CN101239091B - 防治幽门螺杆菌感染的组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种包含原花青素、茯苓多糖和蒲公英的组合物。本发明还涉及所述组合物在制备用于治疗和/或预防与幽门螺杆菌感染相关的疾病的药物、以及食品或保健品中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及药物领域。更具体地说,本发明涉及一种能防治幽门螺杆菌感染作用的组合物,以及该组合物在制备用于防治与幽门螺杆菌感染相关的疾病的药物中的用途。
背景技术
1983年Warren和Marshall发现了幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)。现已证实,幽门螺杆菌是引起胃炎(如慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎等)、消化性溃疡(如十二指肠溃疡及胃溃疡)的主要病因,与胃癌的发生也密切相关。据信感染幽门螺杆菌的个体发生胃肿瘤和MALT(粘膜相关淋巴样)淋巴瘤的风险高2-8倍。世界卫生组织已于上世纪九十年代将幽门螺杆菌列为I级致癌原。幽门螺杆菌的根除对于上述疾病的预防、治疗以及预后都有重要的意义。因此,对慢性胃病的治疗,除使用传统的药物外,还应给予抗幽门螺杆菌药物。2005年Warren和Marshall因此获得了诺贝尔医学或生理学奖。
我国成人幽门螺杆菌感染率高达60%以上。幽门螺杆菌可通过污染水和食物经粪-口或口-口途径感染后进入胃内。胃内幽门螺杆菌大部分游离于黏液层内,只有少数可通过其分泌的黏附素结合于胃上皮细胞。幽门螺杆菌的黏附性是其定植于胃粘膜上皮的必要条件。幽门螺杆菌与胃上皮细胞紧密结合,引发一系列下游事件,导致胃粘膜病变。因此通过抑制或阻断幽门螺杆菌与胃上皮细胞的黏附可以防治幽门螺杆菌感染。同时,研究发现部分患者只产生一过性急性感染而被机体自然清除,说明感染者自身特异性免疫应答的强弱对于幽门螺杆菌感染的清除也是至关重要的。
目前临床上常用的幽门螺杆菌根除方法主要是药物治疗,由制酸剂加两种抗菌药物组成。作用机制是利用抗菌药物的杀菌作用,通过抑制细菌蛋白质合成等机制将细菌杀灭。这些药物治疗虽可获得一定的疗效,但不能预防幽门螺杆菌感染及其引起的胃炎,而且治疗上也存在很大的弊端,如药物副作用较大、患者依从性差、特别是耐药菌株出现及治疗后复发等。尤其值得说明的是,随着抗菌药物的普遍使用甚至是滥用,原发或继发耐药性幽门螺杆菌菌株的发生率正逐年上升,例如上海市幽门螺杆菌对甲硝唑的耐药率由1995年的30%上升至1999年的70%。目前耐药菌株的出现是临床根除幽门螺杆菌失败最主要的原因之一。
我国有着天然的中草药资源,研究表明许多中草药对幽门螺杆菌都有直接抑制作用,目前的抗幽门螺杆菌中药制剂也是针对这一作用机制开发的,但是始终没有获得疗效理想的制剂。
因此,本领域中仍然需要开发出新的抗幽门螺杆菌中药制剂。
发明内容
开发具有不同作用机理的天然植物,尤其是中草药或其提取物将是未来抗幽门螺杆菌研究的方向。这类天然植物或其提取物的优点在于1.副作用小;2.不会产生耐药性。天然植物提取物的机理可以为阻断幽门螺杆菌与胃上皮细胞之间的黏附和调节机体免疫力等。本发明者通过研究发现,将茯苓多糖和蒲公英这两种可以调节机体细胞免疫的中药或提取物添加到原花青素(或蔓越莓果汁)中,可以显著地提高对幽门螺杆菌的防治作用。
为实现上述目的,本发明第一方面提供了一种组合物,其特征在于,所述组合物包含治疗和/或预防幽门螺杆菌感染有效量的原花青素、茯苓多糖和蒲公英。
在一个较优选的实施方案中,所述组合物还包含药学上可接受的载体。
在另一较优选的实施方案中,在所述组合物中,所述原花青素的含量为0.02-100重量份,所述茯苓多糖的含量为0.1-100重量份,所述蒲公英的含量为1-100重量份,所述原花青素、茯苓多糖和蒲公英的总重量为组合物重量的0.01-99.9%重量。
