CN101300272B - 用于治疗增生性病症的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及治疗增生性病症、特别是免疫增生性和自身免疫性病症的方法，并涉及生成与NK细胞受体结合的抗体的方法，这些抗体用于治疗这些病症的医疗方案，特别是用于耗竭与免疫增生病理相关的细胞。

Description

用于治疗增生性病症的组合物和方法

技术领域

本发明涉及治疗增生性病症、特别是免疫增生性病症如NK型LDGL的方法以及生产在医疗方案中用于治疗这些病症的抗体的方法。总体上，这些方法涉及使用抗体，这些抗体特异地结合造成这些病症的增生细胞表面上所存在的受体。

背景技术

自然杀灭(NK)细胞是一个与非常规免疫相关的淋巴细胞亚群。NK细胞的特点和生物学属性包括：表面抗原例如CD16、CD56和/或CD57的表达，以及表达在细胞表面上的α/β或γ/δTCR复合体的缺失；通过激活特异性细胞溶解酶而结合并杀灭不表达“自身”MHC/HLA抗原的细胞的能力；杀灭表达NK激活的受体-配体的肿瘤细胞或其他疾病细胞的能力；以及释放刺激或抑制免疫反应的蛋白分子(即所谓的细胞因子)的能力。

NK细胞的活性是通过一种既包括激活又包括抑制信号的复杂机制进行调节。已经鉴定了多种不同种类的NK特异性受体，这些受体在NK细胞介导的HLA I类缺乏的靶细胞的识别和杀灭中发挥重要作用。其中一种该类受体，NCR(自然细胞毒性受体)，包括NKp30、NKp46和NKp44、Ig超家族的所有成员。它们之间由特异性mAb导致的交联强烈激活NK细胞，引起细胞内Ca⁺⁺水平升高、触发细胞毒性并释放淋巴素。

另外两个NK细胞受体家族是KIR受体(Killer CellImmunoglobulin-like Receptors)和CD94/NKG2。这两个家族各自既包括激活性又包括抑制性受体。KIR基因代表了表达在NK细胞上并具有两种或三种细胞外Ig样结构域的一组多样的、多态性的Ig超家族成员。该家族抑制性成员(包括KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2和KIR3DL3)的胞质域均包含ITIM序列，这与经常包含带电残基的激活性成员(例如KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5和KIR3DS1)的胞质域相反。KIR家族的抑制性成员介导对HLA I类分子的抑制效应。在KIR受体家族内观察到的多态性是个体之间遗传变异以及体内特定的NK细胞克隆性扩增的结果。综述参见，例如Trowsdale and Parham(2004)Eur J Immunol34(1)：7-17；Yawata et al.(2002)Crit Rev Immunol 22(5-6)：463-82；Hsu et al.(2002)Immunol Rev 190：40-52；Middleton et al.(2002)Transpl Immunol 10(2-3)：147-64；Vilches et al.(2002)Annu RevImmunol 20：217-51。

CD94和NKG2蛋白是C型凝集素超家族的成员。CD94优先在NK细胞上表达，并与NKG2家族成员例如NKG2A形成异源二聚体，该NKG2A自身在全部NK细胞的至少50％上表达。NKG2A包含2个ITIM域，并与CD94一起形成抑制性异源二聚体受体，该受体结合非经典MHC I类分子HLA-E(人类；在小鼠中为Qa-1b)(参见，例如OMIM 602894；Braud et al.(1998)Nature 391：795-799；Chang et al.(1995)Europ.J.Immun 25：2433-2437；Lazetic et al.(1996)Immun 157：4741-4745；Rodriguez et al.(1998)Immunogenetics47：305-309.)。

NK-LDGL(颗粒淋巴细胞的NK型淋巴细胞增生性疾病；另外称为NK-LGL)指一类由NK细胞或NK样细胞的克隆性扩增引起的增生性病症，即大颗粒淋巴细胞表现出表面抗原表达的一个特征性组合(例如CD3-、CD56+、CD16+等；参见，例如Loughran(1993)Blood 82：1)。这些病症中涉及的细胞增生可具有不同的效应，从某些患者中观察到的轻微症状到严重的，常常为致命形式的称为NK-LDGL白血病的疾病。这种类型的病症的症状可包括发热、轻微的中性粒细胞减少症、血小板减少症、贫血、淋巴细胞增多、脾大、肝大、***病、骨髓浸润等(参见，例如Zambello et al.(2003)Blood 102：1797；Loughran(1993)Blood 82：1；Epling-Burnette et al.(2004)Blood-2003-02-400)。用于NK-LDGL白血病的治疗常常为攻击性的，包括化疗，由于涉及凝血障碍和多器官衰竭该疾病常常为致命性的，并且包括多种器官的LGL浸入。LDGL中的自身免疫性病症也较显著，且可观察到多种病症包括早期类风湿性关节炎，且已经在类风湿性关节炎患者的血液或滑膜液中发现具有LDGL白血病表型的细胞数量增多。这些扩增的细胞中有些是具有LGL的功能和表型特征的CD28阴性T细胞。在LDGL患者中还观察到了特发性血小板减少性紫癜(ITP)和再生障碍性贫血。因此，在NK-LDGL和LDGL的治疗中有用的疗法通常被认为在免疫增生性和自身免疫性病症的治疗中也有用，特别是那些涉及NK细胞的病症。

总之，对于确立的免疫病症的治疗，极少存在有效的治疗。例如，在类风湿性关节炎中，一旦触发，免疫反应就会引起滑膜炎症。早期和中期的炎症分子介质包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素IL-1、IL-6、IL-8和IL-15、转化生长因子β、成纤维细胞生长因子和血小板衍生的生长因子。RA的现代药物治疗针对这些介质但并不去除作为根源的细胞，特别是当所涉及的细胞为NK细胞时。一旦确立了炎症反应，则滑膜增厚，软骨与下面的骨头开始分离，并出现关节破坏的迹象。考虑到相对缺乏对免疫增生性病症的有效治疗，很显然，本领域中非常需要新颖的且首创的方案以便限制并逆转那些构成这些病症的根源的免疫细胞的激活和/或增生。本发明致力于解决这些以及其他的需求。

发明内容

迄今为止，对于表达在NK细胞上且旨在用于减量调节NK细胞活性的受体特异的抗体已普遍调节了受体的功能或受体的表达。也就是说，抗体已阻断了活化性受体发挥作用，或已激活了NK细胞上的抑制性受体。其他抗体是针对减量调节活化受体。现已证实，针对表达在NK细胞上的受体的抗体可用来耗竭(或杀灭)表达了所关注受体的NK细胞。而且，这种NK细胞的耗竭可通过未用毒性部分(moieties)功能化的“裸”抗体来介导。特别优选具有可结合Fc受体的效应区的抗体，特别是CD16。

诸位发明人也已证实，这些耗竭性抗体可以清除体内的、在所有被检测的器官内的以及骨髓内的细胞。这是一个重要的特征，因为它表明这些抗体可用来治疗包括位于器官内的NK细胞(而不是仅仅循环中的NK细胞)的免疫增生性病症，而且因为这表明这些耗竭性抗体可用来治疗已确立的免疫增生性病症，例如，其中自体反应性NK细胞已出现且已牵涉到病理学中。因为免疫增生性病症一旦充分确立就常常被诊断出，重要的是耗竭NK细胞而非抑制它们活性或防止进一步的增生。

本发明提供了多种抗体以及用于制备抗体的多种方法，它们对于增生性病症的治疗尤其是免疫增生性病症例如NK型LDGL和其他被认为涉及NK细胞的病症的治疗是有用的。已报道了NK细胞与免疫增生性病症例如类风湿性关节炎和糖尿病有关。因此，本发明的抗体预期对治疗以下疾病是有用的，例如哮喘，关节炎，包括骨关节炎、类风湿性关节炎和脊椎关节病，胃肠道炎症，克罗恩病和溃疡性结肠炎，神经性炎症以及自身免疫性病症例如I型糖尿病、类风湿性关节炎、***性红斑狼疮、皮肌炎、银屑癣、干燥综合征、红斑狼疮、脱髓鞘病、多发性硬化症、重症肌无力、莱特尔氏综合征、格雷夫斯病、多发性肌炎、格-巴二氏综合征、韦格纳肉芽肿病、结节性多动脉炎、风湿性多肌病、颞动脉炎、贝切特氏病、丘-施二氏综合征、高安(Takayasu)动脉炎和其他的疾病。在一个实施方案中，这些免疫增生性病症明确地排除了NK型LDGL和T-LDGL。利用本发明的方法制备的抗体能特异地靶向于造成这些病症的扩增的细胞，例如在NK型LDGL中扩增的NK细胞或者免疫增生性特别是诸如类风湿性关节炎和I型糖尿病的自身免疫性病症中扩增的T或NK细胞。这些抗体可以限制细胞增生的病理效果，例如通过靶向这些细胞而由免疫***进行破坏，或通过使这些细胞接触一种细胞毒性剂诸如放射性同位素、毒素或药物而直接杀灭它们。本发明也提供了多种方法来利用所述抗体治疗多种增生性病症中任何一种，并提供了包括本文所述抗体以及它们的使用说明的试剂盒。

因此，本发明提供一种治疗患有涉及NK细胞的免疫增生性病症患者的方法，所述方法包括将与NK受体特异结合的抗体给予该患者。本发明还包括在某一个体的体内减弱炎症的一种方法，或者一种消除、杀灭或耗竭某一个体体内NK或T细胞的方法。

在另一实施方式中，本发明提供了一种包含抗体的组合物在制备用于治疗免疫增生增生性病症的药物中的应用，该抗体特异地结合一个NK受体，并且当结合至人的NK细胞上的所述NK受体时，致使所述NK细胞被耗竭。

另一方面，本发明提供了一种耗竭NK细胞的方法、一种耗竭活化的NK细胞的方法、一种用于减弱炎症的方法、或者一种用于减少个体中或生物样本内促炎症反应细胞因子的方法，该方法包括使所述NK细胞接触包含一种抗体的组合物，该抗体可特异地结合一种NK受体。

另一方面，本发明提供一种用于耗竭哺乳动物体内NK和/或T细胞的方法，该方法包括给予该哺乳动物包含一种抗体的组合物，该抗体可特异地结合一种NK受体。

另一方面，本发明提供了在一个哺乳动物体内或一个生物样本内用于减弱炎症、降低激活的NK细胞数量或减少促炎症反应细胞因子的一种方法，该方法包括耗竭表达NKG2A的NK细胞和/或表达NKG2C的细胞。优选地，耗竭了表达NKG2A的NK细胞和表达NKG2C的细胞。优选地，耗竭NK或T细胞包括使所述NK细胞与一种组合物进行接触，该组合物包含特异地结合NKG2A和/或NKG2C的一种抗体。

在一个实例中，所述进行接触的步骤发生在包含细胞效应器的细胞培养基中，可任选地，所述培养基包含PBMC或总外周血淋巴细胞。另一方面，所述进行接触的步骤发生在哺乳动物体内。

另一方面，本发明提供一种用于治疗个体的方法，包括：a)诊断免疫增生性病症的存在(例如症状和/或NK细胞的存在和/或表达NK细胞受体的细胞的存在)，b)用本发明的抗体进行治疗。一方面，该诊断步骤包括诊断已确立的炎症或自身免疫性病症，可任选地，其中已确立的病症的特征在于组织破坏或损伤或其症状和/或持续超过3、6、9、12、24或36个月的一种病症。

本发明还提供一种治疗免疫增生性病症患者的方法，该方法包括a)确定患者体内NK细胞的NK受体状态，以及b)给予患者一种抗体，该抗体特异地结合在NK细胞内显著表达的一种NK受体。

本发明的方法的一个实施例中，该NK受体是一种激活性受体。在另一个实施例中，该受体选自KIR2DL1、KIR2DS1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DS4、NKG2C、NKG2D、NKG2E、NKG2F、CD94和NKG2A所组成的组。在另一个实施例中，该受体是NCR，例如NKp30、NKp44或NKp46。在另一个实施例中，该抗体特异地结合一种单一的NK受体。在另一个实施例中，该NK受体的状态是利用免疫测试确定的。在另一个实施例中，该NK受体的状态是利用功能测试确定的，该功能测试用于确定存在于该NK细胞上的NK受体的活性。在另一个实施例中，该NK受体的状态是利用基因分型测试确定的。在另一个实施例中，该NK受体的状态是利用检测细胞内编码NK受体的mRNA的测试确定的。在另一个实施例中，该受体可检出地存在于至少50％的NK细胞上。

在另一个实施例中，该抗体是一种细胞毒性抗体。另一方面，这些抗体杀灭表达该单个或多个受体的细胞，例如通过将ADCC(抗体依赖的细胞毒性)或CDC(补体依赖的细胞毒性)导向这些细胞(例如，人IgG1或IgG3型抗体)。

在一个优选的实施例中，该抗体是能够招募细胞效应器的“裸”抗体。本发明的该单克隆裸抗体及其片段的功能总体上取决于它们结合Fc受体的能力。Fc受体例如Fcγ受体被表达在白细胞表面上。这些受体结合免疫球蛋白(Ig)的Fc部分，例如Fcγ受体结合IgG的Fc部分。这种结合通过将由抗体进行的抗原识别与基于细胞的效应器机制相联系而有助于对免疫功能作出贡献。不同的免疫球蛋白类型通过免疫球蛋白Fc区与免疫细胞上的特异性Fc受体(FcRs)的差异性相互作用而触发不同的效应器机制。活化的Fcγ受体包括FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIC以及FcγRIIIA。FcγRIIB被认为是一种抑制性Fcγ受体。(综述参见，例如Woof et al.(2004)NatRev Immunol.4(2)：89-99；Baumann et al.(2003)Arch Immunol TherExp(Warsz)51(6)：399-406；Pan et al.(2003)Chin Med J(Engl)116(4)：487-94；Takai et al.(1994)Cell 76：519-529；Ravetch et al.(2001)Annu Rev Immunol 19：275-290，每个的全部内容均通过引用结合于此)。不受理论的束缚，本发明的诸位发明人认为，在本发明的抗体中Fc受体结合区的存在导致了本发明的抗体所结合的细胞的耗竭。在一个优选的方面，该抗体包含人IgG1或IgG3型的Fc区，而不包含毒性或放射性部分。在另一个实施例中，该Fc区是结合人Fc受体的人IgG2或IgG4，且该Fc区被可任选地被改变而进行或增加与人Fc受体的结合。

在另一个实施例中，该细胞毒性抗体包含一种成分，该成分选自放射性同位素、毒性肽和毒性小分子所组成的组。在另一个实施例中，该抗体是一种抗体片段。在另一个实施例中，该抗体是人源化的或嵌合的。在另一个实施例中，将该放射性同位素、毒性肽或毒性小分子直接连接于该抗体。在另一个实施例中，该抗体结合至所述NK受体的一个小鼠或灵长类的同系物。在另一个实施例中，该抗体结合至多种KIR受体。在另一个实施例中，该细胞毒性抗体衍生于在免疫测试中用来确定所述NK受体状态的相同抗体。

另一方面，本发明提供制备适用于治疗免疫增生性病症的抗体的一种方法，所述方法包括：i)提供多种特异地结合一种或多种NK细胞受体的抗体；ii)检测每一种抗体结合NK细胞的能力，这些NK细胞取自一个或多个患免疫增生性病症的患者；iii)从该多种抗体中选择可结合至少50％的NK细胞的一种抗体，该NK细胞取自一个或多个患者；以及iv)使得该抗体适于对人类给药。

