CN101223274A - 新型的磷脂加工剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新型的磷脂加工剂。本发明的一个目的是提供一种对二酰基形式的磷脂中的磷脂酰肌醇(PI)具有较低水解活性的新型磷脂酶B(PLB)。本发明的另一个目的是提供通过使用所述酶的底物特异性以由磷脂混合物有效地制造PI和甘油磷酰胆碱(GPC)的方法。所述磷脂加工剂含有酶，所述酶具有能够有效地作用于除PI以外的磷脂，如磷脂酰胆碱(卵磷脂)等，并且对PI具有较低的PLB活性。

Description

新型的磷脂加工剂

技术领域

本发明涉及一种新型的磷脂加工剂，所述磷脂加工剂具有高的磷脂酶B(PLB)活性，并对磷脂具有底物特异性。

背景技术

磷脂酶是能够水解磷脂的酶的总称。磷脂(甘油磷脂)具有通过酯键连接到甘油的α位和β位的羟基上的脂肪酸，同时还具有通过磷酸基团连接到甘油的另一个α位的羟基上的胆碱、乙醇胺或肌醇等。

水解甘油磷脂的甘油基团的α位上的脂肪酸酯键的酶通称为磷脂酶A1。水解甘油基团的β位上的脂肪酸酯基团的酶通称为磷脂酶A2。此外，同时具有磷脂酶A1活性和磷脂酶A2活性的酶通称为磷脂酶B(PLB)。

另外，从磷脂上仅去掉α位和β位脂肪酸酰基中的一个脂肪酸酰基的磷脂通称为溶血磷脂。水解以溶血磷脂作用后留下的脂肪酸酯键的酶能够产生与上述PLB相同的分解产物。因此，所述酶也可以包括在PLB家族中。

另一方面，将磷脂中的甘油基团和磷酸基团之间的酯键水解的酶通称为磷脂酶C(PLC)。此外，水解带有胆碱或乙醇胺等的磷酸基团的连接键的酶通称为磷脂酶D(PLD)。

如上所述，PLB还具有磷脂酶活性。已知PLB存在于动物、植物、青霉菌的霉菌、大肠杆菌和酵母等中。PLB对二酰基形式的磷脂的作用非常弱，但是对溶血卵磷脂的作用很强。因此，PLB从未用于有效水解普通的磷脂。此外，对于那些已知的PLB，仅有报道它们可以作用于各种不同的磷脂，例如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇(非专利文献1和2)。

已有各种报道报道了磷脂酰肌醇包含在大豆卵磷脂中并与细胞的信号转导密切相关。近年来，据报道摄入磷脂酰肌醇能够降低血液中的三酰甘油(TG)水平和提高HDL-C(高密度脂蛋白胆固醇)的水平(非专利文献3)。在本领域中，磷脂酰肌醇的生理功能以及磷脂酰肌醇的生理学上的衍生物如溶血磷脂酰肌醇和甘油磷酰肌醇正受到关注。

此外，另据报道，溶血磷脂酰肌醇具有抗霉作用(专利文献1)。

已经尝试通过PLC或PLD对磷脂进行作用而以酶特异性方式来获得磷脂酰肌醇。然而，所得磷脂酰肌醇的纯度很低。因此，本领域需要更具选择性的方法来制备磷脂酰肌醇(专利文献2)。非专利文献2还记述了如果要让PLC作用于除磷脂酰肌醇以外的磷脂，就要在约30％的水解率时终止反应。

专利文献1：日本特开平06-256366号公报

专利文献2：日本特开昭62-48390号公报

非专利文献1：Biochimica Biophysica Acta(1974)369，245～253

非专利文献2：Biochimica Biophysica Acta(1975)403，412～424

非专利文献3：Biochem.J(2004)382，441～449

非专利文献4：Jim W.Burgess等，Journal of Lipid Research(46)，350～355

发明内容

本发明所要解决的问题

本发明的一个目的是提供一种磷脂加工剂，所述磷脂加工剂具有高的PLB活性，并对磷脂具有底物特异性；本发明还提供一种可有效地制备高纯度磷脂酰肌醇和甘油磷酰胆碱的方法。

解决所述问题的手段

本发明人为解决上述问题而进行了深入的研究，结果发现，来自假丝酵母属(Candida)的酶令人惊讶地对二酰基形式的磷脂具有高PLB活性，并且所述酶意外地对磷脂具有这样的特异性：所述酶选择性地水解大豆磷脂(其为磷脂混合物)中除磷脂酰肌醇以外的磷脂，利用所述特异性，本发明人找到了可有效地制造高纯度磷脂酰肌醇和甘油磷酰胆碱的方法。最后，本发明人基于所述发现而完成了本发明。来自假丝酵母属的所述酶常用于食品工业和药用产品用原料生产中的脂酶。然而，仅报道了所述酶具有作用于中性脂质的所谓“脂酶活性”。并没有报道所述酶具有PLB活性。

即，本发明涉及如下各项：

<1>、一种磷脂加工剂，所述磷脂加工剂包含：来自假丝酵母属(Candida)且具有磷脂酶B(PLB)活性的酶。

<2>、一种磷脂加工剂，所述磷脂加工剂包含：具有磷脂酶B(PLB)活性的酶，所述酶基本上仅仅不分解磷脂混合物中的磷脂酰肌醇。

<3>、如项<1>或<2>所述的磷脂加工剂，其中，具有磷脂酶B(PLB)活性的酶还具有脂酶活性。

<4>、如项<1>～<3>任一项所述的磷脂加工剂，其中，具有PLB活性的所述酶具有下述的物理化学性质：

(1)作用：将磷脂水解成2摩尔比的游离脂肪酸和等摩尔比的甘油磷酰胆碱的作用；

(2)分子量：53,000±3,000(根据SDS电泳法测定)；

(3)等电点：pH 4.21±0.2；

(4)最佳pH：约pH 5.5～6.5；

(5)pH稳定性：约pH 5～9(37℃处理90分钟)；

(6)稳定性：55℃(在pH 5处理10分钟)；和

(7)底物特异性：对磷脂酰肌醇的活性比为对磷脂酰胆碱的活性比的10％以下。

<5>、一种磷脂加工剂，所述磷脂加工剂包含由柱状假丝酵母(Candida cylindracea)的培养液得到的酶。

<6>、一种磷脂加工剂，所述磷脂加工剂通过以下步骤得到：

(1)培养柱状假丝酵母；

(2)浓缩柱状假丝酵母的培养液；

(3)用有机溶剂使酶沉淀；

(4)用疏水色谱法对步骤(3)得到的粗制酶溶液进行提纯；和

(5)用离子交换色谱法对步骤(4)得到的酶进行分离和提纯。

<7>、一种磷脂加工剂，所述磷脂加工剂包含选自以下酶中的至少一种酶：具有SEQ ID No.1的氨基酸序列的酶；与SEQ ID No.1的氨基酸序列的同源性为75％以上且具有PLB活性的酶；具有SEQ ID No.1的氨基酸序列中缺失、置换或增加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列且具有PLB活性的酶。

