CN101240327A - 一种检测少儿肥胖遗传易感风险的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测少儿肥胖遗传易感风险的试剂盒。该试剂盒包括检测载脂蛋白E基因(APOE)上rs429358号SNP位点和rs7412号SNP位点的特异性引物对及DNA测序引物、检测脂蛋白脂酶基因(LPL)上rs320号SNP位点、瘦素(LEP)基因上rs13306517号SNP位点和过氧化物酶体增生激活受体γ(PPARγ)基因上rs1801282号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、荧光定量PCR常规组件、PCR反应组件、PCR产物纯化组件、DNA测序反应组件等。本发明的试剂盒通过同时检测与少儿肥胖遗传易感风险密切相关的APOE、LPL、LEP、PPARγ基因上的单核苷酸多态性位点基因型来评估少儿肥胖遗传易感风险。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测少儿肥胖遗传易感风险的试剂盒，通过同时检测载脂蛋白E基因(APOE)、脂蛋白脂酶基因(LPL)、瘦素(LEP)编码基因和过氧化物酶体增生激活受体γ基因(PPARγ)上的单核苷酸多态性位点基因型来评估少儿肥胖遗传易感风险。
背景技术
肥胖症是一种热量代谢障碍，摄入热量超过消耗的热量，引起体内脂肪积聚过多所致。一般认为超过按身高(长)所测标准体重20％即为肥胖。目前，我国小儿肥胖症发病率有逐年上升趋势，已从5％以下提高到10％以上，单纯肥胖症发病率达5％-8％。少儿肥胖与许多成年期慢性病如高血压、高血脂、糖尿病、动脉粥样硬化性心脑血管疾病有非常密切关系，肥胖导致这些疾病的患病率和死亡率急剧上升，使人群健康水平下降。因此，正确认识少儿肥胖症，从少儿期着手预防和治疗肥胖症十分重要。
少儿肥胖病因主要有：摄入热量过多；运动过少热量消耗少；遗传影响；神经中枢调节；内分泌代谢失调；心理因素。近年来对肥胖症的遗传基因研究甚多，人类肥胖属于多基因遗传，遗传在肥胖发病中起一个易发作用，与其他发病因素相互作用。已知，编码载脂蛋白E(APOE)、脂蛋白脂酶(LPL)、瘦素(LEP)和过氧化物酶体增生激活受体γ(PPARγ)的四种基因与少儿肥胖有密切关系。
APOE是一个主要的乳糜微粒的辅基蛋白，可以与肝脏细胞或者周围细胞上的受体结合，对于甘油三酯蛋白的正常分解代谢是非常重要的。APOE蛋白最常见的三种亚型为APOE2，-E3和-E4，分别由三种单倍型ε2、ε3、ε4构成。这三种亚型在氨基酸编码序列上的差异主要在两个位点，位点A为第130号氨基酸残基，位点B为第176号氨基酸残基。其中E3亚型是最为常见的亚型，被定义为APOE基因的野生型。Cys130Arg对应的SNP为rs429358，碱基变化为T471C；Cys176Arg对应的SNP为rs7412，碱基变化为T609C。Sanghera DK等通过对一组9-10岁女童样本的研究发现，APOE遗传多态性对血脂水平及肥胖程度和血脂水平的关系有明显影响。向伟等采用改良的聚合酶链式反应2限制性片段长度多态性方法分析肥胖及健康少儿APOE基因型，也发现单纯型肥胖少儿有APOE基因多态性的变化。张晓等检测了324名8~12岁单纯肥胖少儿的血脂，测量体重和身高，计算BMI，同时使用多聚酶链反应检测他们的APOE基因型，发现APOE基因多态性可能对单纯肥胖少儿BMI与血脂的关系有一定影响。
LPL基因编码脂蛋白脂酶，该酶在心脏、肌肉和脂肪组织中进行表达，以同型二聚体蛋白的形式行使功能，其分子生物学的作用包括两部分，一部分为甘油三脂的水解酶作用，另一部分则是受体介导的脂蛋白内吞作用的桥梁。LPL蛋白上的位点突变不仅与脂蛋白代谢、血脂水平密切相关，而且还与个体的肥胖易感性有关。脂蛋白脂酶LPL在体内主要参与脂质代谢通路，作为催化酶催化极低密度脂蛋白或者低密度脂蛋白的水解。rs320位点是位于LPL基因第8号内含子的多态，由T到G的改变使原有的HindIII酶切位点消失。Jemaa等对236例法国巴黎肥胖患者(162例女性和74例男性，实测体重＞120％理想体重)LPL基因多态性的分析显示，HindIII多态性与BMI相关(P＜0.05)，而且此基因的变异使个体肥胖易感性增加。李蓉等在2003年通过研究发现，肥胖组H+H+基因型者腰围、VA等反映中心性肥胖的测量指标显著高于非H+H+基因型者，说明LPL基因Hind III多态性与肥胖人群脂肪的向心性聚积有关系。
瘦素(Leptin)又称脂肪抑制素，为肥胖基因(如ob)所编码的蛋白质。瘦素是一种由脂肪组织分泌的多肽，参与体内多个能量代谢过程。其受***于下丘脑和脂肪细胞等靶细胞的膜上；后者拥有相应的信号传导体系，是一个庞大的受体家族。瘦素通过瘦素受体，发挥以下广泛生理功能：抑制食欲，减少摄食；改变自主神经活动，增加代谢率，促使体温上升，减少脂肪储存；降低血浆葡萄糖含量，使胰岛素分泌下降，体重和体内能量储存下降，避免肥胖、胰岛素抵抗、糖尿病和不育；与特异性运输蛋白结合，向下丘脑传递体脂信息，调动一系列神经-体液因素，调节能量代谢，使体脂和体重被控制在相对恒定的水平上。rs13306517是位于ob基因的一个G132A多态，引起ob基因编码的蛋白25位Gln同义替换，可能与瘦素的活性有重要的相关性，从而与个体的肥胖程度相关。2000年Ohshiro Y等对日本人群的研究发现，在53例肥胖个体中，瘦素25CAG等位基因的出现频率明显高于132例非肥胖个体，因此认为瘦素基因25CAG等位基因可能与肥胖症的发生有关，推断其也许会成为日本人群甚至世界人群肥胖症易感性的一个新的遗传标志。吴华等在一项瘦素基因突变与少儿肥胖症的研究中对197例汉族少儿，其中正常体重组68例，轻度肥胖组81例，中/重度肥胖组48例，进行了分析。研究结果显示在正常体重组与中/重度肥胖组之间Codn25位点的基因型频率及等位基因频率的分布差异均存在显著性(P＝0.000，P＝0.001)；瘦素基因Codn25(CAA/CAG)突变与汉族少儿的中/重度肥胖存在相关性，该基因变异对汉族少儿肥胖易感性的影响可能存在肥胖程度的差异。
