CN101278056A - 癌性疾病调节抗体 - Google Patents

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CN101278056A CNA2006800366524A CN200680036652A CN101278056A CN 101278056 A CN101278056 A CN 101278056A CN A2006800366524 A CNA2006800366524 A CN A2006800366524A CN 200680036652 A CN200680036652 A CN 200680036652A CN 101278056 A CN101278056 A CN 101278056A
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Abstract

本发明涉及一种利用新型筛选模式来产生患者癌性疾病调节抗体的方法。通过使用癌细胞毒性作用作为指标来分离抗癌抗体，该方法使得生产用于治疗和诊断目的的抗癌抗体成为可能。该抗体可用于辅助癌症的分期和诊断，并可以用于治疗原发性肿瘤和肿瘤转移。该抗癌抗体可以和毒素、酶、放射性化合物及造血细胞偶联。

Description

癌性疾病调节抗体
引用的相关申请
本申请要求2005年8月2日提交的临时申请60/705,242的申请日的权益，将其内容通过引用并入本文。
发明领域
本发明涉及癌性疾病调节抗体(CDMAB)的分离和生产，以及这些CDMAB在治疗和诊断方法中的应用，其可选择地与一种或多种化疗试剂联合使用。本发明还涉及利用本发明的CDMABs进行的结合分析(binding assay)。
发明背景
单克隆抗体作为癌症治疗剂：每一个患有癌症的个体都是独特的，由于个体的差异，每个人所患的癌症与其它癌症都不一样。尽管如此，现有疗法都是以同样的方式来治疗患有相同阶段的同种癌症的患者。这些患者中至少有30％的一线治疗是失败的，从而增加了额外的疗程以及治疗失败、病毒转移和最终死亡的可能性。治疗的优选方法将是针对特定个体的个性化治疗。目前唯一的个性化治疗方法是手术。化疗和放疗无法针对患者做调整，而在大多数情况下单靠手术不足以治愈癌症。
随着单克隆抗体的出现，开发个性化治疗方法的可能性变得更加现实，因为每一抗体能够针对单一的抗原表位(epitope)。而且，也可以生产针对多个抗原表位的集群(constellation)的抗体组合，该抗原表位集群唯一确定了特定个体的肿瘤。
已经认识到癌细胞和正常细胞之间的显著差别是癌细胞含有对转化细胞(transformed cells)来说具有特异性的抗原，科技界长期认为：单克隆抗体能够设计成通过与这些癌抗原特异结合而特异地靶向转化细胞；因此产生了这样的观点：单克隆抗体能够作为“魔术子弹(Magic Bullets)”来消灭癌细胞。然而，现在已经取得广泛共识，没有单一的单克隆抗体可以在所有情况的癌症中发挥作用，并且单克隆抗体可按类来开发，用于目标癌症治疗。结果显示，依照本发明公开的教导分离的单克隆抗体以对患者有益的方式(如通过降低肿瘤负荷)来调节癌症进程，这些抗体在本文中称为癌性疾病调节抗体(CDMAB)或“抗癌”抗体。
目前，癌症患者的治疗选择很少。***化的癌症治疗方法已经改善了全球的存活率和发病率。然而，对于特定个体而言，这些改善的统计数据与他们个人状况的改善并没有必然的联系。
因此，如果提出一种方法学使得医师能够在同类肿瘤患者中，独立于其他患者治疗每例肿瘤，将使得对每个患者可以用适合自己的独特方法进行治疗。理论上，这种治疗过程将提高治愈率，产生更好的结果，从而满足人们长期感受到的需要。
过去，多克隆抗体已经被应用于人类癌症的治疗，但只取得了有限的成功。已经用人血浆来治疗淋巴瘤和白血病，但是很少获得持久的改善或应答。而且，缺乏重现性，相比化疗也没有额外的优点。实体瘤(如乳癌、黑素瘤和肾细胞癌)也已经采用人血液、猩猩血清、人血清和马血清来治疗，但是相应的结果是不确定的和无效的。
有很多用单克隆抗体治疗实体瘤的临床实验。在20世纪80年代，利用抗特异抗原或基于组织选择性的抗体对人乳腺癌进行了至少4次临床实验，在至少47例患者中只产生了1例应答者。直至1998年才有成功的临床实验，该实验联合使用了人源化抗-Her2/neu抗体(Herceptin
Figure A20068003665200071
)与顺铂。在这次实验中，37例患者有应答，其中约1/4具有部分应答率，另外1/4病情发展轻微或稳定。应答者中，中位进展时间(median time to progression)是8.4个月，而中位反应持续时间(median response duration)是5.3个月。
Herceptin在1998年获得批准，与Taxol联合用于一线治疗。临床研究结果显示，与单独接受Taxol
Figure A20068003665200074
的组(3.0个月)相比，接受抗体治疗以及Taxol
Figure A20068003665200075
的患者(6.9个月)的中位疾病进展时间延长。且中位存活时间也有小幅提高；Herceptin联合Taxol治疗对比Taxol
Figure A20068003665200078
单独治疗为22个月比18个月。此外，抗体加Taxol
Figure A20068003665200079
联合组相比Taxol
Figure A200680036652000710
单独组，完全应答者(8％比2％)和部分应答者(34％比15％)的数量均有所上升。然而，Herceptin联合Taxol
Figure A200680036652000712
治疗相比Taxol
Figure A200680036652000713
单独治疗，会导致更高的心脏毒性(cardiotoxicity)发生率(分别为13％比1％)。并且，Herceptin
Figure A20068003665200081
治疗仅对过表达(通过免疫组织化学(IHC)分析测定的)人表皮生长因子受体2(Her2/neu)(目前尚没有已知的功能或生物学重要的配体的受体)的患者有效；约占患有转移性乳癌患者的25％。因此，对于患有乳癌的患者，仍然存在很大的未获满足的需求。甚至那些可得益于Herceptin
Figure A20068003665200082
治疗的患者也需要进行化疗，因此至少某种程度上也必须处理这种治疗的副作用。
研究结肠直肠癌的临床实验涉及同时抗糖蛋白和糖脂类靶标的抗体。对腺癌有一定特异性的抗体，如17-1A，已经在超过60例的患者中进行了2期临床实验，其中仅有1例患者有部分应答。在其他应用17-1A的实验中，在使用附加的环磷酞胺的实验方案中，52例受试患者中仅有1例完全应答和2例轻微应答。至今，17-1A的III期临床实验尚未证明作为III期结肠癌的辅助治疗时具有提高的功效。首次批准用于显像诊断的人源化的鼠单克隆抗体也没有产生肿瘤消退。
只是到最近，使用单克隆抗体进行的结肠直肠癌临床研究才得到了一些正面的结果。在2004年，ERBITUX
Figure A20068003665200083
被批准用于患有表达EGFR的转移性结肠直肠癌患者的二线治疗，这些患者用基于伊立替康的化疗难以医治。双臂II期临床研究和单臂研究的结果显示ERBITUX
Figure A20068003665200084
联合伊立替康分别具有23％和15％的反应率，中位疾病进展时间分别为4.1和6.5个月。来自同一双臂II期临床研究和另一单臂研究的结果显示，单独用ERBITUX
Figure A20068003665200085
进行治疗分别产生11％和9％的反应率，中位疾病进展时间分别为1.5和4.2个月。
因此，ERBITUX
Figure A20068003665200086
联合伊立替康治疗在瑞士和美国，以及ERBITUX
Figure A20068003665200087
单独治疗在美国都获得批准，作为一线伊立替康治疗失败的结肠癌患者的二线治疗。因此，与Herceptin
Figure A20068003665200088
一样，ERBITUX在瑞士仅批准作为单克隆抗体与化疗联合应用。并且，在瑞士和美国，ERBITUX
Figure A200680036652000810
仅批准作为患者的二线治疗。同样，在2004年，AVASTIN被批准与基于静脉注射5-氟尿嘧啶的化疗联合作为转移性结肠直肠癌的一线治疗。III期临床研究结果证明，用AVASTIN联合5-氟尿嘧啶治疗的患者相比单独用5-氟尿嘧啶治疗的患者，中位存活时间延长(20个月相比16个月)。然而，还是与Herceptin
Figure A200680036652000813
和ERBITUX
Figure A200680036652000814
一样，AVASTIN
Figure A200680036652000815
仅批准作为单克隆抗体与化疗的联合应用。
对肺癌、脑癌、卵巢癌、胰腺癌、***癌和胃癌的结果仍然很差。近期最有希望的对非小细胞肺癌的结果来自II期临床实验，其中所述治疗采用与细胞杀伤药阿霉素偶联的单克隆抗体(SGN-15；dox-BR96，抗-Sialyl-LeX)联合化疗剂TAXOTERE
Figure A20068003665200091
。TAXOTERE
Figure A20068003665200092