<8>、一种磷脂加工剂，所述磷脂加工剂包含选自以下酶中的至少一种酶：具有SEQ ID No.2的氨基酸序列的酶；与SEQ ID No.2的氨基酸序列的同源性为75％以上且具有PLB活性的酶；具有SEQ ID No.2的氨基酸序列中缺失、置换或增加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列且具有PLB活性的酶。

<9>、一种制造磷脂酰肌醇和甘油磷酰胆碱的方法，所述方法包括使项<1>～<8>中任一项所述的磷脂加工剂作用于磷脂混合物。

<10>、一种制造磷脂酰肌醇的方法，所述方法包括使项<1>～<8>中任一项所述的磷脂加工剂作用于磷脂混合物。

<11>、一种制造磷脂酰肌醇的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)使权利要求<1>～<8>中任一项所述的磷脂加工剂作用于磷脂混合物；

(2)使用有机溶剂提取磷脂酰肌醇；和

(3)通过水溶性或水混和性烷基羰基烷基溶剂处理，沉淀并回收磷脂酰肌醇。

<12>、如项<9>～<11>中任一项所述的制造磷脂酰肌醇的方法，其中，所述磷脂混合物来自大豆。

<13>、一种磷脂酰肌醇，所述磷脂酰肌醇是通过项<10>～<12>中任一项所述的制造方法得到的，并且在总磷脂中具有的纯度为50摩尔％以上。

<14>、一种制造甘油磷酰胆碱的方法，所述方法包括使项<1>～<8>中任一项所述的磷脂加工剂作用于磷脂混合物。

<15>、一种制造甘油磷酰胆碱的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)使权利要求<1>～<8>中任一项所述的磷脂加工剂作用于磷脂混合物；

(2)用含有有机溶剂的溶剂提取并除去脂质组分，并且将甘油磷酰胆碱收集到水层中；和

(3)将步骤(1)中发挥作用的所述磷脂加工剂吸附在活性炭上，并除去所述磷脂加工剂。

<16>、如项<9>、<14>或<15>所述的制造甘油磷酰胆碱的方法，其中，所述磷脂混合物来自大豆。

<17>、一种甘油磷酰胆碱，所述甘油磷酰胆碱是通过项<14>～<16>中任一项所述的制造方法得到的，并具有55重量％以上的甘油磷酰胆碱纯度。

<18>、项<13>所述的磷脂酰肌醇在制备高纯度甘油磷酸肌醇中的应用。

<19>、项<17>所述的甘油磷酰胆碱在制备高纯度胆碱磷脂中的应用。

<20>、含有通过项<10>～<12>中任一项所述的制造方法制造的所述磷脂酰肌醇的食品、药品或化妆品。

<21>、含有项<14>～<16>中任一项所述的制造方法制造的所述甘油磷酰胆碱的食品、药品或化妆品。

<22>、一种溶血磷脂酰肌醇，所述溶血磷脂酰肌醇是通过使具有磷脂酶A1或磷脂酶A2活性的酶作用于通过项<10>～<12>中任一项所述的制造方法制造的所述磷脂酰肌醇而得到的。

<23>、一种制造溶血磷脂酰肌醇的方法，所述方法包括使具有磷脂酶A1或磷脂酶A2活性的酶作用于通过项<10>～<12>中任一项所述的制造方法制造的所述磷脂酰肌醇。

<24>、含有通过项<23>所述的制造方法制造的溶血磷脂酰肌醇的食品、药品或化妆品。

<25>、一种甘油磷酰肌醇，所述甘油磷酰肌醇是通过使对磷脂酰肌醇具有充分作用的具有磷脂酶B活性的酶作用于通过项<10>～<12>中任一项所述的制造方法制造的所述磷脂酰肌醇而得到的。

<26>、一种制造甘油磷酰肌醇的方法，所述方法包括使对磷脂酰肌醇具有充分作用的具有磷脂酶B活性的酶作用于通过项<10>～<12>中任一项所述的制造方法制造的所述磷脂酰肌醇。

<27>、含有通过项<26>所述的制造方法制造的所述甘油磷酰肌醇的食品、药品或化妆品。

<28>、食品、药品或化妆品，所述食品、药品或化妆品含有选自以下物质组成的组中的两种以上物质：通过项<10>～<12>中任一项所述的制造方法制造的磷脂酰肌醇；通过项<14>～<16>中任一项所述的制造方法制造的甘油磷酰胆碱；通过项<23>所述的制造方法制造的溶血磷脂酰肌醇；和通过项<26>所述的制造方法制造的甘油磷酰肌醇。

本发明的效果

使用本发明的磷脂加工剂使得可以制备高纯度的磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰肌醇、甘油磷酰胆碱和甘油磷酰肌醇等，这些物质可以用作功能性磷脂或功能性磷脂原料。

附图说明

图1显示了由作为本发明实施例4的磷脂加工剂的PLB的凝胶过滤色谱法获得的色谱图。

图2显示了作为本发明实施例5的磷脂加工剂的PLB的最佳pH。

图3显示了作为本发明实施例5的磷脂加工剂的PLB的pH稳定性结果。

图4显示了作为本发明实施例5的磷脂加工剂的PLB的热稳定性结果。

图5显示了作为本发明实施例5的磷脂加工剂的PLB的等电电泳结果。

具体实施方式

下文将进一步详细地描述本发明的构成和优选的实施方式。

1、作为磷脂加工剂的磷脂酶B(PLB)

在本说明书中，术语“PLB”是指用于进行磷脂的α位和β位上的脂肪酸酯的水解、脂肪酸酯合成和脂肪酸酯交换的酶。本发明的PLB包括作用于溶血磷脂和水解残余的脂肪酸酯键的任何酶。另外，术语“磷脂加工”是指这样的反应，例如磷脂的水解、脂肪酸酯合成或脂肪酸酯交换等。所述术语优选指所述水解或脂肪酸酯合成，更优选指所述水解。在另一个优选的方式中，所述术语指所述脂肪酸酯合成。另外，本发明的加工剂不仅包括PLB本身，而且还包括添加有诸如糖等酶稳定剂和pH缓冲剂的PLB。此外，所述磷脂加工剂可以按类似于常规酶的方式以干燥粉末或液体等形式提供。

