子活性并能与细胞因子受体结合的细胞因子蛋白的一部分。编码细胞因子的核酸分子优选含有细胞因子的整个编码区域。本文使用的细胞因子同源物指其氨基酸序列充分类似于天然细胞因子氨基酸序列的蛋白,从而使之具有细胞因子活性(即,天然存在的或野生型细胞因子相关的活性)。根据本发明,细胞因子包括能影响其它细胞生物学功能的蛋白。受细胞因子影响的生物学功能包括(但不限于)细胞生长或停止、细胞分化或细胞死亡。本发明的细胞因子优选能与细胞表面的特异性受体结合,从而影响细胞的生物学功能。
本发明的编码细胞因子的核酸分子编码能影响细胞的生物学功能的细胞因子,所述细胞包括(但不限于)淋巴细胞、肌肉细胞、造血前体细胞、肥大细胞、天然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、上皮细胞、内皮细胞、树突状细胞、间充质细胞、朗格汉斯细胞、在任何细胞来源的肉芽肿和肿瘤细胞中发现的细胞,更优选间充质细胞、上皮细胞、内皮细胞、肌肉细胞、巨噬细胞、单核细胞、T细胞和树突状细胞。
本发明优选的细胞因子的(编码)核酸分子编码造血生长因子、白介素、干扰素、免疫球蛋白超家族分子、肿瘤坏死因子家族分子和/或趋化因子(即,调节细胞(特别是吞噬细胞)的迁移与激活的蛋白)。更优选本发明的细胞因子(编码)核酸分子编码白介素。还要优选的用于本发明方法的细胞因子核酸分子编码白介素-2(IL-2)、白介素-7(IL-7)、白介素-12(IL-12)、白介素-15(IL-15)、白介素-18(IL-18)和/或干扰素-γ(IFN-γ)。最优选的用于本发明方法的细胞因子(编码)核酸分子编码白介素-2(IL-2)、白介素-12(IL-12)、白介素-18(IL-18)和/或干扰素-γ(IFN-γ)。
本领域的技术人员明白,本发明要应用的细胞因子衍生自所有类型的哺乳动物。从中获得细胞因子的优选哺乳动物包括小鼠、人和家养宠物(例如。狗、猫)。从中获得细胞因子的更优选的哺乳动物包括狗和人。从中获得细胞因子的还要优选的哺乳动物是人。
本发明编码细胞因子的核酸分子优选衍生自与待治疗哺乳动物相同种类的哺乳动物。例如,衍生自犬(即,狗)核酸分子的编码细胞因子的核酸分子优选用于治疗犬。本发明包括操作性连接于一条或多条转录控制序列而形成重组分子的本发明核酸分子。如上所述,短语“操作性连接”表示某核酸分子连接于转录控制序列,其连接方式使得该分子在转染(即,转化、转导或转染)进宿主细胞后能表达。用于本发明组合物中的核酸分子优选操作性连接于允许该分子在哺乳动物接受者中瞬时表达的转录控制序列。为避免长时间免疫激活的不利的影响(例如,休克、过度炎症、免疫耐受),本发明优选的实施方案是核酸分子编码的免疫原或细胞因子在免疫接种的哺乳动物中表达约72小时到1个月、优选约1周到1个月、更优选约2周到1个月。例如当发生与长时间免疫激活相关的不利作用时,表达不要超过1个月时间。然而,如果某特定组合物不会发生这种作用或者该作用可避免或受到控制,延长表达则可接受。在一个实施方案中,例如可通过选择合适的转录控制序列来实现瞬时表达。适合于瞬时基因表达的转录控制序列描述于下文。
转录控制序列是控制转录的启动、延伸和终止的序列。特别重要的转录控制序列是控制转录启动的序列,例如启动子。增强子、操纵子和阻遏序列。合适的转录控制序列包括可在至少一种用于本发明方法的重组细胞中起作用的任何转录控制序列。各种这样的转录控制序列是本领域技术人员已知的。优选的转录控制序列包括能在哺乳动物、细菌、昆虫细胞,优选在哺乳动物细胞中起作用的序列。更优选的转录控制序列包括(但不限于)猿病毒40(SV-40)、β-肌动蛋白、逆转录病毒长末端重复序列(LTR)、Rous肉瘤病毒(RSV)、巨细胞病毒(CMV)、tac、lac、trp、trc、oxy-pro、omp/lpp、rrnB、噬菌体lambda(λ)(例如γpL和γpR与含有这种启动子的融合物)、噬菌体T7、T71ac、噬菌体T3、噬菌体SP6、噬菌体SP01、金属硫蛋白、α交配因子、Pichia醇类氧化酶、α病毒亚基因组启动子(例如辛德比斯病毒亚基因组启动子)、杆状病毒、玉米夜蛾(Heliothis zea)昆虫病毒、牛痘病毒和其它痘病毒、肝炎病毒、和腺病毒转录控制序列、以及能控制原核细胞中基因表达的其它序列。其它合适的转录控制序列包括组织特异性启动子和增强子(例如,T细胞特异性增强子和启动子)。本发明的转录控制序列也包括与编码免疫原的基因相关的天然存在的转录控制序列,所述免疫原包括肿瘤抗原、过敏原、病原体抗原或细胞因子。
用于本发明的特别优选的转录控制序列包括使得待表达的核酸分子瞬时表达的启动子,从而能使该核酸分子编码的蛋白在充分引发免疫应答的时间后终止表达。与免疫***的长时间激活相关的不利作用可通过选择启动子和能使核酸分子瞬时表达的其它转录控制因子来避免。本发明的方法与以前描述的基因治疗/基因取代方法之间还有另一点差别。与编码用于本发明的免疫原和/或细胞因子的核酸分子一起使用的合适启动子包括巨细胞病毒(CMV)启动子和其它非逆转录病毒的启动子,例如RSV启动子、腺病毒启动子和猿病毒启动子。在基因治疗/基因取代方法中可能很需要LTR组织特异性启动子自我复制病毒的启动子和***瘤病毒的启动子,因为它们可提供转基因的长时间表达,但这些启动子不宜用作本发明的转录控制序列。
可为DNA或RNA的本发明的重组分子也可含有额外的调节序列,例如翻译调节序列、复制起点和其它与该重组细胞相容的调节序列。在一个实施方案中,本发明的重组分子也含有分泌信号(即,信号片段核酸序列)而使表达的免疫原或细胞因子蛋白从产生它们的细胞中分泌出来。合适的信号片段包括:(1)免疫原信号片段(例如,肿瘤抗原、过敏原或病原体抗原信号片段);(2)细胞因子信号片段;(3)或能指导本发明的免疫原和/或细胞因子蛋白分泌的异源信号。
优选的本发明的重组分子包括含有编码免疫原的核酸序列的重组分子、含有编码细胞因子的核酸序列的重组分子、或同时含有编码免疫原的核酸序列和编码细胞因子的核酸序列形成嵌合性分子的重组分子(即,编码免疫原的核酸序列与编码细胞因子的核酸序列处于同一重组分子中)。包含于这种重组嵌合分子中的核酸分子操作性连接于一条或多条转录控制序列,其中包含于嵌合重组分子中的每个核酸分子可利用相同或不同的转录控制序列来表达。
可利用本发明的一种或多种重组分子来产生用于本发明方法中的编码产物(即,免疫原蛋白或细胞因子蛋白)。在一个实施方案中,通过在有效产生蛋白的条件下表达核酸分子来产生编码产物。产生所编码产物的优选方法是通过用一种或多种重组分子转染宿主细胞来形成重组细胞。适合转染的宿主细胞包括任何可被转染的哺乳动物细胞。宿主细胞可是未受转染细胞或已用至少一种核酸分子转化的细胞。本发明的宿主细胞可是任何能产生本发明的免疫原(例如,肿瘤、过敏原或病原体)和/或细胞因子的细胞。优选的宿主细胞包括哺乳动物的肺细胞、淋巴细胞、肌肉细胞、造血前体细胞、肥大细胞、天然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、上皮细胞、内皮细胞、树突状细胞、间充质细胞、朗格汉斯细胞、在任何细胞来源的肉芽肿和肿瘤细胞中发现的细胞。本发明的宿主细胞更优选哺乳动物间充质细胞、上皮细胞、内皮细胞、肌肉细胞、巨噬细胞、单核细胞、肺细胞、肌肉细胞、T细胞和树突状细胞。
根据本发明的方法,宿主细胞优选在体内(即,在哺乳动物中)转染,即将与脂质体递送载体形成复合物的核酸分子经静脉内或腹膜内施用至哺乳动物。将本发明的核酸分子转染进宿主细胞可通过能将待施用的核酸分子与脂质体递送载体***体内细胞中的任何方法,包括脂质转染法来实现。
本领域的技术人员应该理解可使用重组DNA技术来提高转染的核酸分子的表达,例如,通过操纵转基因(即,重组核酸分子)表达的持续时间、宿主细胞内的该核酸分子的拷贝数、核酸分子转录的效率、所得转录产物被翻译的效率和翻译后修饰的效率。用于提高本发明核酸分子表达的重组技术包括(但不限于)将核酸分子操作性连接于高拷贝数质粒、将该核酸分子整合入宿主细胞的一个或多个染色体、在质粒中加入载体稳定性序列、提高重组分子表达的持续时间、取代或修饰转录控制信号(例如,启动子、操纵子、增强子)、取代或修饰翻译控制信号(例如,核糖体结合位点、SD序列)、修饰本发明的核酸分子使之对应于宿主细胞所用的密码子,和删除使转录物不稳定的序列。本发明所表达的重组蛋白的活性可通过片段化、修饰或衍生编码这种蛋白的核酸分子而得到提高。此外,可修饰核酸分子,特别是质粒部分(包括转录控制序列)来制备更具免疫刺激性的核酸分子,例如将CpG基序加入核酸中。
在本发明方法的一个实施方案中,当哺乳动物患癌症时,经静脉内施用至哺乳动物的治疗性组合物含有多种重组核酸分子,其中每个重组核酸分子含有cDNA序列,而每种cDNA序列编码肿瘤抗原或其片段(即,上述肿瘤抗原的至少一部分,优选含有T或B细胞表位的部分)。将从自体肿瘤样品分离到的全RNA扩增成cDNA序列。每个cDNA序列均操作性连接于转录控制序列。将这种治疗性组合物施用至患癌症的哺乳动物可导致编码肿瘤抗原的cDNA序列在哺乳动物的组织中(静脉内施用在肺组织中而腹膜内施用在脾脏和肝脏组织中)表达。在其它实施方案中,这种治疗性组合物含有的重组核酸分子具有编码细胞因子的核酸序列,其中该核酸序列操作性连接于转录控制序列。将这种治疗性组合物施用至哺乳动物可导致编码细胞因子的核酸序列在哺乳动物的上述组织中表达。根据本发明的该实施方案,自体肿瘤样品得自治疗性组合物要施用的哺乳动物。因此,该治疗性组合物中的cDNA序列将编码该癌症的肿瘤抗原,从而引发对该肿瘤的免疫应答。在该实施方案中,因为施用至哺乳动物的基本上所有的抗原均是该肿瘤样品所表达的,故无需知道给定肿瘤样品中的哪些抗原最具免疫原性(即,最佳免疫原)。此外,引发针对多种肿瘤抗原/免疫原的免疫应答可能有益于提高抵御该癌症的免疫应答的疗效。
在本发明方法的该实施方案中,上述多种重组核酸分子也可表示核酸分子文库,特别是cDNA文库。产生cDNA文库的方法是本领域熟知的。例如,这种方法披露于Sambrook等,同上。更具体地说,在该实施方案中,治疗性组合物含有编码肿瘤抗原的或代表自体肿瘤样品所表达基因的多种重组cDNA分子或其片段。该多种重组核酸分子可例如可通过以下方法制备:从自体肿瘤样品分离得到总RNA,将该RNA转变(即,扩增)成多种cDNA分子,然后通过将cDNA分子克隆进重组载体以形成多种重组分子制成cDNA文库。本文使用的总RNA表示使用本领域已知的标准方法分离自细胞样品的所有RNA,通常包括mRNA、hnRNA、tRNA和rRNA。从细胞样品(例如肿瘤样品)中分离总RNA的方法是本领域已知的(参见,例如Sambrook等,同上)。在其它实施方案中,从总RNA中扩增cDNA之前,可对RNA进行选择分离得到poly-A RNA(即,在3’末端含有poly-A尾部的RNA、反映了mRNA、编码细胞所表达蛋白的原代RNA转录物)。在还有另一个实施方案中,为去除存在于哺乳动物非肿瘤细胞(即,正常细胞)中的抗原的编码核酸分子,这种cDNA文库可“减去”该哺乳动物正常细胞样品的cDNA文库,从而增强抗该肿瘤特异性抗原的肿瘤特异性免疫应答并防止有害的免疫应答。减去核酸文库的方法也是本领域已知的(参见Sambrook等,同上)。
在患有癌症的哺乳动物中引发免疫应答的本发明方法的另一个实施方案中,经静脉内或腹膜内施用至哺乳动物的治疗性组合物含有多种重组核酸分子,其中每个重组核酸分子含有cDNA序列,每种cDNA序列编码肿瘤抗原或其片段(即,上述肿瘤抗原的至少一部分)。在该实施方案中,cDNA序列从分离自同一组织学类型肿瘤的多个同种异体肿瘤样品的总RNA中扩增。每个cDNA序列均操作性连接于转录控制序列。将这种治疗性组合物施用至患有癌症的哺乳动物可导致编码肿瘤抗原的cDNA序列在该哺乳动物的组织中(如上所述,根据施用途径而)表达。在其它实施方案中,这种治疗性组合物含有的重组核酸分子具有编码细胞因子的核酸序列,其中该核酸序列操作性连接于转录控制序列。将这种治疗性组合物施用至哺乳动物可导致编码细胞因子的核酸序列在该哺乳动物组织中表达。
在本发明的该实施方案中,含有编码肿瘤抗原的DNA序列的多种重组核酸分子(即,cDNA文库)从分离自同一组织学类型肿瘤的多个同种异体肿瘤样品的总RNA中扩增。根据本发明,多个同种异体肿瘤样品是相同组织类型肿瘤的肿瘤样品,其分离自两个或多个种类相同的哺乳动物,这些个哺乳动物至少在主要组织相容性复合物(MHC)上不同,通常是在其它遗传基因座上不同。因此,编码肿瘤抗原的多种重组分子代表了分离该RNA的任何个体中存在的基本上所有肿瘤抗原。本发明方法的该实施方案提供了能补偿各个患者之间表达相同组织学类型的肿瘤抗原所存在的天然差异的基因疫苗。因此,施用该治疗性组合物可有效引发对各种肿瘤抗原的免疫应答,从而可将同一治疗性组合物施用至各种不同的个体。通过本发明的方法递送的这种治疗性组合物特别可用于治疗,但也可用于预防性治疗。从多个同种异体肿瘤样品制备这种cDNA文库的方法相同于上述自体肿瘤样品的方法。
在哺乳动物中引发免疫应答的本发明方法的另一个实施方案中,经静脉内或腹膜内施用至哺乳动物的治疗性组合物含有多种重组核酸分子,其中每个重组核酸分子含有cDNA序列,而每个cDNA序列编码感染性疾病病原体的免疫原或其片段(即,上述病原体抗原的至少一部分)。在该实施方案中,cDNA序列是从分离自感染性疾病病原体的总RNA中扩增得到。每个cDNA序列均操作性连接于转录控制序列。将这种治疗性组合物施用至患有或可能接触感染性疾病的哺乳动物可导致编码病原体抗原的cDNA序列在该哺乳动物的组织中(如上所述,根据施用途径而)表达。在其它实施方案中,这种治疗性组合物含有的重组核酸分子具有编码细胞因子的核酸序列,其中该核酸序列操作性连接于转录控制序列。将这种治疗性组合物施用至哺乳动物可导致编码细胞因子的核酸序列在该哺乳动物组织中表达。
在本发明的该实施方案中,编码病原体抗原的多种重组分子代表了要从中分离得到该RNA的感染性疾病病原体中存在的基本上所有抗原。在该实施方案中,因为施用至哺乳动物基本上所有的抗原均是病原体表达的,故无需知道给定肿瘤样品中哪些抗原最具免疫原性(即,最佳免疫原)。此外,引发针对多种病原体抗原/免疫原的免疫应答可能有益于提高抵御该感染性疾病的免疫应答的疗效。从感染性疾病病原体中制备这种cDNA文库的方法相似于上述肿瘤样品的方法。
在哺乳动物中引发免疫应答的本发明方法的还有一个实施方案中,经静脉内或腹膜内施用至哺乳动物的治疗性组合物含有多种重组核酸分子,其中每个重组核酸分子含有从至少一种过敏原分离的总RNA扩增得到的cDNA序列。在该实施方案中,该cDNA序列从分离自至少一种,优选多种过敏原的总RNA或其片段经扩增而得。每个cDNA序列均操作性连接于转录控制序列。将这种治疗性组合物施用至患有或可能接触过敏炎症相关疾病的哺乳动物可导致编码该过敏原的cDNA序列在哺乳动物的组织中(如上所述,根据施用途径而)表达。在其它实施方案中,这种治疗性组合物含有的重组核酸分子具有编码细胞因子的核酸序列,其中该核酸序列操作性连接于转录控制序列。将这种治疗性组合物施用至哺乳动物导致编码细胞因子的核酸序列在哺乳动物组织中表达。在本发明的该实施方案中,编码过敏原的多种重组分子代表了分离得到该RNA的过敏原中存在的基本上所有抗原。此外,多种过敏原可同时施用。
本发明的另一个实施方案涉及在患有癌症的哺乳动物中引发肿瘤抗原特异性免疫应答和全身性、非特异性免疫应答的方法,所述方法的步骤包括向哺乳动物经静脉内或腹膜内施用含有以下物质的治疗性组合物:(a)脂质体送载体;(b)至少一种PRRL;和(c)分离自肿瘤样品的总RNA,其中该RNA编码肿瘤抗原或其片段。向哺乳动物施用这种治疗性组合物可导致编码肿瘤抗原或其片段的RNA在该哺乳动物组织中表达。如上所述,在优选的实施方案中,向哺乳动物施用此治疗性组合物之前富集RNA中的poly-A。在其它实施方案中,该治疗性组合物含有的重组核酸分子具有编码细胞因子的核酸序列,其中该核酸序列操作性连接于转录控制序列。将这种治疗性组合物施用至哺乳动物可导致编码细胞因子的核酸序列在其引入的哺乳动物组织中表达。
在本发明的该实施方案中,总RNA或者优选富含poly-A的RNA分离自上述肿瘤样品(参见Sambrook等,同上),如前所述将其与脂质体递送载体形成复合物并经静脉内或腹膜内施用至患有癌症的哺乳动物。然后该RNA所编码的肿瘤样品基本上在哺乳动物组织中表达所有抗原。虽然RNA通常在血清中被RNA酶快速降解,但本发明人相信与阳离子脂质形成复合物的RNA可受到保护免遭RNA酶降解而直至其到达基因表达的组织。本发明方法的该具体实施方案将RNA施用至哺乳动物的优点在于可直接在体内引发针对多种肿瘤抗原的免疫应答而基本上无需在体外操作肿瘤组织或宿主细胞。
本发明的另一个实施方案涉及在患有感染性疾病的哺乳动物中引发病原体抗原特异性免疫应答和全身性、非特异性免疫应答的方法,所述方法的步骤包括向哺乳动物经静脉内或腹膜内施用含有以下物质的治疗性组合物:(a)脂质体递送载体;(b)至少一种PRRL;和(c)分离自感染性疾病病原体的总RNA,其中该RNA编码病原体抗原或其片段。向哺乳动物施用这种治疗性组合物可导致编码该肿瘤抗原或其片段的RNA在此哺乳动物组织中表达。如上所述,在优选的实施方案中,向哺乳动物施用此治疗性组合物之前富集该RNA中的poly-A。在其它实施方案中,该治疗性组合物含有的重组核酸分子具有编码细胞因子的核酸序列,其中该核酸序列操作性连接于转录控制序列。将这种治疗性组合物施用至哺乳动物可导致编码细胞因子的核酸序列在该哺乳动物组织中表达。
本发明的另一个实施方案涉及在患有过敏性炎症相关疾病的哺乳动物中引发过敏原特异性免疫应答和全身性、非特异性免疫应答的方法,所述方法的步骤包括向哺乳动物经静脉内或腹膜内施用含有以下物质的治疗性组合物:(a)脂质体递送载体;(b)至少一种PRRL;和(c)分离自过敏原的总RNA,其中该RNA编码至少一种过敏原蛋白或其片段。向哺乳动物施用这种治疗性组合物可导致编码至少一种过敏原或其片段的RNA在该哺乳动物组织中表达。如上所述,在优选的实施方案中,向哺乳动物施用治疗性组合物之前富集该RNA中的poly-A。在其它实施方案中,该治疗性组合物含有的重组核酸分子具有编码细胞因子的核酸序列,其中该核酸序列操作性连接于转录控制序列。将这种治疗性组合物施用至哺乳动物可导致编码细胞因子的核酸序列在该哺乳动物组织中表达。
本发明的治疗性组合物包括脂质体载体。根据本发明,该脂质体载体含有能在静脉内施用时将本发明的治疗性组合物优先递送至哺乳动物的肺组织而在腹膜内施用时优先递送至哺乳动物的脾脏和肝脏组织的脂质组合物。短语“优先递送”指虽然脂质体可将核酸分子递送至哺乳动物的肺或脾脏和肝脏组织以外的部位,但这些组织是递送的主要部位。
本发明的脂质体载体可修饰以靶向哺乳动物的特定部位,藉可此将PRRL和/或本发明的核酸分子靶向该部位并应用于该部位。合适的修饰包括调整递送载体的脂质部分的化学配方。调整递送载体的脂质部分的化学配方能导致该递送载体靶向胞外或胞内。例如,可将某化学物质加入脂质体的脂质配方中以改变脂质体脂双层的电荷使该脂质体能与具有特定电荷特征的某些细胞融合。因为本发明组合物及其施用途径已对免疫活性器官提供了有效的免疫激活而无需其它靶向机制帮助,所以其它靶向机制,例如在脂质体上加入外源性寻靶分子(即,抗体)来靶向,不是本发明脂质体输送载体的必需成分(但可能是任选成分)。此外,就疗效而言,本发明不需要某给定核酸分子所编码的蛋白在靶细胞(例如,肿瘤细胞、病原体等)中表达。当这些蛋白表达在靶位点附近(即,毗邻部位)时,包括当这些蛋白是由非靶细胞表达时,本发明的组合物和方法也是有效。
脂质体输送载体优选能在哺乳动物中维持稳定足够时间以将PRRL或PRRL和本发明的核酸分子递送至哺乳动物的优选部位。本发明的脂质体输送载体优选在施用至的哺乳动物中至少能维持约30分钟稳定、更优选至少约1小时、再优选至少约24小时稳定。
本发明的脂质体输送载体含有能与靶细胞质膜融合的脂质组合物而能递送PRRL与核酸分子(如果需要)进入细胞。当本发明的PRRL∶脂质体复合物经静脉内施用时,本发明的PRRL∶脂质体复合物的转染效率宜至少为约1皮克(pg)表达的蛋白/1毫克(mg)总组织蛋白/1微克(μg)递送的核酸。本发明的PRRL∶脂质体复合物的转染效率优选至少为约10pg表达的蛋白/1mg总组织蛋白/1μg递送的核酸,更优选至少为约50pg表达的蛋白/1mg总组织蛋白/1μg递送的核酸,最优选至少为约100pg表达的蛋白/1mg总组织蛋白/1μg递送的核酸。当本发明的PRRL∶脂质体复合物的递送途径是经腹膜内时,该复合物的转染效率可低至1fg表达的蛋白/1mg总组织蛋白/1μg递送的核酸,但上述量是更优选的。
本发明的脂质体输送载体的直径宜约为100-500纳米(nm)、优选约150-450nm、更优选约200-400nm。