在一个较优选的实施方案中,所述组合物包含治疗和/或预防幽门螺杆菌感染有效量的蔓越莓或其提取物、茯苓多糖和蒲公英。所述蔓越莓或其提取物宜为蔓越莓果汁。尤其是,所述组合物中各组分的比例为,每升蔓越莓果汁中含有0.1-100克茯苓多糖和1-100克蒲公英。
本发明的组合物具有食品学或药剂学上可以接受的任何剂型,例如包括,口服液、片剂、胶囊剂、冲剂、颗粒剂、丸剂、散剂、袋泡茶、饮料类或注射剂。
本发明另一方面涉及本发明的组合物在制备用于治疗和/或预防与幽门螺杆菌感染相关的疾病的药物中的应用。
本发明另一方面涉及本发明的组合物在制备食品或保健品中的应用。
本发明者将原花青素、以及天然的中草药(茯苓多糖和蒲公英)或其提取物结合起来,获得了显著的治疗和/或预防幽门螺杆菌感染的效果。而且,本发明的组合物为天然植物提取物与药食同源的中草药,因此还具有作用机制独特、安全、疗效好等优点。
附图说明
图1显示了在750倍显微镜下观察到的经幽门螺杆菌感染后8周的对照组胃粘膜Giemsa染色情况。
图2显示了在750倍显微镜下观察到的幽门螺杆菌感染后经蔓越莓果汁、茯苓多糖和蒲公英组合治疗后4周的胃粘膜Giemsa染色情况。
具体实施方案
具体而言,本发明第一方面提供了一种组合物,其特征在于,所述组合物包含治疗和/或预防幽门螺杆菌感染有效量的原花青素、茯苓多糖和蒲公英。
适用于本发明的原花青素、茯苓多糖和蒲公英均是本领域技术人员已知的。
原花青素(Proanthocyanidins,PACs)是植物王国中广泛存在的一大类多酚化合物的总称,广泛存在于天然植物中,如葡萄、沙棘、松树皮及越橘类植物中。起初统归于缩合鞣质或黄烷醇类。随着分离鉴定技术的提高和对此类物质的深入研究与深刻认识,现已成为独树一帜的一大类物质并称之为原花青素。PACs是黄烷醇的聚合物,也称缩合鞣质。即由不同数量的黄烷-3-醇(flavan-3-ols)或黄烷-3,4-二醇聚合而成。最简单的原花青素是儿茶素或表儿茶素或儿茶素与表儿茶素形成的二聚体,此外还有三聚体、四聚体等直至十聚体以上。已证实原花青素有多种生物学功能,其中包括抗细菌黏附性的功能。一些植物中的原花青素由于其独特的结构,例如源自蔓越莓的原花青素所具有的A型键合(A-type linkage),而具有较强的抗泌尿道P-菌毛大肠杆菌黏附于尿道上皮细胞的作用。
茯苓多糖已知是茯苓的一种成份。茯苓多糖可以明显增加腹腔巨噬细胞的吞噬功能,增强T淋巴细胞功能,并可激活补体C 3和B因子,有强烈的抗肿瘤作用。
蒲公英又名黄花地丁,是菊科多年生草本植物,具有很高的营养价值。
本领域技术人员可采用现有技术从各种已知的天然植物来源如花生皮、松树皮、葡萄籽等提取得到原花青素,或通过各种市售途径来方便地获得适合用于本发明组合物的原花青素。同样,本领域技术人员可采用现有技术从茯苓的子实体或皮提取获得茯苓多糖或通过各种市售途径来方便地获得适合用于本发明组合物的茯苓多糖。茯苓多糖可以是不同的提取比例。因此,本发明对于原花青素、蒲公英和茯苓多糖的具体获得方式和来源并无特别的限制。
然而,在一个特别佳的实施方案中,本发明的原花青素可以从蔓越莓获得。蔓越莓是原产于北美的一种具有保健作用的天然水果,1816年最早在麻萨诸塞洲、新泽西、维斯康新、华盛顿和俄勒冈的沼泽地或雨水浸过的草地中培育。近年的研究发现蔓越莓可抑制幽门螺杆菌与胃上皮细胞的黏附。本发明者推测是蔓越莓中存在的原花青素实现了这一抑制效果。因此,本发明中一个特别优选的方法是,可采用蔓越莓的果汁或蔓越莓提取物。蔓越莓果汁或蔓越莓提取物可通过市售途径购得,或用常规手段得到(例如可按照Phytochemistry 2005;66:2281-2291中描述的方法提取得到)。在另一实施方案中,本发明的原花青素可以从葡萄籽通过本领域常规方法来提取获得。
