CN101250493B - 固、液二步发酵工艺生产饲用嗜酸乳杆菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了固、液二步发酵工艺生产饲用嗜酸乳杆菌的方法，属于微生物技术领域。该方法包括(1)解脂假丝酵母(Yarrowia lipolytica)的菌种培养；(2)解脂假丝酵母的固体发酵培养；(3)嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)的菌种培养；(4)嗜酸乳杆菌的液体发酵培养；(5)嗜酸乳杆菌发酵液的吸附处理与包装等步骤。本发明以豆粕、麸皮、玉米粉等廉价、易得农付产品为原料，经固、液二步发酵生产饲用嗜酸乳杆菌，具有生产成本低；生长繁殖快，产量高等特点，克服了以往饲用嗜酸乳杆菌生产成本过高的难题，可在畜、禽饲料生产企业中推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及以解脂假丝酵母的固体发酵和嗜酸乳杆菌的液体发酵二步工艺，生产饲用嗜酸乳杆菌的方法。
背景技术
饲用微生物活菌制剂，能维持、调整动物肠道内微生态平衡，直接或间接对病原菌起干扰、排除、拮抗作用，从而提高抗病能力，提高动物生产水平。由于具有无抗药性、无残留，且具有提高动物生产性能和预防疾病的作用，可克服长期大量使用抗生素造成的一些不良后果，被认为是抗生素潜在的、天然的、对环境和健康无害的替代物。嗜酸乳杆菌具有较强的耐酸、耐盐和耐胆汁盐能力，不用任何处理就能顺利通过胃肠环境而有效定殖于动物肠道内形成优势种群，而且其产的乳酸和乳酸菌素可直接作用于病源细菌。这是其它饲用微生物活菌剂无法比拟的。嗜酸乳杆菌这种独特的生理、生化特性被认为是最理想的促生长替代抗生素的活菌剂，具有广阔的发展应用前景。
由于嗜酸乳杆菌的营养条件要求苛刻，目前主要是以牛奶为基本培养基，再添加牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、葡萄糖等物质，或以MRS培养基为基本培养基，再添加一些生长刺激物，但因这些用来做培养基的物质，市场售价较麸皮、豆粕、玉米粉等普通农副产品贵出许多倍，用这些物质来生产嗜酸乳杆菌，其成本对医药行业来说尚能接受，但对养殖行业作为饲料添加剂来说难以承受。而其它有些方法生产成本虽然不高，如采用红糖或葡萄糖再加上蛋白胨和无机盐等，但发酵水平极低，菌数只有或小于108级别，达不到好的应用效果。这些问题均阻碍了嗜酸乳杆菌的生产与在养殖行业的推广、应用。
发明内容
本发明目的在于，针对目前嗜酸乳杆菌发酵生产中所存在的，或效果虽好但生产成本过高，或虽成本不高但其发酵水平太低，达不到饲料工业应用效果等缺陷，提供一种以价格低廉、材料易得的农副产品为原料，辅以合理的发酵工艺，达到提高发酵水平、降低生产成本的生产饲用嗜酸乳杆菌的方法。
本发明目的通过以下技术方案得以实现。
固、液二步发酵工艺生产饲用嗜酸乳杆菌的方法，该方法按以下步骤进行：
(1)解脂假丝酵母(Yarrowia lipolytica)的菌种培养：
①液体试管种子培养：采用10°Bx糖化麦芽汁为培养基，121℃、20分钟灭菌后，接入解脂假丝酵母原始斜面菌种，28～30℃静止培养24～30h后，于0～4℃保存，备用；
②三角瓶种子培养：500ml的三角瓶中装由麸皮、玉米粉和磷酸氢二铵按重量份70～90∶20～30∶0.5～1比例配制而成的培养基20～30g，加水量为固形物重量的1～1.5倍，经0.1Mpa灭菌30min后，每瓶接种步骤(1)①液体试管种子2ml，28～30℃培养36～42h后，于0～4℃保存，备用；
(2)解脂假丝酵母的固体发酵培养：
固体发酵培养基为豆粕、麸皮、玉米粉和磷酸氢二铵按重量份30～60∶30～60∶10～30∶0.5～1比例配制而成，加与固形物同等重量水，0.1Mpa灭菌30min；将步骤(1)②每三角瓶种子加150～300ml无菌水充分搅拌后，按每瓶种子：以固形物重量计的10～20公斤固体发酵培养基比例接种，于25～30℃室温条件下进行曲盘固体发酵，发酵物料厚度为2-3cm，培养24～30h，至细胞数达到每克干物质60亿时停止发酵，将发酵物65℃下烘干、粉碎、储存，备用；
