CN101291630A - 食管异常的诊断试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及辅助诊断巴雷特食管或与巴雷特相关的发育异常的试剂盒和方法。优选是包括下列步骤的方法:分析来自受试者食管表面细胞中的非鳞状细胞标记物,其中检测到这种标记物表明巴雷特食管或与巴雷特相关的发育异常可能性增加,优选,其中所述细胞样品不定向到食管内的特定位置。本发明还设计包括对所述受试者食管进行细胞表面取样的方法。本发明还涉及试剂盒,其包含可吞咽装置及将其用于检测巴雷特食管或与巴雷特相关的发育异常的印刷说明书,所述可吞咽装置包含能够从食管表面收集细胞的研磨材料。优选所述装置包含胶囊海绵。
Description
技术领域
本发明涉及检测食管异常如巴雷特食管(Barrett’s oesophagus)或与巴雷特相关的发育异常,包括检测腺癌的方法。另外,本发明还涉及对食管细胞进行取样并检测与上述病症相关的细胞标记物的试剂盒。
背景技术
食管腺癌(oesophageal adenocarcinoma)正快速增多,其前期症状称作巴雷特食管。早期诊断对于改善食管腺癌所致的可怕结果(5年死亡率>80%)是关键的。目前,人群中大多数巴雷特食管患者仍未诊断出来。另外,在那些诊断出来的患者中,目前也不可能准确预测将发展成癌症的小比例(每年1%)。已经建议应该进行内窥镜筛选以检测那些有患巴雷特食管风险的人——例如对50岁以上患有慢性胃灼热的男性进行内窥镜检查。这花费太大,并需要服务资源。
内窥镜检查是强侵入性技术。患者需要输注并局部麻醉。内窥镜需要训练有素的内窥镜医师和两名护士。另外,内窥镜活检(endoscopicbiopsy)需要在分析实验室中进行,所述分析需要有经验的组织学专家对切片进行检查。因此,可以想象内窥镜检查导致患者不适,从进行所述程序所需的设备和资源以及人员水平方面说都极为昂贵。
内窥镜检查有万分之一的死亡率,和千分之一的并发症风险,如出血或穿孔。虽然这似乎统计学上低,但是并发症是非常危险的。一种并发症可以是从活检部位食管出血。这种出血可以严重到需要输血,因此是对受检查个体的严重风险。缘于食管活检的第二种风险是食管穿孔的风险。如果此事件发生,患者可能立即面临食管手术的威胁。这非常严重,不仅是因为需要常规的麻醉,还因为手术过程对食管的严重影响。即使内窥镜检查的进行没有这些危险的并发症,患者也需要时间恢复。甚至患者需要休假一天而不能工作。
诊断食管腺癌或能导致食管腺癌的明确发育异常的金质标准是通过提取深层细胞样品保存细胞结构。如上所述,这通过内窥镜检查来进行。为了评价发育异常,组织学家必须看所有的切片,对许多因素进行评分。这些因素包括核聚集和跨组织全部深度的形态学特征。一个标准是发育异常必须延伸到组织样品的表面,因此需要全部深度的切片来评估这是否已经发生。一旦组织结构丧失,则细胞学家通常不能告诉哪些细胞是柱形的,所述柱形表示巴雷特食管或发育异常食管。另外,如果存在炎性细胞例如淋巴细胞,当组织结构已经丧失时没有位置信息提供说明下述情况的线索:这些细胞是否已迁徙到对于评估发育异常重要的部位,或者它们是否收集自一些其他轻微创伤处,例如由吞咽骨头或食物中其他尖锐物体所致的轻微创伤处。因此,通常认为完整的组织结构对于患者病情的准确评估是必需的。
已经使用一种可替代的技术来收集内窥镜刷洗物(endoscopicbrushings)。这种技术具有与活检内窥镜收集相关的上述所有风险。虽然内窥镜刷具有样品收集可以定向到巴雷特食管部位以及所获细胞材料的量非常小的优点,但内窥镜刷头受大小限制,因为它必须和内窥镜通道相匹配。另外,甚至进行内窥镜刷洗也需要熟练的操作人员。对正确进行刷洗的限度也极窄。如果刷洗得过猛,则网状细胞污染会使样品的有意义分析模糊。但是,如果刷洗得太轻,则不能收集到足够的细胞材料进行有意义的分析。因此,完成令人满意的内窥镜刷洗所需要的技巧甚至高于对内窥镜检查专家的要求。
当采用内窥镜活检时,任何一个程序中大约收集4~20个活检组织进行分析。虽然这些数目的活检组织,该程序中仍只有约1%的食管表面积得以取样。另外,如果取样过程中巴雷特食管内的发育异常部位在空间上错过,则很容易获得假阴性结果。这对于正接受评估的患者而言明显是重大的危险因素。
已考虑使用新兴技术如相机胶囊(camera capsules)进行巴雷特食管的评估或监测。相机胶囊是小丸状物体,其能够在通过食物通道时收集图像。但是,这种胶囊通过食管非常快,因此,在通过食管时收集图像的机会是非常有限的。另外,相机胶囊是非定向的。因此,当它们沿着食管滚动翻转时,它们只能取到食管内部组织的非常窄条的样品。另外,这种取样实际上是随机的,因为这取决于相机在通过食管“旅行”时的滚转运动。因此,如果相机恰好在通过患者“旅行”时未对准巴雷特食管,则不能收集该患者的任何有意义信息。这也会导致假阴性诊断。另外,利用这种方法不可能进行样品收集。
另一种改进是使用鼻内窥镜。这是小型的内窥镜,可以通过患者鼻通道进行检查,而不需要更具侵入性的从口腔进入的内窥镜。但是,鼻内窥镜具有如此小的尺寸,因而不能进行样品收集。因此,不能收集到活检组织或刷洗物,并且该术仅限于观察。这在产生明确的诊断结果方面显然令人不满意。
另一种改进使用Boston Scientific Inc生产的“细胞筛(cytomesh)”、Brandt囊(Brandt balloon)和US4,735,214的“Cell-Mate”海绵(‘Cell-Mate’sponge)。但是,每种方法都使用柱状的递送装置。这些和刚性的内窥镜相似,可能比目前柔软的内窥镜技术更为笨拙。所述装置难以或不可能吞咽。所述装置经常必须强迫导入受试者,因此造成相当大的不舒适感或痛苦,以及技术问题如缠绕在气管上。因此,这些都非常昂贵,并且需要与内窥镜检查相当的技术专家以实施它们。
本发明试图克服与现有技术相关的问题。
发明内容
本发明基于下列惊人的发现:食管的表面取样和细胞学分析相结合可以导致诊断和分级食管损伤如巴雷特食管、发育异常或明确腺癌的非常有力的方法。
本领域的观点是为了获得有意义的诊断结果需要保持组织结构。但是,本发明已经惊人地表明对来自食管表面的细胞进行取样并对它们进行细胞学分析,例如分析增殖的标记物,可以提供非常特异而敏感的诊断和/或分级食管异常的技术。