本文所用的术语“含有”、“包含”、“包括”在用于表征本发明的组合物时可以互换使用,其含义表示该组合物中除了所列出的组分如原花青素、蒲公英和茯苓多糖之外,还可以含有没有指出的其它某些组分,只要这些组分的存在对于本发明组合物所需要达到的效果没有不利的影响。在一个较优选的实施方案中,本发明的组合物由原花青素、蒲公英和茯苓多糖组成。此处,术语“由……组成”则表示本发明的组合物由所指出的具体组分组成,没有其他组分,但是其可以带有含量在通常范围内的杂质。
本申请组合物中原花青素、蒲公英和茯苓多糖各自的含量可以由本领域技术人员依据常规的实验来确定。在一个较优选的实施方案中,本发明的组合物中含有,以组合物的重量计算,0.01-99%的原花青素、0.01-99%的蒲公英和0.01-99%的茯苓多糖(且三者的总和不超过100%)。在另一较优选的实施方案中,所述组合物中含有,以组合物的重量计算,1-90%的原花青素、1-90%的蒲公英和1-90%的茯苓多糖(且三者的总和不超过100%)。另外,本发明组合物中各个组分的含量也可以通过各个组分之间的重量分数关系来表示。在一个实施方案中,本发明的组合物中含有0.02-100重量份原花青素、0.1-100重量份茯苓多糖和1-100重量份蒲公英。在较优选的实施方案中,本发明的组合物中含有2-80重量份原花青素、0.5-80重量份茯苓多糖和2-80重量份蒲公英。在更优选的实施方案中,本发明的组合物中含有5-50重量份原花青素、1-50重量份茯苓多糖和5-50重量份蒲公英。当本发明的组合物中还含有除原花青素、茯苓多糖和蒲公英之外的其它组分(如药学上可接受的载体或其它用于预防和/或治疗幽门螺杆菌感染的活性成份)时,上述原花青素、茯苓多糖和蒲公英的总量(重量)为本发明组合物重量的0.01-99.9%(重量),较优选的为0.1-90%(重量)、更优选的为0.5-80%(重量)、还要优选的为1-50%(重量)。
在采用蔓越莓果汁时,本发明的组合物宜为液体形式。蔓越莓果汁的浓度可在1-100%之间(较优选的为5-80%)变化,也可以是其浓缩汁(浓缩50倍以内)。本发明的组合物可通过在每升蔓越莓果汁(浓度为10-50%)中加入0.1-100克茯苓多糖和1-100克蒲公英来方便地制得。在一个更优选的实施方案中,每升蔓越莓果汁(浓度为10-50%)中宜含有0.5-80克茯苓多糖和2-80克蒲公英。在一个还要优选的实施方案中,每升蔓越莓果汁(浓度为10-50%)中宜含有1-50克茯苓多糖和5-50克蒲公英。该组合物可以采取浓缩物的形式,或可在服用前作进一步的稀释。
本领域技术人员应当理解,本发明的实质在于发现原花青素(蔓越莓提取物或蔓越莓果汁)、茯苓多糖和蒲公英三个组分之间产生了显著优异的抵抗幽门螺杆菌的效果。因此,本发明的组合物中只需包含治疗和/或预防幽门螺杆菌感染有效量的原花青素(蔓越莓提取物或蔓越莓果汁)、茯苓多糖和蒲公英。本领域技术人员完全能够根据组合物的不同形式和不同用途来确定合适的用量,因此本发明的范围不应受各组分具体含量的限制。
在一个较优选的实施方案中,当本发明的组合物用作药物时,该组合物还可含有药学上可接受的载体。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明组合物中的各组分相容,即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物在治疗和/或预防幽门螺杆菌方面的效果。可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类,如乳糖、葡萄糖和蔗糖;淀粉,如玉米淀粉和土豆淀粉;纤维素及其衍生物,如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素;西黄蓍胶粉末;麦芽;明胶;滑石;固体润滑剂,如硬脂酸和硬脂酸镁;硫酸钙;植物油,如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油;多元醇,如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇;海藻酸;乳化剂,如Tween;润湿剂,如月桂基硫酸钠;着色剂;调味剂;压片剂、稳定剂;抗氧化剂;防腐剂;无热原水;等渗盐溶液;和磷酸盐缓冲液等,其中较优选的载体是生理盐水、或磷酸盐缓冲盐水。
