CN101250511B - 稀硫酸处理纸浆作为碳源促进里氏木霉合成纤维素酶的方法 - Google Patents

Abstract

一种以纸浆为原料，经稀硫酸处理后作为里氏木霉(Trichoderma reesei)合成纤维素酶所需碳源的方法。与纯纤维素作为碳源相比较，用这种方法制备纤维素酶可使滤纸酶活提高40％；也解决了以纸浆+葡萄糖作碳源配制培养基时菌体细胞缺乏利用纤维素的能力，纤维素酶活力不高的难题。

Description

稀硫酸处理纸浆作为碳源促进里氏木霉合成纤维素酶的方法

一、技术领域

本发明属于生物化学中微生物培养技术领域，特别涉及一种稀硫酸处理纸浆作为碳源促进里氏木霉合成纤维素酶的方法。

二、背景技术

现有技术：纤维素酶(cellulase)是用于降解纤维素的一组酶的总称，主要组分是内切葡聚糖酶(endoglucanase)、外切葡聚糖酶(exoglucanase)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)。纤维素酶降解纤维素的作用机理是：内切葡聚糖酶随机切断纤维素大分子成短链纤维素，外切葡聚糖酶切断短链纤维素末端形成纤维二糖或寡糖，β-葡萄糖苷酶作用于纤维二糖和寡糖形成葡萄糖。可用于生产纤维素酶的菌种主要有木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)。其中研究较多的菌株之一是里氏木霉(Trichoderma reesei)。

在里氏木霉生产纤维素酶的过程中，纤维素是主要的碳源。使用纯纤维素作为碳源，可以诱导产生较高活力的纤维素酶，但价格昂贵。而使用廉价的木质纤维素(例如纸浆)作为碳源，纤维素酶的产量较低。

里氏木霉利用碳源生产纤维素酶主要分三个阶段：一、里氏木霉利用培养基中较易利用的碳源，菌体细胞快速生长，不分泌或少量分泌纤维素酶；二、里氏木霉利用培养基中较难利用碳源，菌体细胞浓度基本保持稳定，并开始大量分泌纤维素酶；三、培养基中的碳源和氮源基本被消耗，菌体细胞开始死亡，胞内酶逐渐释放，纤维素酶逐渐失活。

产酶培养基中的碳源组成对纤维素酶的合成影响极大。培养基中长纤维素过多，微生物细胞较难利用，导致发酵产酶时间延长，产酶得率下降；培养基中短纤维素过多，微生物细胞过度生长，导致大量碳源用于菌物生长，而产酶能力不足。

在里氏木霉生产纤维素酶的过程中，碳源的合理组成至关重要。碳源中聚合度较低、较易被利用的组分，可以促进菌体细胞快速生长，为其后大量利用聚合度较高、较难利用的组分提供足够浓度的菌体细胞。碳源中聚合度较高、较难利用的组分，则是诱导纤维素酶合成的主体，决定了最终纤维素酶活力的高低。

一般的木质纤维素原料(例如纸浆)很难满足同时提供这两种组分的要求。生产中经常加入葡萄糖等单糖以促进菌体细胞生长，但是以葡萄糖为碳源生长起来的菌体细胞缺乏利用纤维素的能力，导致纤维素酶活力不高。

迄今为止，尚未见到成本更低、效果相当或更好的替代碳源促进里氏木霉合成纤维素酶的方法。

三、发明内容

技术问题：本发明提供一种稀硫酸处理纸浆作为碳源促进里氏木霉合成纤维素酶的方法。该方法对纸浆进行适当的处理，使得纸浆纤维素轻度水解，产生一部分聚合度较低、较易被利用的纤维素组分。

本发明的技术解决方案为：一种用纸浆作为碳源促进里氏木霉合成纤维素酶的方法，其特征在于纸浆预先经过稀硫酸处理，具体处理方法为：

a.将纸浆粉碎，加入质量浓度为0.75～4.0％的硫酸溶液，纸浆粉颗粒质量与硫酸溶液体积之比为1g∶5～20mL，常温浸泡1～5小时，然后将混合液在110～130℃下水解40～80min；

b.用水将稀硫酸处理后的纸浆粉颗粒洗至中性，抽滤至纸浆粉颗粒水分含量至50％～80％左右。

以普通纸浆和稀硫酸处理纸浆为碳源配制里氏木霉产纤维素酶培养基，普通纸浆与稀硫酸处理纸浆的用量比为3∶1～2。

有益效果：轻度水解纸浆中聚合度较低、较易被利用的纤维素组分，可以促进里氏木霉菌体细胞生长，并同时诱导其合成纤维素酶的能力；聚合度较高、较难利用的纤维素组分，被足够浓度的菌体细胞利用，可以大量诱导纤维素酶的合成。这样，就可以用廉价的纸浆作为碳源制备纤维素酶。使用0.75～4.0％稀硫酸处理后的纸浆产生大量细小纤维，同时纤维变短，纤维束表面***糙，有利于微生物利用。

与纯纤维素作为碳源相比较，用这种方法制备纤维素酶可使滤纸酶活提高40％；也解决了以纸浆+葡萄糖作碳源配制培养基时菌体细胞缺乏利用纤维素的能力，纤维素酶活力不高的难题。