本发明提供了具有PLB活性的磷脂加工剂，所述磷脂加工剂基本上仅仅不分解磷脂混合物中的磷脂酰肌醇，但是分解所述混合物的其他组分。

就磷脂加工剂而言，短语“基本上仅仅不分解磷脂酰肌醇”是指在作为底物的磷脂混合物中的磷脂酰肌醇相对于磷脂酰胆碱的活性比(相对活性)的上限为10％以下。意指其活性比优选为7％以下，更优选为5％以下，尤其优选为3％以下，最优选为1％以下。该短语还指其活性比的下限为0.01％以上，更优选为0.1％以上。另外，该短语还指除磷脂酰肌醇和磷脂酰胆碱(例如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸或磷脂酸(PA)等)以外的磷脂相对于磷脂酰胆碱的活性比(相对活性)的下限为15％以上。意指其活性比优选为20％以上，更优选为25％以上，尤其优选为30％以上，最优选为40％以上。表示其活性比的上限为200％以下，优选为150％以下，更优选为100％以下。

此外，作为本发明的磷脂加工剂的PLB优选具有如下性质：

1)作用：将磷脂(例如卵磷脂)水解成2摩尔比的游离脂肪酸和等摩尔比的甘油磷酰胆碱的作用；和作用于甘油三酸酯而将其水解为3摩尔比的游离脂肪酸和等摩尔比的甘油的作用；

2)分子量：53,000±3,000(根据SDS电泳法测定)；

3)根据等电电泳法测得的等电点：pH 4.21±0.2；

4)最佳反应pH：约pH 5.5～6.5；

5)pH稳定性：约pH 5～9(37℃处理90分钟)；

6)热稳定性：55℃(在pH 5处理10分钟)；和

7)底物特异性：对磷脂酰肌醇的活性比为对磷脂酰胆碱的活性比的10％以下。

作为本发明的磷脂加工剂的PLB的来源(根源)不受特别限制，只要所述PLB具有上述特性即可。当所述PLB为天然来源时，所述PLB优选为微生物来源，更优选来自假丝酵母属，更具体地说是来自柱状假丝酵母。另外，作为本发明的磷脂加工剂的PLB可以是基于上述天然来源的酶的基因修饰的酶。通过基因重组技术制得的PLB包括在作为本发明的磷脂加工剂的PLB中，并且优选其具有上述特性。

另外，所述PLB包括具有SEQ ID No.1或2所示的氨基酸序列的酶本身或与SEQ ID No.1或2所示的氨基酸序列具有75％以上同源性的氨基酸序列。具有PLB活性的任何酶也都包括在作为本发明的磷脂加工剂的PLB中，并且这样的酶不受特别限制，只要其具有PLB活性即可。然而，相对于SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的同源性优选为80％以上，更优选为85％以上，进一步优选为90％以上，尤其优选为95％以上，最优选为98％以上。另外，优选所述磷脂加工剂基本上仅仅不分解磷脂酰肌醇。术语“基本上仅仅不分解磷脂酰肌醇”与如上所述的术语同义。

本发明使用的术语“同源性”是指氨基酸序列或DNA核苷酸序列的同源性，其可以采用计算机通过已知方法(如序列比较)来测定。所用的分析软件是GENETEX WIN 5.2(由Software Co.，Ltd制造)。测定同源性时使用的示例性计算机程序可以是包含GAP的GCG程序包(Devereux，J.等，Nucleic Acids Research 12(12)：387(1984))或者BLAST程序包(NCBI，或Altschul，S.F.等，J.Mol.Biol.，215：403～410(1990))和Smith-Waterman算法，但不具体限定于这些。

另外，作为本发明的磷脂加工剂的PLB包括具有同等功能且具有SEQ ID No.1或2所示的氨基酸序列中缺失、置换或增加了一个至多个氨基酸的氨基酸序列以及具有PLB活性的任意经修饰的酶。缺失、置换或增加的氨基酸数量的下限优选为(但不具体限于)一个以上，更优选为两个以上，并且上限优选为25个以下，更优选为20个以下，进一步优选为15个以下，尤其优选为10个以下，最优选为5个以下。另外，优选所述磷脂加工剂基本上仅仅不分解磷脂酰肌醇。术语“基本上仅仅不分解磷脂酰肌醇”与如上所述的术语同义。

本领域熟知来自柱状假丝酵母的5种不同脂酶的氨基酸序列。任何天然的脂酶都可以用作本发明的磷脂加工剂。即使缺失、置换或增加了一个至多个氨基酸的酶也可以用于以下用途中，只要所述酶具有PLB活性即可。

同时，本发明的磷脂加工剂优选还具有脂酶活性。所述磷脂加工剂可以作用于甘油三酸酯并将所述甘油三酸酯水解成3摩尔比的游离脂肪酸和等摩尔比的甘油。如果将所述磷脂加工剂施用于磷脂和甘油三酸酯的混合物，它们可以同时受到水解。

2、制造PLB的方法

用于本发明的磷脂加工剂的PLB可以容易地以来自假丝酵母属的酶产品的形式商购获得并使用。作为选择，所述酶可以由通过培养假丝酵母属的微生物所获得的产物来制备。假丝酵母属的微生物的优选实例包括但不限于柱状假丝酵母株。所述生成PLB的菌株可以是用紫外射线和化学诱变剂处理过的突变株。另外，可以使用通过将以能够高水平表达的形式的后述PLB基因导入宿主细胞而制得的基因重组体。

微生物培养的培养液组分和培养条件不受特别限制，只要菌株能够生成PLB即可。适合所述酶生成的培养条件通常为在需氧条件下在中度温育温度于营养培养液中培养的条件。当将所述菌株培养在任何所述的条件下时，可以观察到良好的细菌生长和酶的生成。具体地说，例如，用于培养液的碳源包括葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖、玉米淀粉和马铃薯淀粉。氮源的实例包括麦麸、蛋白胨、酵母提取物、大豆粉、脱脂大豆粉、酪蛋白、棉籽粉、脱脂棉籽粉、明胶、各种氨基酸(例如谷氨酸)、硫酸铵和脲等。所述碳源和氮源可以适当地组合使用。其中，优选的实例包括大豆粉和葡萄糖的组合或者脱脂大豆粉和葡萄糖的组合。可以在所述培养液中使用的其他组分的实例有诸如食盐、磷酸钠、硫酸镁和氯化钙等无机盐，等等。其中可以优选使用食盐、磷酸盐或镁盐。将假丝酵母属的酵母温育在含有碳源、氮源和无机盐的无菌培养液中，然后在有氧条件下温育。采用的温育温度为22℃至33℃，优选为26℃至30℃，尤其优选为27℃至28℃。温育时间为30小时至60小时，这根据通风、摇动或温育温度而定。可以监测上清液的PLB活性，然后在达到稳定期时终止温育。