本发明的原花青素(尤其是蔓越莓提取物或蔓越莓果汁)、茯苓多糖和蒲公英的组合还可以和其它药物联用。因此,在另一优选的实施方案中,本发明的组合物中还可含有其它具有防治幽门螺杆菌效果的药物、抗生素和/或酸分泌抑制剂。
当本发明的组合物用作药物时,本发明的组合物可以制成各种医学上可接受的剂型,并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。本发明所述制剂是指口服液、注射剂、舌下含服剂等多种液体剂型,或通过加以适当的赋形剂制备成片剂、胶囊剂等多种其他剂型。在较优选的实施方案中,本发明的组合物可以制成口服剂型,例如包括,但不局限于,口服液、片剂、胶囊剂、冲剂、颗粒剂、丸剂、散剂等。
本发明组合物中的各个活性组分,如原花青素、茯苓多糖和蒲公英,可以存在同一制剂或剂型中,也可以分开存在于同一药物的不同的剂型中,直至使用前由使用者混合后进行给药。
在另一个较优选的实施方案中,本发明中的原花青素、茯苓多糖和蒲公英的组合可加入食品中,因此本发明的组合物中还可含有其它食品组分。在这种情况下,本发明的组合物可以制成食品上能够接受的任何固体或液体的形式,例如包括,但不局限于:1)乳制品:奶酪、黄油、牛奶和其它乳制饮料、涂在面包上的软质食品和乳制品混合物、冰淇淋和酸奶;2)以脂肪为基础的制品:如麦淇淋、涂在面包上的软质食品、蛋黄酱、起酥、烹饪和油炸用油和调味品;3)以谷物为基础的制品:如面包、面食、糕点、饼干等;4)糖果:如巧克力、糖果、口香糖、甜点、果汁冰糕、糖衣和其它馅料;5)饮料:酒精类或非酒精类饮料,包括可乐和其它软饮料、果汁、饮食添加物;6)其它制品:如蛋和蛋制品、加工的食品如汤、预制的面食沙司、预先制成的膳食、袋泡茶、动物饲料等。本发明的组合物可用诸如混合、灌输、注射、掺混、分散、乳化、浸泡、喷雾和捏和等方法不作进一步变化而直接掺入食品中。或者,该组合物可由消费者在摄食前直接涂抹到食物上或加入饮料中。这些是简单而经济的输送方式。
在另一个较优选的实施方案中,本发明中的原花青素、茯苓多糖和蒲公英的组合可加入保健品中,因此本发明的组合物中还可含有其它保健品组分。
本发明的组合物可通过将各活性组分混合起来来方便地制备。例如,可将各个组分依次或同时加入药学上可接受的载体(如水)中,然后搅拌均匀,制得均一的组合物。另外,在采用蔓越莓果汁的情况下,可直接将茯苓多糖和蒲公英直接加入蔓越莓果汁中。如上所述,适用于本发明组合物的原花青素(或蔓越莓果汁)、茯苓多糖和蒲公英均可通过市售途径制得。为了便于吸收或其它目的,还可对各种活性组分原料进行一些预处理。例如,用水对蔓越莓浓缩汁进行稀释,以调配成合适的浓度。蒲公英可预先经过常规的烘干、粉碎等步骤。
本发明另一方面涉及所述组合物的应用,即,所述组合物可用来制备药物、食品或保健品。
如本申请实施例中所证实的,本发明的组合物能够显著的治疗和预防幽门螺杆菌感染作用。因此,预计本发明的组合物能够用来预防和/或治疗与幽门螺杆菌感染相关的疾病,例如包括,但不局限于:胃炎(如慢性胃炎、浅表性胃炎、活动性和持续性慢性萎缩性胃炎)、消化性溃疡(如十二指肠溃疡及胃溃疡)、胃癌等。
本发明的组合物对抗幽门螺杆菌的效果可通过常规试验如快速尿素酶试验、切片培养以及组织学检查等手段来确定。目前市场上的快速尿素酶试剂盒都是以酚红作为指示剂,通过试剂由黄变红来定性检测幽门螺杆菌,大多是用于临床,而且不能反映出胃黏膜内幽门螺杆菌的量。当用于科研工作,尤其是进行药物筛选等工作时,这些试剂盒显然都不能满足需要。本发明使用一种用酚蓝作为指示剂,阳性时试剂由黄变蓝,不仅颜色变化更显著,利于肉眼观察,而且可通过测定特定波长下的吸光度来定量反映出幽门螺杆菌感染量,不仅适用于科研工作,而且也可用于临床。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有描述,本发明的实施将采用本领域技术人员所知的常规手段或根据试剂生产商所提供的说明书进行。