在一个实施例中，该抗体特异地结合至一种活化性NK细胞受体。在另一个实施例中，该抗体特异地结合一种受体，该受体选自KIR2DL1、KIR2DS1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DS4、CD94、NKG2D、NKG2E、NKG2F、NKG2C和NKG2A所组成的组。在另一个实施例中，该抗体特异地结合一种NCR例如NKp30、NKp44或NKp46。在另一个实施例中，通过将该抗体人源化或嵌合化而使其适于对人类给药。

在另一个实施例中，该方法进一步包括一个将细胞毒性剂连接于该抗体的步骤。在另一个实施例中，该细胞毒性剂是一种放射性同位素、一种毒性多肽或毒性小分子。在另一个实施例中，该细胞毒性剂直接连接于该抗体。在另一个实施例中，该抗体是一个抗体片段。在另一个实施例中，该抗体结合至少60％的取自一个或多个患者的NK细胞。在另一个实施例中，该抗体结合至少70％的取自一个或多个患者的NK细胞。在另一个实施例中，该抗体结合至少80％的取自一个或多个患者的NK细胞。

另一方面，本发明提供治疗患有免疫增生性病症的患者的一种方法，该方法包括a)确定所述患者体内T细胞或NK细胞的NK细胞受体状态，以及b)对所述患者给予一种特异结合NK细胞受体的抗体，该NK细胞受体由T细胞或NK细胞显著地表达，其中所述受体选自KIR2DL1、KIR2DS1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DS4、CD94、NKG2A、NKG2C、NKG2D、NKG2E、NKG2F、NKp30、NKp44和NKp46所组成的组。本发明还提供治疗患有免疫增生性病症的患者的一种方法，该方法包括a)确定所述患者体内T细胞或NK细胞的NK受体状态，以及b)通过使来自患者的NK或T细胞与包含一种抗体的组合物进行接触而耗竭患者的NK或T细胞，该抗体特异地结合所述T细胞或NK细胞所显著表达的NK受体，其中该抗体致使它与之结合的所述T或NK细胞被耗竭。

另一方面，本发明提供治疗患有免疫增生性病症的患者的一种方法或减弱某一个体的体内炎症的一种方法或消除、杀灭或耗竭某一个体的体内NK或T细胞的一种方法，该方法包括对该患者给予一种特异地结合NK细胞受体的抗体，该受体选自KIR2DL1、KIR2DS1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DS4、CD94、NKG2A、NKG2C、NKG2D、NKG2E、NKG2F、NKp30、NKp44和NKp46所组成的组。

在本发明的方法的一个实施例中，该NK受体是一种活化性受体。在另一个实施例中，该受体选自KIR2DL1、KIR2DS1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DS4和CD94所组成的组。在另一个实施例中，该受体是一种NCR例如NKp30、NKp44或NKp46。在另一个实施例中，该受体是一种抑制性受体，优选一种NKG2蛋白例如NKG2D、NKG2E、NKG2F、NKG2C和NKG2A。在另一个实施例中，该抗体特异地结合一个单一的NK细胞受体。在另一个实施例中，NK受体状态是利用一种免疫测试确定的。在另一个实施例中，该NK受体状态是利用一种功能测试确定的，该功能测试用于确定存在于这些T或NK(或其他)细胞上的NK受体的活性。在另一个实施例中，NK受体状态是利用一种基因分型测试确定的。在另一个实施例中，该NK受体的状态是利用检测细胞内编码NK受体的mRNA的一种测试来确定的。在另一个实施例中，该受体可检出地存在于至少50％的特定群的T细胞或NK(或其他)细胞上。

在另一个实施例中，该抗体是一个抗体片段。优选地，该抗体是一种细胞毒性抗体，并且该抗体导致杀灭表达该单个或多个受体的细胞，例如通过将ADCC导向这些细胞(例如，IgG1或IgG3型抗体)。在另一个实施例中，该细胞毒性抗体包含一种成分，该成分选自放射性同位素、毒性肽和毒性小分子所组成的组。一方面，该抗体还另外阻断受体的功能(例如配体的结合或信号传导)，和/或引起受体的内化。在另一个实施例中，该抗体为人源化或嵌合的。在另一个实施例中，将该放射性同位素、毒性肽或毒性小分子直接连接于该抗体。在另一个实施例中，该抗体结合所述T或NK受体的一个小鼠或灵长类同系物。在另一个实施例中，该抗体结合多种KIR受体。在另一个实施例中，该细胞毒性抗体衍生于在免疫测试中用来确定所述T或NK受体状态的同种抗体。

另一方面，本发明提供制备适用于治疗免疫增生性病症的抗体的一种方法，所述方法包括：i)提供特异地结合一种或多种NK受体的多种抗体；ii)检测每一种抗体结合NK或T细胞的能力，其中这些NK或T细胞取自一个或多个免疫增生性病症的患者；iii)从该多种抗体中选择一种结合至少50％的NK或T细胞的抗体，这些NK或T细胞取自一个或多个该患者；以及iv)使得该抗体适于对人类给药。

在一个实施例中，该抗体特异地结合活化性受体。在另一个实施例中，该抗体特异地结合一种受体，该受体选自KIR2DL1、KIR2DS1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DS4、CD94、NKG2D、NKG2E、NKG2F、NKG2C和NKG2A所组成的组。在另一个实施例中，该抗体特异地结合一种NCR例如NKp30、NKp44或NKp46、NKG2C或NKG2D。在另一个实施例中，通过使该抗体人源化或嵌合化而适于对人类给药。在另一个实施例中，该方法进一步包括将一种细胞毒性剂连接于该抗体的步骤。在另一个实施例中，该细胞毒性剂是一种放射性同位素、一种毒性多肽或一种毒性小分子。在另一个实施例中，该细胞毒性剂直接连接于该抗体。在另一个实施例中，该抗体是一种抗体片段。在另一个实施例中，该抗体结合至少60％的取自一个或多个患者的NK或T细胞。在另一个实施例中，该抗体结合至少70％的取自一个或多个该患者的NK或T细胞。在另一个实施例中，该抗体结合至少80％的取自一个或多个该患者的NK或T细胞。

另一方面，本发明的单克隆抗体的特征在于：

特异地结合一种NK细胞受体，该受体选自KIR2DL1、KIR2DS1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DS4、CD94、NKG2A、NKG2C、NKG2D、NKG2E、NKG2F、NKp30、NKp44和NKp46所组成的组；

结合Fc受体；以及

当结合人类NK细胞上的所述NK细胞受体时，引起所述NK细胞耗竭。优选地，所述抗体为人源化的或嵌合的。

优选地，所述抗体特异地结合NKp46、NKG2A和NKG2C。可任选地，所述抗体特异地结合NKG2A和NKG2C，或可任选地，所述抗体特异地结合NKG2A、NKGC和NKG2E。在一个实施例中，该抗体与Z199或Z270竞争结合NKG2A，和/或包含来自NKG2A的互补性决定区。优选地，所述抗体包含G1或G3同种型的Fc区。

在本文任一实施例的某些方面，该免疫增生性病症是一种自身免疫性病症，该病症选自下组，该组包括：***反应，哮喘，关节炎，包括骨关节炎、类风湿性关节炎和脊椎关节病，胃肠道炎症、克罗恩病和溃疡性结肠炎、神经炎性病症、桥本甲状腺炎、恶性贫血、艾迪生病、I型糖尿病、类风湿性关节炎、***性红斑狼疮、皮肌炎、银屑癣、干燥综合征、红斑狼疮、脱髓鞘病、多发性硬化症、重症肌无力、莱特尔氏综合征、格雷夫斯氏病、多发性肌炎、格-巴二氏综合征、韦格纳肉芽肿病、乳糜泻、结节性多动脉炎、风湿性多肌病、颞动脉炎、贝切特氏病、丘-施二氏综合征和高安动脉炎。优选地，该免疫增生性病症是NK-LDGL或T-LDGL、类风湿性关节炎、I型糖尿病、或选自ITP、多发性硬化症、韦格纳肉芽肿病和干燥综合征所组成的组的病症。在用于治疗免疫增生性病症的方法的某些方面中，所述细胞是T细胞。在一个实施例中，该T细胞是CD3⁺，可任选地为CD4⁺CD28^-或CD8⁺，这些细胞也已经被报道用于表达NK细胞受体。在多个示例性的方面，该抗体结合NKG2A，而且与以下的一种抗体结合基本相同的表位(抗原决定部位)，该抗体选自Z199和Z270所组成的组。在另一个示例性方面，该抗体结合NKp46，而且与以下的一种抗体结合基本相同的表位(抗原决定部位)，该抗体选自BAT281所组成的组。在另一个示例性方面，该抗体结合KIR2DL1、KIR2DL2和/或KIR2DL3，而且与PCT专利公开号WO 2005/003172和WO 06/003179中所描述的抗体DF200、NKVSF或1-7F9结合基本相同的表位，它们披露的内容均通过引用结合于此，而且与以下的一种抗体结合基本相同的表位(抗原决定部位)，该抗体选自Z199和Z270所组成的组。在多个示例性的方面中，该抗体结合NKG2D，而且与以下的一种抗体结合基本相同的表位(抗原决定部位)，该抗体选自BAT221、ECM217和ON72所组成的组。

在此描述的任一实施例的另一方面，该免疫增生性病症，包括炎症性或自身免疫性病症，是一种已确立的疾病。优选地，根据医疗标准(例如ACR)，该疾病的特征在于由免疫细胞介导的身体症状(例如组织损伤、破坏、肿胀等)，并且/或者在一个确定的时间段(例如3、6、9、12、24或36个月)内不消退。

在此描述的任一实施例的其他诸方面中，本发明提供了利用在此描述的任一方法制备的抗体。本发明还包括具有基本相同的抗原特异性和活性(例如，其结合与亲代抗体相同的抗原)的抗体片段和衍生物。这种片段包括但不限于Fab片段、Fab’2片段、CDR和ScFv。

在其他诸方面，本发明提供了多个试剂盒，它们包括本发明所述的抗体中任何一种或多种。在一个实施例中，该试剂盒包括至少一种诊断性抗体和至少一种治疗(例如细胞毒性的)抗体。在另一个实施例中，该诊断抗体和该治疗抗体特异地结合同一NK细胞受体。在另一个实施例中，该试剂盒还包括根据本发明方法使用这些抗体的说明。

本发明还包括药物组合物，这些药物组合物包括一种或多种本发明的抗体或者其中的一个片段或衍生物以及一种药学上可接受的载体或赋形剂。

附图说明

图1。人NKP46基因组序列可用来对小鼠NK细胞进行基因标记：(a)用于转基因的人基因组片段示意图。NKP46外显子以黑色方块表示。(b)将从huNKp46转基因小鼠得到的脾细胞悬液针对NK1.1、人NKp46和其他细胞表面分子的表达进行染色。所标明的细胞类型如实验步骤中描述的进行鉴定。(c)将huNKp46转基因小鼠的骨髓细胞针对CD3、CD122、DX5、NK1.1和人NKp46的表达进行染色。并鉴定NK前体细胞(NKp)、未成熟和成熟NK细胞。(d)将从huNKp46转基因小鼠得到的***(腹股沟)、肝、肺和外周血细胞悬液针对CD3、NK1.1和人NKp46的表达进行染色。在(b-d)中的结果示出了人NKp46(空白分布图，粗线)或同种型对照(灰色分布图，细线)在指定亚群或门控CD3-NK1.1+细胞(c)中的表达。(e)对照与指定抗体一起孵育的Daudi细胞，进行起源于B6(C57BL/6)或huNKp46 Tg(Tg)脾细胞的LAK细胞的重新指向的细胞溶解测试。从B6和huNKp46 Tg小鼠制备的LAK细胞的溶细胞功能是可比的。图1中的结果代表三个实验。

图2。通过注射抗人NKp46抗体可特异性耗竭huNKp46转基因小鼠的NK细胞。多组hu-NKp46转基因小鼠按方法中的描述静脉注射PBS(对照)或三种抗人NKp46的mAb的组合。(a)注射后，测定不同时间血液中NK1.1+CD3-细胞的百分率。(b)注射后48小时牺牲小鼠，并测定脾、外周血、肝和肺中NK细胞、TCR γδ+T细胞及CD1d限制性NKT细胞的百分率。结果以注射后指定细胞亚群相对于对照小鼠的百分率来表示。

图3。与包含CD94/NKG2A和-C的表达细胞(黑色方块)相比，耗竭了CD94/NKG2A和-C表达细胞(白色方块)的淋巴细胞在与THP-1细胞一起培养时，诱导生成的TNF-α减少。淋巴细胞或THP-1细胞单独培养时，未观察到TNF-α的生成(见图注)。相反，INF-α的生成未受影响，表明淋巴细胞在与THP-1细胞共培养时被激活。

具体实施方式

引言

本发明提供了用于制备及使用适于治疗增生性病症特别是免疫增生性病症如NK型颗粒淋巴细胞增生性疾病(NK-LDGL)的抗体的新方法。本发明还包括利用本文描述的方法制备的抗体、抗体衍生物或抗体片段以及利用该抗体治疗患者的方法。具体地说，本发明的方法包括将与这些病症相关的增生性NK或NK样细胞分型，以确定增生性细胞上显著存在的一种或多种NK细胞受体，然后利用特异地结合该相同的一个或多个受体的抗体来治疗患者。

NK-LDGL和其他免疫增生性病症的特征常常在于一种或少数几种NK或NK样细胞的克隆性扩增。因此，由于各个NK细胞通常仅表达NK细胞受体的一个亚群，与造成这些病症的相当一部分过度增生细胞常常表达少数NK细胞受体。因此本发明提供一种治疗这些病症的方法，它通过鉴定在给定患者体内增生性细胞内表达的特定受体，然后利用细胞毒性抗体特异性靶向那些表达该受体的细胞。这样，可特异性减少过度增生的细胞的数量，同时并不影响其他免疫和非免疫细胞。

总体上，本发明的方法涉及到一组单克隆抗体的用途，每一种单克隆抗体均特异结合一种或少数几种NK细胞受体，例如KIR受体、CD94、NKG2受体之一或者NCR(例如NKp30、NKp44、NKp46)。常常使用两组抗体。一组包含直接或间接标记的抗体在性质上为诊断的并用来确定哪种特定NK细胞受体在给定患者的NK细胞上表达。用于治疗的第二组对应于单克隆抗体，它通常在非人动物体内产生但已经通过例如人源化或嵌合而使其适于用于人类。一方面，这些抗体阻断受体功能(例如配体结合或信号传导)，和/或引起受体的内化。另一方面，这些抗体杀灭表达该受体的细胞，例如通过将ADCC导向该细胞(例如IgG1或IgG3型抗体)。在某些实施例中，这些抗体进一步利用细胞毒性剂直接或间接进行衍生，使其杀灭表达该受体的细胞。例如，可将这些抗体连接于放射性同位素、细胞毒性多肽或细胞毒性小分子。

定义

如此使用的下列术语除非另有说明具有赋予它们的含意。

如在此所使用，“NK”细胞是指在非常规免疫中所包括的淋巴细胞的一个亚群。NK细胞可根据某些特点和生物学属性进行鉴定，例如特异性表面抗原包括CD16、CD56和/或CD57的表达、细胞表面上α/β或γ/δTCR复合体的缺失、通过激活特异性细胞溶解酶而结合并杀灭不表达“自身”MHC/HLA抗原的细胞的能力、杀灭表达针对NK活化受体的配体的肿瘤细胞或其他疾病细胞的能力、以及释放那些刺激或抑制免疫反应的蛋白分子(即所谓的细胞因子)的能力。利用本领域中熟知的方法，这些特点和活性中的任何一种均可用来鉴定NK细胞。