PPARγ全称过氧化物酶体增生激活受体γ，编码的蛋白属于核受体过氧化物酶体增生激活受体亚家族。PPAR家族成员目前主要发现了三种亚型：α、δ、γ三种亚型。PPARγ编码的蛋白为γ亚型，主要负责脂类的分化代谢以及糖、脂代谢等。rs1801282是位于第三号染色体上PPARγ基因上的一个C/G多态，引起PPARγ基因编码的蛋白第12个氨基酸由Pro(P)变为Ala(A)。在国外多个群体，超过2000对的肥胖病例对照的研究中发现，PPARγ2基因上的A12P多态与肥胖相关的多个指数如：BMI、腰臀比等都有相关，提示该多态位点是重要的肥胖发生相关位点。Beamer对高加索肥胖人群的调查中发现，A12单倍型具有更高的体重指数，并认为该位点可能与人类多因素导致的肥胖综合症相关。张德峰等人对石家庄地区体检人群中抽取104例非肥胖个体及104例肥胖个体进行研究发现肥胖个体中PPARγ2基因有Ala12突变是导致血清瘦素分泌增高、肥胖症发生有密切关系的遗传因素之一。鲁谨等以PCR2RFLP测定232例中国人群的过氧化物增殖物活化受体γ22(PPARγ22)基因型，发现肥胖组(130例)中，携带等位基因Ala12者体重指数(BM I)、臀围和尿酸均显著高于Pro纯合子组，且该多态性与BMI独立相关。提示该多态性与中国人群超重和肥胖相关。
发明内容
根据国家生物基因检测技术应用评估认证中心颁布的《中国人口健康服务基因位点认证规程》，对与少儿肥胖易感性相关的基因位点的支持文献、分子生物学机理研究、中国人群适用性等进行综合分析评估后，APOE基因上rs429358号SNP位点和rs7412号SNP位点、LPL基因上rs320号SNP位点、LEP基因上rs13306517号SNP位点和PPARγ基因上rs1801282号SNP位点通过国家生物基因检测技术应用评估认证中心认定，可用于检测评估少儿肥胖遗传易感风险。
基于APOE、LPL、LEP、PPARγ基因上这5个SNP位点的多态性可用来评估少儿肥胖遗传易感风险的基础上，本发明提供一种检测少儿肥胖遗传易感风险的试剂盒。
该试剂盒包括：
检测APOE基因上rs429358号与rs7412号SNP多态性基因型的特异性引物对及DNA测序引物；
检测LPL基因上rs320号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；
检测LEP基因上rs13306517号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；
检测PPARγ基因上rs1801282号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；
荧光定量PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水等)。
PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、PCR反应缓冲液、去离子水等)；
PCR产物纯化组件(包括SAP酶、Exo I酶、去离子水等)；
DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、70％乙醇溶液、100％乙醇溶液、HIDI溶液、去离子水等)。
本试剂盒中所述的特异性引物对是指针对这5个SNP位点，能特异性扩增出包含这5个SNP位点的DNA片段的引物对。设计这类引物对是本领域技术人员能够轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO：1和2、3和4、5和6、7和8所示序列的引物对。特异性引物对可用常规的合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的引物不限于这四对引物。
本试剂盒中所述的特异性荧光探针对是指针对LPL、LEP、PPARγ基因上这3个SNP位点而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性检测出这3个SNPs位点基因型的Taqman探针对。设计这类探针是本领域技术人员能够轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO：9和10、11和12、13和14所示序列的Taqman探针对。特异性荧光探针对可用常规的探针合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的特异性荧光Taqman探针对不限于这三对探针，所有可用于荧光定量PCR法检测这3个SNPs位点的探针均在本发明范围内。