本发明中所用的微生物在上述培养条件下可以分泌并生成用于本发明的磷脂加工剂的酶PLB。作为用于制备所述酶的材料的培养液的上清液可以通过与菌体分离而获得。可以通过采用硫酸铵进行的盐沉淀和采用有机溶剂如丙酮或乙醇进行的沉淀来提纯包含在通过离心分离和过滤程序而获得的培养上清液中的PLB，但优选通过丙酮沉淀提纯。可以在所述沉淀程序之前通过超滤来浓缩酶。另外，如果需要，可以采用诸如离子交换色谱法、凝胶过滤法、疏水色谱法和亲和色谱法等熟知的程序，通过将所述酶提纯和/或浓缩至所需的水平来获得经提纯的酶。包含在本发明所使用的磷脂加工剂中的酶的纯度越高，就可以越有效地分解磷脂。然而，根据所述目的，即使是粗制状态的酶也可以使用。即便所述酶是通过离子交换色谱法分馏到的酶级分A和B的混合物，这样的酶也是可以使用的。

当用作本发明的磷脂加工剂的PLB是具有同等功能的经修饰的酶时，本领域技术人员可以根据与序列表中编码具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的酶的SEQ ID No.3基因的碱基序列有关的信息来获得这样的酶。需要注意的是，基因重组技术可以根据已知方法(例如，基因重组技术手册，如Sambrook，J.等的“Molecular Cloning-A Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory，NY，1989)进行。

例如，可以通过以下方法获得经修饰的酶：根据与序列表中SEQ IDNo.3基因序列有关的信息，设计适当的引物或适当的探针。采用所述引物或探针以及来自目标活生物体的样品来进行聚合酶链式反应(PCR)法或杂交法，由此获得目标基因。然后，通过基因改造中常用的诸如诱导位点特异性突变法(Mark，D.F.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，5662～5666，1984)等方法进行基因修饰。然后，在诸如采用酵母属(Saccharomyces)或毕赤酵母属(Pichia)作为宿主的表达***等适合的表达***中表达经修饰的基因，以获得经修饰的酶。可以采用实施例2中描述的方法来证实经修饰的酶是否具有PLB活性。优选含有经修饰的酶的磷脂加工剂基本上仅仅不分解磷脂混合物中的磷脂酰肌醇。另外，优选所述磷脂加工剂具有脂酶活性。

3、制造磷脂酰肌醇(PI)和/或甘油磷酰胆碱(GPC)的方法

本发明提供了同时而有效地制造高纯度的PI和GPC的方法。此外，本发明还提供了单独而有效地制造高纯度的PI或GPC的方法。本发明的磷脂加工剂具有用于选择性水解磷脂混合物中除了PI以外的磷脂的磷脂特异性。因此，可以选择性地制造高纯度的PI。另外，采用本发明的磷脂加工剂来分解包含PC作为主要组分的大豆磷脂，可以在制造PI的同时制造出高纯度的GPC。获得作为功能性磷脂或功能性磷脂原料的高纯度PI和GPC是特别有用的。

PI还可以通过使PLC作用于磷脂来获得(见如上所述的专利文献2)，但这种方法不能导致GPC的生成。通过本发明作为反应产物生成的GPC预计可以用作防止痴呆等的物质，因此，利用了PLB的作用的本发明在这一点上同样也是有利的。

下文将详细描述制造各组分的方法。

(a)制造磷脂酰肌醇(PI)的方法

用作本发明的磷脂加工剂的PLB在加工天然存在的磷脂的应用中特别有用。本发明提供了一种有效地制造高纯度PI的方法。磷脂是细胞膜的结构组分，并负责重要的生理功能。具体地说，PI密切参与细胞膜中的胞内/胞外信号转导。药品/食品应用中的磷脂供应源主要是大豆、鸡蛋黄或鱼卵等。这些磷脂通常作为诸如磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酸(PA)和磷脂酰肌醇(PI)等多种分子物质的混合物获得。为了从这些磷脂混合物中分离出PI，通常采用有机溶剂分馏法、使用诸如硅胶或氧化铝等载体的色谱分离法等。这些方法可以有效地获得含量比较充足的PC和PE，但是远远不足以获得诸如低含量PI等磷脂组分。同时还需要使用大量诸如氯仿等卤素类的有机溶剂。因此，所得产物的用途有限。为了有效地由含有PC、PE、PS、PA、PI的磷脂制备出PI，可以选择性地水解除了PI以外的诸如PC、PE、PA和PS等磷脂，以使PI留下。

通过使本发明的磷脂加工剂作用于磷脂混合物，选择性地从磷脂混合物中单独留下PI，可以有效地获得PI。可以预先使用均质器等使磷脂混合物分散在水中或者强制搅拌所述磷脂混合物来制备均一的水溶液。磷脂的浓度可以是任意浓度，只要PLB可以作用于分散在水中的磷脂混合物即可，并且所述浓度处于1％～20％，优选为5％～10％，尤其优选为6％～8％的范围。反应的pH可以是任意的pH，只要PLB可以作用于磷脂混合物即可，并且所述pH优选处于3～10，或者处于PLB活性达到最高时的约pH 5.5～6.5。所述pH尤其优选为约pH 6。

优选使用缓冲剂来使反应保持在恒定的pH。缓冲剂的类型不受特别限制，只要其具有处于pH 5.5～6.5范围的缓冲能力即可。从食品用途的角度来看，优选使用乙酸盐缓冲剂。此外，可以通过在反应中适当加入NaOH溶液，将反应溶液的pH调节在优选的范围内。

用作本发明的磷脂加工剂的PLB的浓度可以为1,000单位/千克磷脂～100,000,000单位/千克磷脂，优选为2,000单位/千克磷脂～5,000,000单位/千克磷脂。