本发明使用的合适的脂质体可是任何脂质体。本发明优选的脂质体包括通常用于,例如本领域技术人员已知的基因递送方法的脂质体。优选的脂质体输送载体含有多层脂泡(MLV)脂质和挤压脂质。制备MLV的方法为本领域所熟知并描述于,例如本文的实施例章节。按照本发明,“挤压的脂质”是以类似于MLV脂质的方法制备的脂质,但如全文纳入作为参考的Templeton等,Nature Biotech.,15:647-652(1997)所述,该脂质然后要被挤压通过(孔径)大小递减的过滤器。虽然单层小脂泡(SUV)脂质可用于本发明的组合物与方法中,但本发明人发现当与核酸形成复合物在体内应用时,多层脂泡脂质明显比SUV更具免疫刺激性。更优选的脂质体输送载体包括含有聚阳离子脂质组合物的脂质体(即,阳离子脂质体)和/或具有与聚乙二醇偶联的胆固醇骨架的脂质体。优选的阳离子脂质体组合物包含(但不限于)DOTMA和胆固醇、DOTAP和胆固醇、DOTIM和胆固醇,及DDAB和胆固醇。在本发明的方法中用作递送载体的最优选脂质体组合物包含DOTAP和胆固醇。
使用本领域的标准技术可将脂质体与本发明的PRRL形成复合物(参见,例如美国专利申请系列号09/104,759)。参见实施例16。
根据本发明,本文中阳离子脂质∶PRRL复合物也称为TLAC。其中DNA是空载体的阳离子脂质∶DNA复合物也称为EC/CLDC。CLDC进一步与本发明的免疫原形成复合物可称为脂质-抗原-DNA复合物(LADC)或称为疫苗(Vacc)或治疗性组合物。
加入脂质体的本发明PRRL的合适浓度,包括能将足够量的PRRL递送进哺乳动物以引发全身性免疫应答的有效浓度。而如果要加入本发明的核酸分子,其合适浓度包括能将足够量的核酸分子递送进哺乳动物以引发全身性免疫应答的有效浓度。当该核酸分子编码免疫原或细胞因子时,加入脂质体的核酸分子的合适浓度包括将足够量的核酸分子递送进细胞使得该细胞能产生足够的免疫原和/或细胞因子蛋白从而以所需方式调节效应细胞免疫力的有效浓度。优选将约0.1μg-10μg的本发明核酸分子与约8nmol脂质体结合,更优选约0.5μg-5μg的核酸分子与约8nmol脂质体结合,再优选约1.0μg的核酸分子与约8nmol脂质体结合。在一个实施方案中,本发明组合物中的核酸与脂质之比(μg核酸∶nmol脂质)优选核酸∶脂质的重量比至少为约1∶1(即,1μg核酸∶1nmol脂质),更优选至少约1∶5,还要优选至少约1∶10。再优选至少约1∶20。本文所述的比例是基于该组合物中阳离子脂质的量,而非该组合物中脂质的总量。在另一个实施方案中,本发明组合物中核酸与脂质之比优选核酸∶脂质的重量比约1∶1-1∶64,更优选核酸∶脂质的重量比约1∶5-1∶50,还要优选核酸∶脂质的重量比约1∶10-1∶40,再优选核酸∶脂质的重量比约1∶15-1∶30。另一个特别优选的核酸∶脂质之比是约1∶8-1∶16,更优选1∶8-1∶32。核酸经非全身性途径(即,肌肉内、气管内、真皮内)施用通常约1∶1-1∶3的比例,本发明的全身性施用途径所用的核酸远少于脂质,并且可获得比非全身性施用途径相等或更好的结果。此外,与本发明的全身性免疫激活组合物与方法相比,即使通过静脉内施用,设计用于基因治疗/基因取代的组合物通常要使用更多的核酸(例如,6∶1-1∶10,而1∶10是所用DNA的最小量)。
根据本发明,有效的施用方案(即,以有效的方式施用治疗性组合物)包括能在患病哺乳动物中激发免疫应答的合适剂量参数和施用方式,从而较佳地保护该哺乳动物抵御疾病。用于具体疾病的有效剂量参数可使用本领域的标准方法来确定。这些方法包括,例如测定存活率、副作用(即,毒性)和疾病的进展或消退。具体在治疗癌症时,可通过评估应答反应率确定本发明治疗性组合物剂量参数的有效性。这种应答反应率表示具有部分或完全缓解应答反应的治疗患者在患者群中的百分比。缓解可通过,例如测量肿瘤大小或显微镜检查组织样品中癌细胞的存在来确定。
根据本发明,当在合适期间一次或多次施用时,合适的单次剂量是能在患病哺乳动物中引发免疫应答的剂量。剂量可依治疗的疾病而变。在癌症的治疗中,合适的单次剂量取决于所治疗的癌症是原发性肿瘤还是转移癌。本领域技术人员可使用适合于经静脉内或腹膜内施用的技术,基于哺乳动物大小来确定本发明治疗性组合物的全身性施用的合适单次剂量。
在一个优选的实施方案中,本发明的PRRL∶脂质体或PRRL∶核酸∶脂质体复合物的合适的单次剂量约为哺乳动物的每公斤体重施用0.1μg-100μg的该复合物。在另一个实施方案中,合适的单次剂量约为1μg-10μg/每公斤体重。在另一个实施方案中,PRRL∶脂质体复合物的合适单次剂量是至少施用至哺乳动物约0.1μg的PRRL,更优选至少约1μg的PRRL,还要优选至少约10μg的PRRL,再优选至少约50μg的PRRL,再要优选至少施用至哺乳动物约100μg的PRRL。
当本发明的PRRL∶核酸∶脂质体复合物含有要在哺乳动物中表达的核酸分子时,本发明的PRRL∶核酸∶脂质体复合物的合适单次剂量宜导致至少约1pg表达的蛋白/1mg总组织蛋白/1μg递送的核酸。本发明的核酸∶脂质体复合物的合适单次剂量更优选是能导致至少约10pg表达的蛋白/1mg总组织蛋白/1μg递送的核酸的剂量,还优选至少约50pg表达的蛋白/1mg总组织蛋白/1μg递送的核酸,再优选至少约100pg表达的蛋白/1mg总组织蛋白/1μg递送的核酸。当本发明的PRRL∶脂质复合物的施用途径是腹膜内时,本发明的PRRL∶脂质体复合物的合适单次剂量是可导致低至1fg表达的蛋白/1mg总组织蛋白/1μg递送的核酸的剂量,但上述量是更优选的。
能引发哺乳动物全身性、非抗原特异性免疫应答本发明治疗性组合物的合适单次剂量是含有足够量的与脂质体输送载体形成复合物的核酸分子,与未施用本发明治疗性组合物的哺乳动物(即,对照哺乳动物)相比,该组合物经静脉内或腹膜内施用时,能在哺乳动物体内引发细胞和/或体液免疫应答。包含在本发明的核酸∶脂质复合物中的核酸分子的优选剂量见上述。
能引发抗肿瘤免疫应答的治疗性组合物的合适单次剂量是在用脂质转染将该蛋白分子导入患癌症哺乳动物组织的细胞后能降低、优选能消除肿瘤的足够量的编码肿瘤抗原的重组分子,可单独使用或与编码细胞因子的重组分子组合使用。
根据本发明,用于引发抗感染性疾病和/或与这种疾病相关损伤的免疫应答的治疗性组合物的合适单次剂量基本上与用于***的剂量(以上详述的)类似,该组合物含有与脂质体组合的编码病原体的重组分子,可单独使用或与编码细胞因子的重组分子与脂质体组合使用。用于引发抗过敏原的免疫应答的治疗性组合物的单次剂量基本上与用于***的剂量类似,该组合物含有与脂质体组合的编码过敏原的重组分子,可单独使用或与编码细胞因子的重组分子与脂质体组合使用。
施用至哺乳动物的剂量次数取决于疾病的(严重)程度和个体患者对该治疗的应答对本领域的技术人员而言是明显的。例如,大的肿瘤比较小的肿瘤需要更多剂量。然而在一些情况中,如果具有大肿瘤的患者比具有较小肿瘤的患者对该治疗性组合物应答更佳,则具有大肿瘤的患者需要的剂量小于具有较小肿瘤的患者。所以,本发明的范围包括治疗某给定疾病所需的任何数量的合适剂量数。
要注意的是,由于施用PRRL∶脂质复合物和用其作加强免疫相隔时间明显长于一般的基因治疗/基因取代施用方案,本发明方法与以往述及的基因治疗/基因取代方案有所不同。例如,根据本发明治疗疾病之需,用本发明的组合物和方法引发免疫应答通常包括初次施用该治疗性组合物,然后在初次施用后3-4周作加强免疫,然后任选在第一次加强后每3-4周再作加强免疫。相反,为获得足够的基因表达来产生或取代所需的基因功能,基因治疗/基因取代方案通常需要更频繁地施用核酸(例如,每周施用一次)。
治疗性组合物的优选剂量次数是每位患者约施用2-10次、更优选每位患者约施用3-8次、还要优选每位患者约施用3-7次,该组合物含有PRRL、编码肿瘤抗原的重组分子,可单独使用或与编码细胞因子的重组分子组合使用。如上所述,这种施用优选每3-4周一次直至症状出现缓解,然后每月施用一次直至疾病消退。
根据本发明,能引发对感染性疾病和/或其相关损伤免疫应答的治疗性组合物的剂量次数基本上与用于***的剂量次数(以上详述的)类似,该组合物含有编码病原体抗原的重组分子,可单独使用或与和PRRL∶脂质体输送载体形成复合物的编码细胞因子的重组分子组合使用。
将治疗性组合物以在哺乳动物中引发全身性、非抗原特异性免疫应答的方式施用,并且该组合物中的核酸分子编码免疫原时,能使所施用的本发明重组分子在待治疗疾病的哺乳动物中表达产生免疫原性蛋白(对肿瘤、病原体抗原或过敏原而言)或免疫调节蛋白(对细胞因子而言)。根据本发明的方法,治疗性组合物可通过静脉内或腹膜内注射施用,优选通过静脉内施用。静脉内注射可使用本领域已知的标准方法进行。根据本发明的方法,可将PRR∶核酸∶脂质复合物可施用至哺乳动物的任何部位,其中特别是当脂质体输送载体含有阳离子脂质体时,可以全身性施用(即,静脉内或腹膜内施用)。当使用静脉内或腹膜内施用时,特别是当使用静脉内施用时,在哺乳动物的任何部位施用会引发强有力的免疫应答。合适的施用部位包括免疫激活的靶位点不限于在接近施用部位具有毛细血管床的第一器官(即,可将组合物施用于远离靶免疫位点的施用部位)。换言之,例如,虽然肾脏不是接近施用部位具有毛细血管床的第一器官,但用于治疗哺乳动物肾肿瘤的本发明组合物可经静脉内施用至哺乳动物的任何部位而引发强烈的抗肿瘤免疫应答和有效地减小或消除该肿瘤。当需要特异性抗肿瘤作用(即,减小或消除肿瘤)和施用途径是静脉内时,施用部位依旧是可静脉内输入组合物的任何部位,而无论肿瘤与施用部位在何位置。就腹膜内施用的抗肿瘤疗效而言(但非免疫激活/免疫接种),当肿瘤位于腹膜腔内或当肿瘤是小肿瘤时,优选使用该施用方式。如上所述,就免疫接种和免疫激活而言,特别是与非全身性途径相比,本文的实施例部分的结果表明腹膜内施用是合适的施用方式。
在本发明的方法中,可将治疗性组合物施用至脊椎动物纲哺乳类的任一成员,包括(但不限于)灵长类动物、啮齿类动物、家畜和家养宠物。家畜包括可食用或产生有用产品(例如,绵羊的羊毛产品)的哺乳动物。受保护的哺乳动物优选是人、犬、猫、小鼠、大鼠、绵羊、牛、马和猪,人与犬特别优选,而人最优选。尽管本发明的治疗性组合物能在哺乳动物的近交种类中引发抗疾病的免疫应答,但该组合物对在哺乳动物的远交种类中引发免疫应答特别有用。
如上所述,通过本方法施用的本发明的治疗性组合物可用于在患有各种疾病,特别是癌症、过敏性炎症和感染性疾病的哺乳动物中引发免疫应答。当经静脉内或腹膜内施用时,由于本发明的治疗性组合物克服了癌细胞逃避免疫消除的机制(即,癌细胞借以逃避哺乳动物响应于该疾病所产生的免疫应答),所以该组合物有利于在患癌症的哺乳动物中引发免疫应答。癌细胞,例如可因为仅有微弱的免疫原性、能改变细胞表面抗原和诱导免疫抑制而逃避免疫消除。用于在患癌症的哺乳动物中诱导免疫应答的合适的治疗性组合物含有本发明的PRRL∶脂质复合物或PRRL∶核酸∶脂质复合物,其中的核酸没有操作性连接于转录控制序列,或更优选编码操作性连接于转录控制序列的肿瘤抗原编码重组分子,该组合物可单独使用或与编码细胞因子的重组分子组合使用(分开用或一起用)。进入靶子肺或脾脏和肝脏细胞后,本发明的治疗性组合物能在哺乳动物中引发全身性、非特异性免疫应答并导致产生肿瘤抗原(以及在某些实施方案中为细胞因子)而激活细胞毒性T细胞、天然杀伤细胞、T辅助细胞和巨噬细胞。这类细胞的激活克服了对癌细胞的免疫应答的相对缺乏,破坏了癌细胞。
包含编码肿瘤抗原的核酸分子的本发明治疗性组合物可用于在患癌症(包括肿瘤和转移癌)的哺乳动物中引发免疫应答。用该治疗性组合物治疗克服了传统方法不能治疗转移性癌症的缺点。例如,本发明的组合物可靶向使用外科方法难以治疗的散播的转移性癌细胞。此外,施用这种组合物不会导致许多癌症治疗方法,例如高温、光动力超声波、聚焦超声波、化疗和放疗或外科方法造成的有害副作用,并且可反复施用。此外,通过本发明方法施用的组合物通常靶向肿瘤的脂泡,所以在肿瘤细胞自身中表达肿瘤抗原或细胞因子无需提供抵抗肿瘤的疗效。实际上,本发明的总体优点在于输送该组合物自身即可引发强有力的免疫应答并且核酸分子至少能在靶位点的临近区域(在该位点或毗邻位点)表达,从而提供有效的免疫激活以及抵抗靶肿瘤的疗效。
或者,癌症治疗(例如上述治疗方案的一种或组合)可与本发明的治疗性组合物联合使用。将肿瘤的癌症治疗方法(例如放疗)与注射本发明的治疗性组合物相结合的原理是要提供用于掺入该疫苗中的肿瘤抗原的来源。触发肿瘤细胞凋亡的肿瘤辐射会导致游离的肿瘤抗原局部释放进肿瘤组织。当将TLRC注射到正在凋亡的肿瘤中时,垂死细胞释放的肿瘤抗原将自发掺入到TLRC中(由于电荷-电荷相互作用),这将导致在原位产生自身肿瘤疫苗。掺入到TLRC佐剂中的肿瘤抗原然后将诱导局部天然免疫力的激活、募集专职性抗原呈递细胞(APC),接着在最接近的引流***中APC摄取并呈递抗原。递送放疗疗剂之后注射TLRC。在次情况中,直至肿瘤抗原到达引流***后才激活免疫效应细胞,因此当肿瘤再次接受辐射时,效应细胞可免遭破坏。因此,肿瘤可接受多轮放疗和肿瘤内TLRC递送。这可用作免疫***的加强疫苗而进一步促进抗肿瘤免疫力的诱导。此外,患者仍可继续接受当前对其肿瘤的标准治疗方法,不必中断放疗时间安排。癌症疗剂可在导入本发明的组合物之前、同时或之后施用。
诱导肿瘤细胞凋亡的其它方法也可与局部肿瘤内注射TLRC佐剂联用。例如,注射促凋亡药物(例如,喜树碱)、注射光敏剂联合肿瘤的紫外线照射、肿瘤电穿孔或局部高温均可用于引发肿瘤细胞凋亡或坏死以释放肿瘤抗原掺入到TLRC佐剂中。
本发明设计了可治疗任何肿瘤的注射针和放疗方法。所提出的治疗方案围绕标准放疗方案而设计,该标准方案通常包括在每周的第五天向肿瘤局部施用多种放射组分,持续3-4周。所提出的组合方案涉及在放疗开始(第1天)时肿瘤内注射TLRC,并在第5天、第12天、第19天也可能在第26天再次注射。然后,每月在肿瘤部位注射TLRC两次,持续3-4个月,或者直至手术摘除肿瘤或肿瘤消退。待施用的TLRC/LNAC剂量基于肿瘤大小,用LNAC时剂量通常是每次注射250-1000μg核酸(非编码质粒DNA或CpG寡聚核苷酸)。
可用这种方法治疗的典型肿瘤包括不可切除的头颈肿瘤(例如,鳞状细胞癌)、复发性黑色素瘤、乳腺癌和其它皮肤或皮下组织的恶性肿瘤。
另一个实施方案考虑了联合肿瘤内注射TLRC与肿瘤凋亡或坏死诱导剂来诱导抗肿瘤免疫力的方法。该治疗方案涉及施用能引发肿瘤细胞凋亡或坏死的药物(通过局部或全身性注射)来提供TLRC佐剂所需的抗原来源。在施用凋亡/坏死药物之后将TLRC佐剂施用至肿瘤组织中。这方案以凋亡药物加上TLRC的一系列交替循环反复进行。这种药物的例子包括同时施用光动力疗剂和TLRC、凋亡诱导剂(FasL,TRAIL,喜树碱)或肿瘤坏死或溶解诱导剂,如TNF-α或蒸馏水。可用这种方法治疗的典型肿瘤包括上述肿瘤。此外,用PDT,对于不易接近部位(例如肝脏或肾脏)的肿瘤可用超声波引导的注射方法将TLRC注射进肿瘤组织中来治疗。
含有编码肿瘤抗原的核酸分子的本发明治疗性组合物优选用于在患癌症的哺乳动物中引发免疫应答,所述癌症包括(但不限于)黑色素瘤、鳞状细胞癌、乳腺癌、头颈癌、甲状腺癌、软组织肉瘤、骨癌、睾丸癌、***癌、卵巢癌、膀胱癌、皮肤癌、脑癌、血管肉瘤、血管肉瘤、肥大细胞瘤、原发性肝癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃肠癌、肾细胞癌、造血瘤、间充质组织癌和它们的转移性癌。可用本发明的治疗性组合物治疗的特别优选的癌症包括原发性肺癌和肺转移性癌症。本发明的治疗性组合物可用于在哺乳动物中引发免疫应答来治疗可能在这类癌症中形成的肿瘤,包括恶性和良性肿瘤。在患癌症的哺乳动物的肺组织中表达肿瘤抗原(即,通过静脉内递送)宜产生的结果有癌症缓解、癌症相关的肿瘤缩小、癌症相关的肿瘤消除、预防转移性癌症、预防癌症和激或了抵御癌症的效应细胞免疫力。
含有编码感染性疾病病原体免疫原的核酸分子的本发明治疗性组合物的优点是能在患感染性疾病的哺乳动物中引发免疫应答。对应于免疫应答的感染性疾病是病原体导致的疾病,其中引发对该病原体的免疫应答可导致本文上述的预防性或治疗性作用。这种方法可提供对病原体繁殖所致原发性损伤(例如,肉芽肿)的长期靶向治疗。本文使用的术语“损伤”表示哺乳动物感染病原体后形成的损伤。用于在患感染性疾病的哺乳动物中引发免疫应答的治疗性组合物含有与脂质体输送载体组合的编码病原体抗原的重组分子,可单独使用或与本发明的编码细胞因子的重组分子组合使用。类似于上述治疗癌症的机理,在患感染性疾病的哺乳动物中用感染性疾病病原体的免疫原(和或不和细胞因子)引发免疫应答可导致T细胞、天然杀伤细胞和巨噬细胞活性增加从而克服了对病原体所形成损伤的免疫应答的相对缺乏。在患感染性疾病的哺乳动物组织中表达免疫原优选产生的结果有疾病缓解、已有的该疾病相关损伤好转、疾病症状缓解、产生抗该疾病的免疫力和激或抗该疾病的效应细胞免疫力。
本发明的治疗性组合物对于在患病原体导致的感染性疾病的哺乳动物中引发免疫应答特别有用,所述病原体包括(但不限于)细菌(包括寄居于宿主细胞中的胞内细菌)、病毒、寄生虫(包括内部寄生虫)、真菌(包括致病性真菌)和体内寄生虫。可用本发明的治疗性组合物治疗的优选感染性疾病包括慢性感染性疾病,更优选肺部感染性疾病,例如肺结核。可用本发明的治疗性组合物治疗的特别优选的感染性疾病包括人免疫缺陷病毒(HIV)、结核分枝杆菌、疱疹病毒、***瘤病毒(papillomavirus)、假丝酵母(Candida)感染的疾病。
在一个实施方案中,可用本发明的治疗性组合物治疗的感染性疾病是病毒性疾病,优选是包括人免疫缺陷病毒和猫免疫缺陷病毒等的病毒导致的病毒性疾病。
含有编码免疫原为过敏原的核酸分子的本发明治疗性组合物的优点是能在患过敏性炎症相关疾病的哺乳动物中引发免疫应答。过敏性炎症相关疾病是一种所引发的针对致敏剂(例如过敏原)的免疫应答(例如,Th-2免疫应答)可导致炎性介质释放的疾病,该介质募集参与哺乳动物炎症的细胞并且存在这种介质可导致组织损伤有时导致死亡。用于在患过敏性炎症相关疾病的哺乳动物中引发免疫应答的治疗性组合物含有与PRRL∶脂质体输送载体组合的编码过敏原的重组分子,可单独使用或与编码细胞因子的重组分子组合使用。
可用本发明的方法和组合物治疗的优选过敏性炎症相关的疾病包括过敏性气道疾病、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎和足部过敏。
本发明的治疗性组合物对于启动损伤愈合、骨生成、骨移植和/或血管生成和纤维形成特别有用。血管生成和纤维形成是行使人体生长和修复过程的关键成分。不充分的血管生成能力可加重心血管疾病,例如外周脉管疾病(PVD)的严重性。在PVD中,将血液携带至手臂或腿部的动脉变得狭窄或堵塞,使得血流变慢或停滞。该疾病最常影响腿部。由于许多人将PVD的症状,例如腿部或手臂的疼痛或麻木认为是衰老的正常情况,他们患有PVD而不知。刺激血管生成已用作缓解PVD成因的一种方法。
血管生成在损伤愈合中也起着重要作用。对损伤的应答非常原始,但却是修复受伤组织完整性的基本性的天然宿主免疫应答。高级脊椎动物的损伤(愈合)涉及导致纤维化结疤的快速修复过程。外伤、感染或外来物体所致损伤的愈合很大程度上由细胞因子介导促进了炎症和愈合。最初的损伤触发血凝和急性局部炎性应答,然后间充质细胞募集并增殖。由于围绕损伤的局部区域过度的Th1应答造成的炎症超越了控制可导致损伤不愈合。失控的基质聚集导致纤维化后遗症和结疤。炎症和基质长入正在为愈合的创伤之间的平衡受到局部区域中适当细胞因子混合物的调节。
骨肉瘤是最常见的影响***人和青年人的原发性骨肿瘤之一。传统的治疗方法需要截肢然后通过化疗延长生存期。用带有大量的外皮的同种异体移植物进行的肢体补救通常用作截肢的替代方法。多项研究表明肢体补救治疗未对存活率有不利影响,许多患者感到他们的生活质量有提高。尽管此种外科技术是成功的,但常常发生复杂的术后并发症。这些并发症包括骨髓炎、移植物不联合(non-union)与骨折。骨髓炎是最常见的与肢体同种异体移植补救相关的并发症。骨髓炎难以治愈并且常导致多次校正手术、慢性疼痛、肢体使用功能不佳,一些病例仍要截肢。
以上3个例子的相同主题是调节血管生成和纤维化应答与损伤愈合和骨移植相关的并发症需要能提高愈合时间和移植手术成功率的化合物。
宜将本发明的治疗性组合物优选施用至哺乳动物,藉此在哺乳动物中引发新血管生成。该方法包括通过皮下和肌肉内施用途径将治疗性组合物施用至哺乳动物的步骤。该治疗性组合物包含:(a)脂质体输送载体;和(b)模式识别受体的配体。
模式识别受体的配体可含有至少一种Toll-样受体的配体,例如(但不限于)革兰阳性细菌的提取物、分枝杆菌的提取物、酵母提取物、脂多糖(LPS)、肽聚糖、脂肽、脂磷壁酸、鞭毛蛋白、细菌DNA、双链RNA、酵母多糖、和咪唑并喹啉(imidazoquinoline)化合物。其中所述的脂质体输送载体含有脂质,例如(但不限于)多层脂泡脂质、阳离子脂质、挤压脂质、阳离子脂质和中性脂质的组合物、阳离子脂质和甾醇的组合物。
通过与惰性基质组合本发明的治疗性组合物的释放时间延长延长,所述惰性基质是例如(但不限于)明胶和胶原。也可将DNA等稳定(isostabilizing)试剂加入递送载体,例如(但不限于)甜菜碱、三甲铵正氧化物(trimetylamine n-oxide)和L-肉毒碱,这些试剂可单用或组合使用。此外,该脂质递送载体可含有DNA凝聚试剂,例如(但不限于)聚(L-赖氨酸)、亚精胺或精胺,这些试剂可单用或组合使用。