是唯一获得FDA批准用于肺癌二线治疗的化疗剂。初始数据表明，相比单独的TAXOTERE，总存活提高。在参与研究的62例患者中，2/3接受SGN-15联合TAXOTERE
Figure A20068003665200094
，剩余的1/3单独接受TAXOTERE
Figure A20068003665200095
。对于接受SGN-15联合TAXOTERE
Figure A20068003665200096
的患者，中位总体存活时间为7.3个月，相比之下，单独接受TAXOTERE
Figure A20068003665200097
的患者为5.9个月。总存活在1年和18个月的，对接受SGN-15联合TAXOTERE
Figure A20068003665200098
的患者分别为29％和18％，而对单独接受TAXOTERE
Figure A20068003665200099
的患者分别为24％和8％。已策划了进一步的临床实验。
在临床使用前，使用单克隆抗体治疗黑素瘤取得了有限的成功。这些抗体中非常少的种类达到了临床实验，且至今没有一种获得批准，或者在III期临床实验中证明具有有益的结果。
由于无法鉴定与疾病发病机理有关的30,000种已知基因的产物中的相关靶标，治疗疾病的新药的开发受阻。在肿瘤学研究中，通常简单地根据在肿瘤细胞中过表达的事实来选择潜在的药物靶标。随后，根据与众多化合物的相互反应来对由此鉴定的靶标进行筛选。在潜在的抗体治疗中，这些候选化合物通常源自根据Kohler和Milstein(1975，Nature，256，495-497，Kohler和Milstein)提出的基本原则产生单克隆抗体的常规方法。从以抗原免疫的小鼠收集脾细胞(例如全细胞、细胞碎片、纯化的抗原)，并将其与永生化(immortalized)杂交瘤配偶体(partner)融合。根据抗体的分泌来对所得杂交瘤进行筛选和选择，其中该抗体与所述靶标的结合最强烈。使用这些方法产生、并基于其亲合性选择了许多抗肿瘤细胞的治疗和诊断抗体，包括Herceptin
Figure A200680036652000910
和RITUXIMAB。这种策略的缺点是两重的。首先，对治疗或诊断抗体结合的适当靶标的选择受到关于组织特异致癌过程的知识匮乏及由此产生的鉴定这些靶标的简单方法(例如通过过表达选择)的限制。其次，以最大亲合性结合至受体的药物分子通常有最大的可能性启动或抑制信号这一假设并不总是成立。
尽管在乳癌和结肠癌治疗上取得了一些进展，有效抗体治疗的鉴定和开发对各种癌症而言都是不够的，不管是作为单一试剂还是联合治疗。
现有专利：
美国专利US 5,750,102公开了一种方法用MHC基因转染患者肿瘤细胞的方法，该MHC基因可以从患者的组织或细胞中克隆。然后用这些经转染的细胞对患者进行接种。
美国专利US 4,861,581公开了一种方法，该方法包括如下步骤：获得单克隆抗体，该抗体对哺乳动物的肿瘤细胞及正常细胞的内部细胞成分有特异性而对外部成分没有特异性；标记单克隆抗体；将标记的抗体与已经接受过肿瘤细胞杀灭治疗的哺乳动物的组织接触；以及通过测定标记抗体与退化肿瘤细胞的内部细胞成分的结合来确定治疗的效果。在制备靶向人细胞内抗原的抗体的过程中，专利权人认识到癌细胞是这类抗原的一个方便来源。
美国专利US 5,171,665提供了一种新型抗体和该抗体的生产方法。具体地，该专利讲述了单克隆抗体的制备，所述单克隆抗体具有与人肿瘤(如结肠和肺)相关蛋白抗原牢固结合的性质，而与正常细胞的结合程度要小得多。
美国专利US 5,484,596提供了一种癌症的治疗方法，该方法包括：手术去除人类癌症患者的肿瘤组织；处理肿瘤组织以获得肿瘤细胞；照射肿瘤细胞，使其存活但没有致瘤性质；以及用这些细胞为患者制备疫苗，该疫苗能够抑制原发性肿瘤的复发并同时抑制病灶转移。该专利公开了与肿瘤细胞表面抗原具有反应性的单克隆抗体的研制。如第4栏第45行等处说明，专利权人在开发对人类肿瘤表现活性特异的免疫治疗的单克隆抗体的过程中，利用了自体肿瘤细胞。
美国专利US 5,693,763讲述了人类癌细胞的糖蛋白抗原特性，其不依赖于原发的上皮组织。
美国专利US 5,783,186涉及诱导Her2表达细胞凋亡的抗Her2抗体、产生该抗体的杂交瘤细胞系，使用该抗体和含有所述抗体的药物组合物治疗癌症的方法。
美国专利US 5,849,876描述了用于生产单克隆抗体的新型杂交瘤细胞系，所述抗体针对从肿瘤和非肿瘤组织来源中提纯的粘蛋白抗原。
美国专利US 5,869,268涉及产生人淋巴细胞的方法，该淋巴细胞产生对目标抗原具有特异性的抗体，同时涉及生产单克隆抗体的方法，及由该方法生产的单克隆抗体。该专利特别涉及用于诊断和治疗癌症的抗HD人单克隆抗体的生产。
美国专利US 5,869,045涉及与人体癌细胞有反应性的抗体、抗体片段、抗体偶联物和单链免疫毒素。这些抗体功能的机理是双重的，因为这些抗体一方面与人体癌表面的细胞膜抗原具有反应性，另外这些抗体还能够内在化入癌细胞中，随后结合，使它们特别适用于形成抗体-药物和抗体-毒素结合物。在未修饰形式时，所述抗体在特定浓度下也表现出细胞毒性质。
美国专利US 5,780,033公开了自体抗体用于肿瘤治疗和预防。不过，该抗体是从成年哺乳动物中得到的抗细胞核自体抗体。这里，自体抗体是指在免疫***中发现的一种天然抗体。因为自体抗体来源于“成年哺乳动物”，因此就不要求自体抗体真正来源于受治患者。此外，该专利公开了来自成年哺乳动物的天然的单克隆抗细胞核自体抗体以及生成单克隆抗细胞核自体抗体的杂交瘤细胞系。
发明概述
本发明采用了专利US 6,180,357中讲述的生产患者特异性抗癌抗体的方法，用以分离编码癌症调节单克隆抗体的杂交瘤细胞系。可以为一种肿瘤而专门制备这些抗体，从而使癌症治疗的个性化成为可能。在本申请公开的内容中，具有细胞杀灭(细胞毒素的)或细胞生长抑制(细胞生长抑制的)性能的抗癌抗体将在下文中被称为细胞毒。这些抗体用于帮助癌症的分期和诊断，也可用于***转移。这些抗体也可通过预防性治疗的方式用于癌症预防。与根据常规药物开发范例产生的抗体不同，以这种方式产生的抗体可靶向先前未显示为恶性组织的生长和/或存活所需的分子和路径。并且，这些抗体的结合亲合性满足了启动细胞毒性作用事件的要求，而这种细胞毒性作用事件可能不顺从更强的亲合性相互作用。并且，将标准化疗形式(例如放射性核)与本发明的CDMAB结合，从而使所述的化疗作用集中也属于本发明的范围。所述CDMAB也可与毒素、细胞毒性部分(moiety)、诸如生物素偶联酶的酶类、或者造血细胞偶联，从而形成抗体偶联物。
个性化抗癌治疗的前景将给患者的治疗方式带来变化。一种可能的临床情境是在肿瘤出现时就取样并入库。根据该样品，能够通过预存的癌性疾病调节抗体库对该肿瘤进行分类。对肿瘤患者进行常规分期，而所提供的抗体可用于患者的进一步分期。可以用现有的抗体立即对患者进行治疗，肿瘤特异的抗体库可以使用本发明公开的方法来产生，也可以使用噬菌体展示库结合本发明公开的筛选方法来产生。生成的所有抗体将被添加入抗癌抗体库，因为可能其它肿瘤具有某些与被治疗的肿瘤相同的抗原表位。根据本方法生产的抗体可以用于治疗许多患者的癌性疾病，这些患者患有与这些抗体结合的癌症。
除了抗癌抗体外，患者可以选择接受当前推荐的治疗方法作为多重疗法的一部分。本发明方法分离的抗体对非癌细胞相对无毒性的事实使得高剂量抗体可单独使用，或与常规疗法的结合使用。高治疗指数也使得可在短期内再次治疗，从而降低出现治疗耐受细胞的可能性。
如果患者的初期治疗产生耐药性或发生了转移，则可以重复肿瘤特异抗体生成过程来进行再次治疗。而且，抗癌抗体可以和取自患者的红细胞偶联，并再次注入来治疗病灶转移。目前对转移癌症的有效治疗很少，转移通常预示着导致死亡的糟糕结果。不过，转移的肿瘤通常血管丰富，通过红细胞进行的抗癌抗体输送具有将抗体聚集在肿瘤位置的作用。甚至在转移前，大多数癌细胞也依靠宿主血液供应来存活，而与红细胞结合的抗癌抗体对原位肿瘤同样有效。可选择地，抗体可以和其它造血细胞偶联，如淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞、自然杀伤细胞等等。
存在五类抗体，每类抗体都具有由其重链赋予的功能。通常认为裸露抗体(naked antibodies)的癌细胞杀伤作用是由抗体依赖性细胞毒性作用或补体依赖性细胞毒性作用介导的。例如，鼠IgM和IgG2a抗体能够通过与补体***中的C-1组分结合来激活人补体，从而激活补体活化的典型途径，这能导致肿瘤细胞裂解。对于人抗体，最有效的补体激活抗体通常是IgM和IgG1。IgG2a和IgG3同种型的鼠抗体可有效俘获具有Fc受体的细胞毒性作用细胞，其导致单核细胞、巨噬细胞、粒细胞和某些淋巴细胞的细胞杀伤作用。IgG1和IgG3同种型的人抗体都介导ADCC。
抗体介导的癌杀伤作用的另一种可能的机制可以是具有催化功能的抗体(即所谓的催化抗体)的使用，该抗体能催化细胞膜及与其结合的糖蛋白或糖脂中的化学键的水解。
还有其它三种抗体介导癌细胞杀伤的机理。第一种是利用抗体作为疫苗来诱导机体对肿瘤细胞表面的推定抗原产生免疫反应。第二种是利用抗体来靶向生长受体、并干扰其功能或下调该受体以使其功能有效丧失。第三种是这类抗体对细胞表面部分的直接连接(ligation)的作用，其可导致直接细胞死亡，例如诸如TRAIL R1或TRAIL R2的死亡受体、或诸如αVβ3的整联蛋白分子等等的连接。