具体来说,本发明提供了可吞咽研磨性取样装置的使用,所述取样装置不需要输注或麻醉而导入患者,取出时则带有食管表面细胞的样品。根据对现有技术的理解,可能认为这是不可行的,原因如下:首先,小的巴雷特食管损伤在40cm食管上仅占据约1~2cm。因此,预计约95%~98%的细胞或甚至更多的细胞可能是来自食管的鳞状细胞,收集的总的细胞样品中只有小部分预计表现为巴雷特食管的取样。但是,本发明人已经惊人的发现巴雷特食管的表面异常细胞从损伤处的脱落可以比鳞状细胞从完整食管表面的脱落更容易。因此,本发明的方法本身倾向于向更多食管损伤处取样。其次,现有技术教导组织结构对有意义诊断结果读出的重要性。因此,不能期望仅对食管的表面细胞取样就能提供诊断学上有用的细胞样品。但是,本发明人已经惊人地发现事实上食管组织的表面样品,如果根据本发明的方法进行分析的话,能够为有力、敏感、特异且可靠的诊断结果提供必要的信息。第三,现有技术涉及对活检组织或收集的细胞材料进行形态学分析。需要细胞形状的改变和与未受影响细胞形状的比较。通过对比,本发明人出人意料的表明绝对的读出结果即发现食管表面样品中的特定分子标记物可以指示特定的疾病,而不需要将发现与相邻细胞相关联,而与相邻细胞相关联必然需要完整的组织结构,并且不能通过群体细胞取样技术进行。第四,当本领域中分析发育异常时,必须分析整个切片。可以应用许多组织学标准,如核聚集、组织深度等,损伤向食管内表面的延伸仅是许多标准中的一个,在解释发育异常的诊断之前必须符合这一标准。本领域中已经做了很多尝试使巴雷特异常的诊断方法能够基于细胞学检查,但都失败了。因此,本发明人能够设计基于表面细胞取样与分子标记物检测结合的方案为辅助诊断巴雷特和相关的异常提供可靠的工具,这是出人意料的。第五,本发明的取样技术以“盲法”进行,因为没有可视的检查发生。换言之,样品收集不定向于食管的特定部位。这偏离现有技术,因为现有技术中都由操作者定向到食管内表面的可见区域。
因此,本发明是基于新的表面取样方法来诊断巴雷特食管。具体来说,本发明基于表面取样的细胞中标记物表达的分子细胞学分析。相比之下,现有技术主要与组织学分析相关,涉及观察组织切片内不同层的细胞。通过有利地将细胞标记物分析和表面取样技术相结合,可以有利地避免危险的、侵入性的并经常令人痛苦的现有技术,如内窥镜活检。
因此,在广义方面,本发明涉及将分子生物标记物应用到从非内窥镜检查取样装置收集的材料上,以诊断巴雷特食管和与巴雷特相关的发育异常,如腺癌。
因此,在一个方面中,本发明提供了辅助诊断受试者中巴雷特食管或与巴雷特相关的发育异常的方法,所述方法包括在所述受试者食管的细胞表面取样,以及分析细胞的非鳞状细胞标记物,其中检测到所述标记物表明存在巴雷特食管或与巴雷特相关的发育异常的可能性增加。优选的是,所述取样不定向于食管内的特定部位。
优选的是,只对食管的表面进行取样。这具有可避免更侵入性的取样技术,如穿透食管表面的活检收集技术的优点。
在另一个方面中,本发明提供了辅助诊断巴雷特食管或与巴雷特相关的发育异常的方法,所述方法包括分析来自受试者食管表面细胞的非鳞状细胞标记物,其中检测到所述标记物表明存在巴雷特食管或与巴雷特相关的发育异常的可能性增加。在一个实施方案中,优选地,细胞取样不是本发明方法的一部分。
优选地,本发明的方法在体外进行。
优选地,所述非鳞状细胞标记物是细胞增殖标记物。
优选地,所述非鳞状细胞标记物是柱状细胞的标记物。
优选地,所述标记物选自下组:刷状缘蛋白(brush border proteins),如绒毛蛋白或膜组织伸展刺突蛋白(moesin);粘蛋白基因;刷状缘酶(brushborder enzymes),如碱性磷酸酶;同源框基因,如Cdx1和/或Cdx2;细胞角蛋白,如柱状细胞的CK8/18;或已知在巴雷特中相对于在正常食管表面细胞中差异表达的任何标记物。
优选地,所述标记物选自下组:增殖标记物,如Ki67和Mcm蛋白;增殖和DNA损伤标记物,如PCNA;细胞周期蛋白,如细胞周期蛋白D和/或细胞周期蛋白A;异常p53;丧失p16;非整倍体或已知与发育异常程度相关的任何标记物。更优选地,所述标记物是Mcm2或细胞周期蛋白A。优选地,所述标记物是细胞周期蛋白A。甚至更优选地,分析Mcm2和细胞周期蛋白A两者。
在另一个方面中,本发明提供了如上所述的方法,其中对食管细胞表面的取样包括下列步骤:
(i)将包含能够从食管表面收集细胞的研磨材料的可吞咽装置导入受试者体内;
(ii)从食管取出而收回所述装置;和
(iii)从所述装置收集细胞。
优选地,步骤(i)包括将包含研磨材料的可吞咽装置导入受试者的胃,所述研磨材料可以从食管表面收集细胞。
在另一个方面中,本发明提供了如上所述的方法,其还包括分析细胞的染色体组成,其中检测到异常染色体组型表明发育异常的可能性增加。
在另一个方面中,本发明提供了如上所述的方法,其还包括分析细胞的p53状态,其中检测到异常p53状态表明发育异常的可能性增加。
在另一个方面中,本发明提供了一种试剂盒,其包括可吞咽装置和将其用于检测巴雷特食管或与巴雷特相关的发育异常的印刷说明书,所述可吞咽装置包含能够从食管表面收集细胞的研磨材料。
在另一个方面中,本发明提供了如上所述的试剂盒,其还包括局部麻醉剂。优选,所述局部麻醉剂是喷雾剂或锭剂,优选是喷雾剂。
在另一个方面中,本发明提供了如上所述的试剂盒,其还包括在可吞咽装置取出后容纳所述可吞咽装置的容器,所述容器中具有一定量的防腐性液体。优选地,所述容器是水密容器。优选地,所述防腐性液体是制备细胞的液体。优选地,所述的液体用于产生供检验取样细胞用的载玻片的薄层制备液体(thin preparation fluid)。
在另一个方面中,本发明提供了如上所述的试剂盒,其中所述装置包括胶囊海绵(capsule sponge)。
在另一个方面中,本发明提供了如上所述的试剂盒,其中所述可吞咽装置包括取出工具,如线。
在另一个方面中,本发明提供了如上所述的试剂盒,其还包括切断所述取出工具的装置。优选地,所述装置包括刀片或剪刀。
在另一个方面中,本发明提供了如上所述的试剂盒,其还包括向患者施用可饮用液体如水的容器。
在另一个方面中,本发明提供了如上所述的试剂盒,其还包括手套。这有利地保护样品免受取出所述装置时的污染。
在另一个方面中,本发明提供了一种试剂盒,其包括可吞咽装置和用其检测巴雷特食管或与巴雷特相关的发育异常的印刷说明书,所述可吞咽装置包含能够从食管表面收集细胞的研磨材料。优选地,所述装置包含胶囊海绵。
优选地,所述试剂盒还包括用于检测非鳞状细胞标记物的试剂。优选地,所述非鳞状细胞标记物是细胞增殖标记物。优选地,所述非鳞状细胞标记物是柱状细胞标记物。
在另一个方面中,本发明提供了如上所述的试剂盒,其还包括用于检测选自下组的至少一种标记物的试剂:刷状缘蛋白,如绒毛蛋白或膜组织伸展刺突蛋白;粘蛋白基因;刷状缘酶,如碱性磷酸酶;同源框基因,如Cdx1和/或Cdx2;细胞角蛋白,如柱状细胞的CK8/18;或已知在巴雷特和正常食管表面细胞中差异表达的任何标记物。
在另一个方面中,本发明提供了如上所述的试剂盒,其还包括用于检测选自下组的至少一种标记物的试剂:增殖标记物,如Ki67和Mcm蛋白;增殖和DNA损伤标记物,如PCNA;细胞周期蛋白,如细胞周期蛋白D和/或细胞周期蛋白A;异常p53;丧失p16;非整倍体或已知与发育异常程度相关的任何标记物。优选的是所述标记物是细胞周期蛋白A。
优选地,所述标记物是植物凝集素。