配制例1:
原花青素:根据文献(Phytochemistry 2005;66:2281-2291)的描述从蔓越莓中提取原花青素。
茯苓多糖(提取比例为10∶1,即每公斤茯苓多糖由10公斤茯苓提取得到):购自浙江方格药业食用菌多糖有限公司。
蒲公英:将蒲公英烘干、粉碎,过100目筛。
每升蒸馏水中加入0.2克原花青素或/和1.2克茯苓多糖或/和18克蒲公英,充分混匀,分别制得用于以下试验例1和试验例2的本发明的试剂和对照试剂。
配制例2:
原花青素:根据文献(Phytochemistry 2005;66:2281-2291)的描述从蔓越莓中提取原花青素。
茯苓多糖:与配制例1所用的相同,购自浙江方格药业食用菌多糖有限公司。
蒲公英:将蒲公英烘干、粉碎,过100目筛。
每升蒸馏水中加入0.2克原花青素或/和6克茯苓多糖或/和18克蒲公英,充分混匀,分别制得用于以下试验例1和试验例2的本发明的试剂和对照试剂。
试验例1:小鼠幽门螺杆菌感染治疗实验
一.材料和方法:
1.菌株和培养:
本研究所用的幽门螺杆菌菌株为悉尼株(Sydney Strain,SS1)。经液体培养扩增,5000rpm下离心10min,收集细菌。将菌体悬于改良布氏肉汤中,利用分光光度计测定菌液浓度,当OD660=1时,细菌浓度为108/ml。将浓度调整至2×108/ml,用于接种小鼠。
2.动物:
实验动物为无特殊病原菌(S.P.F)级C57BL/6小鼠,6~8周龄,18~20g,委托中科院上海实验动物中心饲养。
3.治疗实验
经口灌胃1×108CFU幽门螺杆菌,隔日1次,共3次。最后1次灌胃后2周从各组中分别随机处死1只小鼠,观察幽门螺杆菌感染情况。然后将小鼠分为12组,经口灌胃分别给予原花青素、茯苓多糖、蒲公英、茯苓多糖加蒲公英、原花青素加茯苓多糖、原花青素加蒲公英、原花青素加茯苓多糖与蒲公英(均为0.5ml,一日一次,共30天)。第1组为不治疗对照组。各种处理后的24h和4周后分别处死小鼠,观察幽门螺杆菌感染情况。
4.幽门螺杆菌感染的检测:
将实验鼠胃沿大弯纵向切开,纵向切成同样大小的3份,1份直接进行半定量尿素酶试验,1份放入无菌生理盐水中,用于细菌培养,1份置于10%***中固定,用于病理组织学(Giemsa和H&E染色)检测。
半定量尿素酶试验:将其中1份胃黏膜放入500μl尿素酶检测试剂(50g尿素,0.3g酚蓝,加0.1%磷酸二氢钾溶液1000ml,pH值5.0)中,室温放置5小时后,在630nm波长处检测其吸光度(OD)值。该值与Hp感染量成正相关,因此此结果可定量反映出胃黏膜Hp的感染量。在Hp未被完全清除的情况下也可显示出防治效果。
培养:将1份胃黏膜黏膜面朝下,均匀涂布于血琼脂平板上,37℃微氧环境中培养5-7天,经涂片革兰氏染色、尿素酶、触酶、氧化酶试验确定是否为幽门螺杆菌。
5.判断标准
当下列3点全符合为幽门螺杆菌阴性。(1)快速尿素酶试验:OD630nm<未感染小鼠OD630nm的均数(mean)+2倍标准差(SD);(2)培养阴性;(3)组织学检查未见细菌。
治疗效果以清除率(即治疗后24h幽门螺杆菌清除的百分比)、根除率(即治疗后4周的幽门螺杆菌根除的百分比)及半定量尿素酶试验结果(OD630nm)来综合评价。预防效果以预防率及半定量尿素酶试验结果(OD630nm)来综合评价。
二.结果
1.治疗后24h小鼠幽门螺杆菌感染情况(清除率)见下表1。
表1.治疗后24h小鼠感染情况
a与对照组相比,p≤0.01(two-tailed Fisher’s Exact Probability Test,双尾Fisher’s精确概率检验)
