CN113122522B - 一种促进生物发酵产纤维素酶的方法 - Google Patents
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Abstract
一种促进生物发酵产纤维素酶的方法，以CN106554931A公开的拜氏梭菌XH0906接种至丁醇发酵培养基中，发酵生产丁醇，将发酵产物除去丁醇后，先加入乙醇，收集沉淀，向沉淀中加入硫酸或盐酸酸解，酸解产物加入至纤维素酶发酵菌种的培养基中，接种纤维素酶发酵菌种，促进纤维素酶的发酵生产。本发明的方法针对特有菌种的特殊丁醇发酵产物进行了有效利用，解决了发酵液后续处理问题，又对纤维素酶的生产起到促进作用，产生较大的经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及生物质能源技术领域，具体涉及一种促进纤维素酶发酵的方法。
背景技术
丁醇是一种重要的有机化工原料，在化工、医药和石油等工业领域有广泛的用途，而且作为一种有潜力的可以替代汽油的可再生生物能源，丁醇越来越受到世界各国政府和很多跨国公司的关注。丁醇主要来源于化学合成和微生物发酵，其中化学合成法目前具有成本优势，但需要大量化石燃料作为原料。化石燃料不可再生、价格不确定而且世界分布不均一，大量使用会造成严重环境污染，因此微生物发酵法生产丁醇代表未来的发展趋势。发酵法生产生物丁醇曾经是仅次于生物乙醇的成熟工业，后来受到石油工业的冲击，逐步衰落。进入新世纪以来，生物丁醇的发展又展现出新的特点。首先，丁醇生产原料的转换，传统的原料是糖蜜和淀粉，发酵流程和技术都已经相当成熟，而当今只适合于极少数原料丰富的国家，淀粉用于生物燃料的生产会产生“与人争粮，与粮争地”的问题，因此开展以木质纤维素为原料的厌氧梭菌丁醇发酵工艺成为研究热点。
木质纤维素是自然界中分布最广、含量最多的可再生糖类资源。作物秸秆等纤维素原料中含有大量的纤维素和半纤维素多糖类物质。这些多糖类物质性质很稳定，即使经过预处理，仍要在催化剂作用下才能水解为单糖，然后再经发酵才能制备纤维素丁醇。水解最常用的催化剂是无机酸和纤维素酶制剂。酶解利用微生物酶系将天然纤维素和半纤维素降解为可发酵的单糖，与化学水解法相比，可发酵单糖得率高、反应条件温和、能耗低、环境友好。纤维素丁醇生产过程中，纤维素酶的成本大约占到丁醇生产成本的四分之一，开发具有低成本的纤维素酶生产过程对降低纤维素丁醇成本、提高丁醇经济性有重要意义。
另一方面，原料的改变给丁醇发酵带来了一系列的科学问题。如产物浓度及产率较低造成原料单耗偏高。传统丁醇生物发酵的主要产物是丙酮、丁醇和乙醇，其含量约为6:3:1，简称ABE发酵。丁醇选择性低，只占ABE总溶剂的60%。而丁醇发酵过程中往往会产生大量副产物，如何充分利用这些副产物，提高其附加值，也是降低丁醇生产成本的关键。
发明内容
针对现有技术中纤维素酶生产成本高，本发明提供一种促进生物发酵产纤维素酶的方法，以拜氏梭菌XH0906发酵生产丁醇的发酵产物为促进剂，用于纤维素酶的生物发酵中，针对特有菌种的特殊丁醇发酵产物进行了有效利用，解决了发酵液后续处理问题，又对纤维素酶的生产起到促进作用，产生较大的经济效益。
本发明的技术目的通过以下技术方案实现：
一种促进生物发酵产纤维素酶的方法，以CN106554931A公开的拜氏梭菌XH0906接种至丁醇发酵培养基中，发酵生产丁醇，将发酵产物除去丁醇后，先加入乙醇，收集沉淀，向沉淀中加入硫酸或盐酸酸解，酸解产物加入至纤维素酶发酵菌种的培养基中，接种纤维素酶发酵菌种，促进纤维素酶的发酵生产。
进一步的，上述方法中，所述丁醇发酵培养基中的碳源为50-150g/L的葡萄糖或相当含糖量的木质纤维素糖化液。作为更具体的技术方案，所述丁醇发酵培养基中还包括蛋白胨5-10g/L、牛肉膏4-8g/L、硫酸铵0.5-1.0g/L、硫酸铁0.05-0.2g/L、硫酸镁0.1-0.5g/L。
进一步的，上述方法中，拜氏梭菌XH0906发酵产丁醇的发酵温度为30-38℃，控制pH为5.0-8.0，发酵时间为72-120h。
进一步的，上述方法中，所述拜氏梭菌XH0906已在CN106554931A中公开，其分类命名为拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii），已于2014年05月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 9124。