术语“NK细胞受体”是指任何始终存在于所有或部分NK细胞上的细胞表面分子。优选地，该NK细胞受体只表达在NK细胞(静息的或激活的)上，尽管该术语也包括还能在其他细胞类型上表达的受体。NK细胞受体的实例包括KIR受体家族的成员、CD94、NKG2受体、NCR受体例如NKp30、NKp44和NKp46、LIR-1等(参见，例如：Trowsdale and Parham(2004)Eur J Immunol 34(1)：7-17；Yawata et al.(2002)Crit Rev Immunol 22(5-6)：463-82；Hsu et al.(2002)Immunol Rev 190：40-52；Middleton et al.(2002)TransplImmunol 10(2-3)：147-64；Vilches et al.(2002)Annu Rev Immunol20：217-51；OMIM 602894；Braud et al.(1998)Nature 391：795-799；Chang et al.(1995)Europ.J.Immun 25：2433-2437；Lazetic et al.(1996)Immun 157：4741-4745；Rodriguez et al.(1998)Immunogenetics47：305-309；OMIM 161555；Houchins et al.(1991)J.Exp.Med.173：1017-1020；Adamkiewicz et al.(1994)Immunogenetics 39：218；Renedo et al.(1997)Immunogenetics 46：307-311；Ravetch et al.(2000)Science 290：84-89；PCT WO 01/36630；Vitale et al.(1998)J.Exp.Med.187：2065-2072；Sivori et al.(1997)J.Exp.Med.186：1129-1136；Pessino et al.(1998)J.Exp.Med.188：953-960；它们各自披露的内容均通过引用结合于此)。

如在此所使用，“NK受体状态”是指对表达在取自某一个体例如免疫增生性病症的一个患者的NK或其他细胞上的不同NK细胞受体的身份和显著性。例如，检查取自一个患者的NK细胞可能发现特定NK细胞受体如KIR2DS2在70％的细胞中得到表达，而另一种受体例如KIR2DL1在40％的细胞中得到表达，另一种受体例如CD94在80％的细胞上得到表达，等等。这些信息对于确定在本发明的方法中采用哪种细胞毒性抗体是有用的。应该理解，尽管获得有关多种NK细胞受体的表达信息明显有用，但NK受体状态还可以指单一种受体例如KIR2DS2或少数受体例如KIR2DL2/3以及KIR2DS2的表达水平或显著性。

“LGL”或“大颗粒淋巴细胞”指一群形态独特的淋巴细胞，LGL构成外周血单核细胞的10-15％。LGL可包括NK细胞和T细胞(参见，例如Loughran(1993)Blood 82：1-14)，它们可通过特定标志物而区分，例如CD3的表达(NK细胞为CD3^-，T细胞为CD3⁺)。优选地，为了本发明的目的，LGL细胞为CD3^-。然而，在本发明的某些实施例中，将从一个患者中取得PBL，并检测以发现是否有任何细胞类型被扩增，优选LGL，特别是CD3-LGL。总的来说，可检测任何被扩增的细胞类型，以确定在它们的表面上是否显著地表达了特殊的NK细胞受体。

“显著表达”是指NK细胞受体表达在取自特定患者的大量指定类型的细胞(例如NK细胞，T细胞)内。然而该术语“显著表达”不限于精确的百分率值，多数情况下，称为“显著表达”的受体存在于至少30％、40％，优选50％、60％、70％、80％或更多的取自患者的NK细胞、T细胞或其他过度增生的细胞上。

如在此所使用，术语“抗体”是指多克隆和单克隆抗体。根据重链恒定区的类型，可将抗体归入以下五种主要类别之一：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。这些类别中有几种被进一步分为亚类或同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4等。一个示例性免疫球蛋白(抗体)的结构单位包括一个四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链构成，每对包括一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的N末端限定一个具有约100至110或更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。术语可变轻链(V_L)和可变重链(V_H)分别指这些轻链和重链。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定区分别命名为“α”、“δ”、“ε”、“γ”和“μ”。不同类别免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型已经为人熟知。IgG和/或IgM是本发明中优选使用的抗体类别，特别优选IgG，因为它们是生理状况下最常见的抗体且在实验室条件下最容易制备。优选地，本发明的抗体是单克隆抗体。特别优选的是人源化的、嵌合的、人的或其他适合人的抗体。“抗体”还包括在此描述的任一抗体的任一片段或衍生物。

术语“特异地结合于”意思为抗体在竞争结合试验中可优先结合至结合配对体，例如一个NK细胞受体如激活性KIR受体，它的评估是利用这些蛋白的重组形式、其抗原表位或存在于分离的NK或相关靶细胞表面上的天然蛋白。下文将进一步阐述竞争结合试验以及其他用于确定特异地结合的方法，这些在本领域中已经为人熟知。

在一种抗体识别一个NK细胞受体(例如NKG2A、NKp46)的效应的背景下，术语“耗竭”或“使耗竭”是指表达该NK受体的细胞(例如表达NKG2A或NKp46的细胞)的减少或消除。

“适合人类”的抗体指任何可安全用于人类用于例如本文描述的治疗方法的抗体、衍生抗体或抗体片段。适合人类的抗体包括所有类别的人源化、嵌合或完全的人抗体，或者任何至少一部分来自人类或以其他方式进行修饰以避免该免疫反应的抗体，该免疫反应通常在使用天然的非人抗体时被激励。

“毒性”或“细胞毒性”肽或小分子包括任意此种化合物，该化合物可以按任何可检出的方式减慢、停止或逆转细胞增生、降低它们的活性(例如NK细胞的细胞溶解活性)，或者直接/间接杀灭它们。优选地，毒性或细胞毒性化合物通过直接杀灭细胞、刺激凋亡或以其他方式发挥作用。如在此所使用，毒性“肽”可包括任何此类的肽、多肽或衍生物，包括带有非天然氨基酸或修饰键的肽或多肽衍生物。毒性“小分子”可包括任何毒性化合物或成分，优选尺寸小于10kD、5kD、1kD、750D、600D、500D、400D、300D或更小。

“免疫原片段”在本文中是指任何能够引起以下免疫反应的多肽或肽片段，例如(i)生成结合所述片段和/或结合包含所述片段的任何形式的分子的抗体，包括膜结合受体及由其衍生的突变体，(ii)刺激T细胞反应，包括T细胞对双分子复合物发生反应，而该双分子复合物包括任何MHC分子和衍生自所述片段的肽，(iii)结合转染的载体，例如表达编码哺乳动物免疫球蛋白的基因的噬菌体或细菌。作为替代，一个免疫原片段也指任何能引起以上所限定的免疫反应的结构，例如通过共价偶联轭合于载体蛋白的肽片段、它的氨基酸序列中包含所述肽片段的嵌合性重组多肽结构，并且明确地包括用cDNA(其序列包括对所述片段编码的一个部分)转染的细胞。

为了本发明的目的，一种“人源化”抗体是指一种抗体，其中一种或多种人免疫球蛋白的恒定和可变框架区与一种动物免疫球蛋白的结合区例如CDR相融合。这种人源化抗体被设计来保持非人抗体(该结合区域由此衍生)的结合特异性，但要避免对非人抗体的免疫反应。

一种“嵌合抗体”是一种抗体分子，其中(a)对恒定区或其一部分进行改变、置换或交换，从而将抗体结合位点(可变区)被连接于类别、效应器功能和/或种属不同(或已改变的)的一个恒定区，或是一种完全不同的分子，该分子对该嵌合抗体赋予新的属性，例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或者(b)将该可变区或其一部分用具有不同或已经改变的抗原特异性的一个可变区进行改变、置换或交换。

“人”抗体是一种从转基因小鼠或其他动物获得的抗体，该转基因小鼠或其他动物经“工程化(engineered)”以便响应于抗原激发(antigenic challenge)而产生特异性人类抗体(参见，例如Greenet al.(1994)Nature Genet 7：13；Lonberg et al.(1994)Nature 368：856；Taylor et al.(1994)Int Immun 6：579，其全部内容均通过引用结合于此)。完全的人抗体也可通过基因或染色体转染法以及噬菌体展示技术而构建，这些技术在本领域中已知(参见，例如McCafferty et al.(1990)Nature 348：552-553)。人抗体还可以由体外激活的B细胞生成(参见，例如美国专利号5,567,610和5,229,275，其全部内容均通过引用结合于此)。

在本发明的背景中，“活性”或“激活的”NK细胞表示生物活性的NK细胞，更具体的是指具有溶解靶细胞的能力的NK细胞。例如，一个“活性”NK细胞能够杀灭表达一个NK激活受体-配体而不表达“自身”MHC/HLA抗原的NK细胞(KIR-不相容的细胞)。用于重导向杀灭测试的适宜靶细胞的实例是P815和K562细胞，但可采用多种细胞类型中的任何一种并且这在本领域中是熟知的(参见，例如Sivori et al.(1997)J.Exp.Med.186：1129-1136；Vitale et al.(1998)J.Exp.Med.187：2065-2072；Pessino et al.(1998)J.Exp.Med.188：953-960；Neri et al.(2001) Clin.Diag.Lab.Immun.8：1131-1135)。“活性”或“激活的”细胞还可以通过本领域中任何其他与NK活性相关的属性或活性来鉴定，例如细胞内游离钙水平升高产生的细胞因子(例如IFN-γ和TNF-α)。

如在此所使用的，术语NK-LDGL是指任何特征如下的增生性病症：NK细胞或NK样细胞的克隆性扩增，例如具有一组特征性表面抗原(例如CD3-、CD56+、CD16+)的大颗粒淋巴细胞，(参见，例如Zambello et al.(2003)Blood 102：1797；Loughran(1993)Blood 82：1；Epling-Burnette et al.(2004)Blood-2003-02-400)或表达任何NK细胞受体，如本文中所定义的。NK-LDGL的症状可以包括，除其他之外，发热、轻微的中性粒细胞减少症、血小板减少症、贫血、淋巴细胞增多、脾大、肝大、***病和骨髓浸润(参见，例如Zambello et al.(2003)Blood 102：1797；Loughran(1993)Blood82：1；Epling-Burnette et al.(2004)Blood-2003-02-400)。

术语“分离的”、“提纯的”或“生物纯的”是指大体上或基本上没有在天然状态下通常与其相伴随组分的物质。通常利用测试化学的技术如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱来确定纯度和同质性。制备物中存在的优势种类的蛋白基本上被提纯。

如在此使用的术语“生物样品”包括但不限于生物学流体(例如血清、淋巴液、血液)、细胞样品或组织样品(例如骨髓)。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可以互换使用，指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于这样的氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是对应于天然存在的氨基酸以及天然存在的氨基酸聚合物的人工化学模拟物和非天然存在的氨基酸聚合物。

当提及例如细胞或核酸、蛋白或载体时使用术语“重组”是指该细胞、核酸、蛋白或载体已经通过引入异源性核酸或蛋白或通过改变天然核酸或蛋白而被修饰，或者表示该细胞来源于如此修饰的细胞。因此，例如重组细胞表达不存在于该天然形式的细胞内的基因，或者表达那些以其他异常方式表达、低表达或根本不表达的天然基因。

制备对NK细胞受体特异的单克隆抗体

本发明涉及适用于人且靶向一种或少数几种NK细胞受体的抗体、抗体片段或抗体衍生物的制备和应用。本发明的抗体可通过本领域中已知的多种技术中的任何一种而制备。典型地，它们使用存在于NK细胞表面上的包含受体的免疫原通过非人动物(优选小鼠)的免疫作用进行制备。该受体可包括全部NK细胞或细胞膜、一种NK细胞受体的全长序列，或者任何NK细胞受体的片段或衍生物，通典型地是免疫原片段，即多肽的一部分，而该多肽包含暴露于细胞表面上的表达该受体的表位。这种片段通常包含成熟多肽序列中至少7个连续的氨基酸，甚至更优选其中至少10个连续的氨基酸。它们主要衍生于该受体的胞外结构域。应该理解，在部分或全部患者体内、有时或一直存在于全部或部分NK细胞表面上的任何受体或任何其他受体均可用于产生抗体。在优选的实施例中，用来产生抗体的该激活性NK细胞受体是一种人受体。

在一个最优选的实施例中，该免疫原包含在脂质膜内(典型地，在细胞表面)的野生型人NK受体多肽。在一个特殊实施例中，该免疫原包含完整的NK细胞，尤其是完整的人NK细胞，可任选地经过处理或溶解。这些抗体可针对NK细胞表面上存在的任何蛋白质或分子而进行制备，优选一种NK细胞受体，更优选选自下组的NK细胞受体，该组包括KIR受体、LIR受体(诸如LIR-1、Ly49、CD94/NKG2A)、NCR(诸如Nkp30、Nkp44和Nkp46)，并且最优选一种激活性NK细胞受体，例如KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5和KIR3DS1(参见，例如Trowsdale and Parham(2004)Eur J Immunol 34(1)：7-17；Yawata et al.(2002)Crit RevImmunol 22(5-6)：463-82；Hsu et al.(2002)Immunol Rev 190：40-52；Middleton et al.(2002)Transpl Immunol 10(2-3)：147-64；Vilches et al.(2002 Annu Rev Immunol 20：217-51；它们所披露的全部内容均通过引用结合于此)；或NKG2D，一种激活性细胞表面分子，其始终存在于全部或部分的各种类型的免疫细胞上，特别是NK细胞、CD8⁺T细胞、部分CD4⁺T细胞以及γ/δT细胞。NKG2D也称杀灭细胞凝集素样受体、C亚家族、成员4或KLRC4(参见，例如OMIM 602893，它所披露的全部内容均通过引用结合于此)。如在此使用的，NKG2D是指任何NKG2D异构体，例如在Diefenbach et al.(2002)NatImmunol.3(12)：1142-9中描述的异构体。在NK和T细胞中，NKG2D可以与诸如DAP10(参见，例如OMIM 604089)或DAP12(参见，例如OMIM 604142)的蛋白形成异源二聚体。应该理解，在此对NKG2D提及的任何活性例如细胞活化、抗体识别等，也可适用于含NKG2D的复合体例如NKG2D-DAP10或NKG2D-DAP12异源二聚体。

在一个实施例中，该抗体衍生于可识别一种或多种NK细胞受体的一种或多种已存在的单克隆抗体。恰当抗体的实例如下文所示。

一个第一个优选实例是识别NKG2A的一种抗体，例如称为3S9、20d5、Z270或Z199的抗体或其衍生物。3S9描述于美国专利公开案20030095965中，它披露的内容通过引用结合于此。3S9结合NKG2C和NKG2E以及NKG2A。20d5是一种可商购的抗体(BDBiosciences Pharmingen，Catalog No.550518，USA)。20d5结合小鼠NKG2A和NKG2E以及NKG2C。Z199是一种可商购的抗体(Beckman Coulter，Inc.，Product No.IM2750，USA)。Z270描述于共同未决的PCT专利公开号WO 06/070286中，其披露的全部内容通过引用结合于此。Z270于2005年12月22日保藏到法国微生物保藏中心(CNCM)，Institute Pasteur，25，Rue du Docteur Roux，F-75725Paris，France，保藏号是I-3549。Z270特异结合人NKG2A，而不结合人NKG2C或NKG2E。在其他实施例中，本发明的抗体特异性排除Z270。

其他优选的实例包括EB6b(识别KIR2DL1、KIR2DS1)、GL183(KIR2DL2/3、KIR2DS2)、FES172(KIR2DS4)、Z27(KIR3DL1、KIR3DS1)、Q66(KIR3DL2)、XA185(CD94)、Z199(NKG2A)、F278(LIR-1)、BAB281(NKp46)、以CNCM登记号I-2576保藏的AZ20(NKp30)、Z231(NKp44)或1D11、BAT221、ECM217和ON72(NKG2D)参见，例如Zambello et al.(2003)Blood102：1797-1805；Groh et al.(2003)PNAS 100：9452-57；Andre et al.(2004)Eur.J.Immunol.34：1-11，前述三个参考文献所披露的全部内容均通过引用结合于此。这些抗体可直接或间接进行标记(即，与标记的第二抗体一起使用)，作为诊断性抗体用于本文描述的分型步骤以确定患者的NK受体状态。此外，这些抗体可制成适于对人类给药以及，可任选地，如本文所述制备成有毒的用于本发明的治疗方法中的细胞毒性抗体。