肿瘤药物的临床应用基于该药物在可接受的风险评估之下对患者的益处。在癌症的治疗中，存活率通常是所寻求的最重要的益处，但是除了延长寿命外，还有许多其它公认的益处。在治疗对存活没有负面影响的情况下，这些其它益处包括症状的减轻、防止负面效果、延长复发周期或无瘤存活时间、和延长疾病进程。这些标准被普遍接受，并且诸如美国食品药品管理局(F.D.A.)的管理机构批准了能产生这些益处的药物(Hirschfeld等，Critical Reviews inOncology/Hematology 42：137-1432002)。除了这些标准外，人们充分认识到还有其他指标可以预示这些类型的益处。部分地，美国FDA批准的快速审批程序确认了有替代者可能预测患者受到的益处。到2003年末，有16种药物被批准进入这个程序，其中四个已经进入全面审批，即后续研究验证了替代指标所预示的直接的患者受益。确定实体瘤药物疗效的一个重要指标是通过测试治疗反应来评价肿瘤负荷(Therasse等，Journal of the National Cancer Institute92(3)：205-2162000)。这种评价的临床标准(RECIST标准)已经由实体瘤疗效评价标准工作组(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors Working Group)颁布，该工作组由国际癌症专家组成。和参照RECIST标准的客观反应所显示的一样，与适当的对照组相比，对肿瘤负荷有确切效果的药物易于最终产生直接的患者受益。在临床前条件下，肿瘤负荷通常更容易被评估和记录。既然临床前研究可以转化为临床条件，在临床前模型中产生存活延长的药物具有最大的预期临床效用。与对临床治疗产生的积极反应类似，在临床前条件下降低肿瘤负荷的药物也可能对疾病具有显著的直接影响。尽管延长存活期是癌症药物治疗所追求的最重要的临床结果，但是还有其他益处具有临床效用，显然肿瘤负荷的降低(其可伴有疾病发展的延迟、延长的存活期或两者并存)也能够导致直接的益处、并具有临床效果(Eckhardt等，Developmental Therapeutics：Successesand Failures of Clinical Trial Designs of Targeted Compounds(发展的治疗学：靶化合物的临床试验设计的成功与失败)；ASCO Educational Book，39th AnnualMeeting，2003，209-219页)。
本发明描述了根据在细胞毒性作用分析及人癌症动物模型中的作用而鉴定得到的AR62A335.9的开发和应用。本发明描述了特异结合靶分子上的一个抗原表位或多个抗原表位的试剂，其作为裸抗体还对恶性肿瘤细胞而非正常细胞具有体外细胞毒性作用，并且也可作为裸抗体直接介导肿瘤生长的抑制。更进一步描述了诸如这种抗体的抗癌抗体的用途，所述用途为靶向表达同源抗原标记物的肿瘤以实现对肿瘤生长的抑制及癌症治疗的其它阳性指标。
总而言之，本发明讲述了AR62A335.9抗原作为治疗剂的靶标的用途，所述治疗剂给药后能降低哺乳动物中的表达该抗原的癌症的肿瘤负荷。本发明还讲述了CDMAB(AR62A335.9)、其衍生物、其抗原结合片段及其细胞毒性作用诱导配体的用途，所述用途为靶向其抗原以降低哺乳动物中的表达所述抗原的癌症的肿瘤负荷。此外，本发明还讲述了癌细胞中的AR62A335.9抗原检测的用途，其可用于患有表达该抗原的肿瘤的哺乳动物的诊断、治疗预测和预后。
因此，本发明的目的是利用一种方法来产生抗来源于特定个体的癌细胞、或者一种或多种特定癌细胞系的癌性疾病调节抗体(CDMAB)，该CDMAB对癌细胞有细胞毒性作用，同时对非癌细胞相对无毒，目的是分离杂交瘤细胞系及所述杂交瘤细胞系所编码的相应的分离的单克隆抗体及其抗原结合片段。
本发明的另一个目的是涉及癌性疾病调节抗体、其配体及抗原结合片段。
本发明的另一个目的是产生癌性疾病调节抗体，该抗体的细胞毒性作用通过抗体依赖的细胞毒性作用来介导。
本发明的另一个目的是产生癌性疾病调节抗体，该抗体的细胞毒性作用通过补体依赖的细胞毒性作用来介导。
本发明的另一个目的是产生癌性疾病调节抗体，该抗体的细胞毒性作用是其催化细胞化学键水解的能力的作用。
本发明的另一个目的是产生癌性疾病调节抗体，该抗体可用于癌症诊断、预后和监测的结合试验。
通过以下以示例和举例的方式、对本发明某些实施方案的描述，本发明的其它目的和优点将变得显而易见。
附图简要说明
图1比较了杂交瘤上清对细胞系MDA-MB-231、OVCAR-3、SW1116、Lovo和CCD-27sk的细胞毒性作用百分比和结合水平。
图2显示了AR62A335.9和抗-EGFR对照对癌细胞系和正常细胞系的结合。数据制成表格，以高出同种型对照的倍增显示平均荧光强度。
图3包括了针对几种癌细胞和非癌细胞系的AR62A335.9和抗-EGFR抗体的代表性FACS直方图。
图4说明了AR62A335.9在预防性Lovo结肠癌模型中对肿瘤生长的影响。垂直线(vertical line)表示抗体给药时间。数据点表示平均值+/-标准误。
图5说明了AR62A335.9在预防性Lovo结肠癌模型中对体重的影响。数据点表示平均+/-SEM。
图6说明了AR62A335.9在预防性DLD-1结肠癌模型中对肿瘤生长的影响。垂直线(vertical line)表示抗体给药时间。数据点表示平均值+/-标准误。
图7说明了AR62A335.9在预防性DLD-1结肠癌模型中对体重的影响。数据点表示平均+/-SEM。
图8说明了AR62A335.9在已建立的Lovo结肠癌模型中对肿瘤生长的影响。垂直线(vertical line)表示抗体给药时间。数据点表示平均值+/-标准误。
图9说明了AR62A335.9在已建立的Lovo结肠癌模型中对体重的影响。数据点表示平均值+/-标准误。
发明的详细说明
一般而言，下列词汇或短语出现在发明内容、发明说明、实施例和权利要求中时具有所给的定义。
术语“抗体”使用其最宽泛的含义，并特别包括例如单种单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂和中和抗体、去免疫的、鼠源的、嵌合的或人源化的抗体)、具有多抗原表位特异性的抗体组合物、单链抗体、抗体的免疫结合物和片段(见下)。
本文使用的术语“单克隆抗体”指从基本同质的抗体群(即构成该群的抗体个体除少量可能自然出现的变异外完全相同)中得到的抗体。单克隆抗体是高特异性的，靶向单一的抗原位点。并且，相比包含靶向不同决定簇(抗原表位)的多种不同抗体的多克隆抗体制剂，每种单克隆抗体靶向抗原上的单一决定簇。除特异性外，单克隆抗体的优点还在于其合成可以不受其他抗体的污染。修饰语“单克隆”指所述抗体得自基本同质的抗体群的特性，而不应理解为需要采用任何特定的方法来生产该抗体。例如，本发明使用的单克隆抗体可通过首次由Kohler等人公开的杂交瘤(鼠或人)方法(Nature，256：495(1975))来制备，或者通过重组DNA方法(参见，例如美国专利第4,816,567号)来制备。还可使用例如Clackson等人(Nature，352：624-628(1991))和Marks等人(J.MoI.Biol，222：581-597(1991))描述的技术，从噬菌体抗体库中分离所述“单克隆抗体”。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选包括所述抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括少于全长抗体，Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双功能抗体(diabodies)；线性(linear)抗体；单链抗体分子；单链抗体，单域抗体分子，融合蛋白、重组蛋白和由抗体片段形成的多特异抗体。
“完整”抗体是包括抗原结合可变区，以及轻链恒定区(CL)和重链恒定区CH1，CH2和CH3的抗体。所述恒定区可以是天然序列恒定区(如人天然序列恒定区)或其氨基酸序列变体。优选地，所述完整抗体具有一种或多种效应器(effector)功能。
根据其重链的恒定区的氨基酸序列，完整抗体可分为不同的“类型”。有五种主要的完整抗体类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几种可进一步划分为“亚类”(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。不同抗体类型对应的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类型的免疫球蛋白的亚单元结构和三维构型是公知的。
抗体“效应器功能”指由抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)导致的生物学活动。抗体效应器功能的例子包括C1q结合；补体依赖的细胞毒性作用；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体的下调(例如B细胞受体；BCR)等等。
“抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用”及“ADCC”指一种细胞介导的反应，在该反应中表达Fc受体(FcRs)的非特异性细胞毒性作用细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，并进而导致靶细胞的裂解。介导ADCC的主要细胞，NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol9：457-92(1991)第464页表3种总结了造血细胞的FcR表达。为了评估所关注的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC分析，例如美国专利5,500,362或5,821,337中所描述的那样。用于这类分析的效应器细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。可选择或者附加地，可在体内评估所关注分子的ADCC活性，例如在诸如Clynes等PNAS(USA)95：652-656(1998)公开的动物模型中。
“效应器细胞”是表达一种或多种FcRs，并执行效应器功能的白细胞。优选地，所述细胞至少表达FcγRIII，并执行ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性作用T细胞和嗜中性粒细胞；优选PBMCs和NK细胞。如本文所述，可从其天然来源例如从血液或PBMCs中分离效应器细胞。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述结合至抗体的Fe区的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体(伽马受体)，并包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类受体的受体，包括这些受体的等位变体(allelicvariant)和可变剪切形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，这两种形式具有类似的氨基酸序列，区别主要在其细胞质区。活化受体FcγRIIA在其细胞质区包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质区包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见Daeron，Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997)中的综述M)。在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)；Capel等，Immimomethods4：25-34(1994)；和de Haas等，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)中对FcRs进行了综述。其它FcRs，包括将在以后鉴定出的那些，都包括在本文的术语“FcR”中。该术语还包括新生受体，FcRn，其参与了母体IgGs到胎儿的转移(Guyer等，J.Immunol.117：587(1976)和Kim等，Eur.J.Immunol.24：2429(1994))。
“补体依赖的细胞毒性作用”或“CDC”指分子在补体存在下使靶标裂解的能力。补体体系C1q的第一组分对与同源抗原复合的分子(例如抗体)的结合启动了补体活化途径。为了评估补体活化，可进行CDC分析，例如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中描述的那样。
术语“可变的”指抗体之间可变区某些部分的序列具有广泛差别，且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的事实。然而，变异并不是平均分布在抗体的整个可变区中。其集中在轻链和重链可变区中的三个称为高变区的区段内。可变区中更高度保守的部分称为框架区(FRs)。天然重链和轻链的可变区均包括通过三个高变区连接的四个FRs(主要采用β折叠构型)，形成环形连接，并且在某些情况下形成＞折叠结构的一部分。每一链的高变区通过FRs紧密连接在一起，并且，与其它链的高变区一起，形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学目标蛋白的序列)，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.pp15-17；48-53(1991))。恒定区不直接参与抗体对抗原的结合，但显示出各种效应器功能，例如抗体在抗体依赖的细胞毒性作用(ADCC)中的参与。
本文使用的术语“高变区”指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。所述高变区通常包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变区的残基24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)，以及重链可变区的残基31-35(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(免疫学目标蛋白的序列)，第五版.Public Health Service，National Institutesof Health，Bethesda，Md.pp 15-17；48-53(1991))和/或来自“高变环(hypervariableloop)”的那些残基(例如轻链可变区的残基2632(L1)，50-52(L2)和91-96(L3)，以及重链可变区的残基26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk J.MoI.Biol.196：901-917(1987))。“框架区”或“FR”残基是除本文定义的高变区残基之外的那些可变区残基。抗体的木瓜蛋白酶消化产生了两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段)和残余的“Fc”片段，其中每一“Fab”片段都有单一的抗原结合位点，而Fc”片段的名称反映了其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生了F(ab′)2片段，其具有两个抗原结合位点，并且仍然能够交联抗原。
“Fv”是包含完整的抗原识别和抗原结合位点的最小的抗体片段。该区由以紧密、非共价结合的一条重链与一条轻链可变区的二聚体构成。每一可变区的三个高变区在该构型中相互作用限定了VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。这六个高变区共同赋予了所述抗体抗原结合特异性。然而，即使单个可变区(或仅包含对抗原具有特异性的三个高变区的半个Fv)同样具有识别和结合抗原的能力，尽管亲合性比整个结合位点要低。所述Fab片段还包含轻链的恒定区和重链的第一恒定区(CH1)。Fab′片段与Fab片段的区别在于在重链CH1区的羧基末端增加了几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。本文将恒定区的半胱氨酸残基上带有至少一个自由巯基的Fab′称为Fab′-SH。F(ab′)2抗体片段最初是由其间具有铰链半胱氨酸的Fab′片段对产生的。抗体片段的其它化学偶合也是公知的。
根据其恒定区的氨基酸序列，任何脊椎动物抗体的“轻链”都可以分入两种明显不同类型(称为kappa(κ)和lambda(λ))中的一类。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL区，其中这些区存在于单一多肽链上。优选地，Fv多肽还包含位于所述VH和VL区之间的多肽连接子(linker)，其使得该scFv能形成所需的抗原结合结构。scFv的综述参见Plückthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies(单克隆抗体药理学)，vol.113，Rosenburg and Moore eds.，Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)。
术语“双功能抗体(Diabodies)”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段在同一多肽链中包含与轻链可变区(VL)相连的重链可变区(VH)(VH-VL)。通过使用使同一链上的两个区之间无法配对的短连接子，这些区被迫与另一条链的互补区配对，并产生两个结合位点。在例如EP 404,097、WO 93/11161和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，90：6444-6448(1993)中对双功能抗体进行了更充分的描述。
“分离的”抗体指已经从其天然环境成分中鉴定并分离和/或回收的抗体。其天然环境中的污染组分是会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶解物。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为缺乏所述抗体的天然环境中的至少一种组分。然而，通常通过至少一个纯化步骤来制备分离的抗体。