在另一个方面中,本发明提供的试剂盒还包括水密容器和防腐液体。优选地,所述液体用于基于液体的细胞学检验,优选地,所述液体是商业上可购买的、用于产生载玻片的薄层制备液体,所述载玻片用于检验取样细胞。
在另一个方面中,本发明提供了如上所述的试剂盒,其还包括局部麻醉剂喷雾剂或锭剂。
在另一个方面中,本发明提供了胶囊海绵在诊断巴雷特食管或与巴雷特相关的发育异常中的用途。
巴雷特食管和发育异常
巴雷特食管的发生可以不伴有发育异常。每年大约1%的巴雷特食管患者会发展成发育异常。在任何给定时间内,大约20%的巴雷特食管患者会患有发育异常。癌症如腺癌发展自发育异常,并认为其是发育异常的一种极端形式,尽管病理学上情况明显不同。本发明涉及检测和诊断这些疾病,由于腺癌被认为是发育异常的一种极端形式,因此其检测和诊断形成了本文讨论的本发明的一部分。
因此可以认为本发明涉及检测和诊断具有可识别不连续阶段的单一渐进性疾病状态。所述这些阶段包括巴雷特食管、巴雷特食管相关的发育异常,包括由其发生的腺癌。
食管中细胞的正常状态是鳞状上皮细胞。在巴雷特食管中,这些细胞具有柱状上皮细胞的特征,且它们随上述疾病状态而经历进一步变化。因此,食管中的非鳞状细胞是异常的,与巴雷特食管相关,并潜在地和发育异常以及这里所讨论的更严重的异常相关。
和现有技术中的失败相一致,本发明表明食管刷洗物的细胞学(即形态学)诊断与病理诊断相关性不是很好,单独的细胞学不足以诊断性验证食管癌变。
表面取样和技术
在优选的实施方案中,本发明涉及使用可吞咽研磨材料从食管表面对细胞进行取样,所述材料从患者取出,随后从所述材料中分离细胞用于分析。
优选地,对食管的基本上整个表面进行取样,优选整个表面取样。现有技术集中在从巴雷特食管的已知或可见区域中进行取样。本发明有利地提供了对食管的整个内表面即全部内腔进行取样。
研磨性是指材料能够从食管的内表面取下细胞。显然,因为这要用于受试者食管中,因此“研磨性”必须从应用角度解释。在本发明上下文中,术语“研磨性”具有上述的含义,可以通过使材料以合适的量/构造(configuration)通过食管并对其进行检验来确定细胞是否已从食管中取出。
所述材料必须具有足够的研磨性以便对食管中存在的任何发育异常的细胞进行取样。优选地,,所述材料的研磨性足以对存在的任何巴雷特或腺癌细胞进行取样。在最优选的实施方案中,优选的是所述材料研磨性足以能够对整个食管进行取样,从而使一些鳞状细胞和可能存在的任何巴雷特和/或柱状和/或腺癌细胞一起收集。这是有利的,因为鳞状细胞比发育异常细胞更难以取出,因此,它们的取样为操作人员提供了对照。如果正常鳞状细胞被所述材料取出,则未取到目的细胞如巴雷特或发育异常细胞(如果存在的话)的机会就小,所述目的细胞比正常鳞状细胞更容易取出。
优选地,所述可吞咽研磨性材料是可膨胀的。在该实施方案中,优选的是所述研磨性材料在吞咽时比取出时具有更小的尺寸。可膨胀材料可以简单的是压缩的弹性材料,从而使其从压缩物中释放时重新膨胀到大致为未压缩尺寸的尺寸。可替代的是,其可以是在水性液体时膨胀到超过其原始尺寸的最终尺寸。
换言之,优选地,所述装置的材料在吞咽和取出期间膨胀、膨大、张大、充气或以其他方式增加尺寸。优选地,所述装置是自动膨胀的,即不需要吞咽和取出期间的进一步介入。优选地,所述装置不是可充气的。优选,所述装置随着吞咽后解除限制,通过解折叠、解收拢、解螺旋或以其他方式增大尺寸。优选地,所述装置的材料是可压缩的,在吞咽后返回至大致为其未压缩尺寸的尺寸。优选地,所述装置由压缩材料构成,所述压缩材料被可释放地束缚在压缩状态。优选地,所述材料在吞咽后不再受束缚,从而使得所述装置/材料在取出之前膨胀。
优选地,所述装置包含可压缩材料,该可压缩材料被压缩成胶囊形式。优选地,所述可压缩材料是海绵材料的形式。优选地,所述压缩的海绵至少部分地被可溶和/或可消化包衣如胶囊包衣所包围。优选地,所述海绵是不可消化的。优选地,所述胶囊包衣至少部分地由明胶形成。优选地,所述胶囊包衣完全由明胶形成。
在一个实施方案中,可能需要使整个装置位于可消化材料的外面,以便当所述装置在受试者体内遗失时增加安全性。无疑,所述研磨材料需要以比胶囊更慢的速度消化,并且绳索(cord)需要同样慢地被消化。优选地,所述研磨材料是不可消化的。优选地,所述绳索是不可消化的。
优选地,所述研磨材料包括聚氨酯,优选为聚氨酯海绵。
优选地,所述装置是胶囊海绵。从说明书中明显可以看出,所述胶囊海绵是包含可压缩海绵作为研磨材料的装置,所述海绵被压缩成胶囊形状,所述胶囊形状的压缩海绵优选被至少一部分可溶和/或可消化的材料如明胶可逆地束缚在其压缩状态。优选地,所述装置是如南美洲Medical Research Council的Francois Venter提供的胶囊海绵。
优选地,所述样品不包含内窥镜收集的材料。优选地,所述样品不包含内窥镜活检组织。优选地,所述样品不包括内窥镜刷洗物。
优选地,所述装置的膨胀(如解压缩)的研磨材料在与食管的轴心垂直的平面上大约为3cm。优选地,这是食管腔的大致直径。更优选地,这略大于食管腔的直径,有利地确保取出/取样发生时与食管腔内表面的良好接触。
本发明的一个特征是取样不是定向的,如不是可视地定向到食管的任何特定部位。本发明的另一个优点是比现有技术如内窥镜活检(取表面的大约1%)或内窥镜刷洗取到更大比例的食管表面。优选的是取到至少10%,优选至少20%,优选至少30%,优选至少40%,优选至少50%,优选至少60%,优选至少70%,优选至少80%,优选至少90%的食管表面。在最优选的实施方案中,优选取到基本上所有的食管,优选取到食管的整个内腔。即使当本发明的方法不包括收集样品时,这也同样适用于体外样品。
筛选和监测
本发明的筛选方面涉及检测和/或诊断巴雷特食管。通常,在本发明的筛选实施方案中,检查的受试者或从中获得样品的受试者处于巴雷特食管的不确定状态。
本发明的监测方面涉及检测和/或诊断发育异常,包括腺癌。虽然,早期发育异常和腺癌是病理上的不同情况,但腺癌可以认为是发育异常的一种极端形式。如下文所讨论的,依赖于所用的分子标记物,本发明可有利地用于区分腺癌和发育异常。但是,通常来讲,本发明监测方面的讨论涉及检测发育异常,包括腺癌。通常,在本发明的监测实施方案中,检查的受试者或从中获得样品的受试者处于发育异常的不确定状态,但是通常已知具有巴雷特食管。
理论上说,筛选和监测方面的差别是本发明作用的小的实际结果。所述差别仅与所选择的标记物有关。在筛选和监测之间的取样和组合方面都是相同的。事实上,将筛选和监测相结合,即同时检验细胞样品中的巴雷特食管标记物和发育异常包括腺癌的标记物可以是有利的,可以增加获得信息的价值,获得更有利的综合诊断结果。
标记物
可用于巴雷特筛选和监测的标记物是不在正常食管组织中表达的任何标记物,优选是不在正常的食管表面细胞中表达的任何标记物。优选,所述标记物是非鳞状细胞的标记物。优选,所述标记物是细胞增殖标记物。
对于筛选方面(即检测巴雷特食管),优选,使用区分肠组织变形(巴雷特食管)和鳞状食管细胞或胃贲门的标记物。这些标记物包括上皮分化的标记物。