本发明的诊断性或治疗性(例如细胞毒性)抗体可以是全长抗体或抗体片段或衍生物。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)₂和Fv片段；双体(diabodies)；单链Fv(scFv)分子；单链多肽，仅含一个轻链可变区或其中的一个片段，该片段包含该轻链可变区的三个CDR，而无相关的重链部分；单链多肽，仅含一个重链可变区或其中的一个片段，该片段包含该重链可变区的三个CDR，而无相关的轻链部分；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。这些片段和衍生物以及制备它们的方法在本领域中是熟知的。例如，胃蛋白酶可用来在铰链区中的二硫键下消化抗体而生成F(ab)’₂，本身是一条轻链的Fab的二聚体通过二硫键连接于V_H-C_H1。F(ab)’₂可在温和条件下还原，打断在铰链区的二硫键，从而将该F(ab)’₂二聚体转化成Fab’单体，该Fab’单体实质上是具有部分铰链区的Fab(参见Fundamental Immunology(Paul ed.，3d ed.1993))。尽管多种抗体片段均根据完整抗体的消化而定义，本领域中技术人员将理解这些片段可通过化学方法或利用重组DNA方法而从头合成。

单克隆或多克隆抗体的制备在本领域中为人熟知，可采用大量可用技术中的任何一种(参见，例如Kohler & Milstein，Nature256：495-497(1975)；Kozbor et al.，Immunology Today 4：72(1983)；Cole et al.，pp.77-96 in monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(1985))。用于生成单链抗体的技术(美国专利号4,946,778)可适合于生产针对所希望的多肽的抗体，例如，NK细胞受体如KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5和KIR3DS1。另外，转基因小鼠或其他有机体如其他哺乳动物，可用来表达人源化的、嵌合的或经类似修饰的抗体。作为替代，噬菌体展示技术可用来鉴定特异地结合至所选抗原的抗体和异源性Fab片段(参见，例如McCafferty et al.，Nature 348：552-554(1990)；Marks et al.，Biotechnology 10：779-783(1992))。在一个实施例中，该方法包括从文库或表达谱中选择的与至少一种NK受体发生交叉反应的一个单克隆抗体或其片段或衍生物。例如，该表达谱可为抗体或其片段任意的(重组)表达谱，可任选地，可由任何恰当的结构(例如噬菌体、细菌、合成复合物等)展示。

用抗原使非人哺乳动物免疫的步骤可以按本领域中熟知的任何方式进行(参见，例如E.Harlow and D.Lane，Antibodies：A Laboratory Manual.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY(1998))。通常，免疫原悬浮于或溶解于缓冲液中，可任选地与佐剂例如完全福氏佐剂一起悬浮或溶解。用于确定免疫原用量、缓冲液的类型以及佐剂用量的方法为本领域中普通技术人员所熟知，并且不以任何方式限制本发明。

类似地，足以刺激抗体产生的免疫作用的部位和频率在本领域中也为人熟知。在一个典型的免疫接种试验中，第1天给非人动物腹膜内注射抗原，约1周后再注射一次。随后在第20天左右进行抗原的回忆注射(recall injection)，可任选地，与佐剂例如不完全福氏佐剂一起注射。该记忆注射为静脉内注射，且可在连续几天内重复。第40天时进行加强免疫注射—静脉内或腹膜内，通常不用佐剂。约40天后，该方案可引起产生抗原特异性抗体的B细胞的生成。也可采用其他方案，只要它们能导致表达针对免疫接种中所采用抗原的抗体的B细胞生成。

在另一个实施例中，将未免疫非人哺乳动物的淋巴细胞分离、体外培养并暴露于细胞培养基中的免疫原。随后收集淋巴细胞，并进行下文所描述的融合步骤。

对于优选用于本发明目的的单克隆抗体，下一个步骤是从未免疫的非人哺乳动物中分离细胞，例如淋巴细胞、脾细胞或B细胞，随后将那些脾细胞或B细胞或淋巴细胞与永生化细胞融合以形成产生抗体的杂交瘤。因此，如在此使用的术语“从被免疫动物中制备抗体”包括从被免疫动物得到B细胞/脾细胞/淋巴细胞并利用那些细胞生成表达抗体的杂交瘤以及从被免疫动物的血清中直接获得抗体。例如从非人哺乳动物中分离脾细胞在本领域中是为人熟知的，例如，包括从麻醉的非人哺乳动物中取出脾、切成小块并从脾包膜中挤出脾细胞并通过细胞滤器的尼龙过滤网挤进恰当的缓冲液中而得到单种细胞悬液。洗涤细胞、离心并重悬于缓冲液中，该缓冲液可溶解任何红细胞。将该溶液再次离心，最后将小球中剩余的淋巴细胞重悬于新鲜缓冲液中。

一旦被分离且存在于单细胞悬液中，这些产生抗体的细胞就融合于永生化细胞系中。这典型地为小鼠骨髓瘤细胞系，尽管本领域中已知还有多种对于生成杂交瘤有用的其他永生化细胞系。优选的小鼠骨髓瘤细胞系包括但不限于那些起源于MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤(可从Salk institute Cell Distribution Center，San Diego，Calif.U.S.A.得到)的细胞系、X63 Ag8653和SP-2细胞(可从American Type Culture Collection，Rockville，Maryl and U.S.A.得到)。该融合是利用聚乙二醇或类似物实现的。随后将得到的杂交瘤在选择性培养基中培养，该培养基含有一种或多种抑制非融合亲代骨髓瘤细胞生长或生存的物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质抑制HGPRT缺陷细胞的生长。

杂交瘤细胞可以生长在巨噬细胞滋养层上。巨噬细胞优选来自用来分离脾细胞的同窝非人哺乳动物，且通常在接种杂交瘤细胞之前几天用不完全福氏佐剂或类似物进行预处理。融合方法披露在例如Goding，“Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，”pp.59-103(Academic Press，1986)中，它所披露的内容通过引用结合于此。

允许这些细胞在选择培养基内培养足够时间，用于形成克隆和产生抗体。这通常在7到14天之间。随后对杂交瘤克隆测试产生特异性识别预期底物(例如，诸如KIR2DS2的NK细胞受体抗体)的抗体生成。该测试通常是比色ELISA型测试，尽管可采用任何适于杂交瘤在其中生长的孔的测试。其他测试包括免疫沉淀和放射免疫测试。测定对预期抗体产生表现为阳性的孔，以确定存在一个还是多个不同的克隆。如果存在一个以上的克隆，可将细胞重新克隆并培养，以确保仅有单个细胞形成可产生预期抗体的克隆。具有单个明显克隆的阳性孔通常重新克隆并重新测试，以确保正在检测并在生成仅一个单克隆抗体。

随后将确定能生成本发明的单克隆抗体的杂交瘤以较大量在恰当培养基中扩大培养，例如DMEM或RPMI-1640。作为替代，该杂交瘤细胞可在动物体内作为腹水瘤培养。

经过充分培养而产生预期单克隆抗体后，将含单克隆抗体(或腹水)的培养基与这些细胞分离，并提纯其中存在的单克隆抗体。典型地，可通过凝胶电泳、透析、利用蛋白A或蛋白G-Sepharose的层析，或者连接于固态底物如琼脂糖或琼脂糖凝胶珠子的抗小鼠Ig而实现纯化(所有这些均在例如Antibody Purification Handbook，Amersham Biosciences，publication No.18-1037-46，Edition AC中描述，其所披露的内容均通过引用结合于此)。通常利用低pH缓冲液(pH3.0或更低的甘氨酸或醋酸缓冲液)，通过立即中和含抗体的组分而从蛋白A或蛋白G的柱洗脱所结合的抗体。收集这些组分、透析并按需要进行浓缩。

在优选的实施例中，将对结合存在于NK细胞受体上的抗原决定基的一种抗体进行编码的DNA从杂交瘤中分离出来、置于恰当的表达载体中用于转染入恰当的宿主中。随后该宿主用于重组生成该抗体、其变异体、其活性片段或包含该抗体的抗原识别部分的人源化的或嵌合的抗体。优选地，用于该实施例中的DNA编码一种抗体，该抗体识别一种存在于一种或多种人NK受体上的抗原决定基，特别是在来自很大一部分NK-LDGL患者的LGL细胞中显著存在的NK受体上的抗原决定基。

对本发明该单克隆抗体进行编码的DNA可利用常规步骤容易地进行分离并测序(例如，通过利用能够特异地结合编码小鼠抗体重链和轻链的那些基因的寡核苷酸探针)。一旦分离出，可将该DNA置入表达载体中，然后将该载体转染入宿主细胞例如E.coli细胞、猿猴COS细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中(这些细胞在其他情况下并不产生免疫球蛋白)，以实现单克隆抗体在重组的宿主细胞内的合成。对该抗体编码的DNA在细菌内的重组表达在本领域中已经为人熟知(参见，例如Skerra et al.(1993)Curr.Op.Immunol.5：526；以及Pluckthun(1992)Immunol.Revs.130：151)。抗体还可通过筛选免疫球蛋白的组合文库而产生，如在Wald et al.(1989)Nature 341：544中所披露的。

在一个特定的实施例中，抗体与以下一种单克隆抗体结合本质上相同的表位或抗原决定基，这些单克隆抗体有：EB6b、GL183、FES172、Z27、Q66、XA185、Z270(CNCM Ref.3549)、Z199(BeckmanCoulter，AZ20(CNCM Ref.1-2576)、Bab281、KL247或产品Ref.195314(R & D Systems，Minneapolis)或F278(参见，例如Zambello etal.(2003)Blood 102：1797)或者以下单克隆抗体中的一种：1D11、BAT221、ECM217和ON72(参见，例如Groh et al.(2003)PANS100：9452-57；Andre et al.(2004)Eur.J.Immunol.34：1-11，前述三个参考文献所披露的全部内容均通过引用结合于此)。术语与单克隆抗体x“结合本质上相同的表位或抗原决定基”的含意为一种抗体可以与x“竞争”，其中x是EB6b等。与所讨论的单克隆抗体结合本质上相同的表位的一种或多种抗体的鉴定，可利用多种实验抗体竞争的免疫学筛查试验中的任何一种而容易地确定。这种测试在本领域中是常规的(参见，例如美国专利号5,660,827，它通过引用结合于此)。应该理解，实际上，为了鉴定出一种抗体与所讨论的单克隆抗体结合在相同或基本上相同的表位上并不要求确定该抗体所结合的表位。

例如，当待检验的实验抗体是来自不同来源的动物或者甚至具有不同的Ig同种型的情况，可采用简单的竞争测试，其中将对照(例如GL183)和实验抗体进行混合(或预吸附)，并且应用到含有带表位蛋白的一个样品上，例如，在GL183的情况下为KIR2DS2。基于ELISA、放射免疫测试、Western印迹以及采用BIACORE(如在实施例中描述的)的多种方案适用于这种简单竞争的研究，并且在本领域中为人熟知。

在某些实施例中，将对照抗体(例如GL183)与不同量的实验抗体(例如1∶10或1∶100)预混合一段时间，随后加到含抗原(例如KIR2DS2表位)的样品中。在其他实施例中，对照和不同量的实验抗体可以在暴露于抗原样品的过程中简单混合。只要能够区分结合抗体与游离抗体(例如通过分离或洗涤技术而清除非结合抗体)以及区分对照抗体与实验抗体(例如通过利用种属特异或同种型特异的第二抗体，或通过用可检测性标记物特异标记的对照抗体)，即能够确定该实验抗体是否减少对照抗体与抗原的结合，表明该实验抗体与对照抗体识别基本上相同的表位。在不存在完全无关抗体的情况下，(标记的)对照抗体的结合将为对照高值。对照低值是通过将该标记的对照抗体(例如GL183)与完全相同型别的未标记抗体(例如GL183)一起孵育而获得，其中将出现竞争并减少标记抗体的结合。在一个实验测试中，在实验抗体存在的情况下，标记抗体反应性的显著降低可以指示那种识别相同表位的实验抗体，即，与该标记的对照抗体发生“交叉反应”的那种抗体。在约1∶10和约1∶100之间的任何对照：实验抗体比率下，将标记的对照与每一种抗原的结合降低至少50％或优选70％的任何实验抗体均认为它是与对照结合基本相同的表位或抗原决定基的抗体。优选地，这种实验抗体可将对照与抗原的结合降低至少90％。

在一个实施例中，可通过流式细胞仪测试来评估竞争。首先将含给定激活性受体的细胞与已知特异地结合至该受体(例如，表达KIR2DL2的NK细胞，和GL183抗体)的对照抗体一起孵育，随后与已经标记了例如荧光染料或生物素的实验抗体一起孵育。如果通过与饱和量的对照抗体预孵育获得的结合是该抗体未与对照预孵育所获得结合(荧光均值)的80％、优选50％、40％或更少，则称该实验抗体与该对照竞争。作为替代，如果通过将细胞上的标记对照(通过荧光染料或生物素)与饱和量的待测抗体预孵育获得的结合是未与该抗体预孵育所获得结合的80％、优选50％、40％或更少，则称实验抗体与该对照竞争。

在一个优选的实例中，可采用简单的竞争测试，其中实验抗体被预吸收，并在饱和浓度下施加到一个上面固定有用于结合抗体(例如KIR2D2S蛋白或其含表位部分，已知该抗体可由GL183结合)的底物的表面上。该表面优选是一个BIACORE芯片。随后使该对照抗体(例如GL183)在底物饱和浓度下与该表面接触，并测定该底物表面与该对照抗体的结合。将该对照抗体的这种结合，与该对照抗体在没有实验抗体时对含底物表面的结合相比较。在一个实验测试中，在一种存在实验抗体的情况下，含底物表面与该对照抗体的结合显著减少，预示着识别相同表位的实验抗体，即，与该对照抗体“交叉反应”的那种抗体。可将对照抗体与含抗原底物的结合降低至少30％或优选40％的任何实验抗体认为是与该对照抗体结合基本相同表位或抗原决定基的抗体。优选地，这种实验抗体可将该对照抗体与底物的结合降低至少50％。应该理解，对照和实验抗体的次序可以颠倒，即首先将对照抗体结合于该表面，随后使实验抗体与该表面相接触。优选地，首先将对该底物抗原具有较高亲和力的抗体结合于含底物的表面，因为预期观察到对于第二抗体结合的降低(假定该抗体是交叉反应的)幅度较大。在实施例部分以及Saunal et al.(1995)J.Immunol.Meth 183：33-41中提供这种测试的其他实例，它们披露的内容通过引用结合于此。

在一个实施例中，可以获得能够与NK细胞表面上多种受体相互作用的多种抗体，特别是在确保这些抗体不表现出与其他非相关蛋白的过度交叉反应性的情况下，其中这些受体，例如两种或多种NK细胞受体如KIR受体(KIR2DL1、KIR2DS1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DS2、KIR2DS4、KIR3DL1、KIR3DS1或KIR3DL2，或任何包括这些受体中一种或多种的组合)或NKG2受体(NKG2A、NKG2C、NKG2D、NKG2E、NKG2F或任何包括这些受体中一种或多种的组合)以及任何其他NK细胞受体的任何组合。优选地，从NK细胞受体识别表位(例如KIR2DL2表位)的多种单克隆抗体将与相当百分比的NK细胞(特别是来自患者的NK细胞)上存在的表位发生交叉反应，但不与CD3⁺T细胞、CD20⁺B细胞或其他免疫或非免疫细胞发生显著性反应。在多个优选的实施例中，该抗体还与单核细胞、粒细胞、血小板和红细胞之间不反应。在多个优选的实施例中，这些抗体将仅识别单种细胞受体，从而尽可能将治疗性(例如细胞毒性)抗体的效应限制于与病症相关的过度增生性细胞。