该治疗性组合物的toll样受体的配体与脂质之比约是1∶1-1∶64,所治疗的哺乳动物可是人、犬、猫、小鼠、大鼠、绵羊、牛、马和猪。
在其它实施方案中,本发明的治疗性组合物可通过缓释聚合物施用。可制备与Toll样受体的配体分子和抗原(包括肽、蛋白、糖类、糖脂、脂蛋白或其它抗原或其组合)形成复合物并配制为微球的含有阳离子脂质体的聚(L-丙交酯)(PLA)微球。能包裹脂质体-Toll样受体的配体-抗原复合物(LATLC)并在体内生物液体中提供缓慢但稳定释放的其它聚合物(例如,聚(L-丙交酯-共聚-乙交酯))也是可接受的。
脂质体-Toll样受体的配体-抗原复合物(LATLC)与PLA可在有机溶剂中配制,然后挤压凝聚形成包裹有的LATLC的PLA微球。最理想的制剂由直径为1-10μm的PLA微球组成。由于该大小最易为抗原呈递细胞(例如树突状细胞和巨噬细胞)所摄取,该直径是最可取的。聚合物设计为可使得LATLC在组织中缓释达1-6个月。包裹有LATLC的微球可通过各种途径施用,包括SC、IM、真皮内,以及各种粘膜途径,包括口服、鼻内、吸入、直肠内和透皮施用。
在本发明的另一个实施方案中,可将治疗有效浓度或剂量的本文所述治疗性组合物与药学上或药理学上可接受的生物可降解或非生物可降解的运载体、赋形剂或稀释剂相组合。本文使用的药学上可接受的赋形剂表示适合于将用于本发明方法的治疗性组合物递送至体内合适的部位的任何物质。优选的药学上可接受的赋形剂的形式是在PRRL和/或本发明的核酸分子到达某细胞后,能维持模式识别受体的配体和/或本发明的核酸分子和使PRRL和/或核酸分子进入细胞和(如果核酸分子编码待表达的蛋白时)被细胞表达。本发明合适的赋形剂包括能转运,但不一定使PRRL和/或核酸分子特异性靶向某细胞的赋形剂或制剂(本文也称为非靶向运载体)。标准的赋形剂包括明胶、酪蛋白、卵磷脂、***树胶、胆固醇、黄芪胶、硬脂酸、氯化苄烷铵、硬脂酸钙、一硬脂酸甘油酯、十六醇十八醇混合物、十六烷基聚乙二醇乳化蜡、山梨聚糖酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、聚乙二醇、硬脂酸聚氧乙烯酯、胶态二氧化硅、磷酸盐、十二烷基硫酸钠、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酯、非结晶纤维素、硅酸镁铝、三乙醇胺、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、糖和淀粉。运载体的示范性例子包括(但决不限于)水、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液、含有血清的溶液、Hank溶液、其它水性生理平衡溶液、油、酯类、聚(乙酸乙烯-乙烯酯)、乳酸和乙醇酸的共聚物、聚(乳酸)、明胶、胶原基质、多糖、聚(D,L丙交酯)、聚(苹果酸)、聚(己内酯)、纤维素、白蛋白、淀粉、酪蛋白、葡聚糖、聚酯、乙醇、丙烯酸酯(mathacrylate)、聚氨酯、聚乙烯、乙烯基聚合物、糖醇、它们的混合物等。水性运载体可含有接近受者生理条件所需的合适的辅助物质,例如通过提高化学物质稳定性和等渗性。特别优选的赋形剂包括非离子稀释剂,优选的非离子缓冲液是用水配制的5%葡萄糖(DW5)。参见,例如《雷明顿:药剂学的科学与实践》(Remington:The Science andPractice of Pharmacy),2000,Gennaro,AR编,Eaton,Pa.:Mack Publishing Co。
合适的辅助性物质包括,例如乙酸钠、氯化钠、乳酸钠、氯化钾、氯化钙和用于生产磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液和碳酸氢盐缓冲液的其它物质。辅助性物质也可包括防腐剂,例如硫柳汞、间-或邻-甲酚、***和苯甲醇。本发明的治疗性组合物可通过常规方法灭菌和/或冻干。
本发明提供实施本发明方法的试剂盒。因此,本发明提供了各种试剂盒。这些试剂盒可用于以下任一或多种用途(并且因此包装有用于以下一种或多种用途的使用说明书):用于治疗性或预防性地治疗个体来抵御致病微生物,例如病毒、真菌或细菌感染;治疗个体的某些形式的癌症;预防某些形式癌症的扩散或转移;预防某些形式癌症的一种或多种症状;减轻一种或多种癌症相关症状;减缓癌症在个体中的发展;或对个体进行疫苗接种以抵御某些形式的癌症。
本发明的试剂盒包括一个或多个容器,这些容器含有本发明的治疗性组合物和本文所述的合适赋形剂以及一套使用说明书,虽然含有使用说明的电子存储介质(例如,磁盘或光盘)也可接受,但说明书通常是关于本发明组合物对所预定治疗疾病的用法和剂量的书面说明书。试剂盒内包含的使用说明书一般包括用于预定治疗方案的剂量、给药方案和施用途径的信息。本发明的治疗性组合物的容器可装有单位剂量、散装(例如,多个剂量包装)或亚单为剂量。
本发明的治疗性组合物可以任何方便的、合适的包装方式包装。
本领域的技术人员应该理解,本发明的治疗性组合物可与本领域已知的其它治疗方法组合或与之联用。
另一个实施方案考虑将本发明的组合物加入到一种医学装置中,然后将该装置置于体内所需的靶位置,在该位置将本发明的组合物从医学装置洗出。因此,例如,本发明所述装置是关于血管支架的。然而,应该理解的是以下实施方案涉及任何可加入本发明组合物的医学装置而不限于该医学装置的任何具体类型。
本发明的装置可将治疗有效量的本发明组合物提供至靶部位,例如患病或受伤的身体组织或器官。所需的精确治疗效果取决于所治疗的疾病、所施用的制剂和本领域普通技术人员理解的各种其它因素。实施本发明所需的本发明组合物的量也随所用PRRL的性质而变。
在一个实施方案中,用本发明组合物涂布的医学装置是用于进行或有助于医学治疗的支架或导管。因此,本发明可与任何合适的或所需的支架组件和配件联合使用,并且包括多种支架设计方式的任一种。这些支架设计方式可包括,例如基础性的固体或管状可弯曲支架膜或气囊导管支架;直到复杂的装置,包括多管道式或多挤压内腔以及各种配件,例如导线、探针、超声波(仪)、光纤、电生理学(配件)、血液或化学物质取样组件。换言之,本发明可与任何合适的支架或导管的设计方式联合使用,而不限于导管的具体类型。
本文使用的“医学装置”表示用于预防或治疗医学疾病的可暂时性或永久性引入哺乳动物体内的装置。这些装置包括经皮下、透皮或外科手术引入,安置在器官、组织或腔隙内的任何装置。医学装置包括支架、合成移植物、人造心脏瓣膜、人造心脏和使修复性器官和血管循环相连接的固定物、静脉瓣膜、腹主动脉动脉瘤(AAA)移植物、下腔静脉过滤器、导管(包括永久性药物输注导管)、栓塞圈、用于脉管栓塞的栓塞物质(例如,PVA泡沫)、网孔修补材料、Dracon脉管颗粒矫型金属板、金属条和螺丝以及脉管缝合线。
出于本发明的目的,“洗出”表示涉及通过(药物)涂层与体液的直接接触来提取或释放(药物)的任何释放过程。
在一个实施方案中,医学装置可设计为具有将本发明组合物递送至所需的身体部位的孔洞,可按美国专利号5,972,027披露的方法制备,该专利引作参考。简言之,该方法包括提供粉末状金属或聚合物材料、将粉末经高压形成压缩物、烧结该压缩物形成最终的多孔金属或聚合物、用该多孔金属制备支架任选至少将本发明的组合物(和任选的一种或多种其它药物)加载进孔中。例如,该支架可用本发明的组合物和任选的一种或多种其它药物通过本领域已知的任何方法浸渍,包括高压加载,此时将支架置于所需的一种或多种药物的槽中浸泡并施以高压,或者抽真空。药物可用挥发性或非挥发性溶液运载。使用挥发性溶剂时,药物加载后,可使挥发性运载体溶液挥发。抽真空时,金属支架孔中的空气被抽去被含有药物的溶液所取代。或者,将支架植入所需的身体部位而非使药物加载于多孔支架,然后通过递送管将药物注射入空心支架,接着药物可从支架孔中穿出到达所需部位。
在另一个实施方案中,支架可设计为含有如美国专利号6,273,913 B1所述可加载本发明组合物的储槽或管道,该专利引为参考。生物相容物质的涂层或膜可涂布于储槽上,从而控制药物从储槽向动脉壁扩散。该***的优点之一是可优化该涂层的性能来实现优越的生物相容性和附着性能,而无需额外的加载和释放药物的能力。可利用储槽的大小、形状、位置和数量来控制药物的量,从而控制所递送的剂量。
实际上,此种支架可用适合于该设计的物理性能的任何生物相容材料制成,并且可是生物可降解或非生物可降解的。这种材料是弹性还是非弹性的取决于涂布于其上的聚合物层的柔韧性或弹性。因此,本发明的医学装置总体上可从各种材料制备,包括常规材料、形状记忆合金、各种塑料和聚合物、碳或碳纤维、乙酸纤维素、硝酸纤维素、硅酮等。
例如,本发明的医学装置,例如(但不限于)支架可由其上涂布有基质的聚合物或金属结构元件组成,或者该支架可是基质与聚合物混合形成的的组合物。
制造可延展支架的合适的生物相容金属包括高级不锈钢;钛合金,包括NiTi(称为镍钛合金的基于镍-钛的合金);钴合金,包括钴-铬-镍合金,例如Elgiloy和Phynox;基于铌-钛(NbTi)的合金;钽、金和铂-铱。
合适的非金属生物相容材料包括(但不限于)聚酰胺、聚烯烃(例如,聚丙烯、聚乙烯等)、不可吸收的聚酯(即,对苯二甲酸乙烯酯)和生物可吸收的脂肪族聚酯(例如,乳酸、乙醇酸、丙交酯、乙交酯、对二噁酮(para-dioxanone)、亚丙基碳酸酯、ε-己内酯等的均聚物和共聚物,及其混合物)。
基质
在一个实施方案中,医学装置(例如支架或移植物)用基质涂布。用于涂布本发明支架或移植物的基质可从各种材料制备。对基质的基本要求是要有充分的弹性和柔韧性以使之在支架或合成移植物的暴露表面维持不破裂。
(A)天然材料
基质可选自天然物质,例如可在人体中被酶降解的或在人体中水解不稳定的成膜聚合物性生物分子,如纤维蛋白、纤维蛋白原、肝素、胶原、弹性蛋白和可吸收的生物相容多糖,如壳聚糖、淀粉、脂肪酸(及其酯)、葡糖醛-聚糖(glucoso-glycan)、透明质酸、碳、层粘连蛋白和纤维素。
(B)合成材料
在一个实施方案中,用于涂布支架或合成移植物的基质选自能支持本发明组合物的任何生物相容性聚合物材料。所选择的聚合物必须是生物相容性聚合物并且当该支架被植入时,其对血管壁的刺激最小。该聚合物是生物稳定的还是生物可吸收的聚合物取决于所需的释放速率或聚合物稳定性程度。
制备聚合物基质的合适材料包括(但不限于)聚羧酸、纤维素聚合物、硅酮粘合剂、纤维蛋白、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、马来酐聚合物、聚酰胺、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚环氧乙烷、氨基葡聚糖、多糖、聚酯、聚(氨基酸)聚氨酯、分段聚氨酯-脲/肝素、硅酮、聚酸酯、聚酐、聚碳酸酯、聚丙烯、聚-L-乳酸、聚乙醇酸、聚己酸内酯、聚戊酸羟丁酯、聚丙烯酰胺、聚醚、聚草酸亚烷酯(polyalkylenes oxalate)、p聚酰胺、聚(亚氨基碳酸酯)、聚氧杂酯(polyoxaester)、聚氨基酯(polyamidoester)、含有氨基的聚氧杂酯、聚磷腈、乙烯基卤化物聚合物、聚乙二烯卤化物、聚丙烯腈、聚乙烯酮、聚乙烯基芳香族化合物(例如,聚苯乙烯)、甲基丙烯酸乙烯-甲酯共聚物、丙烯腈-苯乙烯共聚物、ABS树脂和乙酸乙烯-乙烯酯;聚酰胺,例如Nylon 66和聚己内酰胺;烷基树脂;聚碳酸酯;聚甲醛;聚酰亚胺;聚醚;环氧树脂、聚氨酯;人造纤维;三乙酸人造纤维、纤维素、乙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素;玻璃纸;硝酸纤维素;丙酸纤维素;纤维素醚(即,羧甲基纤维素和羟烷基纤维素)及其混合物和共聚物。
用于涂布的聚合物优选具有足够高的分子量而不是蜡样或粘性的成膜聚合物。该聚合物也优选能附着于支架并且在沉积于支架上后不易变形从而不会因血液动力学应力而移动。该聚合物分子量优选足够高以提供充分的刚性使其不会在支架操作或放置时被蹭掉并且在支架扩张期间不会破裂。
在一个实施方案中,该基质涂层可含有如纳入本文作为参考的美国专利号6,569,195 B2所述的第一共聚物和第二共聚物的混合物,其中第一共聚物具有第一种高的释放速率,而第二共聚合物具有第二种、相对低于第一释放速率的释放速率。第一和第二共聚物优选易蚀或生物可降解。在一个实施方案中,第一共聚物比第二共聚物更亲水。例如,第一共聚物可含有聚乳酸/聚环氧乙烷(PLA-PEO)共聚物,第二共聚物可含有聚乳酸/聚己酸内酯(PLA-PCL)共聚物。PLA-PEO和PLA-PCL共聚物的形成方法是本领域的技术人员熟知的。随时间推移而递送的本发明组合物的相对量和剂量释放速率可通过控制较快释放聚合物与较慢释放聚合物的相对含量来控制。就较高初始释放速率而言,较快释放聚合物的比例可高于较慢释放聚合物。如果需要大部分剂量在长时期内释放,大部分聚合物可是较慢释放的聚合物。
或者,可利用顶部涂层来延缓药学制剂的释放,或可用作递送不同药学活性物质的基质。例如,可采用层叠的快速和慢速水解的共聚物涂层使药物分阶段释放或控制置于不同层的不同制剂的释放。可利用溶剂中溶解性不同的聚合物构建用来递送不同药物或控制药物释放方式的不同聚合物层。例如,因为ε-己内酯-共聚-丙交酯弹性体可溶于乙酸乙酯,而ε-己内酯-共聚-乙交酯弹性体不溶于乙酸乙酯。可使用乙酸乙酯作为溶剂制备的涂布溶液,将含有药物的第一层ε-己内酯-共聚-乙交酯弹性体涂布于ε-己内酯-共聚-乙交酯弹性体涂层之上。本领域的技术人员易于理解的是许多层叠方法可用于提供所需的药物递送。
在一个实施方案中,通过混合本发明的组合物和任选一种或多种其它治疗性药物与涂布混合物配制的涂层聚合物来配制所述涂层。本发明的组合物和治疗性药物可采取液体、精细分级的固体或任何其它合适的物理形式。该混合物可任选含有一种或多种添加剂,例如无毒辅助物质,如稀释剂、运载体、赋形剂、稳定剂等。其它合适的添加剂可与聚合物和本发明的组合物和药学活性药物或化合物一起配制。例如可将选自上述生物相容性成膜聚合物列表的亲水性聚合物加入到生物相容性疏水涂层来改变释放方式(或可将疏水性聚合物加入亲水性涂层来改变释放方式)。例如,将选自下列的亲水性聚合物加入脂肪族聚酯涂层来改变释放方式:聚环氧乙烷、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素及其组合。可通过监测本发明的组合物与治疗性药物的体外或体内释放方式来确定合适的相对用量。
生物可降解的基质
在一个实施方案中,所述基质是不改变该医学装置结构与功能的合成或天然的生物可降解的聚合物,例如乳酸、乙醇酸的脂肪族和羟基聚合物、混合的聚合物和混合物、聚羟基丁酯和聚羟基-戊酯和对应的混合物、或聚二噁酮(polydioxanon)、改性淀粉、明胶、改性纤维素、己内酰胺(caprolactaine)聚合物、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸或其衍生物。这种生物可降解的聚合物与血液或其它体液接触后可以受控方式崩解(取决于载体材料的性能和涂层厚度),接着缓慢释放包含于其中的本发明组合物。生物可降解涂层的讨论见专门引为参考的美国专利号5,788,979。
将基质涂布于医学装置
根据本发明的一个实施方案,本发明的组合物作为完整涂层的一部分至少涂布于支架的外表面。将溶液涂布于支架上并使溶剂蒸发,藉此使得支架表面留有聚合物和治疗性物质的涂层。溶液通常可用任何合适的方法涂布于支架上,例如通过浸渍、喷雾或乳浆沉积或蒸气沉积。为涂布医学装置,例如支架,该支架浸在或用粘性适中的基质溶液喷涂。每一层涂好后,干燥支架再涂下一层。在一个实施方案中,薄的油漆样基质涂层的厚度不超过100微米。选择通过浸渍还是喷雾来涂布主要取决于溶液的粘度和表面张力,然而,发现以细滴喷雾(例如得自喷枪的)作喷涂可提供最均匀的涂层从而最佳控制涂布到支架上的涂层材料量。无论是通过喷雾还是浸渍涂布,通常都需要多次涂布步骤来改善涂层的均匀性和控制涂布到支架上的治疗性物质的量。包含在支架上的本发明组合物的量可通过涂布多层薄的溶液涂层同时使涂布之间使其干透来容易地控制。整个涂层应该足够薄使得其不会显著改变导管支架的血管内递送方式。涂层的粘附力和本发明组合物的递送速率可通过选择合适的生物可吸收或生物稳定的聚合物以及本发明的组合物与聚合物溶液之比来控制。
为提供该实施方案的涂布支架,首先制备含有溶剂、溶解于溶剂的聚合物、分散于溶剂中的本发明的组合物以及任选的交联试剂的溶液。选择与本发明的组合物相容的溶剂和聚合物很重要。溶剂必须能将聚合物以所需浓度置于溶液中。溶剂和聚合物的选择也必须不会化学改变本发明组合物的治疗特性。然而,本发明的组合物仅需能分散在溶剂中,因此,可以是与该溶剂形成真正的溶液或分散在溶剂中的细小颗粒。涂层涂布的优选条件是聚合物和本发明的组合物具有共同的溶剂。该条件是湿涂层是真正的溶液。含有本发明组合物的作为分散在溶剂中的聚合物溶液固体分散物的涂层也可用,但不理想。在分散条件下,如果使用开槽或穿通孔的支架,必须小心保证分散的药物粉末的颗粒大小(最初粉末的大小及其聚集物和凝聚物)足够小从而不会导致涂层表面不规则或堵塞支架的开槽或穿通孔。当将分散液涂布到支架上需要改善涂层表面的光滑性或保证所有的药物颗粒全部包裹进聚合物,或者当需要减缓分散液或溶液沉积药物的释放速率时,可涂布用于提供药物缓释的同一聚合物的透明(仅有聚合物)顶层或另一种聚合物以进一步限制药物扩散出涂层。
组合物涂布支架的外表面和内表面,并且随着其固化,将这些表面包裹在本发明制剂的聚合物/组合物中。因此,干燥的支架在其表面包含本发明组合物的涂层。浸渍方法优选使得该溶液或悬浮液不会完全充满支架的内部或堵塞小孔。本领域已知防止这种情况发生的方法,包括调节用于制备该组合物的溶液的表面张力、浸渍后清洁腔室和放置直径小于腔室的内膜使得支架的所有表面与内膜之间存在通道。一种浸渍支架远端的替代方法是用含有本发明组合物的蒸气形式的组合物喷涂外表面和内表面。
在一个实施方案中,选择能牢固粘附在支架或合成移植物表面的基质。例如,这可通过以连续薄层方式涂布基质来实现。每层基质可加入抗体。或者,本发明的组合物可仅涂布于直接接触血管腔的层上。不同类型的基质可以连续涂布形成连续层。
选择的溶剂在粘度、聚合物的沉积水平、药物制剂的溶解性、支架的湿润性和适合涂布支架的溶剂的蒸发速率之间具有适当的平衡。在优选的实施方案中,所选的溶剂应是本发明组合物和聚合物都能溶于其中的溶剂。在一些情况下,选择的溶剂必须能使涂层聚合物溶解于其中而药物制剂能分散于该溶剂的聚合物溶液中。在该情况下,选择的溶剂必须能悬浮本发明组合物的小颗粒而不使它们聚集或凝聚成颗粒集合体在涂布时堵塞支架沟槽。虽然目标是在加工过程中将溶剂除去使涂层完全干燥,但该溶剂无毒、非致癌和不污染环境是很大的优点。混合溶剂***也可用于控制粘度和蒸发速率。在所有情况中,溶剂决不能与本发明的组合物反应或使之失活或与涂层聚合物反应。优选的溶剂包括(但不限于)丙酮、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲基亚砜(DMSO)、甲苯、二甲苯、二氯甲烷、氯仿、1,1,2-三氯乙烷(TCE)、各种氟利昂、二噁烷、乙酸乙酯、四氢呋喃(THF)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMAC)、水和缓冲盐水。
在一个实施方案中,支架用前聚合物、交联剂和本发明组合物的混合物涂布,然后经过固化步骤,该步骤中前聚合物和交联剂协同作用以产生含有本发明组合物的固化聚合物基质。固化过程包括溶剂的蒸发与聚合物的固化和交联。某些硅酮材料可在较低的温度(即,室温至50℃)下固化,即所谓的室温硫化(RTV)过程。当然,时间和温度可随具体的硅酮、交联剂和生物活性物质而变。
导管上涂层的量一般随聚合物而变,可是涂布后导管总重量的约0.1-40%。聚合物涂层可根据待涂布的聚合物的量进行一次或多次涂布步骤。
将本发明的组合物加入基质
本发明的组合物可共价或非共价地掺入基质,其中该涂层可使得本发明的组合物从中受控释放。本发明的组合物可通过与基质涂布溶液混合而掺入每层基质中。或者,本发明的组合物可共价或非共价涂布在已涂布于医学装置的最后基质层上。如下所述,从医学装置上释放本发明组合物的所需速率方式可通过改变涂层厚度、本发明组合物的径向分布(层对层)、混合方法、本发明组合物的量、不同层的不同基质聚合物材料的组合以及聚合物材料的交联密度来确定。
在一个实施方案中,本发明的组合物加入到含有基质的溶液中。例如,本发明的组合物可以其合适的浓度与含有聚合物的溶液一起孵育。应该理解的是,本发明组合物的浓度可变并且本领域的普通技术人员无需过多的实验就可确定最佳浓度。然后通过本文所述的任何方法将本发明的组合物/聚合物混合液涂布到装置上。
溶液中本发明的组合物与聚合物之比取决于聚合物将本发明组合物固定到支架上的效率和涂层将本发明组合物释放入血管组织的速率。如果本发明的组合物保留在支架上的效率较低,则需要更多聚合物,以提供能限制极本发明易溶组合物洗出的洗出基质。因此,本发明的组合物与聚合物适当宽广的比例可约是10∶1-1∶100。