所用的PLB可以以水溶液的形式加入，或者可以为固定在不溶性载体如硅藻土(Celite)或离子交换树脂上的形式。

酶反应可以在任意温度进行，只要PLB不失活即可。温度上限优选为60℃以下，更优选为45℃以下，并且温度的下限优选为10℃以上，更优选为30℃以上。

反应时间因酶反应条件而异，通常为1小时～150小时。可以根据对底物残留量的定性把握来终止反应。

反应结束后，可以进行热处理或pH处理等来使PLB失活，这是没有任何问题的。

硅胶薄层色谱(TLC)法是证实水解反应状态的最简单、最容易的方法。当使用TLC然后使用碘显色法来定量证实底物残留量时，可以在几乎没有看到TLC上有指示除了PI以外的任意磷脂的点时终止反应。

在得自所述反应的产物中，游离脂肪酸、甘油磷酰胆碱(GPC)、甘油磷酰乙醇胺(GPE)、甘油磷脂酸(GP)和残留的未反应的PI以混合物存在。采用诸如氯仿、乙醇、甲醇和己烷等有机溶剂可以从所述混合物中回收所述PI。从食品用途的角度来看，尤其优选使用乙醇、己烷或其混合溶剂。为了改善提取步骤中的液体分离，可以在提取之前改变反应的pH。

游离脂肪酸和PI可溶于有机溶剂中。GPC和GPE等不溶于诸如己烷等有机溶剂中，但是可溶于水中。通过诸如真空浓缩等程序，从在有机溶剂层中回收的PI和游离脂肪酸中分离出所述有机溶剂。PI不溶于水溶性或水混合性的烷基羰基溶剂。游离脂肪酸可溶于任意所述溶剂。因此，PI可以作为沉淀回收。水溶性或水混和性烷基羰基溶剂可以是丙酮或甲基乙基酮等。优选的实例是丙酮。可以通过离心分离或者过滤方法的固体-液体分离程序来回收PI。

磷脂混合物不受特别限制。可以使用来自鸡蛋黄的磷脂、来自诸如鲑鱼卵等鱼卵的磷脂或者来自大豆的磷脂。从磷脂供应源的稳定性的角度来看，优选来自鸡蛋黄的磷脂和来自大豆的磷脂，尤其优选来自大豆的磷脂。本发明的磷脂加工剂除了具有PLB活性之外，还可以具有强的脂酶活性。然而，对于由大豆磷脂制备PI和甘油磷酰胆碱而言，具有脂酶活性根本不是问题。大豆磷脂也可以作为与甘油三酸酯的混合物供应。当使用这样的混合物作为原料时，可以同时水解甘油三酸酯和磷脂。在这一点上，同时具有脂酶活性和PLB活性是很重要的。当PLB活性高而脂酶活性低或者不具备脂酶活性时，可以添加额外的脂酶以同时分解甘油三酸酯和磷脂。

根据本发明的上述方法，可以提供高纯度的PI。PI的纯度不受特别限制，只要PI具有高纯度即可。然而，PI在总磷脂中的纯度的下限优选为50摩尔％以上，更优选为60摩尔％以上，进一步优选为70摩尔％以上，尤其优选为80摩尔％以上，最优选为85摩尔％以上。高纯度的PI可以用作功能性磷脂。由于PI包含分子中富含羟基的肌醇，因此与诸如PC和PE等其他磷脂相比，PI在水中显示出良好的分散性或溶解性，例如PI具有极其不同于其他脂质组分的溶解性，因此，PI的优点在于其可以作为磷脂而广泛用于各种用途中。

(b)甘油磷酰胆碱(GPC)的制造

作为本发明的磷脂加工剂的PLB在加工天然存在的磷脂的应用中是极其有用的。因此，本发明提供了一种有效地制造高纯度GPC的方法。

使本发明的磷脂加工剂作用于磷脂混合物的方法与制造上述PI的方法中的方法相同。反应时间通常可以为5小时～20小时。反应可以在GPC在反应物中的浓度达到最大时加以终止，不过这取决于所用的酶浓度。

可以向通过使本发明的磷脂加工剂作用于磷脂混合物而获得的PLB的反应溶液中加入如上所述的相同的有机溶剂，例如氯仿、乙醇、甲醇或己烷。提取液体组分(包括游离脂肪酸)后剩下的水层含有GPC、GPE、GP或游离的酶。直接对含有GPC、GPE或GP的水溶液进行真空浓缩，由此获得糖浆状溶液。从除去着色剂组分和本发明的磷脂加工剂的角度来看，优选在浓缩之前用活性炭处理含有GPC、GPE或GP的水溶液。可以使用阳离子交换树脂等以获得高纯度的GPC。

在本发明的制造GPC的方法中使用的磷脂组合物不受特别限制，只要其具有高PC含量即可。可以使用来自鸡蛋黄的磷脂、来自诸如鲑鱼卵等鱼卵的磷脂或者来自大豆的磷脂。从磷脂供应源的稳定性的角度来看，优选来自鸡蛋黄的磷脂和来自大豆的磷脂。尤其优选的是来自大豆的磷脂。本发明的上述方法提供了高纯度的GPC。GPC的纯度不受特别限制，只要是高纯度即可。GPC纯度的下限优选为45重量％以上，更优选为50重量％以上。

4、制造溶血磷脂酰肌醇的方法

以下将描述制造溶血磷脂酰肌醇的方法。

本发明的制造高纯度的溶血磷脂酰肌醇的方法包括如下步骤：

步骤(1)：使用具有磷脂酶A1活性或磷脂酶A2活性的酶对高纯度PI进行水解反应的步骤；和

步骤(2)：通过使用含有一种或者两种以上的溶剂的混合溶剂(其中游离脂肪酸溶解而溶血磷脂酰肌醇不能溶解)进行洗涤来除去游离脂肪酸，并将溶血磷脂酰肌醇与作为反应产物的游离脂肪酸分离以回收溶血磷脂酰肌醇的步骤。

下文将进行详细描述。

在本发明的溶血磷脂酰肌醇的制造中使用的具有磷脂酶A1活性或者磷脂酶A2活性的酶不受特别限制，只要所述酶是作用于PI从而将PI转化为溶血磷脂酰肌醇的酶即可。所述酶的实例包括：包含在酶混合物(来自猪胰腺的胰酶)中的磷脂酶A2(由Novozym Co.，Ltd.制造的Lectitase或者由Genencor Kyowa Co.，Ltd.制造的Lipomod 699L)；来自紫红链霉菌(streptomyces violaceoruber)的磷脂酶A2(由Genencor Kyowa Co.，Ltd.制造的Lizomax PF)；来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的磷脂酶A1(由SankyoLifeTech Co.，Ltd.制造的Phospholipase A1)等。其中，优选的实例是包含在酶混合物(来自猪胰腺的胰酶)中的磷脂酶A2(由Novozym Co.，Ltd.制造的Lectitase)和来自米曲霉的磷脂酶A1(由Sankyo LifeTech Co.，Ltd.制造的Phospholipase A1)。

