CN101240312A - 一种源于鱼皮的ace抑制肽的制备方法 - Google Patents

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刘伟
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Abstract

一种源于鱼皮的ACE抑制肽的制备方法，它以罗非鱼鱼皮为原料，水提罗非鱼鱼皮中的鱼皮蛋白，采用蛋白酶进行水解，经灭酶、脱苦、脱色、脱味、过滤、离子交换和浓缩等工序得到鱼皮蛋白酶解液(TSP－I)，将TSP－I超滤(截流分子量为9000Da)处理后，再经SephadexG－15凝胶层析收集高活性组分，冷冻干燥制得高活性的ACE抑制肽产品。本发明对于实现罗非鱼废弃物的综合利用，提高其附加值具有重要意义。

Description

一种源于鱼皮的ACE抑制肽的制备方法
技术领域
本发明涉及一种源于鱼皮的ACE抑制肽的制备方法。
背景技术
血管紧张素转化酶(ACE)对血压调节起着重要的作用，在人体的肾素-血管紧张素***(renin-angiotensin system，RAS)和激肽释放酶-激肽***(kallikrein-kinin system，KKS)中，ACE以血管紧张素I和舒缓激肽为底物，导致血管收缩，引起血压升高。
血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)是现今治疗高血压与心力衰竭的主要有效药物，化学合成的ACE抑制剂在临床使用时暴露了诸多缺陷，如：作用时间短，血压易反弹，对人体内多个部位造成损伤等。源于食物蛋白质的ACE抑制剂-血管紧张素转换酶抑制肽因其食用安全性高，无毒副作用等优点引起了人们的广泛关注。
目前已有人从沙丁鱼、金枪鱼、小麦、玉米、大豆、酸奶、清酒等食品中分离出具有ACE抑制活性的降压肽并显示出了良好的应用前景。
我国是世界最大的罗非鱼生产国，随着鲜鱼片、冻鱼片和条冻鱼出口量的逐年上升，由此产生的大量鱼皮等下脚料需要处理。这些下脚料若不加以有效的利用，不仅会造成极大的浪费，而且还会造成环境的污染。目前，国外对鱼类胶原蛋白的研究较为深入，有关鱼皮胶原蛋白的研究也有不少报道，但是，对罗非鱼鱼皮胶原蛋白的有关研究，既不***，也缺乏深度。
罗非鱼鱼皮含有丰富的胶原蛋白，如果能够对其进行充分利用，通过酶法加工淡水鱼胶原蛋白获得抑制ACE的活性肽，对促进人们生活质量的提高将会收到很好的经济效益与社会效益。
发明内容
本发明的目的是提供一种源于鱼皮的ACE抑制肽的分离纯化技术，获得鱼皮中具有降血压活性的多肽片段。
本发明是这样来实现的，其方法步骤为：
1、预处理：清洗后的鱼皮经脱脂后，依次用0.1mol/L的盐酸溶液和0.1mol/L的氢氧化钠溶液浸泡1hr。
2、水提：预处理后的鱼皮经洗涤至中性后，在45℃条件下，用10倍体积的蒸馏水恒温匀浆12hr后，抽滤提取上清液。
3、酶解：在一定条件下，采用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶进行酶解，比较两种酶的酶解效果，并确定最佳酶解条件。
4、灭酶：采用100℃，20min灭酶。
5、脱苦、脱色、脱味：分别采用活性炭和复合脱色剂(3g/L的活性炭酵母和环糊精等混合而成)对酶解液进行脱苦、脱色、脱味处理，比较两种方法的效果。
6、过滤：酶解液经脱苦、脱色、脱味处理后，再经4000r/min离心过滤获得清液。
7、离子交换：取一定体积的超滤液在常温下以8倍柱体积/h的流速通过001*7(732)强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，收集流出液，再将脱阳离子后的水解液以8倍柱体积/h的流速通过201*7(717)强碱性I型阴离子交换树脂，收集流出液。
8、浓缩：使用旋转蒸发仪，浓缩温度为50℃，蒸发溶液至粘稠状。
9、超滤：选用中空纤维材料，超滤设备的工作压力为28psi，膜渗透通量为9.98LHM，超滤处理时间为40min，进料温度为29℃，料液pH值为6.7。
10、凝胶色谱：收集超滤液进入凝胶色谱进行进一步分离纯化，分离介质为SephadexG-15，色谱柱(1.6×60cm)，柱层析条件：上样量：1.5ml；流速：0.8ml/min；洗脱剂：蒸馏水；检测波长：220nm。
11、测定ACE的抑制率：参照Nakamura等(1995)改进的方法，根据反应体系的大小、乙酸乙酯萃取量、离心时间等具体情况进行了一定研究和修改。分别测定每个组分峰的半数抑制浓度(IC50)，即所测样品对ACE抑制率达50％时所对应的样品浓度。
据表1将各试剂加入到试管中，在37℃水浴中反应30min，反应结束后马上加入1moL/LHCI以终止反应(样品c需提前加入HCl)，静止5min后，于各试管中加入乙酸乙酯(冷)2.0mL，旋涡混合2min后离心10min(4000r/min)，吸取1.5mL乙酸乙酯于另一试管中，放入烘箱中，120℃挥发溶剂30min，冷却后加入去离子水3mL，旋涡混合30sec静止15min后在228nm下测定其吸光值。
表1ACE体外检测抑制率的方法(ul)
  药品   样号
  a   b   c
  HCL   0   0   125
  ACE   0   0   20
  HHL   60   60   60
  抑制剂   40   0   40
  硼酸缓冲液   0   375   0
  37℃水浴预热4-5min
  ACE   20   20   0
  37℃水浴30min
  HCL   125   125   0
计算公式：
Figure S2008100467456D00031
Aa：在反应中ACE和ACE抑制剂同时存在的吸光度值；
Ab：在反应中不加抑制剂的吸光度值；
Ac：ACE与HHL空白反应的吸光度值。
12、冷冻干燥：高活性ACE抑制组分在-80℃预冻8hr后，真空冷冻干燥72hr，即得产品。
本发明的优点是：1、本发明所制备的降血压肽是鱼皮蛋白经过蛋白酶酶解后产生的小分子肽，易于人体快速消化吸收，对高血压患者起降压作用，对血压正常者起保健作用，且无毒副作用，安全性高；2、本发明的原料是罗非鱼鱼皮蛋白，是罗非鱼加工的废弃物，本发明的技术转化为罗非鱼废弃物的有效利用提供了一条新途径；3、本发明工艺科学合理，操作简单，成本低廉，具有较强的工业实施性；4、本发明所得产品可作为药品、保健食品、食品、食品添加剂、药物增剂等，具有广阔的市场应用前景。
具体实施方式
下面结合实例对本发明作进一步详细说明。
实施案例：
称取100.0008g冲洗干净的罗非鱼鱼皮，脱脂处理后依次用700ml 0.1mol/L的盐酸溶液和0.1mol/L的氢氧化钠溶液浸泡1hr，蒸馏水洗涤至中性后，在45℃条件下，用1000ml的蒸馏水恒温匀浆12hr，抽滤提取上清液，升温至50℃-55℃，调节pH值为6.0，加入0.04671g木瓜蛋白酶恒温酶解2hr，然后在100℃高温条件下水浴加热20min，终止酶解反应，即得鱼皮蛋白酶解液，罗非鱼鱼皮蛋白水解度为12.3％。
采用复合脱色剂(3g/L的活性炭酵母和环糊精等混合而成)对鱼皮蛋白酶解液进行脱苦、脱色、脱味处理，4000r/min离心过滤收集上清液。常温下以8倍柱体积/h的流速通过001*7(732)阳离子交换树脂，收集流出液，测得其氮回收率为95.40％，再将脱阳离子后的水解液以8倍柱体积/h的流速通过201*7(717)阴离子交换树脂，收集流出液，测得其氮回收率为93.31％及脱盐率为93.15％。流出液浓缩后，进行超滤处理，超滤设备工作压力为28psi，料液温度为29℃，料液pH为6.7，超滤处理40min得到鱼皮多肽液。
鱼皮多肽液经凝胶色谱分离，分离介质为SephadexG-15，色谱柱规格为1.6×60cm。柱层析条件：上样量：1.5ml；流速：0.8ml/min；洗脱剂：蒸馏水；检测波长：220nm。在此分离条件下得到8个组分，将高活性ACE抑制组分F在-80℃预冻8hr，真空冷冻干燥72hr，即为产品。各组分的半数抑制浓度见表2。
表2各组分的半数抑制浓度(IC50)
  组分   A   B   C   D   E   F   G   H
  IC50(ug/ml)   46.36   69.52   57.88   58.14   22.37   20.08   0   0