筛选——柱状标记物
优选,所述标记物是柱状细胞标记物。
优选,这种标记物包括刷状缘蛋白,如绒毛蛋白或膜组织伸展刺突蛋白;刷状缘酶,如碱性磷酸酶;它们在特化的肠组织变形中特异表达。同源框基因,如Cdx1和/或Cdx2是这种有用标记物的其他例子,因为柱状组织而非鳞状组织表达同源框基因,如CDX1、CDX2。
另外,特异性粘蛋白基因在巴雷特食管表达,而不在胃组织中表达(如MUC2A、MUC2B)。
其他类型的柱状组织变形和天然的柱状组织可以根据细胞角蛋白表达谱和鳞状上皮细胞区分开(如CK7、8、13、14和18)。具体而言,细胞角蛋白,如柱状细胞的CK7和/或CK8/18和鳞状细胞的CK13/14是根据本发明的有用标记物。
使用柱状标记物是特别优选的。使用柱状标记物的技术优势是只有柱状细胞才能使用它们检测到。这意味着鳞状细胞(无论是正常还是癌变)不能被柱状标记物染色。这是有利的,因为巴雷特细胞和来源于其的发育异常细胞如腺癌细胞是柱状的,因此可以使用柱状标记物选择性地加以识别。这有利地改善了信号,并减少了背景,消除了应用其他区分性标记物的需要,从而通过以这种方式直接检测柱状细胞而简化了程序。
特别优选的是上文提到的柱状标记物,优选诸如刷状缘蛋白和/或同源框基因和/或粘蛋白和/或细胞角蛋白。
本发明的优选组合方面如试剂盒和方法,包括至少一种柱状标记物。
筛选——植物凝集素标记物
植物凝集素是非常丰富的蛋白质。植物凝集素/植物凝集素结合伴侣在BE中的表达比在正常组织中的表达多。植物凝集素是与碳水化合物的特异构型选择性结合的糖蛋白如在BE中表达的粘蛋白。细胞表面分子,包括生长因子受体经常糖基化,植物凝集素也可以和它们结合。当用适当的荧光燃料标记时,植物凝集素可以是使用组织化学和流式细胞术方案检测和诊断发育异常和侵害性细胞的高度敏感、可定量且特异的工具(如Jordinson M 1998)。它们的低成本、高多度和亲和性、通过多个结合位点使得它们作为生物标记物非常诱人。我们的数据表明三个优选的荧光染料结合的植物凝集素(Helix pamatia凝集素(HPA)、花生植物凝集素(PNA)和Ulex europaeua凝集素-1(UEA-1))能够区分非发育异常的和发育异常的细胞系与组织。荧光燃料是高度稳定的,能够进行自动显微镜分析或通过流式细胞术进行定量分析。因此,植物凝集素是本发明的优选标记物。
筛选——通常标记物
来自调节细胞分化的通路的标记物也可用于在筛选实施方案中区分细胞,具体是wnt通路和Notch通路基因。
相对于在正常食管表面细胞中,在巴雷特食管表面细胞中已知差异表达的任何其他标记物都可以使用。
使用表达微阵列比较胃贲门和鳞状细胞活检组织可以鉴定可替代的标记物。在这些细胞类型中差异存在的任何标记物都可以用于本发明。
检测巴雷特食管(即用于本发明的筛选实施方案中)的优选标记物是绒毛蛋白或膜组织伸展刺突蛋白,优选绒毛蛋白。
监测
至于监测方面,优选使用表达与发育异常程度相关的标记物。优选,这种标记物用于对处于危险中的患者分级。
优选,此类标记物包括增殖标记物,如Ki67和Mcm蛋白;增殖和DNA损伤标记物,如PCNA;细胞周期蛋白,如细胞周期蛋白D和/或细胞周期蛋白A;异常p53,例如p53LOH、p53突变或p53过表达如通过其免疫组织化学检测;丧失p16,包括甲基化;和非整倍体,例如通过流式细胞术或成像细胞术检测。
稍微更详细地来说,显示生长因子(如EGF)、生长因子受体(如EGFR)以及细胞因子(IL-4)和参与炎症反应的分子(COX-2)表明在BE和随后发展成AC的进程中具有异常表达,因此它们都是根据本发明的有用标记物。
发展成腺癌可能导致增殖加强。增殖标记物(如MCM蛋白、Ki-67、PCNA)被认为是发展标记物。在细胞周期中表达因此与增殖紧密相关的标记物也是本文使用的标记物(如细胞周期蛋白、pRb)。对细胞周期行使负调控的标记物是感兴趣的,如周期抑制剂,类CDK抑制剂(p15、p16)。
体外和来自体内的工作已经表明酸和胆汁刺激诱导DNA损伤、MAP激酶通路、NFκB通路和凋亡下降,因此参与检测DNA突变和损伤的标记物(如ATM、ATR)、凋亡标记物(p53)、MAPK通路的标记物(erk、p38)和NFκB标记物是有用的。另外,胆酸增加视黄酸通路(CYP26A1、RAR),该通路和鸡胚食管的组织变形相关。许多其他的通路也参与BE的发生和向癌症的发展,如TGFβ和BMP通路。
标记物:进一步的考虑
事实上,已知与发育异常程度相关的任何标记物都将是合适的,包括许多癌基因和肿瘤抑制基因。具体而言,下列文献中中提到的标记物都可适合用于本发明:Fitzgerald RC Clin Gastroenterol Hepatol Complexdiseases in gastroenterology and hepatology:GERD,Barrett’s,andesophageal adenocarcinoma.2005,3:529-37或Fitzgerald RC Recent Resultsin Cancer Res Genetics and prevention of oesophageal adenocarcinoma 2005,166:35-46。
McM标记物和/或细胞周期蛋白A对于检测与巴雷特相关的发育异常包括腺癌都是特别优选的,最优选的是McM标记物。优选的Mcm(微型染色体维护)标记物是Cdc6、Mcm3、Mcm4、Mcm5、Mcm6、Mcm7或Mcm8中的一种或多种,优选Mcm2。当标记物是Mcm2时,获得85%的灵敏度和70%的特异性,或甚至更高。
如果单独使用Mcm标记物,则巴雷特食管的检测仅有可能在部分情况下进行,即许多早期阶段的巴雷特损伤不会表现出Mcm表达。因此,如果将本发明应用于同时筛选和监测,优选,有利地选择单独的筛选(即巴雷特食管)标记物以便与监测标记物Mcm联用。
在一个高度优选的实施方案中,使用单一的标记物或细胞周期蛋白A。优选,使用Mcm2。Mcm检测到所有巴雷特食管和Mcm2阳性发育异常及癌症发生率的大约一半。该实施方案的技术优势在于:尽管高达一半的巴雷特食管发生率检测不到,但这些都是早期阶段的巴雷特食管,并且通过单独的Mcm2检测到的那些都是高危的巴雷特群体。因此,通过使用单个Mcm2标记物,程序得以简化,并且最重要的疾病组可靠地得以检测。优选,单独使用Mcm2时,细胞通过胶囊海绵进行收集。在癌症和高级发育异常的检测中,Mcm2的NPV(阴性预测值)是100%;因此,对Mcm2阴性的患者不会患有HGD或AC。与非发育异常BE相比检测癌症和发育异常的NPV是72%,意味着72%对Mcm2阳性的患者将是发育异常的。另外,Mcm2阳性的90%患者将患有食管异常。(当然,这些数据和下面的数据都基于群体研究,应该相应地加以解释;更多的细节请参见实施例部分)。