(3)嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)的菌种培养：
①一级菌种培养：在300ml三角瓶中装入200ml液体MRS培养基，121℃、15分钟灭菌后接入嗜酸乳杆菌原种斜面菌种，经37～40℃培养30～36h后，于0～4℃保存，备用；
②二级菌种培养：取步骤(2)干粉状的解脂假丝酵母固体发酵培养物和葡萄糖及水按6～10∶1～4∶100的比例，拌匀、调浆后，加热至85～100℃，保持5min灭菌；冷却至40℃，按发酵体积2～3％的用量接入步骤(3)①一级菌种，于37～40℃静止培养8～10h时搅拌一次，再继续培养4～6h至嗜酸乳杆菌活菌数达50亿CFU/ml以上时终止培养，室温保存，备用；
(4)嗜酸乳杆菌的液体发酵培养：
取步骤(2)干粉状的解脂假丝酵母固体发酵培养物和葡萄糖及水按6～10∶1～4∶100的比例，拌匀、调浆后，加热至85～100℃，保持5min灭菌；培养液冷却到40℃，按发酵体积3～5％的用量接入步骤(3)②二级菌种子，于37～40℃静止培养6～8h时搅拌一次，再继续培养6～8h至嗜酸乳杆菌活菌数达55～80亿CFU/ml时发酵结束；
(5)嗜酸乳杆菌发酵液的吸附处理与包装：
将步骤(4)嗜酸乳杆菌液体发酵物和以碳酸钙、玉米粉和色拉油按重量份10～20∶75～80∶1～5比例配制而成的吸附剂，按体积、重量1L∶1～2Kg比例进行吸附处理后，在不高于40℃条件下烘干、粉碎、包装成产品。
本发明的有益效果是，以豆粕、麸皮、玉米粉等廉价、易得农付产品为原料，经解脂假丝酵母发酵后所得到的分解产物和代谢物作为嗜酸乳杆菌的生长繁殖所需要的营养物的固、液二步发酵法来生产饲用嗜酸乳杆菌，具有生产成本低，50亿CFU/g的产品生产成本小于10元/Kg；且生长繁殖快，12～16小时嗜酸乳杆菌繁殖完成；产量高，发酵水平达到55～80亿/ml的特点，克服了以往由于以MRS为发酵培养基或在MRS培养基中再添加其它物质来生产嗜酸乳杆菌而导致生产成本高，阻碍其在饲料工业上推广应用的难题，能极大地推动嗜酸乳杆菌的广泛应用。
具体实施方式：
通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但其发明内容并不受这些内容所限止。
本发明从中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)引进解脂假丝酵母(Yarrowia lipolytica 2.2087)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus 1.1854)
葡萄糖：厦门同永兴化工有限公司 食品级
磷酸氢二铵：太仓市创利化工有限公司(NH4)2HPO4含量98.5％
碳酸钙：长兴县玉峰微粉厂CaCO3含量99％
实施例1：(生产饲用嗜酸乳杆菌方法1)
本发明具体工艺如下：
(1)解脂假丝酵母(Yarrowia lipolytica)的菌种培养：
①液体试管种子培养：
采用10°Bx糖化麦芽汁培养基：取大麦芽一定数量，粉碎，加4倍于麦芽重量的60℃水，在55～60℃保温糖化，不断搅拌，经3～4小时后，用纱布过滤，除去残渣，煮沸后用滤纸过滤一次，即得澄清麦芽汁，再加水稀释成10°Bx麦芽汁；试管液体麦芽汁培养基121℃、20分钟灭菌后，挑取少许保存的解脂假丝酵母原始菌种接种至麦芽汁培养基中，28～30℃静止培养24～30h后，于0～4℃保存，备用；
②三角瓶种子培养：
每个500ml的三角瓶中装入由麸皮，玉米粉和磷酸氢二铵按重量份70∶30∶0.5比例配制而成的固形物20克，并按固形物重1.5倍加水30ml，拌匀，0.1Mpa灭菌30min后，每瓶接种步骤(1)①解脂假丝酵母菌液体试管种子2ml，28～30℃培养36-42h后，于0～4℃保存，备用；
(2)解脂假丝酵母的固体发酵培养：
固体发酵培养基为豆粕、麸皮、玉米粉和磷酸氢二铵按重量份30∶60∶10∶0.5比例配制而成，加等重量水后，0.1Mpa灭菌30min，将步骤(1)②每三角瓶种子加150ml无菌水，经充分搅拌后，按每瓶种子：以固形物重量计10公斤固体发酵培养基的比例接种，发酵物料厚度为2cm，于25～30℃室温条件下进行曲盘固体发酵，培养24～30h，至细胞数达到每克干物质60亿时停止发酵，将发酵物65℃下烘干、粉碎、储存，备用；