“结合”目标抗原的抗体是能够以足够的亲合性结合该抗原的抗体，从而使该抗体用做靶向表达该抗原的细胞的治疗或诊断试剂。当抗体是结合抗原部分的抗体时，它通常优先结合该抗原部分，而不是其它受体，并且不包括与诸如非特异型Fc接触的偶然结合或与其它抗原共有的翻译后修饰物的结合，并且可以是与其它蛋白没有明显的交叉反应的抗体。检测结合目标抗原的抗体的方法是本领域公知的，包括但不限于诸如FACS、细胞ELISA和Western印迹的分析。
本文中使用的表达“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可相互替换，并且这些名称均包括子代(progeny)。并且，可以理解，由于人为或无意的突变，并不是所有子代在DNA成分上都精确地相同。在原始转化细胞内筛选的具有相同的功能或生物活性的变异子代也包括在内。从使用这些不同名称的描述中可以明显看出这一点。
“治疗”指治疗性的治疗、以及预防或防止性的方法，目的是防止或减缓(减轻)目标病理疾病状态或病症。需要治疗的对象包括已经患有该病症的患者、以及倾向于患上该病症的对象，或者需要预防该病症的对象。因此，本文中待治疗的哺乳动物可以是诊断为患有该病症，或者倾向于或易于感染该病症。
术语“癌症”和“癌性(的)”指或描述哺乳动物的一种生理状态，其特征通常在于不受调控的细胞生长或死亡。癌症的例子包括，但不限于，癌瘤、淋巴瘤、胚细胞癌、肉瘤和白血病或恶性淋巴肿瘤。这类癌症的更具体的例子包括鳞状细胞癌(例如鳞状上皮细胞癌)，肺癌包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌，腹膜癌、肝细胞癌、胃癌包括胃肠癌、胰腺癌、恶性胶质瘤、***、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞癌(hepatoma)、乳癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾或肾脏癌症、***癌、***癌、甲状腺癌、肝脏癌症、***癌症、***癌症、以及头和颈部癌症。
“化疗剂”是用于癌症治疗的化学化合物。化疗剂的例子包括诸如噻替派和环磷酰胺(CYTOXANTM)的烷基化试剂类；诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡的烷基磺酸酯类；诸如苄替派(benzodopa)、卡巴醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)的氮丙啶类；包括六甲蜜胺、三亚胺嗪、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三甲基奥罗蜜胺(trimethylolomelamine)的氮丙啶类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamine)；诸如瘤可宁、萘氮芥、环磷酰胺、磷雌氮芥、异磷酰胺、双氯乙基甲胺、双氯乙基甲胺氧化物盐酸盐、美法仑、新氮芥、苯乙酸氮芥胆甾醇酯、泼尼莫司汀、氯乙环磷酰胺、尿嘧啶氮芥的氮芥类；诸如卡氮芥、氯脲菌素、佛替姆丁、罗莫司丁、尼莫司丁、雷莫司汀的硝脲类(nitrosureas)；诸如阿克拉霉素类、放射菌素、安曲霉素、偶氮霉素A、博来霉素类、放线菌素C、刺孢霉素、洋红霉素、碳霉素(carnomycin)、嗜癌霉素、色霉素类、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-羰基-L-己氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、密吐霉素类、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素类、派来霉素、泊非霉素、嘌罗霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、新制癌菌素、佐柔比星的抗生素类；诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)的抗代谢剂类；诸如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、曲美沙特的叶酸类似物类；诸如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤的嘌呤类似物类；诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿核甙、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟脲嘧啶脱氧核苷、5-FU的嘧啶类似物类；诸如卡普睾酮、屈他雄酮、环硫雄醇、环戊缩环硫雄烷、睾内酯的雄性激素类；诸如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦的抗肾上腺类；诸如亚叶酸的叶酸补充剂；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；elformithine；醋酸羟哔咔唑；环氧甘醚；硝酸镓；羟基脲；蘑菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK
Figure A20068003665200211
雷佐生；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(″Ara-C″)；环磷酰胺；塞替派；诸如紫杉醇(TAXOL
Figure A20068003665200212
Bristol-MyersSquibb Oncology，Princeton，N.J.)和多西紫杉醇(TAXOTERE
Figure A20068003665200213
Aventis，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)的紫杉烷类；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；诸如顺铂和卡铂的铂类似物类；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺消灵；替尼泊苷；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维A酸；esperamicins；卡培他滨；和上述试剂中的任意试剂的药物可接受的盐类、酸类或衍生物。该定义中还包括抗激素剂，其调节或抑制激素对肿瘤的作用，例如包括如他莫昔芬、雷洛昔芬、抑制4(5)-咪唑的芳香酶、4-羟泰米芬、曲沃昔芬、雷诺昔芬(keoxifene)、LY117018和托瑞米芬(Fareston)的抗***；和诸如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、醋酸亮丙瑞林和戈舍瑞林的抗雄激素，以及上述试剂中任意试剂的药物可接受的盐类、酸类或衍生物。
作为治疗目标的“哺乳动物”指归类为哺乳动物的任何动物，包括人类、鼠类、SCID鼠或裸鼠或品系小鼠、家畜和农场动物，以及动物园、运动或宠物型动物，例如羊、狗、马、猫、牛等等。优选地，本文所述的哺乳动物是人。
“寡核苷酸”是短长度的单链或双链多聚脱氧核苷酸，其通过公知方法(例如磷酸三酯、亚磷酸酯或亚磷酰胺化学)使用诸如1988年5月4日公开的EP266,032中描述的固相技术，或者通过Froehler等，Nucl.Acids Res.，14：5399-5407，1986描述的脱氧核苷酸H-膦酸酯中间体化学合成。然后在聚丙烯酰胺凝胶上对其进行纯化。
“嵌合”抗体是免疫球蛋白，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类型或亚类的抗体的对应序列相同或同源，而链上的其余部分与衍生自其它物种或属于其它抗体类型或亚类的抗体以及这类抗体的片段(只要其显示所需的生物学活性)的对应序列相同或同源(美国专利4,816,567和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。
非人(如鼠)抗体的“人源化”形式是特定的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如抗体的Fv、Fab、Fab’、F(ab)2或其它抗原结合序列)，其包含衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。很大程度上，人源化的抗体是人免疫球蛋白(受者抗体(recipient antibody))，其中来自受者抗体的互补决定区(CDRs)的残基被来自非人物种(如小鼠、大鼠或兔子)的(供者抗体)、具有所需特异性、亲合性和能力的CDRs的残基所替代。在某些例子中，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人FR残基所替代。并且，人源化的抗体可包含在受者抗体及引入的CDR或FR序列中均未发现的残基。制备这些修饰体来进一步改善和优化抗体性能。通常，人源化的抗体包含至少一个、通常两个可变区的基本全部残基，其中全部或基本全部的CDR区对应于非人免疫球蛋白的残基，而全部或基本全部的FR残基是人免疫球蛋白一致序列的残基。优选地，人源化的抗体还包含免疫球蛋白(通常是人免疫球蛋白)的恒定区(Fc)的至少一部分。