本文首次发现细胞周期蛋白A是巴雷特食管的指标。因此,优选,所述标记物是细胞周期蛋白A。单独的细胞周期蛋白A具有大约95%的灵敏度和大约65%的特异性(阳性(PPV)58%,阴性(NPV)98%)。另外,从巴雷特食管向低级发育异常向高级发育异常并向腺癌发展的过程中细胞周期蛋白A水平增加。因此,在一个实施方案中,本发明涉及细胞周期蛋白A的定量,优选基于每个细胞,并和异常的可能状态相关。
优选,所用的标记物是细胞周期蛋白A。更优选,将细胞周期蛋白A和一种或多种本文所公开的其他标记物联用。
细胞周期蛋白A比Mcm2更为特异,但是从分阶段方面讲具有较低的灵敏度。在优选的实施方案中,Mcm2和周期蛋白A联用。这些标记物具有接近100%的阴性预测值,联用时对发育异常和癌症具有约50%的阳性预测值。因此,如果受试者对Mcm2和细胞周期蛋白A都是阴性的,则这指示为没有与巴雷特相关的发育异常,包括腺癌。
应该注意的是本发明不涉及诊断食管的鳞状细胞瘤。其和巴雷特食管及与巴雷特相关的发育异常如腺癌非常不同的疾病。优选,食管的鳞状细胞瘤的诊断特意从本发明中免除。
标记物分析/检测
分析标记物指测定所述标记物的存在与否。优选,所述分析指免疫染色或标记物的可视化。
标记物表达(标记物基因表达)可以通过本领域技术人员已知的任何适宜的手段检测。表达可以在核酸水平或蛋白质水平上进行检测。表达可以通过质谱分析,并就质谱读数转化为具体的蛋白分子。在核酸水平,检测优选通过监测mRNA水平进行。优选,表达在蛋白质水平检测。优选,标记物基因表达指标记物蛋白表达。优选,标记物蛋白表达是通过直接或间接检测标记物蛋白来测定。优选,这种蛋白质通过免疫化学手段检测。优选,标记物蛋白通过能够与该蛋白质反应的抗体检测,然后使所述抗体可视化。优选,所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。优选,当抗体是多克隆抗体时,其是免疫纯化的多克隆抗体。优选,所述抗体是单可龙抗体。可以有利地使用二级甚至三级或更多抗体,以放大信号和促进检测。优选,标记物蛋白通过使用免疫组化工具如免疫荧光工具直接或间接地与标记物蛋白结合而可视化。优选,检测通过标记物的抗体进行。
其他合适的分析包括ELISA——fish的荧光原位杂交和FACS——细胞分选的荧光分析。
样品
可以理解,所述样品优选包括通过本文所述取样程序获得的个体细胞群。因此,检测标记物优选指检测所述细胞群中至少一种细胞的标记物。检测到样品中任何细胞的增殖标记物表明存在巴雷特食管或与巴雷特相关的发育异常。样品细胞群体中显示标记物的任何细胞的缺失说明不存在巴雷特食管或与巴雷特相关的发育异常。显示标记物表达的细胞比例不那么重要。显示标记物表达的细胞比例通常不对诊断起作用。本发明基于样品细胞群中显示标记物的任何细胞的检测,或显示标记物的细胞的明显缺失。在一些实施方案中,测定细胞类型的相关比例或显示增殖标记物的细胞比例作为可选步骤可以是有利的,取决于操作人员的需要。但是,对于本发明的多数实施方案,结果将表现为阳性或阴性,通常不考虑细胞的相对比例。
试剂盒
设计提供本发明的试剂盒以实施本发明的方法。因此,本发明方法所需的元件(elements)的描述同样适用于本发明试剂盒的内容,其优选含有实施所述方法的元件。具体而言,优选,所述试剂盒含有检测所用的一个或多个标记物的试剂。
优选地,本发明的试剂盒还含有用于食管的局部麻醉剂。优选,其可以是喷雾剂或锭剂形式,优选喷雾剂。
优选的是本发明的试剂盒还含有从受试者取出所述装置时容纳所述装置的容器。优选,该容器是水密的。优选,所述容器含有防腐液体。优选,所述容器含有液基细胞学流体(liquid based cytology fluid),如商业上的用于制备取样细胞的载玻片的薄层制备液体。优选的是所述薄层制备液体包含防腐剂。
优选地,将所述可吞咽装置润滑以辅助吞咽,优选,将所述取出工具也加以润滑。因此,优选,所述试剂盒包括润滑剂。
优选地,试剂盒包括可饮用溶液,以辅助吞咽所述装置。优选,将所述溶液进行调味,以掩盖所述装置的味道,或使之更为可口。优选,所述溶液是浓缩的,如通过加入糖或果胶或其他产生流变学特征如粘度或稠度的其他试剂。这样的优点是更浓或稠的溶液将更有效地辅助所述装置在吞咽过程中通过食管。
为了减小试剂盒的重量/体积,优选,所述溶液以粉末形式提供,从而使操作人员在使用之前通过加入水对其进行重新构建。优选,所述试剂盒包括用于重新构建的容器。优选,所述容器是有刻度的,以便正确测量液体如水的量。
优选,所述可吞咽装置不包含动物产品。
优选,所述试剂盒包括例如锭剂、溶液或粉末形式的止吐剂,以抑制导入和/或取出所述装置过程中呕吐的冲动。
优选,所述试剂盒可以包括抗酸剂,诸如中和酸的化合物,或诸如用于抑制胃中酸产生/分泌的药用抗酸剂。有利的是这可以用于抑制取出所述装置时从胃带到食管的酸的烧灼感。另外,这可以有利地保存用所述装置所获得的细胞样品。
优选,所述防腐液体包含抗酸剂和/或缓冲到所需的pH,以保存所获得的细胞样品。
在一个实施方案中,所述试剂盒优选地包括局部麻醉喷雾、胶囊海绵、含有制备液体(如ThinPrepTM PreservCytTM SolutionTM)、罐的标签、为实施取样的医护专业人士提供的说明书。
优选,试剂盒还包括手套(便于医护专业人士如护士从受试者取出胶囊)。
优选,试剂盒还包括剪刀,以切断取出工具(如线)。
优选,试剂盒还包括塑料杯(便于受试者饮用液体,如水)。
优选,试剂盒还包括为受试者/患者提供的信息页。
在另一个实施方案中,本发明涉及自我检验试剂盒,如检测棒(dip-stick)形式的试剂盒,通过该试剂盒所述棒包含用于检测根据本发明的标记物的试剂,并且在使用中将棒浸入样品细胞材料池中导致根据本发明的标记物的可视读数,从而提供能够辅助本文所述诊断的信息。
优选,所述装置包括一体的取出工具。优选,所述取出工具是基于线或绳索的工具。优选,所述取出工具带有刻度,从而使操作人员可以估计所述装置何时位于或可能位于胃中。另外,刻度可有利地允许监测装置的取出,使得可以校准取出的速率,优化样品收集。
优选,所述取出工具在可吞咽研磨材料的远端包括不可吞咽的元件。其有利的防止整个装置的意外吞咽,从而抑制或阻止其取出。优选,所述不可吞咽的元件在紧急情况是可以检测的,这时可以更安全得使整个装置吞咽下去并通过消化道。
其他试剂盒特征
在一些实施方案中,可以存在多部件试剂盒,以便不同情景下提供不同元件。上述讨论集中在本发明试剂盒的优选方面上,这是基本护理应用,例如对受试者进行初步检测的筛选。但是,对于熟练人员显而易见的是食管表面样品可以在不同于受试者被取样的原始基本护理环境的地方进行分析。例如,细胞可以在与样品被收集的原始护理环境相独立的实验室进行分析。在该实施方案中,显而易见的是,本发明可以涉及具有原始护理组件和读出组件(或实验室组件)的多部件试剂盒,或本发明甚至涉及试剂盒本身的读出/实验室组件本身。在该实施例中,试剂盒的读出(或实验室)组件可以包括下列元件中的一种或多种:
-耗材,如非妇科显微镜载玻片,和/或非妇科滤器;
-设备,如ThinPrepTM2000处理器;
-异常病理检测——使用Mcm2免疫组化检测巴雷特食管;自动免疫染色***,如果例如用DakoCyomation Ltd ChemMateTM***将样品染色。
试剂盒还可以包括下列检测耗材中的一种或多种:如DakoAutostainer试剂瓶、ChemMateTM检测试剂盒、ChemMateTM过氧化物酶封闭溶液、ChemMateTM抗体稀释剂、Mcm2抗体、山羊血清、牛血清白蛋白、苏木素(Haemotoxylin)和/或玻片(Coverslips)。
试剂盒还可以包括诸如Dako自动染色载玻片处理器(S3400 Dako自动染色仪)的设备。
为了便于样品的分析,试剂盒还可以包括可视化工具,如显微镜(如自动显微镜),例如具有X10、X20和/或X40物镜的Olympus BX41。
其他优点/应用
一旦在表面取样中丧失组织结构,则细胞学不再能将细胞类型如鳞状、柱状和巴雷特区分开。另外,炎性细胞如淋巴细胞的观察不再能对诊断作出贡献,因为不能从这些观察获得位置信息。但是,有利的是本发明通过使用生物标记物鉴定细胞类型克服了该问题,甚至当组织学信息已经丧失时也是如此。
对细胞中标记物表达的分析经常通过将细胞分布到显微镜载玻片然后进行染色和分析进行。通过将细胞中的标记物可视化,本发明有利地允许自动操作,从而使组织学家的判断不再需要基于细胞结构,而是将标记物存在与否的阳性/阴性信号作为读出结果。该读出结果可以快速地通过图像捕获收集,数据分析/诊断可以有利地和程序中的染色/成像步骤解偶联。另外,本发明的优选的取样装置如胶囊海绵有利地比困难的现有技术如内窥镜刷洗收集更多的细胞。具体而言,在一次胶囊海绵样品中可以收集到比困难的内窥镜刷洗多大约6~12倍的细胞。
相对于现有技术的关键差别是仅收集表面样品。这不是本领域预计的缺点,事实上这是本发明的优点,因为例如显示增殖标记物如Mcm2或细胞周期蛋白A的任何表面细胞都是异常的,而对于取自食管深处的细胞样品来说这不一定是真的,因为食管深处会发生主动的细胞***(active division),而不与潜在的病理状况相关。因此,仅分析表面细胞是本发明的优点。
已经使用胶囊海绵来检测鳞状细胞腺癌。这是本发明的意料之外的优点,因为这些胶囊海面可以用于检测相当不同的与巴雷特相关的疾病。
传统的巴雷特取样技术如金质标准活检最多能取食管表面积的大约1%。本发明有利的取到食管的大约所有表面积。
虽然优选通过使细胞分布到载玻片上分析细胞,但以不同的方式如ELISA或FACS或FISH来进行分析可以是有利的。优选,直接得自胶囊海绵或其洗涤物的细胞可以这些方式的一种或多种进行分析,有利地避免对载玻片形式分析的需要。如果需要载玻片形式的分析,优选的是,将细胞浓缩到载玻片上,以对于相同数目的细胞产生较少的载玻片,从而节约成本。在一个实施方案中,优选的是从胶囊海绵的细胞,提取其蛋白质并检验标记物,从而缓解对完整细胞染色的需要。
有利的是,优选的胶囊海绵取样装置上的孔径可以改变,以调节收获的细胞数目。例如,通过减小孔径,可以有利地减少细胞的数目(因此减少所需要的载玻片数)。
在高度优选的实施方案中,选择标记物以检测高危巴雷特食管。这还具有其他优点,因为可以减少对巴雷特或者以检测将来的发育异常包括腺癌的监测或重新监测,或使之不必要,因为在一个步骤中就检测到巴雷特食管并将之分级为高危。因此,可以马上对随后的治疗开出处方,而不需要昂贵的监测,没有检测过程中患者在被检测到之前继续发展到更危险损伤的风险。
有利的是本发明的技术可以应用于基本护理中,即普通医师的手术中,其中可以取样品,并远程批量处理,从而降低成本,缩短患者的时间消耗。另外,该可以由普通医师手术中的人员操作,有利地避免对参与取样/处理的特殊训练人员如医生的需要。
本发明的一个优点是假阴性极少。会发生一些假阳性,如检测到天然增殖的细胞,如包扎(closing)选择吞咽摩擦性食物如水果核时所致的伤口。但是,由本发明的检验方法和试剂盒获得的阴性结果是非常可靠的,因此当获得阴性结果时这些患者可以不必再进行以后的程序,可以收到有力的处于早期阶段的保证。因为本发明的方法和试剂盒简单且成本低,服务提供者可以以相同的净成本开展更为广泛的筛选项目。
优选,以3年的间隔对既定的受试者实施本发明的检验方法。
本发明的另一个优点是基于液体的细胞学成为可能,这由于现有技术中在巴雷特食管内采用的传统细胞学。
本发明的另一个优点是发育异常的初步迹象可以非常小,通过视觉观察或内窥镜活检取样可能被漏掉,但是根据本发明将被检测到。同样,40%的高分级发育异常受试者已经患有癌症。本发明可有利地更好地检测/诊断这些患者。
本发明的另一个优点是它不需要内窥镜,因此比现有技术更廉价、便利且安全。因此,根据本发明,食管不是用内窥镜取样。具体而言,本发明的一个关键特征是对食管的表面进行取样。内窥镜活检通常对深层组织而不是仅表面取样。本发明的一个惊人的优点是仅表面取样可以用于辅助诊断巴雷特食管或与巴雷特食管相关的发育异常。优选,食管表面不是通过内窥镜取样的。这具有进一步优点,即快速、廉价并适于基本护理中的群体筛选。
优选,本发明对食管的大范围表面积进行取样。内窥镜取样仅取食管的小范围表面积。对大范围表面积取样的优点是降低由于点取样盖度(coverage)的限制而漏掉发育异常的几率。
优选,本发明涉及筛选(如群体筛选)应用,即检测初始异常。优选,本发明适合于基本护理中的群体筛选。
根据本发明的诊断,其有利地更为一致,消除了现有技术如刷洗/活检所具有的操作人员差异。
本发明优选不涉及基于以刚性柄/索(cable)为特征的装置而取样的技术。这些难以或不可能吞咽。优选,将上述的胶囊海绵用于本发明的方法和试剂盒。其具有容易吞咽的优点。另外,由于其优选的网眼结构,这具有能够通过其结构收集细胞的优点,而不是如现有技术装置那样局限于在细胞表面收集。这具有提高产量的优点。
惊人的是,本发明的非定向取样方法不具有鳞状细胞覆盖背景的问题,而从现有技术的理解预测应该具有这种问题。这是因为现有技术定向到巴雷特食管,其通常仅占食管表面积的2%~5%,甚至更少,而本发明对全部表面积进行取样,因此可以预测任何巴雷特信号都将被背景掩盖,但是本文令人惊奇的表明并非如此。
现在仅通过实施例并参照下列附图对本发明进行描述。
附图说明
图1表示本发明的优选取样装置在吞咽前的照片。
图2表示本发明的优选取样装置部分分解以展示胶囊结构的照片。箭头所指是绳索穿过的胶囊部分。
图3表示本发明的优选取样装置部分分解以展示胶囊结构的照片。
图4表示本发明的优选取样装置在胶囊溶解和可膨胀材料膨胀后的照片。
图5表示膨胀的胶囊海绵的照片。
图6表示染色细胞的照片。
具体实施方式
实施例1:取样装置的结构
将研磨材料切割成合适的大小。在该实施例中,该材料大致为人食管内直径的尺寸,即直径约3cm。