本发明的组合物沉积到涂布的支架上
在另一个实施方案中,本发明的医学装置(例如支架)含有至少一层沉积在到至少一部分支架涂层上的本发明组合物。如果需要,多孔层中可沉积本发明的组合物,其中该多孔层中含有聚合物,从而可控制本发明组合物的释放还能避免本发明组合物降解。涂布该实施方案支架的方法披露于专门引为参考的美国专利号6,299,604。
在又一个实施方案中,本发明的组合物共价偶联于基质。在一个实施方案中,本发明的组合物可通过使用异质-或同质-双功能接头分子共价偶联于基质。用于与本发明组合物连接的接头分子通常包括在组合物附着到支架后与基质分子共价偶联。与基质共价偶联后,该接头分子提供了许多功能性活性基团,可用这些基团共价偶联一种或多种类型的本发明组合物。接头分子可直接共价偶联于基质(即,通过羧基),或通过熟知的偶联化学反应偶联,例如酯化、酰胺化和酰化。例如,该接头分子可以是聚胺功能性聚合物,例如聚乙烯亚胺(PEI)、聚烯丙胺(PALLA)或聚乙二醇(PEG)。各种PEG衍生物(例如mPEG-琥珀酰亚胺丙酯或mPEG-N-羟基琥珀酰亚胺)与共价偶联的方法可购自Shearwater Corporation,Birmingham,Ala.(也参见引为参考的Weiner等,J.Biochem.Biophys.Methods,45:211-219(2000))。应该理解的是,具体偶联剂的选择取决于本发明组合物所用的递送载体的类型,这种选择无需过多的实验。
用本发明的组合物涂布支架
在又一个实施方案中,将本发明组合物的薄层共价或非共价地与支架的外表面结合。在该实施方案中,根据本领域已知的方法将支架表面制备成从分子上可接受本发明的组合物。如果需要,可使本发明的组合物沉积在多孔层中,该多孔层中含有聚合物,可通过聚合物控制本发明组合物的释放并且还避免本发明组合物降解。
含复合物的医学装置
在本发明医学装置的其它实施方案中,本发明的组合物通过在该医学装置形成之前,将本发明的组合物直接与医学装置中融化的聚合物混合与形成复合物,而由该医学装置体提供。例如,本发明的组合物可混合进例如硅酮橡胶或尿烷等材料中。然后通过常规方法,例如挤压、转移到模或铸造等加工以形成具体的构型。该方法得到的医学装置的优点是本发明的组合物可分散于整个医学装置主体中。因此,当该医学装置与身体组织、器官或液体接触时,本发明的组合物存在于该医学装置的外表面可发挥调节免疫应答的作用。
本发明还通过以下非限制性实施例得到说明。所有的科学和技术术语具有与本领域普通技术人员理解的相同的意义。以下的具体例子说明了本发明组合物的制备方法并且不能理解为是对本发明范围的限制。可修改这些方法来生产本发明包括但未明确披露的组合物。此外,以略有变化的方式来生产相同组合物的这些方法的变化形式对本领域技术人员也是显而易见的。
实施例
本文的实施例目的是举例说明实施本发明的各种方面而绝非限制本发明。
实施例1
脂质体通过模式识别受体的配体(PRRL)激活后显著提高了天然免疫力的活性
和IFN-γ释放
对阳离子脂质体提高PRRL引发的免疫激活的能力在体外使用脾细胞试验作评估。脾细胞从正常ICR小鼠制备并以5×106/ml浓度加入24孔板的每个孔中。含有质粒DNA(“DNA”)、CpG寡聚核苷酸(“CpG”)、咪唑并喹啉(R-848;InVivogen)和纯化的大肠杆菌内毒素(“LPS”)的一系列不同的PRRL与阳离子脂质体混合以形成复合物。使用等摩尔量的DOTIM(十八烯氧基-乙基-2-十七碳烯基-3-羟乙基)(octadecenoyloxy-ethyl-2-heptadecenyl-3-hydroxyethyl)和胆固醇制备阳离子脂质体并用0.5%的葡萄糖水溶液复水。为形成特定的PRRL-脂质体复合物,将30μmol阳离子脂质体加入30μl 0.5%的葡萄糖水溶液中,然后加入3μg各种PRRL并用移液器混合。为比较免疫刺激活性,将2.5μl的脂质体-PRRL复合物加入每孔脾细胞中使PRRL终浓度为500ng/ml。向其它孔中单加PRRL(50ng/ml)或脂质体。细胞培养物孵育18小时,然后收集上清液并用商业ELISA试验(R & D***)分析其IFN-γ的浓度。然后如图1所示对IFN-γ浓度进行作图。这些结果表明与单用PRRL相比,脂质体-PRRL复合物是更强的免疫应答和IFN-γ释放的激活剂。此外,这些结果说明这种脂质体(以及其它潜在的递送***)在总体上能充分改变各种PRRL的免疫刺激性能。
实施例2
脂质体通过模式识别受体的配体(PRRL)激活后改变了IL-10的释放
用实施例1所述的脾细胞试验评估了脂质体提高天然免疫***的一种关键性免疫抑制细胞因子释放的能力。PRRL(和或不和脂质体一起)以终浓度500ng/ml加入后,培育18小时。然后用ELISA测定来评估释放进上清液的IL-10。出乎意料的是,图2的数据显示脂质体与PRRL组合可通过促进IL-10的释放(例如,用DNA或R-848作为PRRL)或抑制IL-10的释放(例如,用CpG或LPS作为PRRL)而显著改变PRRL的免疫学性能。例如,与单用LPS相比,脂质体-LPS强烈抑制了IL-10的释放,而脂质体-R848象脂质体-CpG一样实际上增加了IL-10的释放。因此,脂质体-TLR配体复合物的形成以TLR-配体特异性方式改变了该配体本身所引发的细胞因子的释放。细胞因子释放的改变包括刺激与抑制两种作用。在体内,细胞因子释放的这种改变可能具有产生T细胞和B细胞应答的重要结果。这些资料再次证实通过加入脂质体或其它运载体分子可充分改变PRRL的免疫学性能。
实施例3
脂质体通过模式识别受体的配体(PRRL)激活后改变TNF-α的释放
使用实施例1所述的脾细胞试验评估了脂质体提高天然免疫***的第二种关键性刺激性细胞因子的释放的能力。PRRL(和或不和脂质体一起)以终浓度500ng/ml加入后,培育18小时。然后用ELISA测定来评估释放进上清液的TNF-α。图3显示的数据说明,与单用PRRL相比,脂质体与PRRL的复合物是更强的免疫刺激剂进一步支持了可通过脂质体来改变PRRL性能的原理。
实施例4
体外脂质体通过与模式识别受体的配体(PRRL)接触后改变了对树突状细胞的
激活的调节
脾细胞与终浓度为500ng/ml的PRRL(和或不和脂质体一起)一起孵育18小时。然后收集脾细胞对细胞表型标记(例如,巨噬细胞和树突状细胞标记)的表面表达以及早期激活标记CD69的表达进行免疫染色。然后通过流式细胞术分析细胞并测定了CD69在树突状细胞上的表达。CD69的细胞表面表达表示为平均荧光强度(MFI)。如CD69表达的上调所反映的,这些实验发现与脂质体形成复合物的PRRL(就质粒DNA和CpG寡聚核苷酸而言)提高了细胞激活,参见图4。因此,如CD69表达额外上调所反映的,脂质体也可用于改变PRRL的细胞激活性能。
实施例5
与脂-DNA复合物混合的肽或蛋白抗原
使用与脂质-DNA复合物混合的肽或蛋白抗原进行实验来直接评估抗原特异性应答。在这些实验中使用MHC-肽四聚体来定量测定CTL数目和分布。使用Kb-ova8四聚体在C57B16小鼠中追踪用ova和优势的CTL表位肽(SIINFEKL;ova8)免疫的CTL应答。Kb-ova8四聚体由Ross Kedl,国家犹太医学与研究中心(NationalJewish Medical and Research Center),Denver,Colorado提供。这些实验使用较低剂量的肽或蛋白(一般每次免疫每只小鼠接种1-5mg)来评估免疫的效果。出乎意料地发现,用非编码质粒DNA和ova8肽一起配制的脂质体-抗原-核酸复合物(LANAC)极其有效地引发了CTL应答(图5,右下图)。为分析LANAC免疫的效力,小鼠也用经ova8肽脉冲的自体骨髓衍生的树突状细胞(DC)免疫和用四聚体评估CTL应答。这些研究表明,与树突状细胞疫苗接种相比,LANAC疫苗具有强烈的引发对肽抗原的免疫应答的能力。
CD8+T细胞对I类MHC四聚体(H-2Kb)和模型抗原(卵白蛋白)的应答反应用于定量测定CD8+T细胞对肽抗原免疫的应答反应(图5,左上图)。每只C57B16小鼠(每组3-4只)免疫接种两次,隔一周用体外以LPS激活,然后用1mM Kb-结合ova8肽(SIINFEKL)脉冲的1×106自体骨髓衍生的树突状细胞(DC)免疫。使用DC通过SC途径(图5,右上图)或IP途径(图5,左下图)免疫小鼠。另一组小鼠(图5,右下图)用LANAC配制的5mg ova8肽免疫,然后经IP注射。第二次免疫5天后,收集脾细胞不作体外再次刺激立即用Kb-ova8四聚体(PE-标记的)染色,然后用CD8-APC、CD44-FITC和II类MHC-PE/Cy5抗体染色。对所有CD8+(排除II类MHC+细胞后)进行门控并分析四聚体和CD44染色情况;CD44高染色T细胞代表记忆CTL染色。四聚体+细胞的数目表示为所分析的CD8+细胞总数的百分比。用LANAC配制的ova8肽免疫诱导了比用ova8-脉冲的DC(脾CD8T细胞总数的10%为Ag特异性,而DC疫苗接种后为1-2%)更强的CTL应答(图3,右上幅)。与SC或IM途径相比,用LANAC经IP途径免疫是诱导T细胞应答的最有效途径(数据未在文中显示)。
实施例6
LANAC与“交叉敏化”
进行一项实验来测试LANAC是否可用于有效地“交叉敏化”对蛋白抗原的CTL应答。就这些实验而言,完整的ova蛋白(经小心过滤以除去任何小分子量的肽)代替肽加入LANAC中并如实施例5所述免疫小鼠。第二次免疫5天后,使用Kb-ova8四聚体评估脾脏中的CTL应答。出乎意料的是,LANAC在交叉敏化对蛋白抗原的CTL应答中非常有效(图6,中间图)。LANAC引发的对蛋白抗原的CTL应答比相同量(重量)的肽抗原的应答强1.5倍。因为能引发对蛋白抗原的CTL应答使得最终可能用完整的蛋白抗原来免疫人,而无需考虑MHC背景或靶抗原肽的特异性,这些结果非常重要。此外,该***的应答用非复制***引发,而以前证实的最好的CTL应答用复制性载体引发,所述复制性载体例如是病毒(牛痘病毒、腺病毒)或重组细菌(沙门氏菌、李斯特菌)。II类MHC四聚体用于证实LANAC***能引发强烈的CD4T细胞应答。用MCC抗原免疫的小鼠产生了超过用DC免疫引发的强烈的CD4应答(数据未显示于文中)(图6,右图)。因此,LANAC配制的疫苗能引发强烈和平衡的对蛋白抗原的T细胞应答。
实施例7
与其它常规疫苗相比,LANAC疫苗引发CTL应答的效力
使用Kb-ova8四聚体评估用肽(图7A)或蛋白(图7B)免疫后Ag特异性CTL应答的强度。用完全弗氏佐剂配制的50mg肽或经肽(1mm)-脉冲的DC引发对肽的免疫应答。就蛋白疫苗接种而言,通过IV注射用编码Ova的牛痘病毒、经两侧IM注射用100mg编码ova的质粒DNA或用经ova蛋白脉冲的DC来免疫小鼠。每只小鼠用含有5mg肽或蛋白的LANAC免疫,然后如实施例6所述分析脾细胞的四聚体应答。这些数据表明LANAC疫苗在引发CTL应答方面也优于其它常规类型的疫苗。
比较了LANAC疫苗与其它常规疫苗在引发CTL应答中的效力,所述常规疫苗包括肽递送***(肽脉冲的DC,以完全弗氏佐剂配制的肽)和蛋白疫苗(ova-DNA疫苗、ova-牛痘病毒、ova-脉冲的DC)。免疫C57B16小鼠(每组4只小鼠)并评价脾脏中的CTL应答。在各种情况中,特别是蛋白疫苗,LANAC配制的疫苗明显更好(图7A)。
实施例8
脂质体提高作为疫苗佐剂的PRRL引发CTL应答的能力
在小鼠中进行实验来确定在不同的PRRL中加入脂质体是否可提高PRRL作为疫苗佐剂的能力。评估PRRL包含有质粒DNA、CpG寡聚核苷酸、聚I:C(合成的ds-RNA模拟物)、酵母聚糖(得自酵母细胞壁)、与R-848和LPS。使用能定量测定体内卵白蛋白特异性CD8+T细胞(CTL)应答的MHC-肽四聚体试剂评估了C57B16小鼠对模型抗原卵白蛋白的免疫应答。用5μg卵白蛋白与不同的脂质体-PRRL复合物疫苗一起免疫小鼠两次,间隔一周,然后用MHC-肽四聚体和流式细胞术分析脾和肺细胞。为制备不同的疫苗,脂质体先加入到1ml 5%的葡萄糖水溶液中,接着加入100μg的各种特异性PRRL,再加入卵白蛋白。通过IP途径用200μl脂质体-PRRL复合物免疫小鼠。然后收集脾细胞并首先用MHC-肽四聚体作免疫染色,接着用CD8和CD44染色。然后用流式细胞术分析细胞并基于每个处理组3只小鼠的组大小计算抗原特异性CTL的平均百分比。对照小鼠未接着疫苗。示于图8的这些实验结果表明,含PRRL DNA、CpG寡聚物、聚I:C、酵母聚糖和R-848的脂质体复合物均可作为有效的疫苗佐剂在体内引发CTL应答。相反,脂质体-LPS不是有效的疫苗佐剂。也发现仅与卵白蛋白一起施用的DNA或CpG寡聚物,或脂质体只加上卵白蛋白不能有效地引发CTL应答(数据未显示)。因此,将运载体分子(例如脂质体)加入PRRL可显著提高其作为疫苗佐剂的效力,特别是用于引发CTL应答。
实施例9
脂质体-PRRL复合物也可作为引发肺中CTL应答的有效疫苗佐剂
进行以上实施例8所述的实验来确定脂质体-PRRL复合物是否也可引发肺组织中的强烈CTL应答。这种T细胞应答对抵御吸入性病原体(例如流感病毒)的免疫应答中特别需要。用卵白蛋白第二次免疫后收集肺细胞并用MHC-肽四聚体分析肺细胞来定量测定卵白蛋白特异性CTL应答。如图9所示,与脾脏应答相比,除了在肺中酵母聚糖更有效而R-848无效外,发现肺中对用脂质体-PRRL疫苗佐剂免疫的CTL应答的模式类似于图8所示的免疫小鼠的脾脏应答。因此,这数据表明,除了在淋巴组织中(例如脾脏)有应答外,脂质体-PRRL疫苗佐剂也能在外周组织(例如肺)中有效地引发T细胞应答。
实施例10
确定3部分的脂质体-抗原-核酸复合物是否为有效免疫所需
为确定3部分的脂质体-抗原-核酸复合物是有效免疫所需,用结合有各种脂质体和DNA组合的5μg ova蛋白经通过IP途径免疫小鼠。将Ova蛋白加入等量的单独质粒DNA(图10,第一图)中、单独的脂质体(图10,第二图)或脂质体加上DNA中(图10,第三图)(“ova/LADC”;注意:“LADC”表示与“LANAC”相同的制剂)。收集脾细胞用Kb-ova8四聚体染色来定量测定CTL应答。与用脂质-DNA复合物引发的应答相比,观察到单用DNA或脂质体的CTL应答极其微弱,这表明脂质体、TLR配体和抗原的3部分的组合确实是有效免疫所需的。
实施例11
用脂质体-核酸复合物免疫引发的T细胞的功能能力
也进行了实验来评估用脂质体-核酸复合物免疫引发的T细胞的功能能力。将用LANAC配制的ova8肽(示于图11A)或肽-脉冲的DC(示于图11B)免疫的小鼠(每组4只)的脾细胞在体外用ova8肽再次刺激,用ELISA评估IFN-γ的产生。用LANAC配制的ova8肽或DC疫苗免疫的小鼠的T细胞产生了高水平的IFN-γ释放,而仅用LANAC配制的ova蛋白(和不用ova脉冲的DC)不引发CTL的IFN-γ释放。使用其它抗原(包括仙台病毒、灭活的RSV、RSV M2肽、黑色素瘤trp-2抗原和KLH蛋白)的LANAC免疫通过在体外使培养的T细胞与抗原接触也引发了高水平的IFN-γ产生(数据未示于文中)。此外,LANAC免疫小鼠(ovq8或trp2肽)的T细胞在体外再次刺激5天后也产生了高水平的特异性CTL活性(数据未示于文中)。这些数据表明LANAC免疫确实能引发对各种抗原的功能性Th1和Tc1T细胞细胞因子应答。
实施例12
脂质体-核酸疫苗接种引发体液应答的能力
还用ova-LANAC***(但是在BALB/c小鼠中)评估了脂质体-核酸疫苗接种引发体液应答的能力。参见图12A,用10μg以LANAC或完全弗氏佐剂(CFA)配制的ova(蛋白)经SC途径免疫BALB/c小鼠两次(间隔两周),用ELISA测定收集的连续血清样品的抗ova抗体滴度(图12B)。用LANAC经SC免疫引发的抗体应答几乎与CFA引发的相等。经IP途径免疫的小鼠产生了更高的滴度,平均滴度为1∶1,300,000。用其它抗原,包括KLH免疫动物后也观察到了类似的滴度(数据未示于文中)。因此,脂质体-核酸复合物也非常有效地诱导了体液免疫力。这些数据进一步表明,如四聚体染色所评估的,CTL应答确实是强烈的CD4T细胞和体液免疫应答的有力预兆。
实施例13
评估对LANAC疫苗接种的T细胞记忆应答
进行了一系列实验来评估对LANAC疫苗接种的T细胞记忆应答。用ova-LANAC通过IP途径免疫两次后,通过酶消化小鼠的肺组织获得CD8+T细胞,使用kb-ova8四聚体进行分析。免疫后5天(图13,上两幅)和免疫后30天(图13,下两幅)定量测定对照组和疫苗接种组小鼠(每组3只)的四聚体阳性细胞。以tet+细胞占肺CD8T细胞总数的平均百分比作图。虽然在免疫两周时有大量的CTL应答,但有争议的是这些T细胞实际上是短命的会快速消失。
用四聚体检查了CTL记忆细胞,包括淋巴器官和外周组织。已知,例如小鼠的病毒感染最初导致淋巴器官中的Ag特异性T细胞的大规模扩增,然后这些长寿记忆CTL扩散至非淋巴组织中,包括肺。用ova-LANAC免疫后确实观察到发生了相同的现象。在第二次IP免疫后第5天的肺组织中,发现抗原特异性CTL的大量扩增,其数量与LCMV感染后观察到的相当(图13)。特别是,这些小鼠的肺细胞中,每3个CD8+T细胞中有两个是ova特异性的。在肝脏中也观察到了大量的ova特异性CTL(数据未示于文中)。可能同样重要的是,发现外周组织中的这些CTL也是长寿的。第二次免疫后第30天检查小鼠,肺CD8+T细胞总数的约30%仍然是ova特异性的,60天时该数目依旧很高(未显示)。此外,当在体外用ova肽再次刺激(接种后)30天小鼠的脾细胞时,它们仍能产生高水平的IFN-γ(数据未示于文中)。因此,用LANAC免疫产生了极大量的长时间存在于肺和其它组织的记忆性CTL。肺组织中存在大量的长寿记忆性T细胞是提高对吸入性病原体(例如,耶尔森菌属(Yersinia))的快速应答的很理想的状况。
实施例14
评估经粘膜施用LANAC引发局部和全身性免疫应答的能力
因为使用LANAC作胃肠外免疫非常有效,故评估了经粘膜施用LANAC引发局部和全身性免疫应答的能力。用5mg/小鼠的ova-LANAC口服(图14,中间一幅)或鼻内途径(图14,右边一幅)免疫小鼠两次,然后用四聚体定量测定Ag特异性CTL应答。通过酶消化收集肺细胞,对活的脾脏淋巴细胞用流式细胞术进行门控分析。
用四聚体检测到鼻内免疫在肺中引发了相当强的CTL应答(图14,右一幅)。然而,最令人感到意外的是口服施用5mg ova蛋白在引发全身性CTL应答中非常有效,包括血液、脾脏、肝脏和肺(图14,中间一幅)。事实上,口服对引发CTL应答与SC或IM免疫同样有效。同等重要的是,如经离体再刺激后产生高水平的IFN-γ所证实的那样,口服免疫引发的CTL是长寿(至少60天)和功能性的(数据未示于文中)。因此,使用脂质体-TLR配体复合物作为佐剂的蛋白疫苗口服途径免疫可能是一种粘膜疫苗接种的快速方法。
实施例15
评估和比较LANAC分布到淋巴器官中的效率
使用BODIPY标记的脂质体进行实验来评估和比较LANAC分布到淋巴器官中的效率。确定了用LANAC经SC或IP途径免疫的6小时或24小时后标记的复合物是否可在在***中鉴定到。在腹部两侧SC免疫后,收集腹股沟***,而在IP免疫后收集肠系膜***。用CD 11b、CD 11c和II类MHC的抗体染色***细胞作流式细胞术分析。对活细胞设置分析闸门使只有结合了LANAC的细胞得到分析。免疫接种两处部位的***中均发现复合物,但在IP免疫后LANAC在引流***中的分布配更有效(图15)。该复合物主要包含在CD11b h1、CD11c lo和II类中介细胞内。IP免疫后,在腹膜液体中观察到与该相同的细胞群结合的标记复合物。因此,看来IP注射后LANAC在***中的摄取更有效,这与IP注射后引发的T细胞应答强于SC或iv后引发有关(数据未示于文中)。图15所示的含有标记的LANAC迁移至肠系膜***的细胞具有与巨噬细胞最一致的表型。然而,几种出版物现已证实在腹膜腔内存在树突状细胞。这些处于静息状态下的细胞通常具有巨噬细胞样形态,但可通过炎性刺激或用不同细胞因子的混合物,特别是GM-CSF+/-TNF-α诱导分化为典型的树突状细胞。因此,情况很可能是在注射后,真正的巨噬细胞以及巨噬细胞样的树突状细胞前体细胞均存在腹膜的胞吞LANAC中。一旦这些前-DC摄取了此复合物,它们通过TLR接受了激活信号,成熟为更典型的DC,然后迁移至进行抗原呈递的区域***。在皮肤中,情况可能是典型的DC(例如朗格汉斯细胞)对LANAC摄取和抗原呈递更重要。
实施例16
制备阳离子脂质DNA复合物(CLDC)