“去免疫的”抗体是对给定物种不产生免疫原性的或免疫原性较低的免疫球蛋白。可通过改变抗体的结构来实现去免疫化。可采用任何本领域技术人员公知的去免疫技术。例如，2000年6月15日公开的WO 00/34317中描述了一种适用于对抗体进行去免疫的技术。
诱导“细胞凋亡”的抗体是通过任何方式诱导程序性细胞死亡的抗体，这些方式例如，但不限于，膜联蛋白V结合、半胱天冬酶活性、DNA碎裂、细胞收缩、内质网膨胀、细胞碎裂和/或膜囊(称为凋落小体)形成。
在整个说明书中，可相互替换地用内部名称AR62A335.9或保藏名称IDAC170505-05来称呼杂交瘤细胞系，以及由其产生的分离的单克隆抗体。
本文使用的“抗体-配体”包括对靶抗原的至少一个抗原表位显示出结合特异性的部分，其可以是完整的抗体分子、抗体片段及至少具有一个抗原结合区或其部分(即抗体分子的可变区)的任何分子，例如特异地识别和结合抗原(IDAC170505-05抗原)的至少一个抗原表位的Fv分子、Fab分子、Fab′分子、F(ab′)2分子、双特异性抗体、融合蛋白或任一基因工程分子，其中所述抗原被称为IDAC 170505-05的杂交瘤细胞系产生的分离的单克隆抗体结合。
本文使用的“癌性疾病调节抗体”(CDMAB)指以有利于患者的方式，例如通过降低肿瘤负荷或延长患有肿瘤的个体的存活，来调节癌症进程的单克隆抗体及其抗体配体。
本文使用的“抗体结合区”指识别靶抗原的分子部分。
本文使用的“竞争性抑制”指使用常规的抗体相互(reciprocal)竞争分析(Belanger L等，Clinica Chimica Acta 48：15-18(1973))能够识别并结合决定基，其中杂交瘤细胞系IDAC 170505-05产生的单克隆抗体(IDAC 170505-05抗体)靶向该决定基。
本文使用的“靶抗原”是IDAC 170505-05抗原或其部分。
本文使用的“免疫偶联物”指以化学或生物学方式连接到细胞毒素、放射性试剂、酶、毒素、抗肿瘤药或治疗剂的任何分子或CDMAB，如抗体。所述抗体或CDMAB可在该分子上的任何位置连接至细胞毒素、放射性试剂、抗肿瘤药或治疗剂，只要其能结合它的靶标。免疫偶联物的例子包括抗体-毒素化学结合物和抗体-毒素融合蛋白。
本文所用的“融合蛋白”指抗原结合区连接至生物活性分子(如毒素、酶或蛋白药)的任何嵌合蛋白。
为了更完全地理解本文所述的发明，进行了以下描述。
本发明提供了特异识别和结合IDAC 170505-05抗原的CDMAB(即IDAC170505-05CDMAB)。
以保藏号170505-05保藏在IDAC的杂交瘤产生的分离的单克隆抗体的CDMAB可以是任何形式，只要其具有抗原结合区，该抗原结合区能竞争性地抑制杂交瘤IDAC 170505-05产生的分离的单克隆抗体对其靶抗原的免疫特异性结合。因此，任何具有与IDAC 170505-05抗体相同的结合特异性的重组蛋白(例如抗体与诸如淋巴因子或肿瘤生长抑制因子的另一蛋白结合的融合蛋白)都包括在本发明的范围内。
在本发明一实施方案中，所述CDMAB是IDAC 170505-05抗体。
在其它实施方案中，所述CDMAB是抗原结合片段，其可以是具有IDAC170505-05抗体的抗原结合区的Fv分子(例如单链Fv分子)、Fab分子、Fab′分子、F(ab′)2分子、融合蛋白、双特异抗体、异种抗体或任何重组分子。本发明的CDMAB靶向IDAC 170505-05单克隆抗体靶向的抗原表位。
可以对本发明的CDMAB进行修饰(即通过分子内的氨基酸修饰)以产生衍生分子。也可采用化学修饰。
衍生分子会保留所述多肽的功能性，即具有这类取代的分子仍然能使所述多肽结合IDAC 170505-05抗原或其部分。
这些氨基酸取代包括，但不必限于，本领域称为“保守”的氨基酸取代。
例如，作为蛋白质化学中公知的原则，在蛋白中频繁进行称为“保守氨基酸取代”的氨基酸取代不会改变该蛋白的构造或功能。
这类改变包括用异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和亮氨酸(L)中的任一种取代这些疏水氨基酸的任何其他一种；天门冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)，反之亦然；谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)，反之亦然；以及丝氨酸(S)取代苏氨酸(T)，反之亦然。根据特定氨基酸的环境、及其在蛋白的三维结构中的作用，其它取代也可被视为保守的。例如甘氨酸(G)和丙胺酸常常是互换的，丙胺酸和缬氨酸(V)也是。相对疏水的蛋氨酸(M)常常可与亮氨酸和异亮氨酸互换，有时可与缬氨酸互换。在某些位置，赖氨酸(K)和精氨酸(R)常常也是可互换的，在这些位置上氨基酸残基的主要特征是其电荷，而这两种氨基酸残基的pK差别并不重要。在某些特定环境中，仍有其它改变可视为“保守的”。
给定一种抗体，本领域所属技术人员可以产生识别相同抗原表位的竞争性抑制CDMAB，例如竞争性抗体(Belanger L等.Clinica Chimica Acta 48：15-18(1973))。一种方法是用表达该抗体识别抗原的免疫原产生免疫。该样品可包括，但不限于，组织、分离的蛋白或细胞系。可用诸如ELISA、FACS或Western印迹的竞争分析来筛选产生的杂交瘤，其中该竞争分析鉴定抑制测试抗体的结合的抗体。另一方法利用噬菌体展示抗体库，并淘选识别所述抗原的至少一个抗原表位的抗体(Rubinstein JL等，Anal Biochem 314：294-300(2003))。在任一情况下，根据它们与靶抗原至少一个决定簇的结合能力竞争超出原标记抗体来选择抗体。因此，这类抗体与原始抗体一样，具有识别抗原的至少一个抗原表位的特性。
实施例1
杂交瘤生产—杂交瘤细胞系AR62A335.9
根据布达佩斯条约，将杂交瘤细胞系AR62A335.9于2005年5月17日保藏在加拿大国际保藏单位(IDAC)，位于加拿大马尼托巴省R3E 3R2温尼伯市阿林顿街道1015的加拿大***微生物局，保藏编号为170505-05。根据37CFR1.808的规定，保藏者保证在专利授权时彻底取消对公众获取该保藏材料的所有限制。如果保藏处不能给予存活的样本，那么将替换保藏样品。
为了生成产生抗癌抗体的杂交瘤AR62A335.9，在PBS中制备冷冻的转移至肝肿瘤组织的人结肠转移瘤(Genomics Collaborative，Cambridge，MA)的单细胞悬浮液。IMMUNEASYTM(Qiagen，Venlo，Netherlands)佐剂轻轻混合后待用。通过皮下注射含2百万细胞的50微升抗原—佐剂对5-7周的BALB/c鼠进行免疫。初次免疫后2-5周，将新制备的含2百万细胞的50微升抗原—佐剂腹腔注入以加强免疫小鼠。最后一次免疫之后3天，使用脾进行融合。通过将分离的脾细胞与NSO-1骨髓瘤配偶体(partner)融合制备杂交瘤。检测杂交瘤亚克隆融合的上清液。
为了确定杂交瘤细胞分泌的抗体是否为IgG或IgM同种型，进行了酶联免疫测定试验(ELISA)。将4℃包被液(Coating buffer)(0.1M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，pH为9.2-9.6)中的浓度为2.4微克/毫升的山羊抗小鼠IgG+IgM(H+L)以100微升/孔加入到ELISA酶标板(ELISA plate)过夜。酶标板用洗涤缓冲液洗涤(PBS+0.05％Tween)三次。向所述酶标板加入100微升/孔的封闭缓冲液(blockingbuffer)(洗涤缓冲液中含有5％牛奶)，室温保持1小时，随后用洗涤缓冲液洗涤三次。加入100微升/孔的杂交瘤上清液，室温孵育1小时。用洗涤缓冲液洗涤酶标板三次，加入100微升/孔的山羊抗小鼠IgG或IgM与辣根过氧物酶的偶联物的1/100,000稀释液(在含有5％牛奶的PBS中稀释)。室温孵育1小时后，酶标板用洗涤缓冲液洗涤三次。将100微升/孔的TMB溶液在室温孵育1-3分钟。加入50微升/孔的2M H2SO4终止颜色反应，用Perkin-Elmer HTS7000读板机在450nm读板。如图1所示，AR62A335.9杂交瘤主要分泌IgG同种型抗体。
为了确定所述杂交瘤细胞分泌的抗体的亚型，用小鼠单克隆抗体同种型分型试剂盒(Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit)(HyCult Biotechnology，Frontstraat，Netherlands)进行了同种型实验。将500微升缓冲液加入到含有大鼠抗-小鼠亚型特异抗体的试验条(test strip)中。将500微升杂交瘤上清液加入到试管中，通过轻轻搅动混合。通过结合至胶体颗粒的另一种大鼠单克隆抗体直接检测俘获的小鼠免疫球蛋白。这两种蛋白的结合产生了可用于分析所述同种型的视觉信号。抗癌抗体AR62A335.9是IgG1，κ同种型。