一旦鉴定出可特异识别NK细胞(优选人NK细胞)上一个或可能少数受体的一种抗体，即可试验其结合取自免疫增生性病症患者的免疫细胞(优选NK细胞)的能力。

典型情况下，这些抗体可以在试验其结合取自免疫增生性病症患者NK细胞的能力的一种免疫测试中得到证实。例如，外周血淋巴细胞(PBL)取自多个患者，并利用针对NK细胞上存在的受体的抗体例如CD56从PBL富集NK细胞(参见，例如Zambello et al.(2003)Blood 102：1297)。随后，利用本领域中技术人员熟知的标准方法来评估一个给定抗体结合该NK细胞的能力。在一个实施例中，将每一个样品的细胞与不同抗体单独孵育，其中这些不同的抗体各自特异于某一种NK细胞受体。被发现结合来自显著百分比患者(例如5％、10％、20％、30％、40％、50％或更多)的较大比例(例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多)的NK细胞的抗体适用于本发明，它们可在本文所述NK受体状态分型步骤中用作诊断目的，或者用于本文所述的治疗方法中，例如用于衍生化而形成适于人类的细胞毒性抗体。为了评估这些抗体与细胞的结合，可将这些抗体进行直接或间接标记。当间接标记时，通常加入第二种被标记的抗体。随后可利用例如细胞荧光测定测试(例如FACScan)(参见，例如Zambello et al.(2003)Blood 102：1297)或任何其他标准方法来检测该抗体与细胞的结合。应该理解，还可类似地用T细胞与T细胞受体来实施该过程；这可以利用来自患有一种免疫增生性病症(例如T细胞LDGL、类风湿性关节炎等)的患者的T细胞来实施，并且该T细胞可以是CD3⁺，可任选是CD4⁺CD28^-或CD8⁺。

预期一个小数目(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)的抗体就足以检测并靶向患有诸如NK-LDGL、自身免疫性或炎症性疾病等病症的绝大多数患者的绝大多数的过度增生的细胞(例如NK)。因此，它将有可能收集(assemble)多个小组(small panels)的诊断性(直接或间接标记的)和治疗性(适于人类，任选毒性的)抗体，它们将总体上足以用本发明的方法来分型并治疗几乎所有的患者(利用单种抗体或少数抗体的组合)。这些组最终可制成试剂盒而供使用，优选配上使用这些抗体的说明。

因此，根据本发明生成的这些抗体组将包括那些特异于一种或少数几种NK受体类型的抗体。此外，在某些实施例中，将制备针对一个给定受体的多种抗体，以确保在所有患者体内最大限度地靶向于表达受体的细胞，并且还确保在最大数量的患者体内有效地靶向多态受体。

在其他实施例中，应该理解，用于本发明的诊断性(直接或间接标记)和治疗性(适于人类，可选的为毒性的)实施例中的一种抗体有可能识别多种NK受体(例如2、3、4或更多NK受体)。例如该抗体可识别多种NCR或KIR(例如KIR2DL1、KIR2DL2/3等)，或多种KIR活化性受体或KIR抑制性受体。而且，将有可能利用多种抗体(例如至少2、3、4等)，而至少一种识别多种NK受体。在PCT公开号WO 2005/0031172(Innate Pharma)中提供了识别多种NK受体的抗体的多个实例，它披露的全部内容通过引用结合于此。

制备适用于人类的抗体

一旦(通常在非人动物中)生成那些可特异结合通常存在于NK-LDGL患者的LGL(例如NK)细胞上的一种或多种NK受体的单克隆抗体，通常将对这些抗体加以修饰以使其适于人体内的治疗应用。例如，其可利用本领域中熟知的方法对它们进行人源化、嵌合化或从人抗体文库中对它们进行选择。这种适用于人类的抗体可直接用于本发明的治疗方法中，或者如本文中所述可进一步衍生为细胞毒性抗体，用于这些方法中。

在一个优选的实施例中，产生本发明抗体例如GL183样抗体的一个杂交瘤的DNA可在***表达载体前进行修饰，例如通过将用于编码人重链和轻链恒定区的编码序列用同源性非人序列加以取代(例如Morrison et al.(1984)PANS 81：6851)或通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价地连接于免疫球蛋白编码序列。以该方式，可制备“嵌合”或“杂合”抗体，它们具有初始抗体的结合特异性的抗体。典型地，这种非免疫球蛋白多肽可被取代以用于本发明的抗体的恒定区。

在一个特别优选的实施例中，本发明的抗体是人源化的。根据本发明的“人源化”形式的抗体是特异性嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)₂或其他结合抗原的抗体亚序列)，它们含有来自鼠或其他非人免疫球蛋白的最小序列。对于绝大多数来说，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受性抗体)，其中该接受性抗体的互补决定区(CDR)的残基用初始抗体(供者抗体)的CDR中的残基取代，同时保持初始抗体的所希望的特异性、亲和力和能力。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基可由相应的非人残基而取代。此外，人源化抗体可包括既不存在于接受性抗体也不存在于引入的CDR或框架序列中的残基。进行这些修饰是为了进一步提炼并优化抗体性能。通常，人源化受体将包括至少一个，典型地两个可变区的基本上全部区域，其中全部或者基本上全部CDR区域对应于初始抗体的CDR区域，而全部或基本上全部的FR区域是人免疫球蛋白通用序列的FR区域。进一步详细描述可参见Jones et al.(1986)Nature 321：522；Reichmann et al.(1988)Nature 332：323’Vehoeyen et al.(1988)Science 239：1534(1988)；Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2：593；每个的全部内容均通过引用结合于此。

选择用于制备人源化抗体的人轻链和重链可变区，对于降低抗原性非常重要。根据所谓的“最佳适配”法，本发明的一个抗体的可变区的序列可对照已知人可变区序列的整个文库而筛选。随后，可接受最接近小鼠序列的人序列作为用于人源化抗体的人框架区(FR)(Sims et al.(1993)J.Immun.，151：2296；Chothia and Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901)。另一种方法采用来自具有特殊亚组轻链或重链的所有人抗体通用序列的特殊框架区。该相同的框架区可用于几种不同的人源化抗体(Carter et al.(1992)PNAS 89：4285；Presta et al.(1993)J.Immunol.51：1993)。

进一步重要的是将抗体人源化的同时保持其对一种或多种NK细胞受体优选人受体的高亲和力以及其他有利的生物属性。为了实现这个目标，根据一个优选的方法，可通过利用亲代和人源化序列的三维模型来测试亲代序列和不同的概念性人源化产物的过程而制备人源化抗体。通常三维免疫球蛋白模型可供使用，这对本领域中的普通技术人员来说是熟悉的。计算机程序也可供使用，它们展示并显示选定的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构。检查这些显示结果能够分析候选免疫球蛋白序列在发挥作用过程中残基的可能作用，即测试那些影响候选免疫球蛋白结合其抗原能力的残基。以这种方式，可从公认和引入的序列中选择FR残基并加以合并，从而获得预期的抗体特性，例如对靶抗原提高的亲和性。总之，CDR残基直接且最大程度地涉及到影响抗原的结合。

还可以按照不同的其他技术制备人抗体，例如通过利用其他已经被工程化以表达人抗体库的转基因动物进行免疫接种。在该技术中，将人重链和轻链位点的单元引入具有内源性重链和轻链座位的靶向破坏的小鼠或其他动物中(参见，例如Jakobovitz et al.(1993)Nature 362：255；Green et al.(1994)Nature Genet.7：13；Lonberg et al.(1994)Nature 368：856；Taylor et al.(1994)Int.Immun.6：579，它们全部披露的内容均通过引用结合于此)。可替代地，人抗体可通过基因或染色体转染法或通过利用噬菌体展示法筛选抗体表达谱而构建。在该技术中，将抗体可变区基因克隆入丝状噬菌体主要或次要包膜蛋白的基因中，并以功能性抗体片段展示于该噬菌体颗粒的表面上。因为该丝状颗粒包含一个单链噬菌体基因组拷贝，基于抗体功能属性的筛选可以筛选编码表现这些属性的抗体的基因。以这种方式，噬菌体模拟了B细胞的某些属性(参见，例如Johnson et al.(1993)Curr Op Struct Biol 3：5564-571；MaCafferty et al.(1990)Nature 348：552-553，它们披露的全部内容均通过引用结合于此)。人抗体还可由体外激活的B细胞产生(参见，例如美国专利号5,567,610和5,229,275，它们披露的全部内容均通过引用结合于此)。

在一个实施例中，“人源化”单克隆抗体通过利用诸如XenoMouse

(Abgenix，Fremont，CA)的动物进行免疫接种而制备。XenoMouse是一种鼠宿主，它的免疫球蛋白基因由功能性人免疫球蛋白基因取代。因此，由该小鼠或从该小鼠的B细胞制备的杂交瘤中产生的抗体已经被人源化。XenoMouse在美国专利号6,162,963中已描述，它的全部内容均通过引用结合于此。利用HuMAb-Mouse^TM(Medarex)可实现一种类似的方法。

本发明的抗体还可衍生化为“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分等同于或同源于初始抗体中的相应序列，而该链剩余部分等同于或同源于来自另一个种属或属于另一个抗体类别或亚类的抗体的相应序列，以及这些抗体的片段中的相应序列，只要它们表现出所需的生物学活性(参见，例如Morrison et al.(1984)PNAS 81：6851；U.S.Pat.No.4,816,567)。

尽管未衍化(例如“裸”抗体)或未修饰形式的抗体，特别是IgG1或IgG3型，预期能抑制过度增生NK细胞的增生，或对过度增生或不需要的NK细胞(例如在NK-LDGL或类风湿性关节炎患者中的那些细胞)有细胞毒性作用，它还有可能制备衍生化抗体使其具有细胞毒性。在一个实施例中，一旦NK细胞受体特异性抗体被分离并使之适用于人类，它们将被衍生化以便对细胞有毒。以这种方式，给予患者这种抗体将导致抗体与过度增生NK细胞的相对特异地结合，从而直接杀灭或抑制与该病症相关的细胞。由于治疗的特异性，机体的其他非过度增生细胞，包括大多数其他NK细胞，以及免疫***的其他细胞，将最小程度受该治疗的影响。

大量毒性部分(moiety)或方案中的任何一种均可用来产生这种抗体。在某些优选的实施例中，抗体可用放射性同位素或其他毒性化合物直接进行衍生化。在这种情况下，可将标记的单特异性抗体注射入患者体内，在患者体内可以结合并杀灭表达靶抗原的细胞，而未结合抗体则简单地从人体内清除。还可以采用间接方法，例如“亲和力增强***”(AES)(参见，例如美国专利号5,256,395；Barbet et al.(1999)Cancer Biother Radiopharm 14：153-155；它披露的全部内容均通过引用结合于此)。该特殊途径涉及到使用放射标记的半抗原以及既识别NK细胞受体又识别放射性半抗原的抗体。在这种情况下，首先将该抗体注射入患者体内，使其结合靶细胞，随后一旦允许未结合抗体从血流清除，则给予放射标记的半抗原。该半抗原结合过度增生的细胞或不需要的细胞(例如NK或T细胞)上的抗体-抗原复合物，从而将其杀灭，而未结合的半抗原从体内清除。

具有细胞毒性或细胞抑制效应的任何类型的部分(moiety)均可与本发明的抗体联合使用，以抑制或杀灭特异性表达NK受体的细胞，包括放射性同位素、毒性蛋白、毒性小分子例如药物、毒素、免疫调节剂、激素、激素拮抗剂、酶、寡核苷酸、酶抑制剂、治疗用放射性核素、血管生成抑制剂、化疗药物、长春花生物碱、蒽环类抗生素、表叶霉素、紫杉烷、抗代谢药、烷化剂、抗生素、COX-2抑制剂、SN-38、抗有丝***物质、抗血管生成和细胞凋亡药，特别是阿霉素、甲氨蝶呤、紫杉醇、CPT-11、喜树碱、氮芥、吉西他滨、烷基磺酸盐、亚硝基脲、三氮烯、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、铂配位络合物、假单胞菌外毒素、蓖麻毒蛋白、相思豆毒素、5-氟尿苷、核糖核酸酶(RNase)、DNase I、葡萄球菌肠毒素A、美洲商陆(pokeweed)抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素等(参见，例如Remington’sPharmacertical Sciences，19th Ed.(Mack Publishing Co.1995)；Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics(McGraw Hill，2001)；Pastan et al.(1986)Cell 47：641；Goldenberg(1994)Cancer Journal for Clinicians 44：43；美国专利号6,077,499；它们披露的全部内容均通过引用结合于此)。应该理解，毒素可以为动物、植物、真菌或微生物来源，或者可由化学合成而从头生成。

利用大量现存方法中任何一种，可将毒素或其他化合物直接或间接连接于抗体。例如，利用交联剂如N-琥珀酰-3-2-联硫基吡啶-丙酸盐(SPDP)通过形成二硫键，或通过抗体Fc区中的碳水化物部分，可将一种试剂连接在还原的抗体组分的铰链区(参见，例如see，e.g.，Yu et al.(1994)Int.J.Cancer 56：244；Wong，Chemistry ofProtein Conjugation and Cross-linking(CRC Press 1991)；Upeslacis etal.，″Modification of Antibodies by Chemical Methods，″in Monoclonalantibodies：principles and applications，Birch et al.(eds.)，pages187-230(Wiley-Liss，Inc.1995)；Price，″Production andCharacterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies，″inMonoclonal antibodies：Production，engineering and clinicalapplication，Ritter et al.(eds.)，pages 60-84(Cambridge UniversityPress 1995)，Cattel et al.(1989)Chemistry today 7：51-58，Delprino etal.(1993)J.Pharm.Sci 82：699-704；Arpicco et al.(1997)BioconjugateChernistry 8：3；Reisfeld et al.(1989)Antihody，Immunicon.Radiopharrn.2：217；每一篇文献披露的全部内容均通过引用结合于此)。

在一个优选的实施例中，用放射性同位素如I-131将抗体衍生化。可采用多种恰当的放射性同位素中的任何一种，包括但不限于铟-111、镥-171、铋-212、铋-213、砹-211、铜-62、铜-64、铜-67、钇-90、碘-125、碘-131、磷-32、磷-33、钪-47、银-111、镓-67、镨-142、钐-153、铽-161、镝-166、钬-166、铼-186、铼-188、铼-189、铅-212、镭-223、锕-225、铁-59、硒-75、砷-77、锶-89、钼-99、铑-105、钯-109、镨-143、钷-149、铒-169、铱-194、金-198、金-199和铅-211。总之，放射性核素优选具有20-6000keV之间的衰变能，对Auger发射体优选在60-200keV之间，对β发射体在100-2500keV之间，α发射体在4000-6000keV之间。还优选那些随α粒子的生成而充分衰变的放射性核素。

在选择本发明的方法中包括的细胞毒性部分时，所希望的是，确保该部分不表现出显著的针对维持生命的正常组织的体内副作用，这些正常组织例如，一种或多种选自心脏、肾、脑、肝、骨髓、结肠、乳腺、***、胸腺、胆囊、肺、肾上腺、肌肉、神经纤维、胰腺、皮肤或其他维持生命的人体内器官或组织的组织。如在此使用的，术语“显著的副作用”是指一种抗体、配体或抗体轭合物在体内使用时，将仅产生可忽略的或临床可处理的副作用，例如那些在化疗过程中常常遇到的副作用。