本发明的溶血磷脂酰肌醇制造中的酶反应可以采用在水性介质或者在潮湿条件下使酶和底物相互接触的方式进行。反应的pH不受特别限制，只要所述pH处在能够进行酶反应的范围即可。例如，优选的pH范围为pH 6.5～9.0。

反应温度不受特别限制，只要所述温度处在能够进行酶反应的范围即可。例如，所述温度优选处在10℃～70℃的范围内，更优选处在30℃～60℃的范围内。

可以在反应达到所需状态时终止反应，在所需状态中，使用例如高效液相色谱分析、薄层色谱分析来跟踪适合跟踪反应的化合物的反应，例如PI的减少或者溶血磷脂酰肌醇的增加。所需状态可以是例如反应终止状态、稳定状态或者制得足量的溶血磷脂酰肌醇的状态，这可以根据工业生产的不同角度来确定。

反应时间的实例可以是1小时至10天。

反应中所用的酶量可以是足以使充分反应进行的量，但是从工业生产的角度来看，使用超过需要的量是没有优势的。例如，当使用1,000U/g的酶时，相对于底物，优选实例可以是0.05重量％～50重量％。此外，可以加入钙离子(氯化钙)等作为酶稳定剂。另外，在终止酶反应后，可以采用常规方法来使酶失活。

失活手段可以是热处理(在50℃～90℃处理10分钟至2小时)或pH处理(在pH 1～4或pH 8～12处理10分钟至2小时)等。另外，终止反应后或者使酶失活后，可以使用能够溶解脂肪酸但不能溶解溶血磷脂酰肌醇的溶剂如丙酮进行洗涤来除去所生成的游离脂肪酸。

5、制造甘油磷酰肌醇的方法

下面将描述制造甘油磷酰肌醇的方法。

本发明的制造高纯度甘油磷酰肌醇的方法包括以下步骤：

步骤(1)：使用具有磷脂酶B活性的酶对高纯度PI进行水解反应的步骤；和

步骤(2)：将甘油磷酰肌醇与游离脂肪酸(反应产物)分离以回收甘油磷酰肌醇的步骤。

下文将对所述方法进行详细描述。

在本发明的甘油磷酰肌醇制备中所用的具有磷脂酶B活性的酶不受特别限制，只要其能够充分地作用于PI并将PI转化成甘油磷酰肌醇即可。所述酶的实例包括来自青霉菌(Penicillium)属和酵母等的酶。

本发明的酶反应可以采用在水性介质或者在潮湿条件下使酶和底物相互接触的方式进行。反应的pH不受特别限制，只要所述pH处在能够进行酶反应的范围即可。例如，优选的pH范围为pH 3.5～8.0。当使用来自点青霉(Penicillium notatum)的磷脂酶B作为酶时，尤其优选约pH4.0～5.0。

反应温度不受特别限制，只要所述温度处在能够进行酶反应的范围即可。例如，所述温度优选处在10℃～70℃的范围内，更优选处在30℃～60℃的范围内。

可以在反应达到所需状态时加以终止反应，在所需状态中，使用例如高效液相色谱分析、薄层色谱分析来跟踪适合跟踪反应的化合物反应，例如PI的减少或者甘油磷酰肌醇的增加。所需状态可以是例如反应终止状态、稳定状态或者制得足量的甘油磷酰肌醇的状态，这可以根据工业生产的不同角度来确定。反应时间的实例可以是1小时至10天。

反应中所用的酶量可以是足以使反应充分进行的量，但是从工业生产的角度来看，使用超过需要的量是没有优势的。例如，当使用3,800U/g的酶时，相对于底物，优选实例可以是0.05重量％～5重量％。此外，可以加入钙离子(氯化钙等)作为酶稳定剂。另外，在终止酶反应后，可以采用常规方法来使酶失活。失活手段可以是热处理(在50℃～90℃处理10分钟至2小时)或pH处理(在pH 1～4或pH 8～12处理10分钟至2小时)等。

另外，终止反应后或者使酶失活后，可以使用诸如己烷等溶剂提取除去所生成的游离脂肪酸，然后真空浓缩水层，再以含有高浓度甘油磷酰肌醇的水溶液形式保存或者作为冻干粉末保存。作为选择，可以直接将水层中的甘油磷酰肌醇吸附在离子交换树脂等中然后进行洗涤。此后，使用具有各种pH的高浓度盐溶液进一步提纯游离脂肪酸。另外，如果需要，可以将任何的着色组分吸附到活性炭上以进行脱色。

6、高纯度PI和高纯度GPC的应用

通过本发明的制造PI的方法获得的PI使用了能够充分水解PI的来自点青霉或Dictyostelium discoidoum的PLB，然后可以用作高纯度甘油磷酰肌醇制备中的原料。此外，通过本发明的制造GPC的方法获得的GPC可以用作在通过采用脂肪酸或脂肪酸酯的GPC的化学合成或酶法酯合成来制造高纯度的含有脂肪酸的胆碱磷脂(即，功能性磷脂)时的原料。

7、含有磷脂酰肌醇(PI)、甘油磷酰胆碱(GPC)、溶血磷脂酰肌醇或甘油磷酰肌醇的食品、药品或化妆品

食品和药品中的PI、GPC、溶血磷脂酰肌醇和甘油磷酰肌醇的含量不受特别限制。这些物质中的每一种的含量可以优选对应于1mg/天～10,000mg/天，优选为10mg/天～5,000mg/天，更优选为30mg/天～1,000mg/天的PI、GPC、溶血磷脂酰肌醇或甘油磷酰肌醇的摄入量。

含有本发明的PI、GPC、溶血磷脂酰肌醇或甘油磷酰肌醇的食品不受限制，只要它们含有任意的所述组分即可。所述食品的实例包括增补剂(例如，散在、颗粒剂、软胶囊、硬胶囊、片剂、咀嚼片剂、快速崩解剂、糖浆、溶液等)、饮料(例如，茶、碳酸饮料、乳酸饮料和运动饮料等)、糖果点心(例如，胶皮糖(gummy)、果冻、口香糖、巧克力、小甜饼和蜜饯等)、油、油/油脂食品(例如，蛋黄酱、调味品、黄油、奶油和人造黄油等)、番茄酱、沙司、流食、乳品(例如，牛奶、酸奶和奶酪等)、面包、面条(例如，乌冬面、荞麦面、拉面、意大利面、炒面、扁条面(kisimen)、素面(soumen)、凉面(hiyamugi)和米粉等)、汤(例如，味噌汤、玉米汤和清炖肉汤等)和用于撒在米饭上的干燥佐料等。