(3)嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)的菌种培养：
①一级菌种培养：
培养基采用MRS培养基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母浸膏5，乙酸钠5，柠檬酸氢二铵2，葡萄糖20，磷酸氢二钾2，硫酸镁0.58，硫酸锰0.25，吐温1ml，121℃灭菌15min；
在300ml的三角瓶中，装MRS培养基200ml，挑取少许保存的嗜酸乳杆菌原种斜面培养物接入MRS培养基，37～40℃培养30～36h后，于0～4℃保存，备用；
②二级菌种培养：在4升的种子发酵罐中，取步骤(2)干粉状的解脂假丝酵母固体发酵培养物和葡萄糖及水按重量6∶4∶100的比例，拌匀、调浆后，加热至85～100℃，保持5min灭菌；冷却至40℃，按发酵体积2％的用量接入步骤(3)①一级菌种，于37～40℃静止培养8～10h时搅拌一次，再继续培养4～6h至嗜酸乳杆菌活菌数达50亿CFU/ml以上时终止培养，室温保存，备用；
(4)嗜酸乳杆菌的液体发酵培养：
在70升发酵罐中，取步骤(2)干粉状的解脂假丝酵母固体发酵培养物和葡萄糖及水按重量6∶4∶100的比例，拌匀、调浆后，加热至85～100℃，保持5min灭菌；培养液冷却到40℃，按发酵体积3％的用量接入步骤(3)②二级菌种子，于37～40℃静止培养6～8h时搅拌一次，再继续培养6～8h至嗜酸乳杆菌活菌数达55～80亿CFU/ml时发酵结束；
(5)嗜酸乳杆菌发酵物的处理与包装：
将步骤(4)嗜酸乳杆菌液体发酵物和以碳酸钙、玉米粉和色拉油按重量份10∶80∶1比例配制而成的吸附剂，按体积与重量(L/kg)1∶2比例进行吸附处理后，在不高于40℃条件下烘干、粉碎成40目后、包装成产品。
实施例2：(生产饲用嗜酸乳杆菌方法2)
本例中，(1)解脂假丝酵母(Yarrowia lipolytica)的菌种培养：②三角瓶种子培养：每个500ml的三角瓶中装入由麸皮，玉米粉和磷酸氢二铵按重量份80∶25∶0.8比例配制而成的固形物为25克，并按固形物重1.3倍加水32.5ml；
(2)解脂假丝酵母的固体发酵培养：固体发酵培养基为豆粕、麸皮、玉米粉和磷酸氢二铵按重量份45∶45∶20∶0.8比例配制而成，加等重量水后，0.1Mpa灭菌30min，将步骤(1)②每三角瓶种子加200ml无菌水，经充分搅拌后，按每瓶种子：以固形物重量计15公斤固体发酵培养基的比例接种，发酵物料厚度为2.5cm；
(3)嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)的菌种培养：②二级菌种培养：在4升的种子发酵罐中，取步骤(2)干粉状的解脂假丝酵母固体发酵培养物和葡萄糖及水按重量8∶3∶100的比例，拌匀、调浆后，加热至85～100℃，保持5min灭菌；冷却至40℃，按发酵体积2.5％的用量接入步骤(3)①一级菌种；
(4)嗜酸乳杆菌的液体发酵培养：在70升发酵罐中，取步骤(2)干粉状的解脂假丝酵母固体发酵培养物和葡萄糖及水按重量8∶3∶100的比例，拌匀、调浆后，加热至85～100℃，保持5min灭菌；培养液冷却到40℃，按发酵体积4％的用量接入步骤(3)②二级菌种子；
(5)嗜酸乳杆菌发酵物的处理与包装：将步骤(4)嗜酸乳杆菌液体发酵物和以碳酸钙、玉米粉和色拉油按重量份15∶78∶3比例配制而成的吸附剂，按体积与重量(L/Kg)1∶1.5比例进行吸附处理。
其余工艺、步骤同实施例1。
实施例3：(生产饲用嗜酸乳杆菌方法3)
本例中，(1)解脂假丝酵母(Yarrowia lipolytica)的菌种培养：②三角瓶种子培养：每个500ml的三角瓶中装入由麸皮，玉米粉和磷酸氢二铵按重量份90∶20∶1比例配制而成的固形物为30克，并按固形物重1倍加水30ml；
(2)解脂假丝酵母的固体发酵培养：固体发酵培养基为豆粕、麸皮、玉米粉和磷酸氢二铵按重量份60∶30∶30∶1比例配制而成，加等重量水后，0.1Mpa灭菌30min，将步骤(1)②每三角瓶种子加300ml无菌水，经充分搅拌后，按每瓶种子：以固形物重量计20公斤固体发酵培养基的比例接种，发酵物料厚度为3cm；