本试剂盒中所述的DNA测序引物是指针对APOE基因上rs429358号SNP位点和rs7412号SNP位点而设计，能通过DNA测序技术特异性检测出这2个SNPs位点基因型的DNA测序引物。设计这类引物是本领域技术人员能够轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO：15所示序列的DNA测序引物。DNA测序引物可用常规的合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的DNA测序引物不限于这条引物，所有可用于DNA测序技术检测这2个SNPs位点的DNA测序引物均在本发明范围内。
本发明试剂盒的组分和含量包括：
1.荧光定量PCR反应套装
10X荧光定量PCR反应缓冲液3μl，
25mM dNTP混合液0.3μl，
25mM MgCl2溶液1.8μl，
5units/μl Taq DNA聚合酶0.075μl，
20μM特异性引物对每条引物各0.225μl，
10μM特异性荧光探针对每条探针各0.25μl，
去离子水15.975μl。
2.PCR反应套装
10X PCR反应缓冲液2.5μl，
25mM dNTP混合液0.2μl，
25mM MgCl2溶液1.5μl，
5units/μl Taq DNA聚合酶0.125μl，
20μM APOE基因特异性引物对每条引物各0.25μl，
去离子水19.175μl。
3.PCR产物纯化套装
lunits/μl SAP酶0.75μl，
10units/μl ExoI酶0.375μl，
去离子水3.875μl。
4.测序反应套装
25％BigDye mix 1μl，
3.2μM DNA测序引物1μl，
125mM EDTA溶液1μl，
100％乙醇溶液15μl，
70％乙醇溶液30μl，
HIDI溶液8μl，
去离子水2μl。
本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例1.检测试剂盒的使用
步骤1：DNA模板的抽取
用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。
步骤2：荧光定量PCR反应
使用检测试剂盒中的荧光定量PCR套装，其中，含有下列引物对和荧光探针对：
有义引物1：5’-AGGGTGAGATTCCAAGATAA-3’(SEQ ID NO：1)
反义引物1：5’-CAAGCAAATGACTAAAGAGAA-3’(SEQ ID NO：2)
有义引物2：5’-TCTATGTCCAAGCTGTG-3’(SEQ ID NO：3)
反义引物2：5’-GGGTTTTGGTGTCATC-3’(SEQ ID NO：4)
有义引物3：5’-AACTCTGGGAGATTCTC-3’(SEQ ID NO：5)
反义引物3：5’-TATCAGTGAAGGAATCG-3’(SEQ ID NO：6)
带VIC荧光基团探针1：5’-GGATTTAAAGCgTTT-3’(SEQ ID NO：9)
带FAM荧光基团探针1：5’-AGGATTTAAAGCtTT-3’(SEQ ID NO：10)
带VIC荧光基团探针2：5’-ATCCAaAAAGTCCA-3’(SEQ ID NO：11)
带FAM荧光基团探针2：5’-TCCAgAAAGTCCA-3’(SEQ ID NO：12)
带VIC荧光基团探针3：5’-GACcCAGAAAG-3’(SEQ ID NO：13)
带FAM荧光基团探针3：5’-GACgCAGAAAG-3’(SEQ ID NO：14)
有义引物1，反义引物1、带VIC荧光基团探针1、带FAM荧光基团探针1特异地针对检测LPL基因上rs320号SNP位点多态性；
有义引物2，反义引物2、带VIC荧光基团探针2、带FAM荧光基团探针2特异地针对检测LEP基因上rs13306517号SNP位点多态性；
有义引物3，反义引物3、带VIC荧光基团探针3、带FAM荧光基团探针3特异地针对检测PPARγ基因上rs1801282号SNP位点多态性；
3个SNPs位点分别进行3次独立的荧光定量PCR反应，每个反应的体系为总体积10μl，包含浓度为20ng/μl的DNA模板2μl、1μl 10X荧光定量PCR反应缓冲液、0.1μl 25mM dNTP混合液、0.6μl 25mM MgCl2溶液、0.025μl(5units/μl)Taq DNA聚合酶、20μM的有义引物和反义引物各0.225μl、10μM的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针各0.25μl，去离子水5.325μl。
在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50℃、2分钟，95℃、10分钟，进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟。反应结束后在ABI7900型荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。
步骤3：PCR扩增反应
使用检测试剂盒中的PCR反应套装，其中，含有下列引物对：
有义引物：5’-TAAGCTTGCACGGCTGTCCAAGGA-3’(SEQ ID NO：7)
反义引物：5’-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3’(SEQ ID NO：8)