检测细胞毒性抗体的结合和细胞毒活性

一旦获得了抗体，即已知特异地结合至免疫增生性病症的患者细胞上的NK细胞受体、且已经使其适用于人体、并可任选地经过衍生而包括毒性部分的抗体，通常要评估它们与靶细胞相互作用、影响其活性和/或杀灭靶细胞的能力。通常，上述用于检测抗体与NK细胞或NK细胞受体结合的测试，包括基于竞争的测试、ELISA、放射免疫测试、Western印迹、基于BIACORE的测试以及流式细胞仪测试，可同样用于检测人源化的、嵌合的或其他适于人类的、NK细胞抗体(例如细胞毒性抗体)与它们靶细胞的相互作用。典型地，靶细胞将是取患有一种自免疫增生性病症的患者的NK细胞。

在这些测试中，将人源化或适于人类的治疗性(例如细胞毒性)抗体结合靶细胞或人NK细胞受体的能力与对照蛋白，例如针对结构上不相关抗原而产生的一种抗体，或者非Ig肽或蛋白结合相同靶标的能力进行比较。利用任何恰当测试，相对于对照蛋白，如果结合靶细胞或NK细胞受体的抗体或片段的亲和力增高25％、50％、100％、200％、1000％或更多，则称之为“特异地结合于”靶标或与该靶标“特异性相互作用”，并优选用于以下所述的治疗方法中。

除了结合，可评估抗体抑制靶细胞增生或优选地杀灭靶细胞的能力。在一个实施例中，将表达一个或多个相关受体的人NK细胞，例如取自NK-LDGL患者的LGL或NK细胞，置入多个孔板(例如96孔板)内并暴露于不同量的相关抗体。通过加入活性染料，即，可由完整细胞吸收的染料，例如AlamarBlue(BioSource International，Camarillo，CA)并洗涤以去除过量染料，存活细胞的数量可借助于光学密度而测定(抗体杀灭的细胞越多，则光学密度越低)。(参见，例如Connolly et al.(2001)J Pharm Exp Ther 298：25-33，它所披露的全部内容通过引用结合于此)。可同样使用任何其他恰当的体外细胞毒性测试、测定细胞增生或生存的测试或检测NK细胞活性的测试，可同样使用体内测试，例如将抗体给予含表达相关受体的人NK细胞的动物模型如小鼠，并检测抗体给药对人NK细胞的生存或活性随时间变化的效应。而且，在该抗体与非人受体，如灵长类NK细胞受体，发生交叉反应的情况下，可以在体外或体内使用这些治疗性抗体，以评估该抗体结合和/或杀灭来自表达相关受体的动物的NK细胞的能力。

本发明的方法中可使用能在体外或体内可检测地减慢、终止或逆转过度增生NK细胞的增生的任何一种抗体，优选一种适于人类的抗体，例如细胞毒性抗体。优选地，该抗体能够终止增生(例如，阻止体外或体内表达靶NK细胞受体的NK细胞数量增加)，最优选地，该抗体可逆转增生，引起这些细胞总数下降。在某些实施例中，抗体能够引起表达靶受体的NK细胞的数量下降10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

因此，在一个优选的实施例中，本发明提供一种用于制备适于治疗免疫增生病症的抗体的方法，该方法包括下列步骤：a)提供多种特异地结合存在于NK细胞表面的受体的抗体；b)检测这些抗体结合NK细胞的能力，这些NK细胞取自一个或多个患NK-LDGL的患者；c)从所述多种抗体中选择可结合相当数量的取自患有免疫增生性病症的一个或多个所述患者的NK细胞的一种抗体；并且d)使所述抗体适于对人类给药。在一个实施例中，该方法进一步包括一个步骤，其中将细胞毒性剂连接于所述抗体的。在这些方法中，“相当数量”可表示例如30％、40％、50％，优选60％、70％、80％、90％或一个更高百分比的细胞。

本发明还提供一种相关方法，包括下列步骤：a)提供一种特异地结合NK细胞的抗体，这些NK细胞取自患有NK-LDGL的一个或多个患者；b)检测该抗体结合取自患有NK-LDGL的一个或多个患者的NK细胞的能力；并且c)如果该抗体结合取自一个或多个该患者的相当数量的NK细胞，则使该抗体适于对人类给药。在一个实施例中，该方法进一步包括一个步骤，其中将细胞毒性剂连接于该抗体。应该理解，这些方法以及在本发明其他部分描述的方法，包括前一段中的方法，可利用除NK细胞之外的细胞例如T细胞、LGL细胞而同样实施，并用于治疗除NK-LDGL之外的病症如T细胞LDGL或其他免疫增生性病症。

应该理解，可用同等的方法制备适于治疗动物或适于在动物模型中进行试验的抗体。在该情况下，要确保这些抗体能特异性识别来自相关动物的NK细胞受体，并且在涉及NK或其他细胞克隆性增生的动物病症中有优势。类似地，抗体将进行修饰以便适合于在该特定动物体内给药。

检测体内炎症的模型

可在小鼠模型内评估耗竭表达CD94/NKG2A和/或C的细胞对于体内炎症的抗炎效应。抗CD94/NKG2A和/或C(例如小鼠CD94/NKG2A、-C和-E靶向性兔mAb 20D5的耗竭性抗体)被用来耗竭小鼠体内的特异性淋巴细胞群，例如在用作慢性炎症的鼠模型中。这些模型的例子包括胶原诱导性关节炎(CIA)模型，这是一种研究类风湿性关节炎的体内模型，或实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)，这是一种用作人多发性硬化症的小鼠模型。在这些模型中，可在炎症发作前、发作过程中或发作后注射耗竭CD94/NKG2A和-C细胞的mAb，而炎症的减弱可通过本领域中已知的技术加以评估，以测定这些模型中的炎症强度(例如，生理性或通过免疫组织化学)。

用于治疗方法的抗体给药

利用本发明方法制备的抗体在治疗增生性病症特别是免疫增生性病症时特别有效。总体上，本发明方法可用来治疗任何由于表达一种或少数几种NK细胞受体的任何细胞的存在或过量而引起的任何病症，因此它们可通过选择性杀灭或抑制表达特殊NK细胞受体的细胞而有效地得到治疗。其他适用的病症包括T细胞型LDGL、自身免疫性病症以及任何其他涉及NK或相关细胞的免疫增生性或恶性病症，这些相关细胞包括T细胞，这些T细胞为CD3⁺，可任选地为CD4⁺CD28^-或CD8⁺。“免疫增生性病症”是指任何病症、症状或疾病，其特征在于(或引发自)过度或失控的炎症，或炎症的任何方面，例如发红、肿胀、发热、疼痛等，并确切地包括炎症性疾病和自身免疫性病症。炎症性疾病包括***反应(包括过敏性鼻炎/鼻窦炎)、皮肤过敏反应如荨麻疹、血管性水肿、特应性皮炎、食物过敏、药物过敏、昆虫过敏以及过敏性病症，例如肥大细胞增生性哮喘、哮喘，关节炎，包括骨关节炎、风湿性关节炎和脊椎关节病，胃肠道炎症、克罗恩病和溃疡性结肠炎、神经炎性病症以及自身免疫性病症。

“自身免疫”病症包括任何病症、症状或疾病，其中由于区分自身和非自身能力下降或其他原因，免疫***发起了抗自身细胞或组织的反应。自身免疫性病症的例子包括桥本氏甲状腺炎、恶性贫血、艾迪生病、I型糖尿病、类风湿性关节炎、***性红斑狼疮、皮肌炎、银屑癣、干燥综合征、红斑狼疮、脱髓鞘病、多发性硬化症、重症肌无力、莱特尔氏综合征、格雷夫斯氏病、多发性肌炎、格-巴二氏综合征、韦格纳肉芽肿病、乳糜泻、结节性多动脉炎、风湿性多肌病、颞动脉炎、贝切特氏病、丘-施二氏综合征、高安动脉炎等。自身免疫性病症可涉及免疫***的任何部分，并针对体内任何细胞或组织类型。

如在本文中使用的，术语类风湿性关节炎指任何涉及关节炎症的病症，且包括如下特征，如关节腐蚀、淋巴细胞浸润、滑膜增生、成纤维细胞样滑膜细胞核巨噬细胞的急性增生和/或T或NK细胞的存在(例如CD56⁺的NK细胞；CD3⁺的T细胞，可任选地为CD4⁺CD28^-或CD8⁺的T细胞)，还可以为KIR2DL1⁺、KIR2DL2⁺、KIR2DL3⁺、KIR2DL5A⁺、KIR2DL5B⁺、KIR3DL1⁺、KIR3DL2⁺、KIR3DL3⁺、KIR2DS1⁺、KIR2DS2⁺、KIR2DS3⁺、KIR2DS4⁺、KIR2DS5⁺、KIR3DS1⁺、CD94⁺、NKG2A⁺、NKG2C⁺、NKG2D⁺、NKG2E⁺、NKG2F⁺、NKG2G⁺、NKp30⁺、NKp44⁺和NKp46⁺中的一个或多个。特别地，当存在的细胞类型是T细胞时，由本发明抗体所靶向的T或NK细胞受体是NKG2蛋白，优选NKG2D。通常，在已确诊的类风湿性关节炎中，滑膜增厚，软骨与下面的骨头开始分离，并出现关节破坏的征象。

在一个实施例中，根据本发明所治疗的病症是一种已确立的免疫增生性病症，特征通常为组织损伤或破坏和/或至少3、6、9、12、24、36个月的持续性疾病(例如炎症、症状或组织损伤)。

在一个实施例中，本发明治疗方法的一部分是一个分型步骤，其中对患者体内扩增的NK或其他细胞上的优势受体进行鉴定。通常，在该步骤中，从患者中取出NK细胞或其他细胞(例如T细胞、LGL细胞)样品，并利用例如免疫测试进行检测，确定细胞上多种NK细胞受体的相对显著性。尽管优选NK细胞用于该方法，应该理解可采用表达NK细胞受体的任何细胞类型(例如T细胞，它们是CD3⁺，可任选地为CD4⁺CD28^-或CD8⁺)。理想地，该步骤利用含一组抗体的试剂盒来实施，该抗体组被直接或间接标记，共同识别免疫增生性病症的增生性NK细胞中最常存在的多种NK细胞受体。经常，将会发现一种或少数几种受体存在于相当数量的例如30％、40％、50％的细胞中，优选60％、70％、80％、90％或更高。在该情况下，可以给予单一的或少数几种治疗性(例如细胞毒性)抗体，即那些特异性对抗所检测受体的抗体。以该方式，可特异地靶向于过度增生的或不需要的细胞。

除了上述免疫测试，其他方法也可用来确定取自患者的NK细胞受体或NK细胞的身份和相对表达水平。例如，基于RNA的方法，例如RT-PCR或Northern印迹，可用来检测取自患者的细胞中多种NK细胞受体的相对转录水平。在很多情况下，单种或少数几种受体特异性转录体将占优势，从而实现利用特异于该转录体编码的特殊受体的细胞毒性抗体来治疗患者。

在另一个实施例中，可通过基因分型来获得患者体内增生性免疫细胞(例如NK细胞)上表达的NK细胞受体身份的内情。例如，已经鉴定了20种或更多种不同的KIR单体型以及至少40种不同的基因型(参见，例如Hsu et al.(2002)Immunol Rev.190：40-52，它的全部内容均通过引用结合于此)。这些单体型和基因型中的某些与激活性或抑制性KIR受体表达相关。因此，确定患者具有某种单体型或某种基因型，常常预示那些受体最可能在患者的NK细胞内被表达。在某些情况下，患者体内的某些单体型或基因型可能与NK受体状态的特殊表达模式可靠性相关，从而允许筛选特殊的治疗性(例如细胞毒性)抗体用于本发明的治疗方法中。

在另一个实施例中，将采用功能测试来评估患者体内免疫增生性(优选NK)细胞的活性，该测试可以单独进行，或与其他方法联用，例如免疫学、基于RNA或基因分型方法。由于一种或多种激活性NK细胞受体可能在很多患者体内占优势，那么发现取自一个给定患者的细胞是特别活化的(如利用任何标准测试例如细胞溶解测试、细胞因子产生、细胞内游离钙等所确定的)将提供关于哪些受体可在增生性细胞中被表达的重要信息。这种信息，特别是结合其他结果时，可用来决定采用哪种或哪些细胞毒性抗体来实现最特异的治疗策略。例如，发现取自给定NK-LDGL患者的NK细胞中大多数NK细胞可由GL183抗体(它既识别抑制性KIR2DL2和KIR2DL3受体，又识别激活性KIR2DS2受体)特异性识别，结合一个发现即大多数NK细胞也是活化的，这些发现可用来推断：理想的治疗将涉及特异于NKR2DS2而非KIR2DL2和KIR2DL3的单种细胞毒性抗体。理想情况下，这些治疗方法利用最小数量的治疗性抗体靶向于最大比例的过度增生的NK或NK样细胞。

理想情况下，在研发本发明的抗体、使用它们的方法和试剂盒的过程时，将用针对不同NK细胞受体的多个不同抗体筛选多个患者。以该方式，可组合一个诊断性和治疗性(例如细胞毒性)抗体组，它将覆盖绝大多数患者中的大多数扩增的NK细胞。例如，如果已确定其中一种KIR受体(例如KIR2DS2)在相当百分比(例如25％、50％或更高)的NK-LDGL患者的至少50％膨胀的细胞中表达，则根据本发明制备的试剂盒通常包括至少一种抗该受体的诊断性抗体以及一种或多种抗该受体的治疗性抗体。如果该受体特异于NK细胞，即它不在任何其他细胞类型上表达，这尤其正确，尽管还可以包括也表达在其他细胞类型上的受体。特别地，可采用特异地结合非NK细胞特异性受体的治疗性抗体，如果它是靶向于患者体内相当比例NK细胞的唯一途径。取决于所涉及的非NK细胞类型的种类，治疗性抗体的给药形式和时间安排可以具体设计为使其与NK细胞的相互作用最大化而与非NK细胞类型的相互作用最小化(例如，如果该受体还在未成熟B或T细胞内表达，则以使抗体与骨髓或胸腺的接触达到最小化的方式而给予该抗体)。

本发明试剂盒可包括任何数量的诊断性和/或治疗性抗体，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30种或任何其他数量的诊断性和/或治疗性抗体。在这些试剂盒中，常常直接或间接(例如，利用第二抗体)标记这些诊断性抗体|。治疗性抗体可未经修饰，即无任何相连接的细胞毒性的或其他的部分，仅通过例如结合于靶细胞而将其灭活、触发细胞死亡或对它们标记以便被免疫***破坏。在其他实施例中，可将这些治疗性抗体连接于一种或多种细胞毒性部分。应该理解，对试剂盒内容物的描述在任何方面均无限制性。例如，对于这些治疗性抗体，该试剂盒还包含未经修饰抗体或细胞毒性基团的任何组合。另外，该试剂盒还包含其他类型的治疗性化合物，例如化疗性或抗增生药物。优选地，该试剂盒还包括该抗体的使用说明，例如详细说明本文用于将患者体内NK受体状态进行分型以及相应地给予治疗性抗体的方法。

还应该理解，治疗性抗体的给药可涉及给予1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或任何数量抗单种或多种NK细胞受体的不同抗体，如以上说明的分型步骤尽可能恰当的确定其种类，特别是根据NK受体状态而确定。根据例如该抗体中每一种的相对毒性、患者的NK受体状态或其他因素，可一起或单独给予多个抗体的此类组合。