经过一轮有限稀释，在细胞ELISA分析中检测杂交瘤上清液中结合至靶细胞的抗体。检测了一种人乳癌细胞系、一种人卵巢癌细胞系、两种人结肠癌细胞系和一种人正常皮肤细胞系，分别是：MDA-MB-231、OVCAR-3、SW1116、Lovo和CCD-27sk。所有细胞系得自美国典型培养物保存中心(American TypeTissue Collection，ATCC；马纳萨斯，VA)。铺板细胞在使用前先被固定。酶标板用含有MgCl2和CaCl2的PBS在室温洗涤三次。每个板孔中加入100微升2％多聚甲醛的PBS稀释液，室温保持10分钟，随后弃掉该液。孔板再次用含有MgCl2和CaCl2的PBS室温洗涤三次。用100微升/孔的含有5％牛奶的洗涤缓冲液(PBS+0.05％Tween)室温封闭1小时。孔板用洗涤缓冲液洗涤三次，以75微升/孔加入杂交瘤上清液，室温放置1小时。孔板用洗涤缓冲液洗涤三次，以100微升/孔加入与辣根过氧物酶偶联的山羊抗-小鼠IgG或IgM抗体的1/25,000稀释液(在含有5％牛奶的PBS中稀释)。室温孵育1小时，孔板用洗涤缓冲液洗涤三次，将100微升/孔的TMB培养基在室温孵育1-3分钟。用50微升/孔的2M H2SO4终止反应，用Perkin-Elmer HTS7000读板机在450nm下读板。图1列表显示的结果表示为高出背景的倍数，对照为内部(in-house)的IgG同种型，事先已经证明该对照不能与被测细胞系结合。来自杂交瘤AR62A335.9的抗体对乳癌细胞系MDA-MB-231表现出牢固的结合，其后是卵巢癌细胞系OVCAR-3。AR62A335.9对正常皮肤细胞系CCD-27sk表现出低水平的结合。
在进行抗体结合实验的同时，在所述细胞系：MDA-MB-231、OVCAR-3、SW1116、Lovo和CCD-27sk中测试了杂交瘤上清液的细胞毒性作用。从Molecular Probes(Eugene，OR)公司获得了钙黄绿素(Calcein)AM，并如下所述进行了所述分析。分析前将细胞以预先确定的适当浓度进行铺板。2天后，将来自杂交瘤微量滴定板的75微升上清液转移至细胞孔板，并于5％CO2培育箱中孵育5天。将阳性对照孔抽空，加入100微升的叠氮化钠(NaN3，.01％，Sigma，Oakville，ON)、放线菌酮(cycloheximide)(CHX，0.5微摩尔，Sigma，Oakville，ON)或抗-EGFR抗体(c225，IgG1，Kappa，5微克/毫升，Cedarlane，Hornby，ON)。经过5天的处理后，孔板经倒空并吸干。将室温下含有MgCl2和CaCl2的DPBS(Dulbecco′s磷酸盐缓冲液)从多通道塑料挤压瓶中分配入每个孔中，轻敲三次，倒空然后吸干。将50微升在含有MgCl2和CaCl2的DPBS中稀释的荧光钙黄绿素染料加入到每个孔中，并在5％C02培养箱中于37℃孵育30分钟。用Perkin-Elmer HTS7000荧光读板机读板，数据用Microsoft Excel进行分析。结果在图1中以表格列出。杂交瘤AR62A335.9的上清对OVCAR-3细胞产生了25％的特异细胞毒性作用。分别是用阳性对照叠氮化钠和放线菌酮获得的细胞毒性作用的42％和69％。
图1的结果证明AR62A335.9的细胞毒性作用与其对所述癌细胞类型的结合水平并不成比例。尽管在MDA-MB-231细胞中的结合水平更高，但是相对于MDA-MB-231细胞，在OVCAR-3细胞中产生的细胞毒性作用更大。如图1列表所示，AR62A335.9在CCD-27sk正常细胞系中并不产生细胞毒性作用。而公知的非特异性细胞毒性作用试剂放线菌酮和NaN3产生了普遍的预期的细胞毒性作用。抗EGFR抗体c225在SW1116上产生预期的细胞毒性作用。
实施例2
体外结合
通过在CL-1000瓶(BD Biosciences，Oakville，ON)中培养所述杂交瘤来产生AR62A335.9单克隆抗体，每星期进行两次收集和再接种。然后用蛋白G琼脂糖4快流(Protein G Sepharose 4 Fast Flow)(Amersham Biosciences，Baie d′Urfé，QC)进行标准的抗体纯化过程。利用人源化的、去免疫的、嵌合的(chimerized)或鼠源单克隆抗体均属于本发明的范围。
通过流式细胞计量术(FACS)评估了AR62A335.9与乳癌(MDA-MB-231)、结肠癌(DLD-1，Lovo，SW1116)和卵巢癌(OVCAR-3)细胞系及来自皮肤(CCD-27sk)和肺(Hs888.Lu)的非癌细胞系的结合。所有细胞系得自美国典型培养物保存中心(ATCC；Manassas，VA)。通过首先用DPBS(不含Ca++和Mg++)洗涤所述细胞单层来准备用于FACS的细胞。然后用细胞离解缓冲液(INVITROGEN，Burlington，ON)在37℃下将细胞从细胞培养板上分离出来。离心收集后，在4℃下，将细胞重悬在含有MgCl2、CaCl2和2％胎牛血清的DPBS(染色培养基)中并计数，稀释到适当的细胞浓度，旋转沉淀使细胞成球，并在4℃、在20微克/mL的测试抗体(AR62A335.9)或对照抗体(同种型对照，抗EGFR)的存在下，重悬在染色培养基中，冰上放置30分钟。在加入偶联了Alexa Fluor 546的二抗之前，将细胞用染色基质洗涤一次。然后加入溶于染色培养基质的AlexaFluor 546偶联抗体，在4℃持续30分钟。然后最后洗涤一次细胞，并重悬于固定液中(含有1.5％多聚甲醛的染色培养基)。通过在使用FACSarrayTM SystemSoftware(BD Biosciences，Oakville，ON)的FACSarrayTM上运行样品来评估流式细胞计数的细胞获取。通过调节前向散射(FSC)和测向散散(SSC)检测器上得到的电压和幅度(amplitude)来设置细胞的FSC和SSC。通过运行未染色的细胞来调节荧光通道(Alexa-546)的检测器，从而该细胞具有均匀的峰，中位荧光强度约为1-5单位。对于每个样品，需要约10,000个门事件(gated events)(被染色固定的细胞)来进行分析，结果如图2所示。
图2显示了高出同种型对照的平均荧光强度倍增。图3汇集了AR62A335.9抗体的有代表性的直方图。AR62A335.9对结肠癌细胞系DLD-1显示出强结合(9.5倍)，对结肠癌细胞系SW1116显示出弱结合(1.9倍)。对乳癌细胞系MDA-MB-231(3.1倍)、卵巢癌细胞系OVCAR-3(2.9倍)和正常肺细胞系Hs888.Lu(4.9倍)也观测到结合。在这些条件下未检测到对Lovo结肠癌和CCD-27sk正常皮肤细胞系的结合。这些数据证明AR62A335.9选择性地结合不同的人细胞系。
实施例3：
用Lovo细胞进行的体内肿瘤试验
实施例1和2证明了AR62A335.9具有抗人癌细胞系的抗癌特性，并且可结合结肠细胞类型。参照图4和5，将颈背皮下注射的100微升的生理盐水中的1百万人结肠癌细胞(Lovo)植入4-6周龄的雌性SCID小鼠。小鼠被随机分为两个治疗组，每组5只。植入后第一天，每一群动物腹膜内给予300微升的AR62A335.9测试抗体(20mg/kg)或缓冲液对照，所述溶液由保存浓缩液稀释获得，所用稀释剂含有2.7mM的KCl、1mM的KH2PO3、137mM的NaCl和20mM的Na2HPO4。随后，以同一方式每周给予一次抗体和对照样品，持续7周。大约每7天用测径器测量肿瘤的生长，持续到第8周，或直至动物个体达到加拿大动物护理委员会(CCAC)规定的指标。在研究的持续过程中每周一次记录动物的体重。在研究结束时，所有的动物都根据CCAC指南采取安乐死。
在人结肠癌预防性体内模型中，AR62A335.9抑制了肿瘤生长并降低了肿瘤负荷。在植入后的第56天，最后一次治疗给药后第6天，AR62A335.9治疗组的平均肿瘤体积比缓冲液对照治疗组低44％(图4)。最终时间点时的平均肿瘤体积受到治疗期结束前由于溃疡性损伤而损失的小鼠的影响。在第42天，当所有小鼠仍然存活时，相比缓冲液治疗的对照小鼠，AR62A335.9使肿瘤体积降低60％(p＝0.055)。
在整个研究中，没有出现临床毒性症状。图5所示的体重作为动物健康和发育停止的指标。在组内，整个研究期间对照组内有不显著的9％的体重降低，而AR62A335.9治疗组的体重显示出15％的降低，从平均21g至17.8g。在治疗期末，各组间没有显著的体重差别(p＝0.1，t-检验)。
总而言之，在该人结肠癌异种移植模型中，AR62A335.9良好耐受并降低了肿瘤负荷。显然从实施例1和2中，AR62A335.9对Lovo细胞系的结合使用细胞ELISA或FACS是无法检测到的。尽管如此，该抗体能够降低Lovo异种移植模型中的肿瘤生长。该功效可能源于两个因素中的任一个。有可能Lovo细胞系以低于任一方法在这些条件下的检出阈的水平表达所述抗原靶标，但该低表达水平足以触发导致肿瘤生长延迟的事件。还可能当将Lovo细胞置于更符合生理学的体内环境中时，会诱导抗原表达。在任一情况下，该抗体在Lovo结肠癌模型中的功效都是以结合为基础所不能预见到的非显而易见的发现。
实施例4
用DLD-1细胞进行的体内肿瘤试验
实施例3的结果扩展至人结肠癌的不同模型。参照图6和7，将颈背皮下注射的100微升的生理盐水中的5百万人结肠癌细胞(DLD-1)4-6周龄的雌性SCID小鼠。小鼠被随机分为两个治疗组，每组5只。植入后第一天，每一群动物腹膜内给予300微升的AR62A335.9测试抗体(20mg/kg)或缓冲液对照，所述溶液由保存浓缩液稀释获得，所用稀释剂含有2.7mM的KCl、1mM的KH2PO3、137mM的NaCl和20mM的Na2HPO4。随后，在整个研究期间以同一方式每周给予一次抗体和对照样品。大约每7天用测径器测量肿瘤的生长。研究在7次注射(48天)后结束，因为动物由于大溃疡性损伤达到CCAC的指标。在研究的持续过程中每周一次记录动物的体重。在研究结束时，所有的动物都根据CCAC指南采取安乐死。