b与第2、3、4、5组相比,p≤0.01(two-tailed Fisher’s Exact Probability Test)
*与对照组相比,p<0.05(ANOVA,方差分析)
**与对照组相比,p<0.01,第11、12组与第2、3、4、5组相比,p<0.05(ANOVA)
治疗后4周小鼠感染情况(根除率)见下表2。
表2.治疗后4周小鼠感染情况
a与对照组相比,p<0.05(two-tailed Fisher’s Exact Probability Test)
b与对照组相比,p<0.01(two-tailed Fisher’s Exact Probability Test)
c与第2组相比,p<0.05(two-tailed Fisher’s Exact Probability Test)
与第3、4、5组相比,p<0.01(two-tailed Fisher’s Exact Probability Test)
*与对照组相比,p<0.05(ANOVA)
**与对照组相比,p<0.01,第11、12组与第2、3、4、5组相比,p<0.05(ANOVA)
根据上述结果可以看出,与单用原花青素、茯苓多糖、蒲公英的结果相比,原花青素、茯苓多糖和蒲公英的组合具有更为显著的治疗幽门螺杆菌感染的效果。
试验例2:小鼠幽门螺杆菌感染预防实验
一.材料和方法
1-2.同试验例1
3.预防实验
将小鼠分为12组,第1-60天分别给予原花青素、茯苓多糖、蒲公英、茯苓多糖加蒲公英、原花青素加茯苓多糖、原花青素加蒲公英、原花青素加茯苓多糖与蒲公英(均为0.5ml,一日一次)。第1组为不预防对照组。其中第42、44、46天给予幽门螺杆菌攻击。第61天处死小鼠鉴定幽门螺杆菌感染情况。
4-5.同试验例1。
二.结果
1.预防实验结果见下表3。
表3.预防小鼠感染情况
a与对照组相比,p<0.05(two-tailed Fisher’s Exact Probability Test)
b与对照组相比,p<0.01(two-tailed Fisher’s Exact Probability Test)
c与第2组相比,p<0.05(two-tailed Fisher’s Exact Probability Test)
与第3、4、5组相比,p<0.01(two-tailed Fisher’s Exact Probability Test)
*与对照组相比,p<0.05(ANOVA)
**与第1、3、4、5组相比,p<0.01,与第2组相比,p<0.05(ANOVA)
从表3可以看出,与单用原花青素、茯苓多糖、蒲公英的结果相比,原花青素、茯苓多糖和蒲公英的组合具有更为显著的预防幽门螺杆菌感染的效果。
配制例3
蔓越莓果汁:浓度为17%(v/v),由蔓越莓浓缩汁(购于美国Ocean Spray公司)加入水调配。
茯苓多糖:与配制例1相同,购自浙江方格药业食用菌多糖有限公司。
蒲公英:将蒲公英烘干、粉碎,过100目筛。
在每升蔓越莓果汁或蒸馏水中不加入或加入1.2克茯苓多糖或/和18克蒲公英,充分混匀,分别制得用于以下试验例3和试验例4的本发明的试剂和对照试剂。
配制例4
蔓越莓果汁:浓度为17%(v/v),由蔓越莓浓缩汁(购于美国Ocean Spray公司)调配。
茯苓多糖:与配制例1相同,购自浙江方格药业食用菌多糖有限公司。
蒲公英:将蒲公英烘干、粉碎,过100目筛。
在每升蔓越莓果汁或蒸馏水中不加入或加入6克茯苓多糖或/和18克蒲公英,充分混匀,分别制得用于以下试验例3和试验例4的本发明的试剂和对照试剂。
试验例3:小鼠幽门螺杆菌感染治疗实验
一.材料和方法:
1.菌株和培养:
本研究所用的幽门螺杆菌菌株为悉尼株(Sydney Strain,SS1)。经液体培养扩增,5000rpm,10min离心收集细菌。将菌体悬于改良布氏肉汤中,利用分光光度计测定菌液浓度,当OD660=1时,细菌浓度为108/ml。将浓度调整至2×108/ml,用于接种小鼠。
2.动物:
实验动物为无特殊病原菌(S.P.F)级C57BL/6小鼠,6~8周龄,18~20g,委托中科院上海实验动物中心饲养。
3.治疗实验
经口灌胃1×108CFU幽门螺杆菌,隔日1次,共3次。最后1次灌胃后2周从各组中分别随机处死1只小鼠,观察幽门螺杆菌感染情况。然后将小鼠分为12组,经口灌胃分别给予蔓越莓汁、茯苓多糖、蒲公英、茯苓多糖加蒲公英、蔓越莓汁加茯苓多糖、蔓越莓汁加蒲公英、蔓越莓汁加茯苓多糖与蒲公英(均为0.5ml,一日一次,共30天)。第1组为不治疗对照组。各种处理后的24h和4周后分别处死小鼠,观察幽门螺杆菌感染情况。
4.幽门螺杆菌感染的检测:
将实验鼠胃沿大弯纵向切开,纵向切成同样大小的3份,1份直接进行快速尿素酶试验,1份放入无菌生理盐水中,用于细菌培养,1份置于10%***中固定,用于病理组织学(Giemsa和H&E染色)检测。
半定量尿素酶试验:将其中1份胃黏膜放入500μl尿素酶检测试剂(50g尿素,0.3g酚蓝,加0.1%磷酸二氢钾溶液1000ml,pH值5.0)中,室温放置5小时后,在630nm波长处检测其吸光度(OD)值。该值与Hp感染量成正相关,因此此结果可定量反映出胃黏膜Hp的感染量。在Hp未被完全清除的情况下也可显示出防治效果。
培养:将1份胃黏膜黏膜面朝下,均匀涂布于血琼脂平板上,37℃微氧环境中培养5-7天,经涂片革兰氏染色、尿素酶、触酶、氧化酶试验确定是否为幽门螺杆菌。
5.判断标准
当下列3点全符合为阴性。(1)快速尿素酶试验:OD630nm<未感染小鼠OD630nm的均数(mean)+2倍标准差(SD);(2)培养阴性;(3)组织学检查未见细菌。
治疗效果以清除率(即治疗后24h幽门螺杆菌清除的百分比)、根除率(即治疗后4周的幽门螺杆菌根除的百分比)及半定量尿素酶试验结果(OD630nm)来综合评价。预防效果以预防率及半定量尿素酶试验结果(OD630nm)来综合评价。
二.结果
治疗后24h小鼠感染情况见下表4。
表4.治疗后24h小鼠感染情况
a与对照组相比,p<0.01(two-tailed Fisher’s Exact Probability Test)
b与第2组相比,p<0.05(two-tailed Fisher’s Exact Probability Test)
与第3、4、5组相比,p<0.01(two-tailed Fisher’s Exact Probability Test)
*与对照组相比,p<0.05(ANOVA)
**与第1、3、4、5组相比,p<0.01(ANOVA),与第2组相比,p<0.05(ANOVA)
治疗后4周小鼠感染情况见下表5、图1和图2。
表5.治疗后4周小鼠感染情况
a与对照组相比,p<0.05(two-tailed Fisher’s Exact Probability Test)
b与对照组相比,p<0.01(two-tailed Fisher’s Exact Probability Test)
c与第2组相比,p<0.05(two-tailed Fisher’s Exact Probability Test)
与第3、4、5组相比,p<0.01(two-tailed Fisher’s Exact Probability Test)
*与对照组相比,p<0.05(ANOVA)
**与第1、3、4、5组相比,p<.01(ANOVA),第11、12组与第2组相比,p<0.05(ANOVA)
另外,从图1可以看到,对照组在感染幽门螺杆菌8周后,胃黏膜中可见大量幽门螺杆菌定植(Giemsa染色)。而在图2中,用本发明的蔓越莓果汁、茯苓多糖(6克)和蒲公英的组合治疗后4周,没有见到幽门螺杆菌(Giemsa染色)。
根据上述试验结果可以知道,与单用蔓越莓果汁、茯苓多糖、蒲公英的结果相比,蔓越莓果汁、茯苓多糖和蒲公英的组合具有更为显著的预防幽门螺杆菌感染的效果。
试验例4:小鼠幽门螺杆菌感染预防实验
一.材料和方法
1-2.同试验例3
3.预防实验