在该实施例中,该材料是聚氨酯网或布。
将绳索***材料中,以便在吞咽后可将其取出。(图3所示为附有绳索的装置)。
绳索足够长,从而使部分绳索在装置被吞咽并停留在胃中时仍在口腔外。绳索和***足够强并耐消化,以便膨胀后它可以用于将装置取出。
然后压缩材料并***明胶胶囊中(图1)。绳索在胶囊上(图2所示为带有绳索的部分分解胶囊)。然后装置就可以使用了。
实施例2:从食管表面对细胞进行取样
提供了根据实施例1的装置。受试者可以服用通过制剂得到的锭剂或喷雾剂形式的局部麻醉剂。
将装置导入受试者口腔,绳索的远端保留在口腔外。
然后将装置吞咽。饮用温水辅助这一过程,弄湿绳索,促进其通过食管。
大约10~20秒后,装置到达受试者的胃,绳索处于胃内、并位于食管和口腔中,且向外到滞留点。
5分分钟后,胶囊包衣已经溶解,研磨性聚氨酯材料已经膨胀回其未压缩时的大小。
然后通过轻拉绳索远端将装置取出,沿着食管将装置拉出口腔,沿路收集食管细胞。然后,将装置保存到封闭容器中的防腐液体中,直到处理用于分析取样的细胞。优选地,防腐液体是薄层制备液体,用于产生分析载玻片。
实施例3:分析细胞标记物
洗涤实施例2的取出的装置以收集食管细胞。然后将它们加到载玻片上并固定,以可视化。
Mcm2是本实施例的标记物。
用于本部分研究的分析人数是18名BE患者和22名健康者(对照)。BE患者的年龄是64.5±2.1岁,相比之下健康志愿者是31.2±1.6,男:女比例在两组中都偏向男性群体(分别是1∶5和1∶1.7)。
用PAP载玻片评估样品的细胞结构。专业的细胞病理学家评价样品的细胞,88%的样品具有良好到非常良好的细胞结构,22%的样品具有平均的细胞结构。
图6表示来自胶囊海绵样品的单层代表性图片。Pap染色的样品(A-C)和Mcm2染色的样品(C)。黑色箭头所示为柱状细胞的位置,红色箭头所示为鳞状细胞的位置。
如通过内窥镜刷洗物可看到的,柱状细胞和鳞状细胞容易在PAP染色的样品上区分(图6A、6B和6C)。Mcm2阳性细胞染色强度和从内窥镜刷洗物看到的一样强(图6C)。
非内窥镜技术具有至少两种工业应用。首先是鉴定所有的巴雷特患者,以显示本发明作为检测巴雷特食管的筛选测试方法的应用。第二是根据发展成腺癌的危险性将BE患者分级(即显示本发明在监测中的应用)。两种独立的应用可通过改变所用的生物标记物来实现。
在91%的BE患者和9%的对照患者中检测到了柱状细胞(表A)。
表A表示来自巴雷特患者(具有或不具有发育异常)和对照患者的胶囊海绵细胞样品中的Mcm2阳性和柱状细胞的存在。分析结果在下部分表中(PPV:阳性预测值;NPV:阴性预测值)。
如所讨论的,我们已经表明Mcm2的表面表达和高危险的癌症发展相关。在55%的BE样品和9.1%的NE样品中检测到Mcm2表达(表B)。
表B | Mcm2阳性 |
NE | 2/22(9%) |
BE | 5/9(55%) |
LGD | 4/8(50%) |
HGD | 1/1(100%) |
表B表示BE和相关发育异常的诊断中染色的胶囊海绵样品。阳性刷洗物的值代表具有任何可分辨Mcm2表达的患者(NE:正常食管;BE:巴雷特食管;LGD:低级发育异常;HGD:高级发育异常)。
通过Mcm2染色检测的样品的百分比和发育异常程度的增加进行相关(p<0.05)。
表C:胶囊海绵中Mcm2阳性和柱状细胞的存在和巴雷特片段的长度相关。
片段长度和柱状细胞的存在之间有相关性(表4~9,p<0.05),但是和Mcm22阳性没有相关性。
因此,证明了分析表面细胞样品的生物标记物以辅助诊断巴雷特食管和与巴雷特相关的发育异常如腺癌的价值。
实施例4:建立和评价对巴雷特食管的非内窥镜免疫细胞学筛选测试方法
背景:巴雷特食管(BE)是食管腺癌的已确定的危险因素。但是,大多数患者都未得到诊断。对BE的内窥镜群体筛选是不实际的,无线胶囊成像装置不能进行组织取样。之前的非内窥镜细胞学取样装置耐受性差,并且细胞学分析不足以准确评价BE。
在本实施例中我们演示了一种辅助诊断受试者中巴雷特食管或与巴雷特相关的发育异常的方法。该方法包括对所述受试者食管的细胞表面进行取样,其中所述的取样不定向于食管的特定部位。在本实施例中,通过胶囊海绵的方式取样。
该方法因此涉及分析细胞的非鳞状细胞标记物。在本实施例中,标记物是Mcm2。我们表明增殖标记物微染色体维持蛋白2(Mcm2)的免疫细胞学分析是检测和监控BE的有用方法,因为增殖在疾病病理早期就逐渐失调。本实施例演示了一种对BE的非内窥镜筛选测试方法,其将胶囊海绵装置和Mcm2染色联用。
在本技术中,检测到这种Mcm2标记物表明存在巴雷特或与巴雷特相关的发育异常的可能性增加。
方法:在常规优化优选的胶囊海绵装置和免疫细胞学后,招募27名患者(活检组织上具有内窥镜可见的含腺粘膜的肠组织变形)和30名健康志愿者参加研究。
患者吞咽海绵,5分钟后,将膨胀的海绵置入防腐液中。用液基细胞学技术产生细胞单层,其中从装置提取尽可能多数目的细胞。用小鼠抗Mcm2单克隆抗体进行免疫组织化学分析。产生双元评分,从而使具有核Mcm2阳性的单个细胞获得阳性评分。
对临床诊断不知情的两个人评估载玻片。
为了确定测试方法的可接受性,患者使用了线性分级工具。
结果:从3/57(5.2%)患者获得不足够的样本。从任何患者回收的鳞状细胞都不具有Mcm2阳性。22/26(84%)的BE患者具有柱状Mcm2阳性,相比7/28(25%)健康志愿者,分别具有84.6%和75%的灵敏度和特异性。测试方法的阴性和阳性预测值分别是75.9%和84.0%。
胶囊的可接受性评价为4.4+/-0.3,10人非常喜欢,5人无所谓,没有非常不高兴的。
结论:胶囊海绵免疫细胞学的灵敏度和特异性表明和目前临床实践中的其他筛选测试方法相比更有利。
因此已证明根据本发明的非内窥镜免疫细胞学技术可应用于基础护理,可以使用自动处理技术。因此,本发明的方法是BE的有用筛选工具。
实施例5:建立和评价对巴雷特食管的非内窥镜免疫细胞学筛选测试方法
背景:巴雷特食管(BE)是食管腺癌的已确定的危险因素。但是,大多数患者都未得到诊断。本研究的目的是建立一种BE的非内窥镜筛选测试方法,并表明它适合应用于基础护理情景下。
本实施例列出了辅助诊断巴雷特食管或与巴雷特相关的发育异常的方法,其包括分析来自受试者食管表面的细胞中的非鳞状细胞标记物。在本实施例中,通过胶囊海绵的方式收集细胞。
我们之前已经说明BE的表面上皮细胞含有增殖细胞,可以通过对微染色体维持蛋白-2(Minichromsome maintenance protein-2,Mcm2)的免疫细胞化学分析检测到。这是本实施例所用的标记物。
我们证实:检测到这种Mcm2标记物表明存在巴雷特或与巴雷特相关的发育异常的可能性增加。