在人结肠癌的高侵入性(aggressive)DLD-1预防性体内模型中，AR62A335.9降低了肿瘤生长。在植入后的第48天，最后一次治疗给药后第5天，AR62A335.9治疗组的平均肿瘤体积比缓冲液对照治疗组的肿瘤体积低19％(图6)。尽管AR62A335.9治疗小鼠的肿瘤负荷低于对照治疗小鼠，但在该人结肠癌的侵入性模型中差别是非显著性的(p＝0.39，t-检验)。最终时间点时的平均肿瘤体积受到治疗期结束前由于溃疡性损伤而损失的小鼠的影响。在第27天，当所有小鼠仍然存活时，AR62A335.9使肿瘤体积降低40％(p＝0.071)。仅在4次抗体注射后就观察到该显著降低。
在整个研究中，没有临床毒性症状。每周测得的体重用做动物健康和发育停止的指标。如图7所示，在研究期末，对照或62A335.9治疗组的体重没有显著的差别。在治疗期末，两组间没有体重差别(p＝0.622，t-检验)。
因此，在该人结肠癌异种移植模型中，AR62A335.9良好耐受并降低了肿瘤负荷。
实施例5
用Lovo细胞进行的体内肿瘤试验
参照图8和9，将颈背皮下注射的100微升的生理盐水中的1百万Lovo人结肠癌细胞植入4-6周龄的雌性SCID小鼠。每周用测径器测量肿瘤的生长。植入后第24天，当动物群中的多数达到了90mm3(范围55-150)的平均肿瘤体积时，将8只小鼠随机分配入两个治疗组中的一个。每一群动物腹膜内给予AR62A335.9测试抗体或同种型对照抗体，剂量为300微升体积中10mg/kg的抗体，所述溶液由保存浓缩液稀释获得，所用稀释剂含有2.7mM的KCl、1mM的KH2PO3、137mM的NaCl和20mM的Na2HPO4。随后，以同一方式每周给予三次所述抗体，共10次剂量，直到植入后第45天。大约每7天用测径器测量肿瘤的生长，持续到植入后第48天，或直至动物个体达到CCAC的终点。在研究的持续过程中每周一次记录动物的体重。在研究结束时，所有的动物都根据CCAC指南采取安乐死。
AR62A335.9显著降低了人结肠癌的已建立模型中的肿瘤负荷。在第34天，约整个治疗期的半程，当所有动物仍然存活时，AR62A335.9治疗组动物的平均肿瘤体积为对照治疗组动物的平均肿瘤体积的66％(p＝0.027；图8)。在植入后的第48天，最后一次治疗给药后3天，AR62A335.9治疗组的平均肿瘤体积降低了19％，该结果是非显著的，因为在第48天时大批动物由于达到CCAC终点而从研究中剔除。
每周测得的体重用做健康和发育停止的指标。如图9所示，治疗期末，AR62A335.9治疗组和对照治疗组的平均体重分别明显降低11.1％和8.4％，证明了该模型的侵入性特性(分别为p＝0.0071和p＝0.0422，t-检验)。在整个研究过程中，两组间的平均体重没有显著的差别。
总而言之，在该已建立的人结肠癌异种移植模型中，AR62A335.9良好耐受并降低了肿瘤负荷。如实施例3中所讨论的，尽管明显缺少结合，仍可明显观察到所述抗体在Lovo模型中的功效，证明用常规的结合标准不能发现该抗体。
大部分证据显示AR62A335.9通过对癌细胞系上的抗原表位的连接(ligation)介导了抗癌作用。进一步表明，利用诸如FACS、细胞ELISA或IHC的技术可将AR62A335.9抗体用于细胞和/或组织的检测，其中该细胞和组织表达所述抗体特异结合的抗原表位。
本说明书中所涉及的所有专利和公开物显示了本发明所属技术领域的技术人员的技术水平。所有的专利和公开物通过引用的方式并入本文，其引用程度如同每个出版物被专门单独地指明以引用的方式并入本文。。
应当明白的是尽管说明了本发明的特定形式，发明不限于在此描述和显示的特定形式或各部分的布局。对于本领域的技术人员而言，显而易见地可以在不背离本发明范围的情况下进行各种改变，并且不应当认为本发明限于本说明书中显示和描述的内容。本领域的技术人员容易理解，本发明非常适于实现所述目标，并取得所提及以及发明本身所固有的结果和优点。在此描述的任何寡核苷酸、肽、多肽、生物学相关化合物、方法、步骤和技术代表了优选的实施方案，仅为示范性的、而不是限制本发明的范围。本领域技术人员想到的对发明的修改和其它应用都包含在本发明的范畴内，并由所附权利要求书的范围所限定。虽然本发明结合特定的优选实施方案进行了说明，应当理解所要求保护的发明不应不恰当地受到这些特定实施方案的限制。事实上，对于本领域所属技术人员显而易见的，对实现本发明的上述方式的各种修改都应该包含在随后的权利要求书的范围内。

Claims (24)

1.由杂交瘤产生的分离的单克隆抗体，所述杂交瘤以保藏号170505-05保藏在IDAC。
2.由权利要求1所述分离的单克隆抗体产生的人源化抗体。
3.由权利要求1所述分离的单克隆抗体产生的嵌合抗体。
4.分离的杂交瘤细胞系，其以保藏号170505-05保藏在IDAC。
5.引发抗体诱导的选自人肿瘤的组织样品中癌细胞的细胞毒性作用的方法，包括：
提供所述人类肿瘤的组织样品；
提供由杂交瘤产生的分离的单克隆抗体或其CDMAB，所述杂交瘤以保藏号170505-05保藏在IDAC，所述CDMAB的特征在于竞争性地抑制所述分离的单克隆抗体对其靶抗原的结合的能力；以及
将所述分离的单克隆抗体或其CDMAB与所述组织样品接触；
其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB与所述组织样品的结合诱导细胞毒性作用。
6.权利要求1所述分离的单克隆抗体的CDMAB。
7.权利要求2所述人源化抗体的CDMAB。
8.权利要求3所述嵌合抗体的CDMAB。
9.权利要求1、2、3、6、7或8中任一权利要求所述的分离的抗体或其CDMAB，其与选自细胞毒性部分、酶、放射性化合物和造血细胞的成员偶联。
10.确定选自人肿瘤的组织样品中癌细胞的存在的结合分析方法，所述癌细胞被分离的单克隆抗体特异性结合，该单克隆抗体由具有IDAC保藏号170505-05的杂交瘤细胞系AR62A335.9产生，所述方法包括：
提供所述人类肿瘤的组织样品；
提供至少一种分离的单克隆抗体或其CDMAB，所述单克隆抗体或其CDMAB识别的一个抗原表位或多个抗原表位与由杂交瘤细胞系AR62A335.9产生的分离的单克隆抗体所识别的一个抗原表位或多个抗原表位相同，所述杂交瘤细胞系具有IDAC的保藏号170505-05；
将所述至少一种分离的单克隆抗体或其CDMAB与所述组织样品接触；以及
测定所述至少一种分离的单克隆抗体或其CDMAB与所述组织样品的结合；
从而指示出所述组织样品中所述癌细胞的存在。
11.治疗哺乳动物的人肿瘤的方法，其中所述人肿瘤表达特异结合至分离的单克隆抗体或其CDMAB的抗原的至少一种抗原表位，所述单克隆抗体由以保藏号170505-05保藏在IDAC的克隆所编码，所述CDMAB的特征在于竞争性地抑制所述分离的单克隆抗体对其靶抗原的结合的能力，所述方法包括对所述哺乳动物给予降低所述哺乳动物的肿瘤负荷的有效量的所述单克隆抗体或其CDMAB。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体偶联到细胞毒性部分。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述的细胞毒性部分是放射性同位素。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB激活补体。
15.根据权利要求11所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB介导抗体依赖的细胞毒性作用。
16.根据权利要求11所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是人源化的。
17.根据权利要求11所述的方法，其中所述的单克隆抗体是嵌合的。
18.治疗哺乳动物的对抗体诱导的细胞毒性作用敏感的人肿瘤的方法，其中所述人肿瘤表达特异结合至分离的单克隆抗体或其CDMAB的抗原的至少一种抗原表位，所述单克隆抗体由以保藏编号170505-05保藏在IDAC的克隆所编码，所述CDMAB的特征在于竞争性地抑制所述分离的单克隆抗体对其靶抗原的结合的能力，所述方法包括对所述哺乳动物给予降低所述哺乳动物的肿瘤负荷的有效量的所述单克隆抗体或其CDMAB。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体结合到细胞毒性部分。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述的细胞毒性部分是放射性同位素。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB激活补体。
22.根据权利要求18所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其CDMAB介导抗体依赖的细胞毒性作用。
23.根据权利要求18所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体是人源化的。
24.根据权利要求18所述的方法，其中所述的单克隆抗体是嵌合的。
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