如果需要，含有本发明的PI、GPC、溶血磷脂酰肌醇或甘油磷酰肌醇的食品中可以加入任意的各种营养物、各种维生素类(例如，维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素C、维生素D、维生素E和维生素K)、各种矿物质(例如，镁、锌、铁、钠、钾、硒、氧化钛)、食用纤维、各种糖类(例如，纤维素、糊精和几丁质)、各种多不饱和脂肪酸(例如，花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳五烯酸)、各种共轭脂肪酸(例如，共轭亚油酸、共轭亚麻酸、共轭花生四烯酸、共轭DHA、共轭EPA和共轭DPA)、各种磷脂(例如，卵磷脂、PA、PS、PE、磷脂酰甘油、PC和磷脂酰DHA)、各种糖脂(例如，脑苷脂)、各种类胡萝卜素(例如，β-胡萝卜素、番茄红素、虾青素、β-隐黄素、辣椒质、黄体素和玉米黄质)、各种类黄酮(例如，槲皮酮、毛地黄黄酮素和异黄酮)、各种氨基酸(例如，甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸)、其他各种营养物(例如，氧化形式的辅酶Q10、还原形式的辅酶Q10、肉碱、芝麻素、α-硫辛酸、肌醇、D-手性肌醇、松醇、牛磺酸、葡糖胺、硫酸软骨素、S-腺苷甲硫氨酸、姜黄素、γ-阿魏酸脂、谷胱甘肽、γ-氨基丁酸、脱氧肾上腺素、吡咯并喹啉醌、儿茶素和辣椒素)、各种分散剂、稳定剂(如各种乳化剂)、各种甜味剂(例如，山梨糖醇和蔗糖)、各种调味组分(例如，柠檬酸和苹果酸)、调料、王浆、蜂蜜、蜂蜡、蜂胶、落叶松蕈、人参和黑胡椒提取物(bioperine)等。另外，可以加入诸如薄荷、香柠檬、甘菊和薰衣草等任意草药。另外，可以混合诸如羊芾甙(teanin)、脱氢表雄甾酮和褪黑激素等任意物质。

含有本发明的PI、GPC、溶血磷脂酰肌醇或甘油磷酰肌醇的药品不受限制，只要其含有任意的这些组分即可。药品的制剂包括散在、颗粒剂、丸剂、软胶囊、硬胶囊、片剂、咀嚼片剂、快速崩解剂、糖浆、溶液、悬浮剂、栓剂、软膏、乳膏、凝胶、胶浆剂、吸入剂和注射剂等。这些制剂可以根据常规方法制备。然而，由于PI不溶于水，因此可以将其溶解在诸如植物油和动物油等任意的非亲水性溶剂中。作为选择，可以使用均质器(高压均质器)将PI和乳化剂(一种分散剂)或表面活性剂一起分散或乳化在水溶液中。另外，为了提高PI的吸附性，可以在将PI粉碎至平均粒系为约1微米后，在存在或不存在赋形剂(例如***树胶、糊精或酪蛋白等)的情况下使用PI。

可以在配制时使用的添加剂包括例如：大豆油、红花油、橄榄油、胚芽油、向日葵油、牛脂、动物油如沙丁鱼油；多元醇如聚乙二醇、丙二醇、甘油和山梨糖醇；表面活性剂如山梨聚糖脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、甘油的脂肪酸酯和聚脂肪酸甘油酯；诸如纯净水、乳糖、淀粉、微晶纤维素、D-甘露糖、麦芽糖、卵磷脂、***树胶、糊精、山梨糖醇溶液和糖类溶液等赋形剂；甜味剂；着色剂；pH调节剂；和调味剂。此外，液体制剂在给药时可以采用溶解或悬浮在水中或者任意的其他适当介质中的形式。另外，可以采用熟知的方法涂覆片剂或颗粒剂。

当以注射剂的形式施用时，优选以静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、经皮、关节内、滑膜内、肺泡内、骨膜内、舌下或口腔内施用。其中，尤其优选的是静脉内施用或腹膜内施用。静脉内施用可以是滴注和渗透施用(porous administration)中的任意一种。

含有本发明的PI、GPC、溶血磷脂酰肌醇或甘油磷酰肌醇的化妆品包括乳膏、乳状洗剂、洗液、微乳精、敷糊剂和痱子粉等。还可以混入芳香剂等。

下面将参考实施例来描述本发明，但是本发明并不限于以下的实施例。

实施例

实施例1制造PLB的方法

向装有20升无菌培养基的30升体积的发酵罐中无菌接种上100ml在相同培养基中预温育(28℃温育4天)的柱状假丝酵母株ATCC14830的培养液，所述无菌培养基含有3％脱脂棉籽粉、0.3％食盐、0.2％磷酸氢二钾、0.2％磷酸钾、0.1％硫酸镁和0.3％消泡剂。在以300rpm搅拌的同时，在28℃进行温育并用无菌空气进行通风(20升/分钟)。在50小时后证实PLB已经达到最大活性(0.2U/ml)。

以5,000rpm对所得培养液离心10分钟，得到16升的上清液。通过超滤浓缩上清液。以5,000rpm对通过向3升的所得浓缩物中加入9升冷冻丙酮形成的沉降物离心10分钟以收集沉淀，然后将所述沉淀溶解在2升含有2M氯化钠的10mM Tris盐酸缓冲液(下文简称为Tris-HCl)(pH7.5)中。通过离心除去不溶性物质，然后使之通过预先用辛基琼脂糖填充的柱子(柱床体积；300ml)来吸附PLB。然后，用含有2M氯化钠的10mMTris-HCl(pH 7.5)和10mM Tris-HCl(pH 7.5)洗涤柱子。用含有2％Adecatol SO 120的10mM Tris-HCl(pH 7.5)洗脱吸附在柱子上的PLB(用疏水色谱法提纯)。然后，使洗脱液(1升)通过预先用10mM Tris-HCl(pH7.5)平衡的DEAE-琼脂糖柱子(柱床体积；200ml)以吸附PLB。使用上述缓冲液洗涤柱子，然后用浓度梯度为0～0.3M的氯化钠洗脱酶。在约0.1M氯化钠处获得PLB酶级分A，在约0.25M氯化钠处获得PLB酶级分B(采用离子交换色谱分离提纯)。