(3)嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)的菌种培养：②二级菌种培养：在4升的种子发酵罐中，取步骤(2)干粉状的解脂假丝酵母固体发酵培养物和葡萄糖及水按重量10∶1∶100的比例，拌匀、调浆后，加热至85～100℃，保持5min灭菌；冷却至40℃，按发酵体积3％的用量接入步骤(3)①一级菌种；
(4)嗜酸乳杆菌的液体发酵培养：在70升发酵罐中，取步骤(2)干粉状的解脂假丝酵母固体发酵培养物和葡萄糖及水按重量10∶1∶100的比例，拌匀、调浆后，加热至85～100℃，保持5min灭菌；培养液冷却到40℃，按发酵体积5％的用量接入步骤(3)②二级菌种子；
(5)嗜酸乳杆菌发酵物的处理与包装：将步骤(4)嗜酸乳杆菌液体发酵物和以碳酸钙、玉米粉和色拉油按重量份20∶75∶5比例配制而成的吸附剂，按体积与重量(L/Kg)1∶1比例进行吸附处理。
其余工艺、步骤同实施例1。
Claims (1)
1.固、液二步发酵工艺生产饲用嗜酸乳杆菌的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
(1)解脂假丝酵母(Yarrowia lipolytica)的菌种培养：
①液体试管种子培养：采用10°Bx糖化麦芽汁为培养基，121℃、20分钟灭菌后，接入解脂假丝酵母原始斜面菌种，28～30℃静止培养24～30h后，于0～4℃保存，备用；
②三角瓶种子培养：500ml的三角瓶中装由麸皮、玉米粉和磷酸氢二铵按重量份70～90∶20～30∶0.5～1比例配制而成的培养基20～30g，另按固形物重量的1～1.5倍加水，经0.1Mpa灭菌30min后，每瓶接种步骤(1)①液体试管种子2ml，28～30℃培养36～42h后，于0～4℃保存，备用；
(2)解脂假丝酵母的固体发酵培养：
固体发酵培养基为豆粕、麸皮、玉米粉和磷酸氢二铵按重量份30～60∶30～60∶10～30∶0.5～1比例配制而成，加与固形物同等重量水，0.1Mpa灭菌30min；将步骤(1)②每三角瓶种子加150～300ml无菌水充分搅拌后，按每瓶种子：以固形物重量计的10～20公斤固体发酵培养基比例接种，于25～30℃室温条件下进行曲盘固体发酵，发酵物料厚度为2-3cm，培养24～30h，至细胞数达到每克干物质60亿时停止发酵，将发酵物65℃下烘干、粉碎、储存，备用；
(3)嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)的菌种培养：
①一级菌种培养：在300ml三角瓶中装入200ml液体MRS培养基，121℃、15分钟灭菌后接入嗜酸乳杆菌原种斜面菌种，经37～40℃培养30～36h后，于0～4℃保存，备用；
②二级菌种培养：取步骤(2)干粉状的解脂假丝酵母固体发酵培养物和葡萄糖及水按6～10∶1～4∶100的比例，拌匀、调浆后，加热至85～100℃，保持5min灭菌；冷却至40℃，按发酵体积2～3％的用量接入步骤(3)①一级菌种，于37～40℃静止培养8～10h时搅拌一次，再继续培养4～6h至嗜酸乳杆菌活菌数达50亿CFU/ml以上时终止培养，室温保存，备用；
(4)嗜酸乳杆菌的液体发酵培养：
取步骤(2)干粉状的解脂假丝酵母固体发酵培养物和葡萄糖及水按重量6～10∶1～4∶100的比例，拌匀、调浆后，加热至85～100℃，保持5min灭菌；培养液冷却到40℃，按发酵体积3～5％的用量接入步骤(3)②二级菌种子，于37～40℃静止培养6～8h时搅拌一次，再继续培养6～8h至嗜酸乳杆菌活菌数达55～80亿CFU/ml时发酵结束；
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将步骤(4)嗜酸乳杆菌液体发酵物和以碳酸钙、玉米粉和色拉油按重量份10～20∶75～80∶1～5比例配制而成的吸附剂，按体积与重量1L∶1～2Kg比例进行吸附处理后，在不高于40℃条件下烘干、粉碎、包装成产品。
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