此外，治疗可涉及多轮治疗性(例如细胞毒性)抗体给药。例如，在第一轮抗体给药后，通常将重新测定患者体内的NK或LGL细胞的总数，如果仍然升高，则可进行另外一轮NK受体状态分型，随后进行另一轮治疗性抗体给药。应该理解，在另一轮给药中所给予的细胞毒性抗体不一定与第一轮中使用的抗体相同，而将主要依赖于另一轮分型步骤的结果。以此方式，可进行多轮NK受体状态分型及治疗性抗体给药，例如直到LGL或NK细胞增生得到控制。

本发明还提供多种组合物，例如药物组合物，它们包含本发明的任何一种抗体，包括其片段和衍生物，存在于任何恰当载体中，其量值足以抑制患者体内那些表达靶NK细胞受体的细胞的增生或活性或将其杀灭。该组合物通常还包括一种药用载体。应该理解，本发明将抗体和组合物给予患者的方法还可用来治疗动物，或用来测试在此描述的方法或组合物用于人类疾病的动物模型中的效力。

可用于这些组合物中的药用载体包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白例如人血清白蛋白、缓冲物质例如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸盐(酯)、蜡类、聚乙烯-聚氧化丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。

本发明的这些组合物可口服、胃肠外、通过吸入喷雾、局部、经直肠、经鼻、含服、经***或通过植入式储药器而给药。如在本文中使用的，术语“胃肠外”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜腔内、胸骨内、鞘膜内、肝内、损伤区内、颅内注射或灌注技术。优选地，组合物可经口服、腹膜内或静脉内给药。

本发明的这些组合物的无菌可注射形式可为水性或油状悬浮液。这些悬浮液可以按照本领域中已知的技术利用恰当的分散或湿润剂以及悬浮剂而配制。这些无菌可注射制备物还可以为无菌可注射溶液或悬浮在非毒性胃肠外可接受性稀释剂或溶剂中的悬浮液，例如溶于1，3-丁二醇中的溶液。可采用的合适载体和溶剂包括水、林格氏液以及等渗氯化钠溶液。此外，无菌不挥发油常规用作溶剂或悬浮介质。为了这个目的，任何温和的不挥发油均可采用，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。脂肪酸例如油酸及其甘油酯衍生物在可注射物的制备中非常有用，天然药用油例如橄榄油或蓖麻油也非常有用，特别是它的聚氧乙醇衍生物。这些油溶液或悬浮液还可包含长链醇稀释剂或分散剂，例如羧甲基纤维素或类似分散剂，其通常用于制备药用剂型包括乳液和悬浮液。其他常用的表面活性剂，例如通常用于制备药用固体、液体或其他剂型的Tween、Span和其他乳化剂或生物利用度增强剂，也可以用于配制目的。

本发明的这些组合物可以任何适于口服的剂型给药，包括但不限于胶囊、片剂、含水悬浮液或溶液。在用于口服的片剂中，最常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还加入润滑剂例如硬脂酸镁。为了以胶囊形式口服给药，有用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。如果需要含水悬浮液用于口服，将活性成分与乳化和悬浮剂混合。如果需要，还可以加入甜味剂、调味剂或着色剂。

作为替代，本发明的组合物还可以栓剂形式用于直肠给药。这些组合物还可以通过将该试剂与恰当的非刺激性赋形剂混合而制备，赋形剂室温下是固态而在直肠温度下为液态，因此将在直肠内溶解而释放药物。这些材料包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。该发明的组合物还可局部、眼内、通过气雾剂或吸入而给药。这些组合物可按照药物制剂领域中熟知的技术制备。

在一个实施例中，本发明的这些抗体还可以单独或与另一种用于靶向递送至患者或动物的物质一起掺入脂质体内(“免疫脂质体”)。这些其他物质可包括核酸，用于递送用于基因治疗的基因或者用于递送反义RNA、RNAi或siRNA以抑制NK细胞内的基因，或者包括毒素或药物用于通过其他方式激活NK细胞，或包括在此所述的对于激活NK细胞或靶向于肿瘤或感染细胞非常有用的其他任何试剂。

在另一个实施例中，本发明的抗体可经修饰而改善其生物可利用度、体内半衰期等。例如，可利用大量聚乙二醇形式中任何一种以及本领域中已知的连接方法而将抗体聚乙二醇化(参见，例如Leeet al.(2003)Bioconjug Chem.14(3)：546-53；Harris et al.(2003)NatRev Drug Discov.2(3)：214-21；Deckert et al.(2000)Int J Cancer.87(3)：382-90)。

已经证实几种单克隆抗体在临床情形中比较有效，例如利妥昔(Rituxan)(利妥昔单抗)、赫赛汀(曲妥单抗)、Xolair(奥马佐单抗)、Bexxar(托西莫单抗)、坎帕斯(阿仑单抗)、泽娃灵(Zevalin)、Oncolym以及类似给药方案(即剂型和/或剂量和/或给药方法)，这些可以与本发明抗体一起使用。给药计划和剂量可按照这些产品的已知方法确定，例如利用生产商的说明书。例如，单克隆抗体可以按10mg/mL的浓度在100mg(10mL)或500mg(50mL)单次使用的小瓶中提供。将该产品配制于9.0mg/mL氯化钠、7.35mg/mL二水柠檬酸钠、0.7mg/mL聚山梨醇酯80和无菌水中，用于IV给药，将pH调为6.5。用于本发明抗体的示例性恰当剂量范围可在约10mg/m²和500mg/m²之间。然而，应该理解，这些计划是示例性的，且最优计划和方案可加以调整，将抗体亲和性以及在临床试验中必须确定的抗体可耐受性考虑在内。在确定针对那些饱和NK细胞的NK细胞受体的24小时、48小时、72小时或一周或一个月抗体注射用量和日程时，要考虑抗体亲和性以及其药物动力学参数。

根据另一个实施例，本发明的抗体组合物进一步包含一种或多种其他治疗试剂，包括通常用于具体治疗目的(该抗体是为了该目的而给药)的试剂。其他治疗试剂通常以用于待治疗特殊疾病或症状的单次治疗所采用的量而存在于组合物中。这些治疗试剂包括但不限于癌症治疗中使用的治疗试剂、用来治疗炎症性或自身免疫性病症、传染性病症的治疗试剂、用于其他免疫治疗中的治疗试剂、细胞因子(例如IL-2或IL-15)、其他抗体以及其他抗体的片段。只要已知特殊治疗途径对患者症状本身不是有害的，且不显著性抵消基于NK细胞受体的抗体的治疗，即可考虑将其与本发明加以组合。

由于常常用化疗来治疗增生性病症例如NK-LDGL，特别是NK-LDGL白血病，本发明的NK细胞受体的抗体的治疗性组合物可以与其他化学治疗或激素治疗剂联合给药。多种激素治疗和化学治疗剂可用于在此披露的联合治疗法。考虑为示例性的化学治疗剂包括烷化剂、抗代谢药、细胞毒性抗生素、长春花生物碱、例如阿霉素、更生霉素、丝裂霉素、洋红霉素、柔红霉素、阿霉素、他莫昔芬、紫杉醇、泰索帝、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、依托泊苷(VP-16)、5-氟尿嘧啶(5FU)、阿糖胞苷、环磷酰胺、塞替派、甲氨喋呤、喜树碱、放线菌素-D、丝裂霉素C、顺铂(CDDP)、氨基蝶呤、考布他汀及其衍生物和药物前体。激素剂包括：例如，LHRH激动剂例如亮丙瑞林、戈舍瑞林、曲普瑞林和布舍瑞林；抗***，例如他莫昔芬和托瑞米芬；抗雄激素，例如氟他胺、尼鲁米特、环丙孕酮和比卡鲁胺；芳香酶抑制剂，例如阿那曲唑、依西美坦、来曲唑和法倔唑；以及孕激素，例如甲羟孕酮(medroxy)、氯地孕酮和甲地孕酮。其他有用的药剂包括干扰DNA复制、有丝***和染色体分离的化合物，还可采用能破坏多核苷酸前体合成和保真性(精确度)的试剂。用于综合疗法的多种示例性化学治疗剂在美国专利号6,524,583的表C中列出，它所披露的试剂和适应症通过引用结合于此。所列出的每一种试剂均是示例性而非限制性的。另一个有用的来源是“Remington’s Pharmaceutical Sciences”第15版第33章，具体是624-652页。根据待治疗症状可能对剂量做一些变化。实施治疗的内科医生将能够确定用于某一个体患者的恰当剂量。

根据本发明的另一个重要实施例，NK细胞受体抗体的治疗性组合物可联合一种或多种其他治疗剂一起给药，其中该其他治疗剂通常用于特定的治疗性炎性的或自身免疫适应症，其中为这些适应症将该抗体或化合物与一些治疗剂一起给药，这些治疗剂例如，用于治疗类风湿性关节炎的治疗剂；用于治疗韦格纳肉芽肿病的治疗剂；用于治疗干燥综合征的治疗剂；用于治疗胰岛素依赖的糖尿病的治疗剂；细胞因子，例如IL-10以及可抵消那些驱动免疫细胞激活和增生的细胞因子和其他分子的化合物(例如抗TNF-α抗体和其他化合物以及抗IL-15的抗体和其他化合物)。

本发明可与经典方法例如手术等联合使用。当一种或多种药剂或方法与本发明的疗法联合使用时，不要求综合结果是单独开展每种治疗时观察到的效应的累加。尽管起码至少累加效应是所希望的，但NK细胞数量的减少、细胞因子生成或相对于单一疗法中每一种的其他有益效应均属有益的。此外，对于该综合治疗一定要表现为协同效应并无特殊要求，尽管这确实是可能的且是有益的。该NK细胞受体的抗体治疗组合物疗法可以在另一种疗法之前或之后，间隔从几分钟至几周和几个月。人们设想还可以利用NK细胞受体的抗体治疗组合物或另一种试剂的多于一次的用药。这些药剂可隔天或隔周交换给药；或给予一轮NK细胞受体的抗体治疗组合物疗法，随后是一轮另一种药物疗法。在任何情况下，无论给药时间如何，所需的只是以可表现出有效治疗效应的组合量递送两种试剂。

在其他方面，免疫调节化合物或方案可与本发明联合实施。优选的例子包括与细胞因子的疗法，在这些综合途径中可采用多种细胞因子。细胞因子的例子包括IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-21、TGF-β、GM-CSF、M-CSF、G-CSF、TNF-α、TNF-β、LAF、TCGF、BCGF、TRF、BAF、BDG、MP、LIF、OSM、TMF、PDGF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ或抑制这些细胞因子中任何一种的化合物(例如，结合这些细胞因子的抗体或可溶性受体)。可按照标准方案而给予细胞因子或其抑制剂，这与临床指征，例如患者的症状以及细胞因子的相对毒性一致。

本发明方法还可与辅助化合物联合应用，作为举例，辅助化合物包括例如5-羟色胺拮抗剂的抗催吐药和例如吩噻嗪、取代的苯甲酰胺、抗组织胺、丁酰苯、皮质类固醇、苯并二氮类和***素的疗法；二膦酸盐(酯)如唑来膦酸和帕米膦酸；造血生长因子如***和G-CSF，例如非格司亭、来格司亭和达贝泊汀(darbepoietin)。本发明的其他方面和优势将在下面的实验部分披露，该实验部分应认为是说明性的而非限制本申请的范围。

实例1-生成对NK细胞受体特异的mAb

通过用激活的多克隆或单克隆NK细胞系对5周龄的Balb C小鼠进行免疫而生成单克隆抗体，如Moretta et al.(1990)J Exp Med.172(6)：1589-98中所述的。不同细胞融合后，首先针对mAb特异性识别一种或多种NK细胞受体的能力进行mAb筛选，这些NK细胞受体为例如KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、CD94、NKG2A、NKG2C、NKG2D、NKG2E、NKG2F、NKp30、NKp44、NKp46等。进一步针对阳性单克隆抗体特异地结合NK细胞的能力进行阳性单克隆抗体的筛选，该NK细胞取自免疫增生性病症(例如NK-LDGL、类风湿性关节炎等)的患者。

实例2-纯化外周血淋巴细胞(PBL)并生成多克隆或克隆性NK 细胞群

外周血淋巴细胞(PBL)来源于NK-LDGL患者或另外一种免疫增生性病症的患者或使用Ficoll-Hipaque梯度的并耗竭了贴壁细胞(plastic-adherent cell)的健康供体。为了得到富集的NK细胞，将PBL用抗CD3(JT3A)、抗CD4(HP2.6)和抗HLA-DR(D1.12)mAb孵育(30分钟，4℃)，随后用羊抗鼠包被的Dynabead(Dynal，Oslo，Norway)孵育(30分钟，4℃)并用免疫磁耗竭(Pende et al.(1998)Eur.J.Immunol.28：2384-2394；Sivori et al.(1997)J.Exp.Med.186：1129-1136；Vitale et al.(1998)J.Exp.Med.187：2065-2072)。CD3^-4^-DR^-细胞用于细胞溶解性测试中，或者在100U/mlrlL-2(Proleukin，Chiron Corp.，Emeryville，USA)和1.5ng/ml PHA(Gibco Ltd，Paisley，Scotland)存在的情况下，将其在受照射饲养细胞中培养，以获得多克隆NK细胞群，或限制性稀释后获得NK细胞克隆(Moretta(1985)Eur.J.Immunol.151：148-155)。

实例3-流式细胞仪分析

患者细胞和对照细胞用特异于多种NK细胞受体的mAb进行染色，mAb或者被直接标记或者随后使用PE-或FITC-轭合的同种型特异性羊抗鼠第二试剂(Southern Biotechnology Associated，Birmingham，Ala.)。样品通过单色或双色细胞荧光分析(FACScanBecton Dickinson & Co，Mountain View，Calif.)进行分析(参见，例如Moretta et al.(1990)J.Exp.Med.171：695-714)。

实例4-抗体-底物相互作用的Biacore分析

重组蛋白的生成和纯化

重组蛋白在编码NK细胞受体整个胞外结构域的大肠杆菌cDNA中生成，该cDNA利用标准方法通过PCR扩增。将该核酸序列克隆入pML1表达载体中含编码生物素化信号的序列的框架内(Saulquin et al，2003)。在BL21(DE3)细菌株(Invitrogen)中表达蛋白。将已转染的细菌在补充了氨苄青霉素(100μg/ml)的培养基中于37℃培养至OD₆₀₀＝0.6，并用1mM IPTG诱导表达。在变性条件下(8M尿素)从包涵体回收蛋白。室温下，通过降低六步透析中的尿素浓度(分别是4、3、2、1、0.5和0M尿素)，在含L-精氨酸(400mM，Sigma)和β巯基乙醇(1mM)的20mM Tris，pH7.8，NaCl 150mM缓冲液中实施该重组蛋白的重新折叠。在0.5和0M尿素透析步骤中，加入还原和氧化的谷光苷肽(分别是5mM和0.5mM，Sigma)。最后，将该蛋白在10mM Tris，pH7.5，NaCl 150mM缓冲液中广泛透析。浓缩可溶性、重新折叠的蛋白，随后在Superdex 200大小排阻柱(Pharmacia；AKTA***)上纯化。在Biacore仪(Biacore)上进行表面等离子共振测量。在所有的Biacore实验中，用0.05％表面活性剂P20补充的HBS缓冲液作为流动缓冲液。

蛋白固定

将按上述生成的重组底物蛋白共价固定于传感器芯片CM5(Biacore)上葡聚糖层内的羧基基团上。该传感器芯片表面通过EDC/NHS(N-乙基-N’-(3-二甲氨丙基)羰基二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，Biacore)激活。注射溶于偶联缓冲液(10mM乙酸，pH4.5)中的蛋白。用100mM乙醇胺pH8(Biacore)灭活剩余的活化基团。