如上所述(Solodin等,Biochemistry,34:13537-13544(1995),全文纳入作为参考),用于以下实验的阳离子脂质体(除非另有指出)由摩尔比为1∶1的DOTAP(1,2-二油酰-3-三甲铵-丙烷)和胆固醇混合而成,在圆底试管中干燥,然后用0.5%的葡萄糖溶液(D5W)加热至50℃、6小时复水。用类似于所述一些实验的方法制备其它脂质(例如,DOTMA)。该方法得到由多层脂泡(MLV)组成的脂质体,本发明人发现与小单层脂泡(SUV)相比,MLV具有最佳的转染效率。MLV和相关“挤压脂质”的产生也描述于Liu等,Nature Biotech.,15:167-173(1997)和Templeton等,NatureBiotech.,15:647-652(1997);二者均全文纳入作为参考。如前所述,使用改进的碱裂解法和聚乙二醇沉淀(Liu等,1997,同上)纯化大肠杆菌的质粒DNA(pCR3.1,Invitrogen)。将用于注射的DNA悬浮于蒸馏水中。真核DNA(鲑鱼睾丸和小牛胸腺)购自Sigma化学品公司(Sigma Chemical Company)。就本文报道的许多实验而言,所述质粒DNA不含有基因***物(除非另有注释),因此称为“非编码”或“空载体”DNA。
用于这些实验的阳离子脂质TLR-配体通过室温轻柔地将TLR配体加入用5%葡萄糖溶液(D5W)配制的脂质溶液中,然后轻柔地上下移液抽吸数次以保证适当的混合。TLR-配体∶脂质之比是1∶8(1.0μg的DNA与8nmol脂质)。复合物在制备后30-60分钟内使用。如上所述,为制备用于一些实验(所示的)中的小单层脂泡(SUV),使用上述MLV脂质体经过5分钟的超声波处理形成CLDC(Liu等,1997,同上)。
以上描述应理解为仅是对本发明主旨的描述。此外,因为许多改进和改变对本领域的技术人员是显而易见的,本发明不希望受限于上述显示的具体构建物和方法。因此,所有合适的改进和等价物均属于以下权利要求所限定的本发明范围内。当短语“含有”、“含有的”、“包括”和“包含的”用于本说明书和后面的权利要求书中时,其表示所述特征、整数、组分或步骤的存在,但它们不排除一种或多种其它特征、整数、组分、步骤或其组合的存在或加入。
Claims (150)
1.一种方法,所述方法包括:将含有至少一种模式识别受体分子的配体和递送载体的组合物施用至受试对象。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述模式识别受体的配体包括信号模式识别受体的配体。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述信号模式识别受体包括至少一种选自下组的受体:Toll样受体TLR-1、TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5、TLR-6、TLR-7、TLR-8、TLR-9、TLR-10、TLR-11和TLR-12和甘露聚糖结合凝集素,以及巨噬细胞甘露糖受体和清除受体。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述配体包括TLR-2、TLR-3和/或TLR-9的配体。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述模式识别受体的配体包括内吞模式识别受体或清除受体或甘露糖结合受体的配体。
6.如权利要求1所述的方法,还包括调节所述受试对象的免疫应答。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述调节免疫应答包括提高免疫应答。
8.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述调节免疫应答包括下调免疫应答。
9.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述调节免疫应答包括提高易患癌症的受试对象的免疫应答。
10.如权利要求9所述的方法,其特征在于,所述癌症包括以下一种或多种癌症:肺癌、皮肤癌、肝癌、骨髓癌、白血病、卵巢癌、乳腺癌、***癌、结肠癌、淋巴瘤、脑癌、肾细胞癌和间充质组织癌。
11.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述调节免疫应答包括提高易患感染性疾病的受试对象的免疫应答。
12.如权利要求11所述的方法,其特征在于,所述感染性疾病由以下一种或多种生物引起:病毒病原体、真菌病原体、细菌病原体、立克次氏体病原体、寄生虫病原体和朊病毒病原体。
13.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述调节免疫应答包括提高或抑制易患过敏性疾病的受试对象的免疫应答。
14.如权利要求13所述的方法,其特征在于,所述过敏性疾病由对内源性非自身抗原的异常免疫应答所引起。
15.如权利要求14所述的方法,其特征在于,所述非自身抗原包括吸入的过敏原、皮肤过敏原和口服过敏原中的至少一种。
16.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述调节免疫应答包括调节易患自身免疫疾病的受试对象的免疫应答。
17.如权利要求16所述的方法,其特征在于,所述自身免疫疾病由对自身抗原的异常免疫应答所引起。
18.如权利要求17所述的方法,其特征在于,所述对自身抗原的异常免疫应答由至少一种选自以下的抗原所引起:衍生自神经***的抗原、衍生自关节的抗原、衍生自血液成分的抗原、衍生自肾脏的抗原与衍生自眼睛的抗原。
19.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述调节免疫应答包括调节易患体内异常产生的蛋白质所致疾病的受试对象的免疫应答。
20.如权利要求16所述的方法,其特征在于,所述自身免疫疾病由异常产生的蛋白质所引起。
21.如权利要求20所述的方法,其特征在于,所述异常产生的蛋白质包括选自以下的蛋白质:脑中的异常蛋白、肾脏中的异常蛋白和关节中的异常蛋白。
22.如权利要求21所述的方法,其特征在于,所述脑中的异常蛋白包括阿尔茨海默病中的脑或血液中的异常蛋白。
23.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述施用包括至少通过一种选自以下的途径来施用:静脉内、腹膜内、吸入、皮下、真皮内、淋巴节内、肌肉内、鼻内、口服、直肠、***内、囊内、眼内和局部。
24.一种方法,所述方法包括:施用一种能诱导针对特定细胞类型的免疫应答的制剂,所述制剂能诱导针对该细胞类型的免疫应答并抑制该类型细胞的正常或异常功能。
25.如权利要求24所述的方法,其特征在于,所述特定细胞类型包括用于抑制新血管生成的内皮细胞。
26.一种方法,所述方法包括:施用能刺激新血管生成和/或纤维生成和/或骨生成的至少一种模式识别受体的配体和递送载体。
27.如权利要求26所述的方法,其特征在于,所述模式识别受体的配体与所述递送载体形成复合物。
28.如权利要求26所述的方法,其特征在于,所述模式识别受体选自TLR配体和其它模式识别受体。
29.如权利要求26所述的方法,还包括治疗患有创伤、骨缺陷或骨折的受试对象。
30.如权利要求29所述的方法,其特征在于,所述创伤包括皮肤或软组织的创伤或缺陷。
31.一种组合物,所述组合物包含:模式识别受体分子家族的配体;和递送载体,其中所述组合物能在受试对象中诱导免疫应答。
32.如权利要求31所述的组合物,其特征在于,所述诱导免疫应答包括诱导天然免疫应答。
33.如权利要求32所述的组合物,其特征在于,所述天然免疫应答包括巨噬细胞、中性白细胞、NK细胞和/或树突状细胞参与的天然免疫应答。
34.如权利要求31所述的组合物,其特征在于,所述递送载体包括脂质体。
35.如权利要求34所述的组合物,其特征在于,所述脂质体的毫摩尔数与配体的毫克数之比约为1∶1-100∶1。
36.如权利要求34所述的组合物,其特征在于,所述脂质体的毫摩尔数与配体的毫克数之比约为16∶1或约为8∶1。
37.如权利要求34所述的组合物,其特征在于,所述脂质体至少包括选自带正电的脂质体、带负电的脂质体和中性脂质体中的一种。
38.如权利要求31所述的组合物,其特征在于,所述递送载体包括脂质体的任何组合。
39.如权利要求37所述的组合物,其特征在于,所述带正电的脂质体与模式识别受体分子家族的配体形成复合物。
40.如权利要求34所述的组合物,其特征在于,所述脂质体由摩尔比为1∶1的DOTIM(1-(2-(油酰氧)乙基)-2-油烯基-3-(2-羟乙基)咪唑啉鎓)的荷电和电中性脂质与胆固醇的混合物组成。
41.如权利要求31所述的组合物,其特征在于,所述递送载体是非脂质体。
42.如权利要求30所述的组合物,其特征在于,所述非脂质体输送载体包括至少一种选自以下的载体:多肽、多胺、壳聚糖、PEI、聚谷氨酸、硫酸精蛋白和微球。
43.如权利要求34所述的组合物,其特征在于,所述配体包括TLR配体。
44.如权利要求43所述的组合物,其特征在于,所述TLR配体含有细菌的某一部分。
45.如权利要求44所述的组合物,其特征在于,所述细菌的某一部分还包括与TLR结合的细菌的某一部分。
46.如权利要求45所述的组合物,其特征在于,所述TLR配体包括与TLR-1、TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5、TLR-6、TLR-7、TLR-8、TLR-9、TLR-10、TLR-11和TLR-12中任何一个结合的细菌的某一部分。
47.如权利要求43所述的组合物,其特征在于,所述TLR配体包括真菌生物的某一部分。
48.如权利要求47所述的组合物,其特征在于,所述TLR配体包括能与TLR结合的真菌生物的某一部分。
49.如权利要求37所述的组合物,其特征在于,所述真菌生物的某一部分还包括与以下至少一种受体结合的酵母的某一部分:TLR-1、TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5、TLR-6、TLR-7、TLR-8、TLR-9、TLR-10、TLR-11和TLR-12。
50.如权利要求43所述的组合物,其特征在于,所述TLR配体包括多细胞生物的某一部分。
51.如权利要求43所述的组合物,其特征在于,所述TLR配体包括单细胞生物的某一部分。
52.如权利要求31所述的组合物,其特征在于,所述配体包括至少一种选自以下的物质:衍生自细菌病原体某一部分的糖蛋白、脂蛋白、糖脂、糖类、脂质、核酸和/或蛋白或肽序列。
53.如权利要求52所述的组合物,还包括与以下至少一种受体结合的细菌病原体的某一部分:TLR-1、TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5、TLR-6、TLR-7、TLR-8、TLR-9、TLR-10、TLR-11和TLR-12。
54.如权利要求31所述的组合物,其特征在于,所述配体包括至少一种选自以下的配体:与TLR-1、TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5、TLR-6、TLR-7、TLR-8、TLR-9、TLR-10、TLR-11和TLR-12中的一种或多种结合的衍生自真菌生物某一部分的糖蛋白、脂蛋白、糖脂、糖类、脂质、核酸和/或蛋白或肽序列。
55.如权利要求31所述的组合物,其特征在于,所述配体包括衍生自真菌生物某一部分的糖蛋白、脂蛋白、糖脂、糖类、脂质、核酸与和/或蛋白或肽序列。
56.如权利要求31所述的组合物,其特征在于,所述配体包括衍生自病毒生物某一部分的糖蛋白、脂蛋白、糖脂、糖类、脂质、核酸与和/或蛋白或肽序列。
57.如权利要求31所述的组合物,其特征在于,所述配体包括衍生自立克次氏体生物某一部分的糖蛋白、脂蛋白、糖脂、糖类、脂质、核酸与和/或蛋白或肽序列。
58.如权利要求31所述的组合物,其特征在于,所述配体包括衍生自寄生虫生物体某一部分的糖蛋白、脂蛋白、糖脂、糖类、脂质、核酸与和/或蛋白或肽序列。
59.如权利要求31所述的组合物,其特征在于,所述配体包括衍生自节肢动物生物体某一部分的糖蛋白、脂蛋白、糖脂、糖类、脂质、核酸和/或蛋白或肽序列。
60.如权利要求31所述的组合物,其特征在于,所述配体含有编码TLR配体的核酸。
61.如权利要求60所述的组合物,其特征在于,所述核酸含有至少一种选自以下的分子:细菌DNA、真核DNA、dsDNA、ssDNA合成的寡聚核苷酸、RNA和合成的RNA。
62.如权利要求61所述的组合物,其特征在于,所述寡聚核苷酸含有聚I:C或相关的聚I:C寡聚核苷酸的至少一种。
63.如权利要求31所述的组合物,其特征在于,所述配体是两种或多种不同的TLR配体以足够引发免疫应答的比例相混合的混合物。
64.如权利要求31所述的组合物,其特征在于,所述配体由能结合和/或刺激模式识别受体的任何分子组成。
65.如权利要求31所述的组合物,其特征在于,所述配体包括能结合并刺激模式识别受体的合成产生的配体。
66.如权利要求31所述的组合物,还包含有具有甾体骨架的任何分子。
67.如权利要求60所述的组合物,还包含有DNA凝聚剂。
68.如权利要求67所述的组合物,其特征在于,所述DNA凝聚剂是聚乙烯亚胺(PEI)。
69.一种组合物,所述组合物含有:
至少一种抗原;和
一种含有递送载体的佐剂组合物;和至少一种模式识别受体分子的配体。
70.如权利要求69所述的组合物,还含有与所述递送载体形成复合物的所述抗原和所述模式识别分子受体的配体。
71.如权利要求69所述的组合物,其特征在于,所述模式识别分子受体的配体包括TLR受体的配体。
72.如权利要求69所述的组合物,其特征在于,所述抗原含有整个微生物。
73.如权利要求72所述的组合物,其特征在于,所述微生物包括至少一种选自下组的生物:病毒生物、细菌生物、真菌生物、原虫生物、寄生虫致病性生物、立克次氏体生物和节肢动物生物。
74.如权利要求69所述的组合物,其特征在于,所述抗原包括至少一种选自以下的分子:蛋白、肽、糖类、脂蛋白、糖肽、糖蛋白、糖脂和脂质。
75.如权利要求69所述的组合物,其特征在于,所述抗原是细胞。
76.如权利要求75所述的组合物,其特征在于,所述细胞由一种或多种自体或同种异体肿瘤细胞组成。
77.如权利要求69所述的组合物,其特征在于,所述递送载体包括脂质体。
78.如权利要求69所述的组合物,其特征在于,所述递送载体包括选自以下的脂质:多层脂泡脂质、挤压脂质体和单层脂质体。
79.如权利要求77所述的组合物,其特征在于,所述脂质体包括至少一种选自以下的脂质体:带正电的脂质体、改进的多层脂质体、阳离子脂质体、中性脂质体和带负电的脂质体。
80.如权利要求69所述的组合物,其特征在于,所述递送载体含有至少一对以下脂质:DOTMA和胆固醇;DOTAP和胆固醇;DOTIM和胆固醇;DDAB和胆固醇。
81.如权利要求69所述的组合物,其特征在于,所述递送载体包括非脂质体输送载体。
82.如权利要求81所述的组合物,所述递送载体包括至少一种选自以下的载体:多肽、多胺、壳聚糖、PEI、聚谷氨酸、硫酸精蛋白和三氯酚。
83.一种疫苗接种的方法,所述方法包括:向受试对象施用抗原组合物;和含有递送载体的佐剂组合物;以及TLR配体。
84.如权利要求83所述的方法,还包括所述递送载体与所述抗原和所述TLR配体形成复合物。
85.如权利要求83所述的方法,还包括通过选自以下的途径施用所述组合物:静脉内、腹膜内、吸入、皮下、真皮内、结节内、肌肉内、鼻内、口服、直肠、***内、囊内、眼内和局部。
86.如权利要求83所述的方法,还包括提高易患癌症的受试对象的免疫应答。
87.如权利要求86所述的方法,其特征在于,所述癌症包括至少一种以下癌症:肺癌、皮肤癌、肝癌、骨髓癌、卵巢癌、乳腺癌、***癌、结肠癌、淋巴瘤、脑癌、肾细胞癌和间充质组织癌。
88.如权利要求83所述的方法,还包括提高易患感染性疾病的受试对象的免疫应答。
89.如权利要求88所述的方法,其特征在于,所述感染性疾病包括至少一种由以下生物引起的疾病:病毒病原体、真菌病原体、细菌病原体、立克次氏体病原体、寄生虫病原体、节肢动物病原体和朊病毒病原体。
90.一种组合物,所述组合物含有:含有至少一种抗原、递送载体和模式识别受体分子的至少一种配体的佐剂组合物。
91.如权利要求90所述的组合物,还含有掺入所述递送载体中,然后与模式识别分子受体的配体相混合的所述抗原。
92.如权利要求91所述的组合物,其特征在于,所述模式识别分子受体的配体包括TLR配体。
93.如权利要求90所述的组合物,其特征在于,所述递送载体含有脂质体。
94.如权利要求93所述的组合物,其特征在于,所述TLR配体的纳克数与脂质体的纳摩尔数之比约为1∶1-100∶1。
95.如权利要求93所述的组合物,其特征在于,所述脂质体由至少一种选自以下的分子组成:带正电的脂质体、带负电的脂质体、阳离子脂质体和改进的多层脂质体。
96.如权利要求95所述的组合物,其特征在于,所述阳离子脂质体还包括与细菌DNA形成复合物的所述阳离子脂质体。
97.如权利要求90所述的组合物,其特征在于,所述递送载体由荷电与中性脂质的混合物组成。
98.如权利要求90所述的组合物,其特征在于,所述TLR配体含有能与TLR结合的细菌的某一部分。
99.如权利要求90所述的组合物,其特征在于,所述TLR配体含有细菌的细胞壁成分。
100.如权利要求90所述的组合物,其特征在于,所述TLR配体结合至少一种选自以下的受体:TLR-1、TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5、TLR-6、TLR-7、TLR-8、TLR-9、TLR-10、TLR-11和TLR-12。
101.如权利要求90所述的组合物,其特征在于,所述TLR配体结合TLR 2、TLR 5或TLR 9。
102.如权利要求90所述的组合物,其特征在于,所述TLR配体含有鞭毛蛋白。
103.如权利要求102所述的组合物,其特征在于,所述鞭毛蛋白含有能结合并激活TLR 5的鞭毛蛋白的最小部分。
104.如权利要求90所述的组合物,其特征在于,所述TLR配体含有核酸。
105.如权利要求104所述的组合物,其特征在于,所述核酸包括至少一种选自以下的分子:细菌DNA、真核DNA、合成的寡聚核苷酸物和RNA。
106.如权利要求105所述的组合物,其特征在于,所述RNA包括至少一种选自以下的分子:双链RNA、单链RNA和合成的RNA。
107.如权利要求90所述的组合物,其特征在于,所述TLR配体含有能结合TLR3的聚I:C和聚I:C相关寡聚核苷酸中的至少一种。
108.如权利要求90所述的组合物,其特征在于,所述TLR配体含有真菌或酵母菌生物的某一部分。
109.如权利要求108所述的组合物,所述真菌或酵母菌生物的该部分含有该生物体的细胞壁的某一部分。
110.如权利要求90所述的组合物,其特征在于,所述TLR配体含有两种或多种不同的TLR配体以足够引发免疫应答的比例混合的混合物。
111.如权利要求90所述的组合物,其特征在于,所述TLR配体由能结合和/或刺激TLR的任何配体组成。
112.一种治疗患癌症的受试对象的方法,所述方法包括:
与至少一种癌症治疗方法相结合,施用至少一种模式识别受体的配体和递送载体;其中所述方法能引发易患癌症的受试对象的免疫应答。
113.如权利要求112所述的组合物,其特征在于,所述癌症治疗方法包括高温疗法、放疗、化疗、光动力学疗法(PDT)、外科手术、超声波和聚焦超声波的至少一种。
114.如权利要求112所述的方法,其特征在于,给予所述疗法的顺序不同会产生不同的应答。
115.如权利要求114所述的方法,其特征在于,先进行放疗。
116.如权利要求114所述的方法,其特征在于,最后进行放疗。
117.如权利要求114所述的方法,其特征在于,同时进行放疗。
118.如权利要求112所述的方法,其特征在于,所述模式识别受体的配体含有核酸分子。
119.如权利要求112所述的方法,其特征在于,所述模式识别受体的配体含有细菌DNA。
120.如权利要求112所述的方法,其特征在于,所述递送载体含有脂质体。
121.如权利要求112所述的方法,其特征在于,所述递送载体包括非脂质体输送载体。
122.一种方法,所述方法包括:用含有至少一种模式识别分子受体的配体和递送载体的组合物涂布医学装置。
123.如权利要求122所述的方法,其特征在于,所述医学装置包括植入的装置。
124.如权利要求123所述的方法,其特征在于,所述植入装置由至少一种以下装置组成:导管、支架、网孔修补材料、涤纶血管假体、矫型金属板、金属条和螺丝。
125.如权利要求122所述的方法,其特征在于,所述递送装置包括缓释颗粒和递送载体。
126.如权利要求125所述的方法,其特征在于,所述递送载体含有脂质体。
127.如权利要求126所述的方法,其特征在于,所述脂质体还含有与惰性基质或缓释生物材料相结合的脂质体。
128.如权利要求127所述的方法,其特征在于,所述惰性基质包括至少一种选自以下的材料:胶原、明胶、PLA(已定义)微球、血清凝块和有机凝胶。
129.一种方法,所述方法包括:向受试对象施用含有至少一种模式识别分子受体的配体;递送装置以及放射疗法的组合。
130.如权利要求129所述的方法,其特征在于,所述模式识别分子受体的配体包括信号模式识别受体的配体。
131.如权利要求129所述的方法,其特征在于,所述模式识别分子受体的配体包括模式识别受体的配体。