将小鼠分为12组,第1-60天分别给予蔓越莓汁、茯苓多糖、蒲公英、茯苓多糖加蒲公英、蔓越莓汁加茯苓多糖、蔓越莓汁加蒲公英、蔓越莓汁加茯苓多糖与蒲公英(均为0.5ml,一日一次)。第1组为不预防对照组。其中第42、44、46天给予幽门螺杆菌攻击。第61天处死小鼠鉴定幽门螺杆菌感染情况。
4-5.同试验例3
二.结果
预防实验结果见下表6。
表6.预防小鼠感染情况
a与对照组相比,p<0.05(two-tailed Fisher’s Exact Probability Test)
b与对照组相比,p<0.01(two-tailed Fisher’s Exact Probability Test)
c与第2组相比,p<0.05(two-tailed Fisher’s Exact Probability Test)
与第3、4、5组相比,p<0.01(two-tailed Fisher’s Exact Probability Test)
*与对照组相比,p<0.05(ANOVA)
**与对照组相比,p<0.01(ANOVA),第11、12组与第2、3、4、5组相比,p<0.05(ANOVA)
从表6结果得知,与单用蔓越莓果汁、茯苓多糖、蒲公英的结果相比,蔓越莓果汁、茯苓多糖和蒲公英的组合具有更为显著的预防幽门螺杆菌感染的效果。
另外,除了上述实施例外,发明人还对按照上述配制例和试验例的相同方法配制了来自葡萄籽的原花青素市售产品(购自上海康九化工公司)与茯苓多糖、蒲公英的组合物。试验结果证明,该来自葡萄籽的原花青素与茯苓多糖、蒲公英的组合也同样获得了比单用葡萄籽原花青素、茯苓多糖或蒲公英显著优异的治疗和预防幽门螺杆菌感染的效果。
尽管本发明描述了具体的例子,但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的,即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此,所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均纳入本文作参考。
Claims (9)
1.一种防治与幽门螺杆菌感染相关的疾病的组合物,其特征在于,所述组合物包含治疗和/或预防幽门螺杆菌感染有效量的原花青素、茯苓多糖和蒲公英,所述原花青素的含量为0.02-100重量份,所述茯苓多糖的含量为0.1-100重量份,所述蒲公英的含量为1-100重量份,所述原花青素、茯苓多糖和蒲公英的总重量为组合物重量的0.01-99.9%重量。
2.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述组合物还包含药学上可接受的载体。
3.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述组合物包含蔓越莓或其提取物、茯苓多糖和蒲公英。
4.如权利要求3所述的组合物,其特征在于,所述组合物包含蔓越莓果汁、茯苓多糖和蒲公英,所述组合物中各组分的比例为,每升蔓越莓果汁中含有0.1-100克茯苓多糖和1-100克蒲公英。
5.如权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述组合物具有食品学或药剂学上可以接受的任何剂型。
6.如权利要求1-5任一项所述的组合物,其特征在于,所述组合物的剂型为口服液、片剂、胶囊剂、冲剂、颗粒剂、丸剂、散剂、袋泡茶、饮料类或注射剂。
7.权利要求1所述的组合物在制备用于治疗和/或预防与幽门螺杆菌感染相关的疾病的药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用,其特征在于,其中所述与幽门螺杆菌感染相关的疾病是胃炎、消化性溃疡或胃癌。
9.权利要求1所述的组合物在制备食品或保健品中的应用。
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