四、附图说明

图1为以商品纯纤维素为碳源里氏木霉产纤维素酶的历程；

图2为未处理纸浆电子显微镜扫描照片；

图3为经稀硫酸处理的纸浆电子显微镜扫描照片；

图4为以纸浆和稀硫酸处理纸浆为碳源，里氏木霉产纤维素酶的历程。

五、具体实施方式

实施例1：

以商品纯纤维素为碳源里氏木霉产纤维素酶

产酶培养基为：商品纯纤维素(脱木质素纤维素，Solkc·Flock200)12g/L、葡萄糖1g/L、蛋白胨1g/L、硫酸铵2.2g/L、尿素0.5g/L、氯化钙0.3g/L、硫酸镁0.3g/L、硫酸亚铁0.005g/L、硫酸锰0.0016g/L、硫酸0.0014g/L、氯化钴0.0037g/L、吐温802滴/50mL。培养基用柠檬酸缓冲液调节pH值为4.5～5.0。

产酶条件：向产酶培养基接种里氏木霉菌丝体，里氏木霉菌丝体接种量占培养基体积的10％。培养温度26～32℃，转速为150～250r/min。每隔一天取样，3000r/min离心，取上清液分别测定pH值、滤纸酶活和蛋白质浓度。

滤纸酶活的测定：采用国际理论和应用化学协会(IUPAC)推荐的标准方法测定。实验条件是：底物使用Whatman滤纸50mg，加入适当稀释倍数的酶液，在50℃，80r/min下反应1h，测定酶解产生的葡萄糖量。一个滤纸酶活的国际单位(IU)定义为标准反应条件下每分钟生成1μmol葡萄糖量的酶量。

结果表明，使用商品纯纤维素为碳源，滤纸酶活最高值为2.23IU/mL，酶蛋白浓度为1.1g/L，如附图1所示。

实施例2：

纸浆的稀硫酸处理

将普通商品纸浆粉碎成直径1mm左右的颗粒，按固液比为1∶10的比例加入浓度为0.75～4.0％的硫酸溶液，浸泡1～5h，然后在110～130℃下水解40～80min。

稀硫酸处理后的纸浆用水洗至中性，抽滤至含水率为50～80％左右。

对纸浆和稀硫酸处理纸浆进行电子显微镜(SEM)分析，电子显微镜设备及操作步骤如下：

设备：飞利浦quanta200电子显微镜，日立HCP-2临界点干燥器、日立E-1010离子溅射仪。

稀硫酸处理纸浆样品制备步骤：固定、梯度脱水、临界点干燥、粘台、导电处理。

电子显微镜分析表明，与未经处理的纸浆(附图2)相比较，稀硫酸处理后的纸浆(附图3)产生大量细小纤维，同时纤维变短，纤维束表面***糙，有利于微生物利用。

在纸浆稀硫酸处理过程中，温度过低或保温时间过短，纸浆中的半纤维素不能充分溶出，纤维束碎片化程度不高；温度过高或保温时间过长，大量纤维素水解成单糖和低聚糖，不利于诱导纤维素酶的合成。只有在温度110～130℃，反应时间为40～80min的条件下，纸浆中的半纤维素才能充分除去，同时纤维束断裂成较多的细小纤维。

实施例3：

以普通纸浆和稀硫酸处理纸浆为碳源配制里氏木霉产纤维素酶培养基。

将普通纸浆与稀硫酸处理纸浆按3∶1～2的使用比例替代实施例1中所用的纯纤维素，其余同实施例1，产酶条件也同实施例1。

由附图4可知，使用纸浆和稀硫酸处理纸浆为碳源，滤纸酶活最高值为3.12IU/mL，酶蛋白浓度为1.34g/L。商品纯纤维素(脱木质素纤维素，Solkc·Flock200)是一种较好的诱导纤维素酶合成的碳源，但是价格昂贵，只能用于实验室研究。实施例1用商品纯纤维素12g/L为碳源，滤纸酶活最高值为2.23IU/mL。本实施例以相对低廉的普通纸浆和稀硫酸处理纸浆的混合物为碳源配制里氏木霉产纤维素酶培养基，碳源总量并没有增加，但滤纸酶活最高值比实施例1提高了40％，显著提高了纤维素酶产率，同时，酶蛋白浓度也有所提高。

Claims (2)

1.一种用纸浆作为碳源促进里氏木霉(Trichoderma reesei)合成纤维素酶的方法，其特征在于纸浆预先经过稀硫酸处理，具体处理方法为：

a.将纸浆粉碎，加入质量浓度为0.75～4.0％的硫酸溶液，纸浆粉颗粒质量与硫酸溶液体积之比为1g∶5～20mL，常温浸泡1～5小时，然后将混合液在110～130℃下水解40～80min；

b.用水将稀硫酸处理后的纸浆粉颗粒洗至中性，抽滤至纸浆粉颗粒水分含量至50％～80％左右。

2.如权利要求1所述的用纸浆作为碳源促进里氏木霉合成纤维素酶的方法，其特征在于以普通纸浆和经权利要求1中a、b步骤稀硫酸处理的纸浆为碳源配制里氏木霉产纤维素酶培养基，普通纸浆与经权利要求1中a、b步骤稀硫酸处理的纸浆的用量比为3∶1～2。

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