132.如权利要求129所述的方法,还包括提高所述受试对象的免疫应答。
133.如权利要求132所述的方法,其特征在于,所述提高免疫应答包括提高易患癌症的受试对象的免疫应答。
134.如权利要求133所述的方法,其特征在于,所述癌症包括至少一种选自以下的癌症:肺癌、皮肤癌、肝癌、骨髓癌、脑癌、肾细胞癌、卵巢癌、乳腺癌、***癌、间充质组织癌、淋巴瘤和结肠癌。
135.如权利要求129所述的方法,其特征在于,给予所述疗法的顺序不同可产生不同的应答。
136.如权利要求135所述的组合物,其特征在于,先进行放疗。
137.如权利要求135所述的方法,其特征在于,最后进行放疗。
138.如权利要求135所述的方法,其特征在于,同时进行放疗。
139.如权利要求129所述的方法,其特征在于,所述配体含有能结合模式识别受体的合成化合物。
140.如权利要求139所述的方法,其特征在于,所述合成化合物含有咪唑并喹啉(immadazoquinoline)。
141.一种试剂盒,所述试剂盒装有:
递送容器;
递送装置;
至少一种模式识别受体的配体;和
有或没有某种抗原;
其中所述配体能引发受试对象的免疫应答。
142.如权利要求141所述的试剂盒,还装有一种或多种化疗制剂。
143.一种方法,所述方法包括:向受试对象施用含有至少一种模式识别分子受体的配体;和递送载体的组合物,其中所述组合物能提高骨愈合。
144.如权利要求143所述的方法,其特征在于,在骨移植之前施用所述组合物。
145.如权利要求143所述的方法,其特征在于,所述配体用缓释材料包裹。
146.一种方法,所述方法包括:
向受试对象施用含有至少一种模式识别分子受体的配体;和
一种递送载体的组合物,其中所述组合物能减轻损伤。
147.如权利要求146所述的方法,其特征在于,所述损伤包括至少一种氧化应力损伤和/或凋亡介导的损伤。
148.如权利要求147所述的方法,其特征在于,所述损伤包括粘膜炎、浆膜炎、薄壁组织损伤、多次灌注损伤、或放疗和/或化疗相关的损伤。
149.如权利要求146所述的方法,其特征在于,所述组合物还能诱导天然免疫应答。
150.如权利要求146所述的方法,其特征在于,所述组合物施用至晚期受试对象。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US10/621,254 US20050013812A1 (en) | 2003-07-14 | 2003-07-14 | Vaccines using pattern recognition receptor-ligand:lipid complexes |
US10/621,254 | 2003-07-14 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101304759A true CN101304759A (zh) | 2008-11-12 |
Family
ID=34062954
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNA2004800237863A Pending CN101304759A (zh) | 2003-07-14 | 2004-06-08 | 使用模式识别的受体-配体:脂质复合物的疫苗 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20050013812A1 (zh) |
EP (1) | EP1648379A4 (zh) |
JP (1) | JP2007530430A (zh) |
CN (1) | CN101304759A (zh) |
AU (1) | AU2004262523A1 (zh) |
CA (1) | CA2532140A1 (zh) |
WO (1) | WO2005013891A2 (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102300556A (zh) * | 2008-12-26 | 2011-12-28 | 株式会社三养社 | 含有阴离子药物的药物组合物及其制备方法 |
CN103961697A (zh) * | 2013-02-05 | 2014-08-06 | 日东电工株式会社 | 粘膜给予用疫苗组合物 |
CN110684768A (zh) * | 2019-10-12 | 2020-01-14 | 浙江省农业科学院 | 一种基于模式识别受体配体的鸭天然免疫增强剂 |
Families Citing this family (84)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6727230B1 (en) * | 1994-03-25 | 2004-04-27 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs |
US6239116B1 (en) * | 1994-07-15 | 2001-05-29 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules |
US6207646B1 (en) * | 1994-07-15 | 2001-03-27 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules |
US7935675B1 (en) | 1994-07-15 | 2011-05-03 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules |
US20030026782A1 (en) * | 1995-02-07 | 2003-02-06 | Arthur M. Krieg | Immunomodulatory oligonucleotides |
EP0855184A1 (en) * | 1997-01-23 | 1998-07-29 | Grayson B. Dr. Lipford | Pharmaceutical composition comprising a polynucleotide and an antigen especially for vaccination |
US6406705B1 (en) * | 1997-03-10 | 2002-06-18 | University Of Iowa Research Foundation | Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant |
US20030022854A1 (en) | 1998-06-25 | 2003-01-30 | Dow Steven W. | Vaccines using nucleic acid-lipid complexes |
US6693086B1 (en) * | 1998-06-25 | 2004-02-17 | National Jewish Medical And Research Center | Systemic immune activation method using nucleic acid-lipid complexes |
US7776343B1 (en) * | 1999-02-17 | 2010-08-17 | Csl Limited | Immunogenic complexes and methods relating thereto |
EP1239876B1 (en) * | 1999-11-19 | 2008-07-30 | Csl Limited | Hcv vaccine compositions |
US7585847B2 (en) * | 2000-02-03 | 2009-09-08 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of asthma and allergy |
US20020156033A1 (en) * | 2000-03-03 | 2002-10-24 | Bratzler Robert L. | Immunostimulatory nucleic acids and cancer medicament combination therapy for the treatment of cancer |
US20040131628A1 (en) * | 2000-03-08 | 2004-07-08 | Bratzler Robert L. | Nucleic acids for the treatment of disorders associated with microorganisms |
KR100917101B1 (ko) * | 2000-08-04 | 2009-09-15 | 도요 보세키 가부시키가이샤 | 플렉시블 금속적층체 및 그 제조방법 |
US20060177416A1 (en) | 2003-10-14 | 2006-08-10 | Medivas, Llc | Polymer particle delivery compositions and methods of use |
CA2457027C (en) | 2001-08-16 | 2011-10-11 | Medical Research Council | Chitin microparticles and their medical uses |
AU2002360278A1 (en) * | 2001-10-12 | 2003-11-11 | Coley Pharmaceutical Gmbh | Methods and products for enhancing immune responses using imidazoquinoline compounds |
EP1499187B1 (en) | 2002-04-04 | 2015-06-17 | Zoetis Belgium S.A. | Immunostimulatory g,u-containing oligoribonucleotides |
US7807803B2 (en) * | 2002-07-03 | 2010-10-05 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Nucleic acid compositions for stimulating immune responses |
US20040053880A1 (en) * | 2002-07-03 | 2004-03-18 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Nucleic acid compositions for stimulating immune responses |
US7576066B2 (en) * | 2002-07-03 | 2009-08-18 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Nucleic acid compositions for stimulating immune responses |
US7569553B2 (en) * | 2002-07-03 | 2009-08-04 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Nucleic acid compositions for stimulating immune responses |
US7605138B2 (en) * | 2002-07-03 | 2009-10-20 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Nucleic acid compositions for stimulating immune responses |
EA008777B1 (ru) * | 2002-10-29 | 2007-08-31 | Коли Фармасьютикал Груп, Лтд. | Способы и продукты, относящиеся к лечению и предупреждению инфекции вируса гепатита c |
CA2502015A1 (en) * | 2002-12-11 | 2004-06-24 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | 5' cpg nucleic acids and methods of use |
US20080269846A1 (en) * | 2003-03-14 | 2008-10-30 | Light Sciences Oncology, Inc. | Device for treatment of blood vessels using light |
US10376711B2 (en) * | 2003-03-14 | 2019-08-13 | Light Sciences Oncology Inc. | Light generating guide wire for intravascular use |
CN2885311Y (zh) | 2006-01-18 | 2007-04-04 | 郑成福 | 经尿道光动力疗法***治疗仪 |
WO2004087203A2 (en) * | 2003-04-02 | 2004-10-14 | Coley Pharmaceutical Group, Ltd. | Immunostimulatory nucleic acid oil-in-water formulations for topical application |
US20060188469A1 (en) * | 2003-10-14 | 2006-08-24 | Medivas, Llc | Vaccine delivery compositions and methods of use |
US20080160089A1 (en) * | 2003-10-14 | 2008-07-03 | Medivas, Llc | Vaccine delivery compositions and methods of use |
US7225210B2 (en) * | 2003-11-20 | 2007-05-29 | Overland Storage, Inc. | Block level data snapshot system and method |
TW200533750A (en) * | 2004-02-19 | 2005-10-16 | Coley Pharm Group Inc | Immunostimulatory viral RNA oligonucleotides |
JP2008537684A (ja) * | 2005-01-24 | 2008-09-25 | ニューロシステック コーポレイション | 内耳およびその他の組織へ治療薬および/またはその他の薬剤を送達するための装置および方法 |
US20060171988A1 (en) * | 2005-01-28 | 2006-08-03 | Norbert Hilf | Method of treatment using foams as artificial lymph nodes |
DE102005020798A1 (de) * | 2005-04-28 | 2006-11-02 | Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum | Verwendung von TLR- und/oder Nod2-Liganden zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Krankheit des zentralen Nervensystems |
AU2006269555A1 (en) * | 2005-07-07 | 2007-01-18 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Anti-CTLA-4 antibody and CpG-motif-containing synthetic oligodeoxynucleotide combination therapy for cancer treatment |
EA013468B1 (ru) * | 2005-09-16 | 2010-04-30 | Коли Фармасьютикал Гмбх | Иммуностимулирующая одноцепочечная рибонуклеиновая кислота с фосфодиэфирным остовом |
EP1926780B1 (en) | 2005-09-22 | 2013-08-14 | Medivas, LLC | Bis-( -amino)-diol-diester-containing poly(ester amide) and poly(ester urethane) compositions and methods of use |
EP1933881B1 (en) * | 2005-09-22 | 2019-03-13 | Medivas, LLC | Solid polymer delivery compositions and methods for use thereof |
ES2536103T3 (es) * | 2005-11-25 | 2015-05-20 | Zoetis Belgium S.A. | Oligorribonucleótidos inmunoestimuladores |
JP2009524584A (ja) * | 2005-12-07 | 2009-07-02 | メディバス エルエルシー | ポリマー−生物製剤送達組成物を構築するための方法 |
CA2676601A1 (en) * | 2006-01-31 | 2007-08-09 | Medivas, Llc | Vaccine delivery compositions and methods of use |
WO2007103048A2 (en) * | 2006-03-01 | 2007-09-13 | Regents Of The University Of Colorado | Tlr agonist (flagellin)/cd40 agonist/antigen protein and dna conjugates and use thereof for inducing synergistic enhancement in immunity |
GB0605521D0 (en) * | 2006-03-18 | 2006-04-26 | Isis Innovation | Adjuvant |
US8267905B2 (en) * | 2006-05-01 | 2012-09-18 | Neurosystec Corporation | Apparatus and method for delivery of therapeutic and other types of agents |
JP5445130B2 (ja) * | 2006-05-02 | 2014-03-19 | メディバス エルエルシー | 眼の外部または内部への眼科用薬剤の送達法 |
US20070282011A1 (en) * | 2006-05-09 | 2007-12-06 | Medivas, Llc | Biodegradable water soluble polymers |
US7803148B2 (en) | 2006-06-09 | 2010-09-28 | Neurosystec Corporation | Flow-induced delivery from a drug mass |
EP3047860A1 (en) | 2006-07-20 | 2016-07-27 | OrbusNeich Medical, Inc. | Bioabsorbable polymeric composition for a medical device |
US20080145439A1 (en) * | 2006-07-31 | 2008-06-19 | Neurosystec Corporation | Nanoparticle drug formulations |