Claims (1)

1、一种源于鱼皮的ACE抑制肽的制备方法，其特征是方法步骤为：
(1)预处理：清洗后的鱼皮经脱脂后，依次用0.1mol/L的盐酸溶液和0.1mol/L的氢氧化钠溶液浸泡1hr；
(2)水提：预处理后的鱼皮经洗涤至中性后，在45℃条件下，用10倍体积的蒸馏水恒温匀浆12hr后，抽滤提取上清液；
(3)酶解：在一定条件下，采用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶进行酶解，比较两种酶的酶解效果，并确定最佳酶解条件；
(4)灭酶：采用100℃，20min灭酶；
(5)脱苦、脱色、脱味：分别采用活性炭和复合脱色剂对酶解液进行脱苦、脱色、脱味处理，比较两种方法的效果；
(6)过滤：酶解液经脱苦、脱色、脱味处理后，再经4000r/min离心过滤获得清液；
(7)离子交换：取一定体积的超滤液在常温下以8倍柱体积/h的流速通过732强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，收集流出液，再将脱阳离子后的水解液以8倍柱体积/h的流速通过717强碱性I型阴离子交换树脂，收集流出液；
(8)浓缩：使用旋转蒸发仪，浓缩温度为50℃，蒸发溶液至粘稠状；
(9)超滤：选用中空纤维材料，超滤设备的工作压力为28psi，膜渗透通量为9.98LHM，超滤处理时间为40min，进料温度为29℃，料液pH值为6.7；
(10)凝胶色谱：收集超滤液进入凝胶色谱进行进一步分离纯化，分离介质为SephadexG-15，色谱柱(1.6×60cm)，柱层析条件：上样量：1.5ml；流速：0.8ml/min；洗脱剂：蒸馏水；检测波长：220nm；
(11)冷冻干燥：高活性ACE抑制组分在-80℃预冻8hr后，真空冷冻干燥72hr，即得产品。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Open date: 20080813