亲和性测定

将不同浓度的可溶性抗体(1×10^-7至4×10^-10)涂敷到固定的底物样品上，用于动力学测定。该测定在20μl/min的连续流速下进行。每一循环中，均通过注射5μl的10mM NaOH pH11而再生传感器芯片的表面。使用BIAlogue动力学评估程序(BIAevaluation3.1，Biacore)进行数据测试。将可溶性测试物(不同浓度下40μl)在HBS缓冲液中以20μl/min的流速注射于葡聚糖层上，葡聚糖层含有例如500反射单位(RU)，以及1000RU的底物。

实例5-用于耗竭表达人NK细胞受体的鼠NK细胞的体内模型

由于缺乏选择性缺陷模型使NK细胞生物学功能的测试复杂化。为了研究抗体特别是裸抗体能否用来耗竭体内的NK细胞，采用一个选择性缺陷模型来评估抗体能耗竭小鼠体内NK细胞的程度。已经证实NKp46是一种特异性NK细胞标记物，因此采用NKp46调控序列创建这种模型。为了验证该方法的可行性，生成了一种转基因载体(图1a)，它包含位于NKP46相邻基因FCAR和NALP7之间的一个24kb的人基因区域。从转基因初始物(称为huNKp46Tg)，以孟德尔频率获得它的子代、发育正常且具有繁殖力。不与小鼠NKp46发生交叉反应的BAB281(抗人NKp46)抗体，被用来评估人NKp46在这些小鼠体内细胞表面的表达。人NKp46不在粒细胞、树突状细胞、B细胞、T细胞和CD1d-α-gal-cer四聚体+NKT细胞上表达，但在所有NK细胞上以较高且均一水平表达(图1b)。而且，人NKp46开始在骨髓中NK细胞发育的不成熟阶段表达(图1c)，且随后保持以相同水平在所有分离自全部被测器官的NK细胞上表达(图1d)。很明显，因此huNKp46Tg小鼠中人NKp46的表达模式类似于亲代小鼠中内源性小鼠NKp46分子的表达模式。因此，人NKp46的细胞表面表达确定huNKp46 Tg小鼠中的NK细胞，表明人NKp46调控序列可用来驱动NK特异性基因表达。huNKp46 Tg小鼠中的NK细胞表现为正常计数、表型和效应器功能。重要的是，通过人NKp46诱导导向溶解(图1e)，表明人NKp46分子在小鼠NK细胞中具有功能。

实例6-利用抗人NKp46耗竭小鼠体内NK细胞

HuNKp46 Tg小鼠：用PBS或抗NKp46：BAB281(IgG1，100μg)、KL247(IgM，100μg)和195314(IgG2b，R&D***，50μg)的三种不同抗体的混合物在眼眶后给小鼠注射。注射后2天，I.v.给予抗人NKp46的抗体引起血液和被测所有器官中的NK细胞几乎完全消失(图2)。与之相反，NKT细胞和TCRγδ+T细胞计数未受显著影响(图2)，表明huNKp46 Tg小鼠可用作NK细胞选择性耗竭的小鼠模型，且具有Fcgamma受体(例如CD16)结合能力的抗体(例如小鼠IgG1和IgG2b)可介导NK细胞的耗竭。因此，利用结合CD16(例如IgG1、IgG3或经修饰可结合CD16的其他Fc区如IgG2或IgG4)的相应的人效应器区，可用于NK细胞的耗竭，尤其也在骨髓和器官中，这是那些免疫增生病症的一个重要特征，其中不需要的NK细胞可能存在于给定的器官或组织中。

实例7-用Z270耗竭表达NKG2A和-C的淋巴细胞可减少促炎性 细胞因子的分泌

引言

已知IL-15在炎性部位被增量调节且对淋巴细胞如T和NK细胞以及单核细胞源性细胞系具有免疫刺激效应。CD94/NKG2A和-C是HLA-E特异性受体，在慢性炎症例如类风湿性关节炎炎性部位的T和NK细胞上以高频率存在。在这些指征中，促炎性细胞因子TNF-α是一种重要的炎症驱动子，TNF-α靶向治疗(例如英夫利昔单抗或阿达木单抗)可减弱炎症。TNF-α由巨噬细胞、NK细胞、T细胞和B细胞产生。在几个实验中已经表明：一方面NK或T细胞之间的细胞-细胞接触依赖性机制，另一方面单核细胞源性细胞如巨噬细胞，可诱导TNF-α强烈生成。在此，我们证实用单克隆抗体耗竭CD94/NKG2A和-C阳性NK和T细胞具有抗炎效应。这一点在体外测试中加以例证，其中我们表明与未耗竭表达CD94/NKG2A和-C细胞的淋巴细胞相比，耗竭淋巴细胞中表达CD94/NKG2A和-C的细胞后，诱导单核细胞系产生的TNF-α较少。

耗竭表达CD94/NKG2A和-C的淋巴细胞减弱了淋巴细胞激活单核 细胞的能力

从血液中耗竭CD94/NKG2A和-C阳性细胞的抗炎效应是在体外证实的。为此，利用含肝素的CPT采血管(BD Sciences)基本按照生产商提供的方案从健康供者的新鲜血液中分离外周血单核细胞(PBMC’s)。通过于Petri培养皿中将PBMC’s在10ml含Glutamax的RPMI 1640培养基(补充了10％FCS和青霉素/链霉素，下文指定的培养基)中培养1小时，使单核细胞黏附于培养皿，而将淋巴细胞与单核细胞分离。洗涤淋巴细胞一次。随后，在6孔板内将上清中的淋巴细胞在存在人IL-15(BD Sciences，50ng/ml)的培养基中于37℃、5％CO₂孵育约24小时，使用总体积5ml。通过MACS(Miltenyi Biotech)，基本按照生产商提供的步骤而耗竭CD94/NKG2A和-C阳性细胞。简单地说，将细胞在含0.5％BSA的无菌PBS中洗涤一次。将其中1/2的细胞与抗NKG2A(Z199)(BDBiosciences)(2μg/ml)和抗NKG2C(克隆134522)(R&D systems)(2.5μg/ml)的组合物一起冰上孵育30分钟。随后，将细胞在无菌PBS/0.5％BSA中洗涤两次，并与20μl羊抗鼠IgG微珠(MicroBeads)(加入80μl细胞中)一起冰上孵育30分钟。然后用PBS/0.5％BSA洗涤细胞。利用LD MACS柱耗竭CD94/NKG2A和-C阳性细胞。CD94/NKG2A和-C阳性细胞的耗竭通常＞95％，这是通过在流式细胞仪(FACSarray)中测试抗-CD94(HP-3D9)(Pharmingen)着色的细胞而评估的(见图3)。将流过的细胞在含Glutamax的RPMI 1640培养基中洗涤1次，补充10％FCS和青霉素/链霉素RPMI 1640(Gibco)，并在24孔板中与THP-1细胞一起培养24小时，淋巴细胞/THP-1＝10∶1，体积为每孔1ml培养基。利用CBA Th1/Th2细胞因子试剂盒II，基本按照制造商的方案，通过在FACSarray(BD Biosciences)上测定组织培养基中TNF-α、IFN-γ、IL-2、-4、-6和-10的分泌情况来测试由耗竭CD94/NKG2A和-C的淋巴细胞引起的THP-1细胞的激活。与未耗竭的细胞相比，在采用耗竭表达NKG2A和-C的淋巴细胞的培养基中观察到了TNF-α的生成显著减少。因此，耗竭表达CD94/NKG2A和-C的淋巴细胞可减弱淋巴细胞的促炎性反应能力。

本说明书中引用的全部出版物和专利申请的全部内容均通过引用结合于此，如同每一个单独的出版物和专利申请均确切地并单独表明是通过引用结合在此。

尽管为了清晰理解的目的，前文已经通过描述和举例的方式详细地描述了上述发明，但很显然，对于本领域的普通技术人员而言，可根据本发明所传授的内容在不背离所附权利要求的精神或范围的前提下做某些变化和修改。

Claims (48)

1.一种组合物在制备用于治疗免疫增生性病症的一种药物中的用途，该组合物包含特异地结合一种NK受体的一种抗体，该NK受体选自KIR2DL1、KIR2DS1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DS4、CD94、NKG2C、NKG2E、NKG2F、NKp30、NKp44和NKp46所组成的组，其中所述抗体包含结合Fc受体的IgG1或IgG3同种型的Fc区，并且当该抗体结合在一个人的NK细胞上的所述NK受体时致使所述NK细胞被耗竭。 

2.根据权利要求1所述的组合物的用途，其中所述NK受体主要由病人的T细胞或NK细胞表达，并且在给予所述组合物之前该病人的T细胞或NK细胞的NK受体状态是确定的。 

3.权利要求2的用途，其中所述NK受体的状态是利用一种免疫测试而确定的。 

4.权利要求2的用途，其中所述NK受体的状态是利用确定存在于所述NK细胞上的所述NK受体的活性的一种功能测试而确定的。 

5.权利要求2的用途，其中所述NK受体的状态是利用一种基因分型测试而确定的。 

6.权利要求2的用途，其中所述NK受体的状态是利用检测这些细胞内编码NK受体的mRNA的一种测试而确定的。 

7.权利要求2的用途，其中所述NK受体可检出地存在于至少50％的所述NK细胞上。 

8.权利要求1-7中任一项的用途，其中所述免疫增生性病症是一种自身免疫性病症。 

9.权利要求1-7中任一项的用途，其中所述免疫增生性病症选自：自身免疫性溶血性贫血、恶性贫血、结节性多动脉炎、***性红斑狼疮、韦格纳肉芽肿病、自身免疫性肝炎、贝切特氏病、克罗恩病、原发性胆汁性肝硬化、硬皮病、溃疡性结肠炎、干燥综合征、I型糖尿病、眼葡萄膜炎、格雷夫斯氏病、甲状腺炎、心肌炎、风湿热、硬皮病、强直性脊柱炎、类风湿性关节炎、肾小球性肾炎、肉样瘤病、皮肌炎、重症肌无力、多发性肌炎、格-巴二氏综合征、多发性硬化症、局限性脱发、天疱疮/类天疱疮、银屑癣和白癜风。 

10.权利要求1-7中任一项的用途，其中所述免疫增生性病症是NK型LDGL。 

11.权利要求1-7中任一项的用途，其中所述NK受体是一种活化受体。 

12.权利要求1-7中任一项的用途，其中所述抗体特异性识别一种单一的NK受体。 

13.权利要求1-7中任一项的用途，其中所述抗体特异性识别多种NK受体。 

14.权利要求1-7中任一项的用途，其中所述组合物包含多种抗体的一个组合，每种抗体特异地识别一种单一的NK受体。 

15.权利要求1-7中任一项的用途，其中所述组合物包含多种抗体的一个组合，至少一种抗体特异地识别多种NK受体。 

16.权利要求1-7中任一项的用途，其中所述抗体结合至CD16。 

17.权利要求1-7中任一项的用途，其中所述抗体包含人IgG1或IgG3同种型的Fc区 。

18.权利要求17的用途，其中所述抗体不包括放射性同位素、毒性肽或毒性小分子。 

19.权利要求1-7中任一项的用途，其中所述抗体是抗体片段。 

20.权利要求1-7中任一项的用途，其中所述抗体包括放射性同位素、毒性肽或毒性小分子。 

21.权利要求1-7中任一项的用途，其中所述抗体为人源化的或嵌合的。 

22.权利要求1-7中任一项的用途，其中所述抗体结合至所述NK受体的小鼠或灵长类的同系物。 

23.权利要求1-7中任一项的用途，其中所述抗体结合多种KIR受体。 

24.权利要求1-7中任一项的用途，其中所述抗体结合多种NKG2受体。 

25.权利要求1-7中任一项的用途，其中所述抗体特异地结合NKp46。 

26.权利要求1-7中任一项的用途，其中所述抗体特异地结合NKG2C。 

27.权利要求26的用途，其中所述抗体特异地结合NKGC和NKG2E。 

28.一种单克隆抗体： 

a.特异地结合至一种NK细胞受体，该受体选自人类KIR2DL1、KIR2DS1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DS4、CD94、NKG2C、NKG2E、NKG2F、NKp30、NKp44和NKp46受体所组成的组； 

b.结合至一种Fc受体；并且 

c.当结合至一个人的NK细胞上的所述NK细胞受体时，致使所述NK细胞被耗竭，其中该抗体包含结合Fc受体的IgG1或IgG3同种型的Fc区。 

29.根据权利要求28的单克隆抗体，其中所述抗体为人源化的或嵌合的。 

30.根据权利要求28的单克隆抗体，其中所述抗体特异地结合NKp46。 

31.根据权利要求28的单克隆抗体，其中所述抗体特异地结合NKG2C。 

32.根据权利要求28的单克隆抗体，其中所述抗体特异地结合NKGC和NKG2E。 

33.根据权利要求28-32中任一项的单克隆抗体，其中所述抗体包含人IgG1或IgG3同种型的Fc区。 

34.生产适于治疗免疫增生性病症的一种抗体的一种方法，所述方法包括： 

i.提供多种抗体，这些抗体特异地结合至存在于NK细胞表面上的一种或多种受体，该受体选自KIR2DL1、KIR2DS1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DS4、CD94、NKG2C、NKG2E、NKG2F、NKp30、NKp44和NKp46； 

ii.检测所述抗体结合至NK细胞的能力，这些NK细胞取自患有一种免疫增生性病症的一个或多个患者； 

iii.从所述多种抗体中选择结合到至少50％的NK细胞的一种抗体，这些NK细胞取自一个或多个所述患者；并且 

iv.使所述抗体适于对人类给药，其中所述抗体包含结合Fc受体的IgG1或IgG3同种型的Fc区。 

35.权利要求34的方法，其中该抗体致使它与之结合的所述NK细胞被耗竭。 

36.权利要求34的方法，其中所述抗体结合至一种单一的受体，该受体选自KIR2DL1、KIR2DS1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DS4、CD94、NKG2C、NKG2E、NKG2F、NKp30、NKp44和NKp46。 

37.权利要求34的方法，其中通过使人源化或嵌合而使所述抗体适于对人类给药。 

38.权利要求34的方法，进一步包括将一种细胞毒性剂连接到所述抗体的一个步骤。 

39.权利要求34的方法，其中所述细胞毒性剂是一种放射性同位素、一种毒性多肽、或一种毒性小分子。 

40.权利要求34的方法，其中所述抗体结合到取自一个或多个所述患者的至少60％的NK细胞上。 

41.权利要求34的方法，其中所述抗体结合到取自一个或多个所述患者的至少70％的NK细胞上。 

42.权利要求34的方法，其中所述抗体结合到取自一个或多个所述患者的至少80％的NK细胞上。 

43.一种组合物，包含利用权利要求34至42中任一项的方法制备的一种抗体。 

44.权利要求43的组合物，其中所述组合物包含多种抗体的一个组合，其中至少一种抗体特异地识别多种NK受体。 

45.一种药物组合物，包含权利要求44的组合物或权利要求28-33中任一项的一种抗体，以及一种药学上可接受的载体。 

46.一种试剂盒，包括通过权利要求35的方法制备的一种抗体，以及使用所述抗体治疗一种免疫增生性病症的说明书。 

47.一种组合物在制备用于耗竭一个哺乳动物体内NK细胞的一种药物中的用途，该组合物包含特异地结合至一种NK受体的一种抗体，该NK受体选自KIR2DL1、KIR2DS1、KIR2DL2、KIR2DL3、CD94、NKG2C、NKp30、NKp44和NKp46所组成的组，其中所述抗体包含结合Fc受体的IgG1或IgG3同种型的Fc区。 

48.根据权利要求47所述的应用，其中所述组合物包含权利要求44的组合物或权利要求28-33中任一项的抗体。 

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