NZ575437A (en) | 2006-09-27 | 2012-02-24 | Coley Pharm Gmbh | Cpg oligonucleotide analogs containing hydrophobic t analogs with enhanced immunostimulatory activity |
WO2008057696A2 (en) * | 2006-10-10 | 2008-05-15 | Juvaris Biotherapeutics, Inc. | Compositions of pattern recognition receptor-ligand: lipid complexes and methods of use thereof |
US7959942B2 (en) | 2006-10-20 | 2011-06-14 | Orbusneich Medical, Inc. | Bioabsorbable medical device with coating |
CN103212115B (zh) | 2006-10-20 | 2016-09-14 | 奥巴斯尼茨医学公司 | 可生物吸收的聚合物组合物和医疗设备 |
JP2010518917A (ja) | 2007-02-19 | 2010-06-03 | マリン ポリマー テクノロジーズ,インコーポレーテッド | 止血組成物及び治療法 |
EP2178944A1 (en) * | 2007-07-24 | 2010-04-28 | Medivas, LLC | Biodegradable cationic polymer gene transfer compositions and methods of use |
JP5731198B2 (ja) | 2007-09-27 | 2015-06-10 | イムノバクシーン・テクノロジーズ・インコーポレイテッドImmunovaccine Technologies Inc. | インビボでのポリヌクレオチドの送達のための連続疎水相を含む担体におけるリポソームの使用 |
DE102007056488A1 (de) * | 2007-11-22 | 2009-07-23 | Biontex Laboratories Gmbh | Steigerung von Transfektionseffizienzen nicht-viraler Genliefersysteme durch Blockierung des angeborenen Immunsystems |
EP2257306B1 (en) * | 2008-03-25 | 2014-05-07 | Juvaris Biotherapeutics, Inc. | Enhancement of an immune response by administration of a cationic lipid-dna complex (cldc) |
US20110045001A1 (en) * | 2008-03-28 | 2011-02-24 | Biontex Laboratories Gmbh | Transfection results of non-viral gene delivery systems by influencing of the innate immune system |
WO2009146523A1 (en) * | 2008-06-05 | 2009-12-10 | Immunovaccine Technologies Inc. | Compositions comprising liposomes, an antigen, a polynucleotide and a carrier comprising a continuous phase of a hydrophobic substance |
US7993640B2 (en) | 2008-08-06 | 2011-08-09 | Light Sciences Oncology, Inc. | Enhancement of light activated therapy by immune augmentation using anti-CTLA-4 antibody |
WO2010019716A1 (en) * | 2008-08-13 | 2010-02-18 | Medivas, Llc | Aabb-poly(depsipeptide) biodegradable polymers and methods of use |
US8883174B2 (en) | 2009-03-25 | 2014-11-11 | The Board Of Regents, The University Of Texas System | Compositions for stimulation of mammalian innate immune resistance to pathogens |
US20110008372A1 (en) * | 2009-07-08 | 2011-01-13 | Light Sciences Oncology, Inc. | Enhancement of light activated drug therapy through combination with other therapeutic agents |
AU2011203740B2 (en) * | 2010-01-06 | 2014-11-13 | Vaxinnate Corporation | Methods and compositions for providing protective immunity in the elderly |
WO2011136828A1 (en) | 2010-04-27 | 2011-11-03 | The Johns Hopkins University | Immunogenic compositions and methods for treating neoplasia |
CN101893618A (zh) * | 2010-06-17 | 2010-11-24 | 中国科学院海洋研究所 | 病原相关分子模式免疫检测芯片及其制备方法与应用 |
EP3159368A1 (en) | 2011-06-23 | 2017-04-26 | DSM IP Assets B.V. | New biodegradable polyesteramide copolymers for drug delivery |
US9873765B2 (en) | 2011-06-23 | 2018-01-23 | Dsm Ip Assets, B.V. | Biodegradable polyesteramide copolymers for drug delivery |
BR112014007927B1 (pt) | 2011-10-06 | 2021-04-13 | Immunovaccine Technologies Inc | Composições de lipossoma compreendendo um adjuvante e usos das referidas composições e usos das referidas composições |
CA2900008A1 (en) | 2013-02-07 | 2014-08-14 | Children's Medical Center Corporation | Protein antigens that provide protection against pneumococcal colonization and/or disease |
JP6684215B2 (ja) * | 2013-08-28 | 2020-04-22 | ピーシーアイ バイオテック エイエス | 予防接種用化合物および免疫化用化合物、ならびに予防接種方法および免疫化方法 |
CA2939093A1 (en) * | 2014-02-14 | 2015-08-20 | Immune Design Corp. | Immunotherapy of cancer through combination of local and systemic immune stimulation |
US10973896B2 (en) * | 2014-04-11 | 2021-04-13 | Pci Biotech As | Treatment or prevention of melanoma using photochemical internalization of a melanoma antigen |
WO2016044839A2 (en) | 2014-09-19 | 2016-03-24 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Compositions and methods for treating viral infections through stimulated innate immunity in combination with antiviral compounds |
US10434071B2 (en) | 2014-12-18 | 2019-10-08 | Dsm Ip Assets, B.V. | Drug delivery system for delivery of acid sensitivity drugs |
CA3019515A1 (en) * | 2016-04-01 | 2017-10-05 | Colorado State University Research Foundation | Compositions and methods for enhanced innate immunity |
EP3468605A4 (en) | 2016-06-08 | 2020-01-08 | President and Fellows of Harvard College | MODIFIED VIRAL VECTOR REDUCING THE INDUCTION OF INFLAMMATORY AND IMMUNE RESPONSES |
CN109125264B (zh) * | 2017-06-19 | 2020-10-30 | 林海祥 | 一种抗感染抗肿瘤的粘膜免疫制剂 |
US11981911B2 (en) | 2017-11-08 | 2024-05-14 | President And Fellows Of Harvard College | Compositions and methods for inhibiting viral vector-induced inflammatory responses |
EP3873598A4 (en) * | 2018-11-01 | 2022-07-20 | Alpha Tau Medical Ltd. | INTRATUMORAL ALPHA-EMITTING RADIATION AND ACTIVATION OF CYTOPLASMIC SENSORS FOR AN INTRACELLULAR PATHOGEN |
Family Cites Families (74)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5087617A (en) * | 1989-02-15 | 1992-02-11 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for treatment of cancer using oligonucleotides |
US5399346A (en) * | 1989-06-14 | 1995-03-21 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Gene therapy |
US5178860A (en) * | 1989-09-01 | 1993-01-12 | Coopers Animal Health Limited | Adjuvant complexes and vaccine made therefrom |
US4981684A (en) * | 1989-10-24 | 1991-01-01 | Coopers Animal Health Limited | Formation of adjuvant complexes |
US5705187A (en) * | 1989-12-22 | 1998-01-06 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Compositions of lipids and stabilizing materials |
US6030954A (en) * | 1991-09-05 | 2000-02-29 | University Of Connecticut | Targeted delivery of poly- or oligonucleotides to cells |
US5593972A (en) * | 1993-01-26 | 1997-01-14 | The Wistar Institute | Genetic immunization |
US5567604A (en) * | 1993-04-23 | 1996-10-22 | Aronex Pharmaceuticals, Inc. | Anti-viral guanosine-rich oligonucleotides |
WO1995000638A2 (en) * | 1993-06-23 | 1995-01-05 | Genesys Pharma Inc. | Antisense oligonucleotides and therapeutic use thereof in human immunodeficiency virus infection |
DE4338704A1 (de) * | 1993-11-12 | 1995-05-18 | Hoechst Ag | Stabilisierte Oligonucleotide und deren Verwendung |
US5595756A (en) * | 1993-12-22 | 1997-01-21 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents |
WO1995026204A1 (en) * | 1994-03-25 | 1995-10-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs |
US6207646B1 (en) * | 1994-07-15 | 2001-03-27 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules |
US20030050263A1 (en) * | 1994-07-15 | 2003-03-13 | The University Of Iowa Research Foundation | Methods and products for treating HIV infection |
US6194388B1 (en) * | 1994-07-15 | 2001-02-27 | The University Of Iowa Research Foundation | Immunomodulatory oligonucleotides |
US20030026782A1 (en) * | 1995-02-07 | 2003-02-06 | Arthur M. Krieg | Immunomodulatory oligonucleotides |
AU3559695A (en) * | 1994-09-30 | 1996-04-26 | Inex Pharmaceuticals Corp. | Glycosylated protein-liposome conjugates and methods for their preparation |
US5858987A (en) * | 1995-05-05 | 1999-01-12 | Mitotix, Inc. | E6AP antisense constructs and methods of use |
US5705385A (en) * | 1995-06-07 | 1998-01-06 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer |
US5981501A (en) * | 1995-06-07 | 1999-11-09 | Inex Pharmaceuticals Corp. | Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers |
SE9600648D0 (sv) * | 1996-02-21 | 1996-02-21 | Bror Morein | Receptorbimdande enhet |
US6030955A (en) * | 1996-03-21 | 2000-02-29 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York And Imclone Systems, Inc. | Methods of affecting intracellular phosphorylation of tyrosine using phosphorothioate oligonucleotides, and antiangiogenic and antiproliferative uses thereof |
WO1998016247A1 (en) * | 1996-10-11 | 1998-04-23 | The Regents Of The University Of California | Immunostimulatory polynucleotide/immunomodulatory molecule conjugates |
EP0855184A1 (en) * | 1997-01-23 | 1998-07-29 | Grayson B. Dr. Lipford | Pharmaceutical composition comprising a polynucleotide and an antigen especially for vaccination |
US6406705B1 (en) * | 1997-03-10 | 2002-06-18 | University Of Iowa Research Foundation | Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant |
US20030032090A1 (en) * | 1997-05-07 | 2003-02-13 | Schering Corporation, A New Jersey Corporation | Human receptor proteins; related reagents and methods |
DE69838294T2 (de) * | 1997-05-20 | 2009-08-13 | Ottawa Health Research Institute, Ottawa | Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäurekonstrukten |
US20040006034A1 (en) * | 1998-06-05 | 2004-01-08 | Eyal Raz | Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof |
US20020127576A1 (en) * | 1997-06-16 | 2002-09-12 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
US6221882B1 (en) * | 1997-07-03 | 2001-04-24 | University Of Iowa Research Foundation | Methods for inhibiting immunostimulatory DNA associated responses |
US5877309A (en) * | 1997-08-13 | 1999-03-02 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotides against JNK |