进一步的，上述方法中，发酵产物除去丁醇的方法是蒸馏法。
进一步的，上述方法中，发酵产物除去丁醇后按3-8倍体积加入乙醇，混匀反应后，离心或过滤收集沉淀，40-60℃干燥2-4h。
进一步的，上述方法中，所述硫酸或盐酸的质量浓度为0.5%-5%。
进一步的，上述方法中，酸解处理后还需经过灭菌处理，灭菌处理后，调节pH至5.5-7.0。
进一步的，上述方法中，纤维素酶发酵菌种可选现有技术中所有可用于产纤维素酶的菌株，优选CN105647813A所提供的绿色木霉（Trichodermaviride）F4、CN101899398A所提供的黑曲霉（Aspergillusniger）T2，更进一步，优选为绿色木霉（Trichodermaviride）F4。
进一步的，上述方法中，酸解产物向纤维素酶发酵菌种的培养基的添加比例按酸解前固形物沉淀的质量计为20-100g固体/L培养基。
进一步的，上述方法中，作为更具体的技术方案，所述纤维素酶发酵菌种的培养基还包括以下组分：麦麸10-60g/L，磷酸二氢钾0.1-10g/L，硫酸铵1-10g/L，氯化钙 0.01-3g/L，硫酸镁0.01-3g/L，ZnSO4·7H2O 0.01-50mg/L，MnSO4·4H2O 0.01-20mg/mL，CoCl2 0.01-50mg/L和FeSO4 0.1-20mg/L。
进一步的，上述方法中，纤维素酶发酵采用批次发酵，菌种的接种体积比为5%-15%，发酵温度为23-35℃，pH为4.0-7.0，发酵时间为48-168h。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）利用拜氏梭菌发酵丁醇过程中的多糖类副产物，经过一系列预处理，使其作为部分纤维素酶发酵的诱导碳源，既促进了纤维素酶的发酵，有效降低了纤维素酶的生产成本，又对发酵产丁醇的产物进行了有效利用，提高了其经济性。
（2）拜氏梭菌发酵产丁醇的发酵液中剩余的不溶性氮源和残糖等都可作为纤维素酶发酵的培养基组分，在节省纤维素酶发酵成本的同时，也降低了发酵废液的排放处理成本。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均从常规生化试剂商店购买得到。
本发明测定FPA和β-葡萄糖苷酶酶活，酶活测定底物分别采用滤纸和水杨素。使用DNS法测定滤纸酶活定义为，以在50℃，pH5.0条件下，1min催化底物水解产生相当于1μmol葡萄糖的还原糖定义为一个国际酶活力单位。β-葡萄糖苷酶酶活力单位定义为，在标准反应条件下，每分钟水解生成1µmol对硝基苯酚所需要的酶量。
葡萄糖、木糖和丁醇均采用Agilent 1200液相色谱仪（HPLC）进行检测分析。色谱柱为Bio-Rad的Aminex HPX-87H（300 mm×7.8 mm），检测器为示差折光检测器，流动相为0.005M的H2SO4水溶液，流速为0.7mL/min。
实施例1
（1）配制组分为葡萄糖100g/L、蛋白胨8g/L、牛肉膏5g/L、硫酸铵0.5g/L、硫酸铁0.1g/L和硫酸镁0.25g/L的培养基，接种拜氏梭菌XH0906菌株进行丁醇发酵。发酵过程中搅拌速率为60rpm，控制发酵温度为34℃，控制pH为7.0，发酵时间为72h。
（2）将步骤（1）中的发酵液用蒸馏法除去丁醇后，剩余溶液中加入6倍体积的无水乙醇，在室温下震荡器混匀10min，以4000rpm离心10min，去上清收集沉淀，40℃干燥2h。结果表明，该条件下发酵产生丁醇13.5g/L，消耗葡萄糖82g/L，收集沉淀28.9g/L；向质量浓度为2%的硫酸中按40g/L加入上述沉淀，酸解后，于在121℃下灭菌锅中反应60min，冷却后将pH调至6.0；
（3）按以下组分比例配制纤维素酶发酵培养基：麦麸30g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸铵4.8g/L，氯化钙0.3g/L，硫酸镁0.3g/L，ZnSO4•7H2O 6.3mg/L，MnSO4•4H2O 1.6mg/mL，CoCl24mg/L，FeSO4 2mg/L和步骤（2）得到的产物，培养基中按酸解前固形物沉淀的质量计为40g固体/L培养基，接种CN105647813A所提供的绿色木霉（Trichodermaviride）F4，采用批次发酵，菌种的接种体积比为10%，发酵温度为30.5℃，pH 6.0，搅拌速率为400r/min，发酵144h后取样分析发酵液的滤纸酶活和β-葡萄糖苷酶活。分析结果表明，滤纸酶活达到15.8IU/mL，β-葡萄糖苷酶活平均为3.7 IU/mL。