反应的体系为总体积25μl，包含浓度为12.5ng/μl的DNA模板1μl、10X PCR反应缓冲液2.5μl，25mMdNTP混合液0.2μl，25mM MgCl2溶液1.5μl，5units/μl Taq DNA聚合酶0.125μl，20μM APOE特异性引物对每条引物各0.25μl，去离子水19.175μl。
在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为94℃、12分钟，进行30个循环的94℃、30秒，60℃、30秒，72℃、30秒，然后进行72℃、10分钟。
步骤4：PCR产物纯化
使用检测试剂盒中的PCR产物纯化套装，反应体系为总体积25μl，包含步骤3中PCR产物20μl，1units/μl SAP酶0.75μl，10units/μl ExoI酶0.375μl，去离子水3.875μl。
在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37℃、15分钟，72℃、20分钟。
步骤5：DNA测序反应
使用检测试剂盒中的测序反应套装，其中，含有下列APOE基因的DNA测序引物：
DNA测序引物：5’-TAAGCTTGCACGGCTGTCCAAGGA-3’(SEQ ID NO：15)
反应的体系为总体积5μl，包含步骤4中PCR纯化产物1μl，25％BigDye mix 1μl，3.2μM DNA测序引物1μl，去离子水2μl。
在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98℃、2分钟，进行25个循环的96℃、30秒，55℃、30秒，60℃、4分钟。
反应结束后加入125mM EDTA溶液1μl和100％乙醇溶液15μl，于室温下沉淀15分钟；在4℃以3650转/分的转速离心30分钟，轻轻倒去上清液；加入70％乙醇溶液30μl，以3650转/分的转速离心15分钟，轻轻倒去上清液；室温放置20分钟后加入HIDI溶液8μl，放入测序仪中。
步骤6：基因型分析
熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根据不同序列探针VIC和FAM荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。
熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的SNP位点的基因型。
实施例2.进行少儿肥胖遗传易感风险检测的服务
步骤1：DNA提取
由医院检验科医师指导被检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用硅胶吸附法进行口腔上皮细胞的DNA抽提。
步骤2：基因分型检测
使用本发明提供的试剂盒，对APOE基因上rs429358号SNP位点和rs7412号SNP位点进行DNA测序检测，对被检测者基因组DNA的LPL基因上rs320号SNP位点、LEP基因上rs13306517号SNP位点、PPARγ基因上rs1801282号SNP位点进行荧光定量PCR检测，确定这5个SNPs位点的基因型。
步骤3：少儿***肥胖易感遗传风险的分析
通过对被检测者SNPs基因型的分析，出具少儿肥胖遗传易感风险的分析报告单。报告中详细说明了被检测少儿肥胖遗传易感风险的高低，并由医师向被检者详细说明和解读少儿肥胖遗传易感风险分析报告单。
序列表
<110>上海主健生物工程有限公司
<120>一种检测少儿肥胖遗传易感风险的试剂盒
<160>15
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
AGGGTGAGAT TCCAAGATAA 20
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
CAAGCAAATG ACTAAAGAGA A 21
<210>3
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
TCTATGTCCA AGCTGTG 17
<210>4
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
GGGTTTTGGT GTCATC 16
<210>5
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>5
AACTCTGGGA GATTCTC 17
<210>6
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>6
TATCAGTGAA GGAATCG 17
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>7
TAAGCTTGCA CGGCTGTCCA AGGA 24
<210>8
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>8
ACAGAATTCG CCCCGGCCTG GTACAC 26
<210>9
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>9
GGATTTAAAG CgTTT 15
<210>10
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>10