US20030027260A1 (en) * | 1997-10-17 | 2003-02-06 | Genentech, Inc. | Human Toll homologues |
US6391311B1 (en) * | 1998-03-17 | 2002-05-21 | Genentech, Inc. | Polypeptides having homology to vascular endothelial cell growth factor and bone morphogenetic protein 1 |
US20050031638A1 (en) * | 1997-12-24 | 2005-02-10 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Vaccine |
EP1674574A1 (en) * | 1998-05-14 | 2006-06-28 | Coley Pharmaceutical GmbH | Methods for Regulating Hematopoiesis using CpG-Oligonucleotides |
US20030022854A1 (en) * | 1998-06-25 | 2003-01-30 | Dow Steven W. | Vaccines using nucleic acid-lipid complexes |
US6693086B1 (en) * | 1998-06-25 | 2004-02-17 | National Jewish Medical And Research Center | Systemic immune activation method using nucleic acid-lipid complexes |
EP0974357A1 (en) * | 1998-07-16 | 2000-01-26 | Schering-Plough | Chemokines as adjuvants of immune response |
US6207819B1 (en) * | 1999-02-12 | 2001-03-27 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compounds, processes and intermediates for synthesis of mixed backbone oligomeric compounds |
DE19935756A1 (de) * | 1999-07-27 | 2001-02-08 | Mologen Forschungs Entwicklung | Kovalent geschlossenes Nukleinsäuremolekül zur Immunstimulation |
US20020034784A1 (en) * | 1999-10-27 | 2002-03-21 | John Bertin | Novel molecules of the card-related protein family and uses thereof |
GB0001704D0 (en) * | 2000-01-25 | 2000-03-15 | Glaxo Group Ltd | Protein |
US7129222B2 (en) * | 2000-03-10 | 2006-10-31 | Dynavax Technologies Corporation | Immunomodulatory formulations and methods for use thereof |
US20030129251A1 (en) * | 2000-03-10 | 2003-07-10 | Gary Van Nest | Biodegradable immunomodulatory formulations and methods for use thereof |
US7037676B2 (en) * | 2000-03-21 | 2006-05-02 | Bristol-Myers Squibb | Drosophila tumor necrosis factor class molecule polynucleotides and variants thereof |
WO2001072123A1 (en) * | 2000-03-28 | 2001-10-04 | The Regents Of The University Of California | Methods for increasing a cytotoxic t lymphocyte response in vivo |
WO2001083753A2 (en) * | 2000-05-03 | 2001-11-08 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Molecules of the nbs/lrr protein family and uses thereof |
US6656470B2 (en) * | 2000-05-12 | 2003-12-02 | Pharmacia & Upjohn Company | Vaccine composition, method of preparing the same, and method of vaccinating vertebrates |
US6506596B2 (en) * | 2000-06-01 | 2003-01-14 | Anna-Lena Spetz-Holmgren | Method of DNA transfer |
EP1296714B1 (en) * | 2000-06-22 | 2009-08-26 | University Of Iowa Research Foundation | Combination of CpG and antibodies directed against CD19,CD20, CD22 or CD40 for the treatment or prevention of cancer. |
EP1373564A2 (de) * | 2000-09-01 | 2004-01-02 | Epigenomics AG | Diagnose von bestehenden erkrankungen oder der prädisposition für bestimmte erkrankungen |
FR2814958B1 (fr) * | 2000-10-06 | 2003-03-07 | Aventis Pasteur | Composition vaccinale |
GB0025577D0 (en) * | 2000-10-18 | 2000-12-06 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
US20030022151A1 (en) * | 2001-01-17 | 2003-01-30 | Gopal Thinakaran | Functional screening |
AU2002245371A1 (en) * | 2001-01-31 | 2002-08-12 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Novel molecules of the pyrin/nbs/lrr protein family and uses thereof |
US7041643B2 (en) * | 2001-01-31 | 2006-05-09 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Molecules of the PYRIN/NBS/LRR protein family and uses thereof |
WO2002103059A2 (en) * | 2001-02-15 | 2002-12-27 | Bayer Corporation | Innate immunity markers for rapid diagnosis of infectious diseases |
US20030050268A1 (en) * | 2001-03-29 | 2003-03-13 | Krieg Arthur M. | Immunostimulatory nucleic acid for treatment of non-allergic inflammatory diseases |
CA2446458A1 (en) * | 2001-05-09 | 2002-11-14 | Yale University | Toll/interleukin-1 receptor adaptor protein (tirap) |
EP1256354A1 (en) * | 2001-05-11 | 2002-11-13 | Schering Corporation | Methods for treating cancer |
CA2447431A1 (en) * | 2001-05-11 | 2002-11-21 | Research Development Foundation | Inhibitors of receptor activator of nf-kb and uses thereof |
GB0117578D0 (en) * | 2001-07-19 | 2001-09-12 | Zarlink Semiconductor Ltd | Tuner |
US20030032674A1 (en) * | 2001-08-13 | 2003-02-13 | Hwang Daniel H. | Use of unsaturated fatty acids to treat severe inflammatory diseases |
US7276489B2 (en) * | 2002-10-24 | 2007-10-02 | Idera Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends |
KR101092043B1 (ko) * | 2002-04-22 | 2011-12-12 | 바이오니취 라이프 사이언시즈 인코포레이티드 | 올리고뉴클레오티드 조성물 및 면역 반응 조절시 이의 용도 |
US20040009949A1 (en) * | 2002-06-05 | 2004-01-15 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Method for treating autoimmune or inflammatory diseases with combinations of inhibitory oligonucleotides and small molecule antagonists of immunostimulatory CpG nucleic acids |
US20040013688A1 (en) * | 2002-07-03 | 2004-01-22 | Cambridge Scientific, Inc. | Vaccines to induce mucosal immunity |
US20040053880A1 (en) * | 2002-07-03 | 2004-03-18 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Nucleic acid compositions for stimulating immune responses |
AR040996A1 (es) * | 2002-08-19 | 2005-04-27 | Coley Pharm Group Inc | Acidos nucleicos inmunoestimuladores |
EA008777B1 (ru) * | 2002-10-29 | 2007-08-31 | Коли Фармасьютикал Груп, Лтд. | Способы и продукты, относящиеся к лечению и предупреждению инфекции вируса гепатита c |
WO2005016235A2 (en) * | 2003-04-14 | 2005-02-24 | The Regents Of The University Of California | Combined use of impdh inhibitors with toll-like receptor agonists |
WO2005111057A2 (en) * | 2004-04-02 | 2005-11-24 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Immunostimulatory nucleic acids for inducing il-10 responses |
CA2570786C (en) * | 2004-06-15 | 2013-05-28 | Idera Pharmaceuticals, Inc. | Modified cpg-containing oligonucleotide multimers in immune stimulation |
EP1776105A2 (en) * | 2004-07-18 | 2007-04-25 | Coley Pharmaceutical Group, Ltd | Methods and compositions for inducing innate immune responses |
-
2003
- 2003-07-14 US US10/621,254 patent/US20050013812A1/en not_active Abandoned
-
2004
- 2004-06-08 EP EP04776412A patent/EP1648379A4/en not_active Withdrawn
- 2004-06-08 AU AU2004262523A patent/AU2004262523A1/en not_active Abandoned
- 2004-06-08 JP JP2006520170A patent/JP2007530430A/ja not_active Withdrawn
- 2004-06-08 WO PCT/US2004/018363 patent/WO2005013891A2/en active Application Filing
- 2004-06-08 CN CNA2004800237863A patent/CN101304759A/zh active Pending
- 2004-06-08 CA CA002532140A patent/CA2532140A1/en not_active Abandoned
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102300556A (zh) * | 2008-12-26 | 2011-12-28 | 株式会社三养社 | 含有阴离子药物的药物组合物及其制备方法 |
CN102300556B (zh) * | 2008-12-26 | 2015-04-29 | 株式会社三养生物制药 | 含有阴离子药物的药物组合物及其制备方法 |
CN103961697A (zh) * | 2013-02-05 | 2014-08-06 | 日东电工株式会社 | 粘膜给予用疫苗组合物 |
CN110684768A (zh) * | 2019-10-12 | 2020-01-14 | 浙江省农业科学院 | 一种基于模式识别受体配体的鸭天然免疫增强剂 |
CN110684768B (zh) * | 2019-10-12 | 2021-03-30 | 浙江省农业科学院 | 一种基于模式识别受体配体的鸭天然免疫增强剂 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2004262523A1 (en) | 2005-02-17 |
US20050013812A1 (en) | 2005-01-20 |
WO2005013891A3 (en) | 2007-05-24 |
JP2007530430A (ja) | 2007-11-01 |
WO2005013891A2 (en) | 2005-02-17 |
EP1648379A4 (en) | 2008-01-16 |
EP1648379A2 (en) | 2006-04-26 |
CA2532140A1 (en) | 2005-02-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101304759A (zh) | 使用模式识别的受体-配体:脂质复合物的疫苗 | |
US10568949B2 (en) | Method of eliciting an anti-tumor immune response with controlled delivery of TLR agonists in porous polymerlc devices | |
US9370558B2 (en) | Controlled delivery of TLR agonists in structural polymeric devices | |
EP1083232B1 (en) | Transfer of mRNA using polycationic compounds | |
CN104411331B (zh) | 在结构聚合装置中tlr激动剂的控制传递 | |
US20180117171A1 (en) | Immunoconjugates for programming or reprogramming of cells | |
US20090285901A1 (en) | Polyamino acid for use as adjuvant | |
Goldman | Translational mini-review series on Toll-like receptors: Toll-like receptor ligands as novel pharmaceuticals for allergic disorders | |
Galili | α-Gal nanoparticles in wound and burn healing acceleration | |
US20120195854A1 (en) | Granulysin in immunotherapy | |
JP2005528373A (ja) | 免疫プロトコルにFlt3リガンドを用いる方法 | |
WO2019081625A1 (en) | TREATMENT OF IMMUNE DISEASES BY ADMINISTRATION OF ANTIGEN-SPECIFIC FORMULATIONS | |
WO2008057696A9 (en) | Compositions of pattern recognition receptor-ligand: lipid complexes and methods of use thereof | |
EP1143934B1 (en) | Genetic immunization with co-delivery of nucleic acid and cytokines | |
EP2746396A1 (en) | Selective local inhibition of TNFR1-mediated functions at the site of antigen/allergen presentation | |
US7368106B2 (en) | Use of a promoter of T-cell expansion and an inducer of CD40 stimulation in the treatment or prevention of a pathologic state | |
WO2006112476A2 (ja) | 抗原を固定化した生分解性ナノ粒子、およびそれを含むワクチン | |
Ali | Programming cells in situ | |
Martínez Gómez | Novel treatments in allergen-specific immunotherapy |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20081112 |