实施例2
除步骤（3）中向纤维素酶发酵培养基中按酸解前固形物沉淀的质量计为20g固体/L培养基加入步骤（2）的产物外，其他同实施例1。发酵144h后取样分析发酵液的滤纸酶活和β-葡萄糖苷酶活。分析结果表明，滤纸酶活达到12.4 IU/mL，β-葡萄糖苷酶活平均为2.2IU/mL。
实施例3
除步骤（3）中向纤维素酶发酵培养基中按酸解前固形物沉淀的质量计为80g固体/L培养基加入步骤（2）的产物外，其他同实施例1。发酵144h后取样分析发酵液的滤纸酶活和β-葡萄糖苷酶活。分析结果表明，滤纸酶活达到14.1 IU/mL，β-葡萄糖苷酶活平均为2.8IU/mL。
实施例4
除步骤（3）中纤维素酶发酵中使用CN101899398A所提供的黑曲霉（Aspergillusniger）T2作为发酵菌种外，其他同实施例1。分析结果表明，滤纸酶活达到9.3IU/mL，β-葡萄糖苷酶活平均为6.5 IU/mL。
对比例1
按照实施例1中步骤（3），除纤维素酶发酵培养基中未加入步骤（2）得到的产物外，其他条件同实施例1步骤（3）。分析结果表明，滤纸酶活达到6.5 IU/mL，β-葡萄糖苷酶活平均为1.8 IU/mL。
对比例2
除步骤（3）中以相同量的酸处理玉米芯代替步骤（2）的产物外，其他同实施例1。分析结果表明，滤纸酶活达到12.5 IU/mL，β-葡萄糖苷酶活平均为2.5 IU/mL。
对比例3
除步骤（2）中不用质量浓度为2%的硫酸进行酸处理外，其他同实施例1。分析结果表明，滤纸酶活达到7.3 IU/mL，β-葡萄糖苷酶活平均为2.0 IU/mL。
Claims (8)
1.一种促进生物发酵产纤维素酶的方法，以保藏编号为CGMCC No. 9124的拜氏梭菌XH0906接种至丁醇发酵培养基中，发酵生产丁醇，所述丁醇发酵培养基中的碳源为50-150g/L的葡萄糖或相当含糖量的木质纤维素糖化液，还包括蛋白胨5-10g/L、牛肉膏4-8g/L、硫酸铵0.5-1.0g/L、硫酸铁0.05-0.2g/L、硫酸镁0.1-0.5g/L；将发酵产物除去丁醇后，先加入乙醇，收集沉淀，向沉淀中加入硫酸或盐酸酸解，酸解产物加入至纤维素酶发酵菌种的培养基中，酸解产物向纤维素酶发酵菌种的培养基的添加比例按酸解前固形物沉淀的质量计为20-100g固体/L培养基，之后接种纤维素酶发酵菌种，促进纤维素酶的发酵生产，纤维素酶发酵菌种为保藏编号是CGMCC No.2736的绿色木霉（Trichoderma viride）F4。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，拜氏梭菌XH0906发酵产丁醇的发酵温度为30-38℃，控制pH为5.0-8.0，发酵时间为72-120h。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵产物除去丁醇的方法是蒸馏法。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵产物除去丁醇后按3-8倍体积加入乙醇，混匀反应后，离心或过滤收集沉淀，40-60℃干燥2-4h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硫酸或盐酸的质量浓度为0.5%-5%。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，酸解处理后还需经过灭菌处理，灭菌处理后，调节pH至5.5-7.0。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纤维素酶发酵菌种的培养基还包括以下组分：麦麸10-60g/L，磷酸二氢钾0.1-10g/L，硫酸铵1-10g/L，氯化钙 0.01-3g/L，硫酸镁0.01-3g/L，ZnSO4·7H2O 0.01-50mg/L，MnSO4·4H2O 0.01-20mg/mL，CoCl2 0.01-50mg/L和FeSO4 0.1-20mg/L。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，纤维素酶发酵采用批次发酵，菌种的接种体积比为5%-15%，发酵温度为23-35℃，pH为4.0-7.0，发酵时间为48-168h。
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