AGGATTTAAA GCtTT 15
<210>11
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>11
ATCCAaAAAG TCCA 14
<210>12
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>12
TCCAgAAAGT CCA 13
<210>13
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>13
GACcCAGAAA G 11
<210>14
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>14
GACgCAGAAA G 11
<210>15
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>15
TAAGCTTGCA CGGCTGTCCA AGGA 24
Claims (8)
1. 一种检测少儿肥胖遗传易感风险的试剂盒，其特征在于：包括检测载脂蛋白E基因(APOE)上rs429358号SNP位点和rs7412号SNP位点的特异性引物对及DNA测序引物、检测脂蛋白脂酶基因(LPL)上rs320号SNP位点、瘦素(LEP)基因上rs13306517号SNP位点和过氧化物酶体增生激活受体γ(PPARγ)基因上rs1801282号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、PCR反应缓冲液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix，EDTA溶液、70％乙醇溶液、100％乙醇溶液、HIDI溶液、去离子水等。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的特异性引物对是指针对载脂蛋白E基因(APOE)上rs429358号SNP位点和rs7412号SNP位点、脂蛋白脂酶基因(LPL)上rs320号SNP位点、瘦素(LEP)基因上rs13306517号SNP位点和过氧化物酶体增生激活受体γ(PPARγ)基因上rs1801282号SNP位点，能特异性扩增出包含这5个SNP位点的DNA片段的引物对。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的特异性荧光探针对是指针对脂蛋白脂酶基因(LPL)上rs320号SNP位点、瘦素(LEP)基因上rs13306517号SNP位点和过氧化物酶体增生激活受体γ(PPARγ)基因上rs1801282号SNP位点而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性检测出这3个SNPs位点基因型的Taqman探针对。
4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的DNA测序引物是指针对APOE基因上rs429358号SNP位点和rs7412号SNP位点而设计，能通过DNA测序技术特异性检测出这2个SNPs位点基因型的DNA测序引物。
5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所含的特异性引物对选自具有SEQ ID NO：1和2、3和4、5和6、7和8所示序列的引物对。
6. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所含的特异性荧光探针选自具有SEQ ID NO：9和10、11和12、13和14所示序列的Taqman探针对。
7. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所含的DNA测序引物选自具有SEQ ID NO：15所示序列的引物。
8. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括：
1)荧光定量PCR反应套装：10X荧光定量PCR反应缓冲液3μl，25mM dNTP混合液0.3μl，25mM MgCl2溶液1.8μl，5units/μl Taq DNA聚合酶0.075μl，20μM特异性引物对每条引物各0.225μl，10μM特异性荧光探针对每条探针各0.25μl，去离子水15.975μl。
2)PCR反应套装：10X PCR反应缓冲液2.5μl，25mM dNTP混合液0.2μl，25mM MgCl2溶液1.5μl，5units/μl Taq DNA聚合酶0.125μl，20μM特异性引物对每条引物各0.25μl，去离子水19.175μl。
3)PCR产物纯化套装：1units/μl SAP酶0.75μl，10units/μl ExoI酶0.375μl，去离子水3.875μl。
4)测序反应套装：25％BigDye mix 1μl，3.2μM DNA测序引物1μl，125mM EDTA溶液1μl，100％乙醇溶液15μl，70％乙醇溶液30μl，HIDI溶液8μl，去离子水2μl。
本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。
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