方法:43名BE患者和42名健康志愿者吞咽附有线的胶囊海绵。5分钟后将膨胀的海绵取出并置入防腐液中。使用液基细胞学技术产生细胞单层,对Mcm2进行染色。如果柱状细胞具有核染色,则样品被认为是阳性。不了解临床诊断的3个个体分析载玻片。为了确定测试方法的可接受性,患者使用了线性分级工具(10人喜欢,5人无所谓,没有不高兴的)。
结果:从4/83(4.8%)患者获得不足够的样本。27/41(66%)的BE样本为阳性;相比8/40(20%)健康志愿者样本,分别具有67%和80%的灵敏度和特异性。测试方法的阴性和阳性预测值分别是77.19%和71.0%。胶囊的可接受性为4.4+/-03。
结论:胶囊海绵免疫细胞学的灵敏度和特异性表明和目前临床实践中的其他筛选测试方法相比更有利。另外,该方法适用于基础护理,并且在实施该方法时可以使用自动处理技术。这是BE的有用筛选工具。可以通过使用其他分子标记物如植物凝集素标记物来改变该方法。
我们已经证明三种荧光染料结合的植物凝集素(Helix pamatia凝集素(HPA)、花生植物凝集素(PNA)和Ulex europaeua凝集素-1(UEA-1))能够区分非发育异常的和发育异常的细胞系与组织。荧光燃料是高度稳定的,能够进行自动显微镜分析或通过流式细胞术进行定量分析。因此,本文也证实了植物凝集素的利用。
上面说明书中提到的所有出版物都通过参考方式并入本文。在未偏离本发明的范围的情况下,对本发明所述方法和***的各种修改和变动对于本领域的技术人员都是显而易见的。虽然结合具体优选的实施方案已对本发明做了描述,应该理解,所要求保护的本发明不应局限于这些具体的实施方案。事实上,对实施本发明的所述模式进行的各种修改,这对于生物化学和生物技术或相关领域的技术人员显而易见的,其也落入权利要求的范围内。
Claims (31)
1、试剂盒,其包括含有能够从食管表面收集细胞的研磨材料的可吞咽装置,和用其检测巴雷特食管或与巴雷特相关的发育异常的印刷说明书。
2、根据权利要求1所述的试剂盒,还包括局部麻醉剂。
3、根据权利要求1或权利要求2所述的试剂盒,还包括用于在所述可吞咽装置取出后容纳所述可吞咽装置的容器,所述容器中具有一定量的防腐液体。
4、根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒,其中所述的装置包含胶囊海绵。
5、根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒,其中所述的装置包含取出工具。
6、根据权利要求5所述的试剂盒,其还包括用于切断所述取出工具的装置。
7、根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒,其还包括用于向受试者施用可饮用液体的容器。
8、根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒,其还包括手套。
9、根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒,其还包括用于检测非鳞状细胞标记物的试剂。
10、根据权利要求10所述的试剂盒,其中所述非鳞状细胞标记物是细胞增殖标记物。
11、根据权利要求10所述的试剂盒,其中所述非鳞状细胞标记物是柱状细胞标记物。
12、根据权利要求10所述的试剂盒,其中所述试剂盒还包括用于检测选自下组的至少一种标记物:刷状缘蛋白,如绒毛蛋白或膜组织伸展刺突蛋白;粘蛋白基因;刷状缘酶,如碱性磷酸酶;同源框基因,如Cdx1和/或Cdx2;细胞角蛋白,如柱状细胞的CK8/18;或已知在巴雷特中相对于在正常食管表面细胞中差异表达的任何标记物。
13、根据权利要求10所述的试剂盒,其中所述试剂盒还包括用于检测选自下组的至少一种标记物的试剂:增殖标记物,如Ki67和Mcm蛋白;增殖和DNA损伤标记物,如PCNA;细胞周期蛋白,如细胞周期蛋白D和/或细胞周期蛋白A;异常p53;丧失p16;非整倍体或已知与发育异常程度相关的任何标记物。
14、根据权利要求19所述的试剂盒,其中所述标记物是细胞周期蛋白A。
15、根据权利要求9所述的试剂盒,其中所述标记物是植物凝集素。
16、根据权利要求3所述的试剂盒,其中所述液体是用于产生用于检验取样细胞的载玻片的薄层制备液体。
17、根据权利要求2~16中任一项所述的试剂盒,其中所述局部麻醉剂是喷雾剂或锭剂。
18、辅助诊断受试者中巴雷特食管或与巴雷特相关的发育异常的方法,所述方法包括在所述受试者食管的细胞表面取样,其中所述取样不定向于食管内的特定部位,以及分析细胞的非鳞状细胞标记物,其中检测到所述标记物表明存在巴雷特食管或与巴雷特相关的发育异常的可能性增加。
19、辅助诊断受试者中巴雷特食管或与巴雷特相关的发育异常的方法,所述方法包括分析来自受试者食管表面细胞的非鳞状细胞标记物,其中检测到所述标记物表明存在巴雷特食管或与巴雷特相关的发育异常的可能性增加。
20、根据权利要求18或权利要求19所述的方法,其中所述的非鳞状细胞标记物是细胞增殖标记物。
21、根据权利要求18~20中任一项所述的方法,其中所述的非鳞状细胞标记物是柱状细胞标记物。
22、根据权利要求18~21中任一项所述的方法,其中所述标记物选自刷状缘蛋白,如绒毛蛋白或膜组织伸展刺突蛋白;粘蛋白基因;刷状缘酶,如碱性磷酸酶;同源框基因,如Cdx1和/或Cdx2;细胞角蛋白,如柱状细胞的CK8/18;或已知在巴雷特中相对于在正常食管表面细胞中差异表达的任何标记物。
23、根据权利要求18~21中任一项所述的方法,其中所述标记物选自下组:增殖标记物,如Ki67和Mcm蛋白;增殖和DNA损伤标记物,如PCNA;细胞周期蛋白,如细胞周期蛋白D和/或细胞周期蛋白A;异常p53;丧失p16;非整倍体或已知与发育异常程度相关的任何标记物。
24、根据权利要求23所述的方法,其中所述的标记物是Mcm2或细胞周期蛋白A。
25、根据权利要求24所述的方法,其中所述的细胞周期蛋白A得以分析。
26、根据权利要求24所述的方法,其中Mcm2和细胞周期蛋白A两者都得以分析。
27、根据权利要求18所述的方法,其中对食管的细胞表面取样包括下列步骤:
(i)将含有能够从食管表面收集细胞的研磨材料的可吞咽装置导入受试者体内;
(ii)从食管取出而收回所述装置;以及
(iii)从所述装置收集细胞。
28、根据权利要求18~27中任一项所述的方法,还包括分析细胞的染色体组成,其中检测到异常染色体组型表明发育异常的可能性增加。
29、根据权利要求18~28中任一项所述的方法,还包括分析细胞的p53状态,其中检测到异常p53状态表明发育异常的可能性增加。
30、根据权利要求1~17中任一项所述的试剂盒,其中用于检测巴雷特食管或与巴雷特相关的发育异常的印刷说明书包括根据权利要求18~29中任一项所述的辅助诊断方法。
31、胶囊海绵在诊断巴雷特食管或与巴雷特相关的发育异常中的用途。
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