采用氨基酸测序仪测定酶级分A和酶级分B的N末端氨基酸序列。作为结果，酶级分A的氨基酸序列为SEQ ID No.1序列，而酶级分B的氨基酸序列为SEQ ID No.2序列。另外，使用GENETEX WIN 5.2(由Software Co.，Ltd.制造)进行同源性分析，以分析酶级分B相对于酶级分A的同源性，结果为88.5％。

实施例2测定PLB活性的方法

PLB的酶活性可以通过实施测定由磷脂酰胆碱生成的GPC的酶法来检测。即，在37℃将0.5ml的反应溶液预热2分钟至3分钟，所述反应溶液由溶解在0.5ml的含有3％Triton X-100的1M MES-NaOH缓冲液(下文简称为MES-NaOH)(pH 6)中的以下物质组成：0.05ml的10mM蛋黄磷脂酰胆碱、0.025ml的1M氯化钙、0.05ml的0.2％TODB、0.05ml的0.2％4-氨基安替吡啉、0.1ml的50U/ml甘油一酸酯脂酶、0.1ml的300U/m甘油磷酸氧化酶、0.025ml的6U/ml GPC磷酸二酯酶和0.05ml的100U/ml过氧化物酶。随后，使用含有0.05％BSA的10mM Tris-HCl(pH7.5)稀释反应溶液，然后向反应溶液中加入25μl的PLB溶液(0.03U/ml～0.15U/ml)，用相同的稀释缓冲液将其稀释以引发反应。在刚过10分钟后，加入1ml的0.5％SDS终止反应，然后测定其在550nm处的吸光度。

需要注意的是，将每分钟释放出1毫摩尔的GPC的活性定义为一个单位。

实施例3测定脂酶活性的方法

通过使用甘油一酸酯脂酶将使用甘油二酸酯作为底物生成的甘油一酸酯转化为グルセリン，然后通过利用酶法测定来进行脂酶活性测定。即，向0.5ml的反应溶液中加入25μl的以含有0.05％BSA的10mMTris-HCl稀释的酶溶液(0.03U/ml～0.15U/ml)，然后在37℃进行10分钟的反应，所述反应溶液由溶解在0.1ml的含有3％Triton X-100的1MMES-NaOH(pH 6.0)中的以下物质组成：0.05ml的10mM 1，2甘油二酸酯、0.025ml的0.5M氯化钙、0.025ml的0.05M氯化镁、0.05ml的0.05MATP、0.05ml的10U/ml甘油一酸酯脂酶、0.05ml的5U/ml甘油激酶、0.25ml的400U/ml甘油磷酸氧化酶、0.025ml的100U/ml的过氧化物酶、0.025ml的0.3％TOOS和0.025ml的0.3％4-氨基安替吡啉。之后，使用0.5％SDS终止反应，然后测定其在550nm处的吸光度。需要注意的是，将每分钟释放出1毫摩尔的甘油的活性定义为一个单位的脂酶活性。

实施例4通过PLB级分A的凝胶过滤色谱法进行的提纯

通过离心超滤装置浓缩由实施例1获得的PLB活性酶级分A。之后，对浓缩溶液进行凝胶过滤色谱法(SuperDex 75)(预先用含有0.5M氯化钠的10mM Tris-HCl(pH 7.5)平衡)，然后以0.5ml/分钟的流速分离，由此获得活性级分。

在各级分中，通过如实施例2和3所述方法获得PLB活性和脂酶活性。使用280nm处的吸光度来测定蛋白质浓度。各级分的PLB活性、脂酶活性和蛋白质浓度的结果如图1所示。

结果，其中在280nm处测定的蛋白质浓度、脂酶活性和PLB活性的洗脱模式相互吻合。发现具有脂酶活性和PLB活性的蛋白是同一种酶蛋白。

实施例5PLB性质

5-1(反应的最佳pH)

在实施例2所示的反应溶液的组成中，使用乙酸盐缓冲液(下文简称为Acetate)、PIPES-NaOH缓冲液(下文简称为PIPES-NaOH)或MES-NaOH测定酶级分A在各种pH下的酶活性。获得了酶级分A在各缓冲液中相对于使用MES-NaOH pH 6.0获得的活性的相对活性。结果如图2所示。

如图2所示，MES-NaOH在约pH 6显示最大的酶活性。此外，还预计PIPES-NaOH和Acetate也在约pH 6显示最大的酶活性。

5-2(pH稳定性)

将酶级分A溶解使得其在10mM的Acetate、MES-NaOH、Tris-HCl或Bicine-NaOH缓冲液(下文简称为Bicine-NaOH)中的每一种缓冲液中为5U/ml，然后在37℃静置90分钟。之后，根据实施例2的方法测定PLB活性，接着测定各pH下相对于在Acetate(pH 5)中的活性的相对残余活性。结果如图3所示。

如图3所示，发现在pH 5～pH 8的很宽范围内具有pH稳定性。

5-3(热稳定性)

将酶级分A溶解使得其在10mM的MES-NaOH(pH 6.0)中为5U/ml，然后采用实施例2中所示的方法，在0～70℃的温度范围内加热10分钟后，进行PLB活性测定。结果如图4所示。当将冻藏保存的酶级分A的PLB活性定义为100％时，以至多55℃的温度处理的相对残留活性为90％以上。由此发现酶级分A是热稳定性酶。

5-4(底物特异性)

通过如实施例2所述的测定PLB活性的方法，测定作为通过实施例1的离子交换色谱法获得的两种不同的磷脂加工剂的各PLB(酶级分A和酶级分B)的、关于相应磷脂相对于PC的活性。换言之，与实施例2中所示的卵磷脂的反应组合物不同的是，在活性测定中使用PE、PI或PA来测定相对于PC的相对活性。结果如表1所示。作为结果，酶级分A和酶级分B同时显示出较小的相对于PC的相对活性(与其他磷脂相比)。发现本发明的磷脂加工剂具有底物特异性，使得对PI的活性小于对任何其他磷脂的活性。表1的结果显示，各级分具有PLB活性，因此所述磷脂加工剂可以是两种级分的组合。

表1

5-5(分子量)

对通过实施例1所述方法获得的经提纯的酶级分A进行SDS-聚丙烯酰胺电泳，得到单一条带。参照分子量已知的作为标记的蛋白，所述产物的分子量为53千道尔顿。

5-6(等电点)

采用使用两性电介质载体(Carrier Ampholyte)通过形成pH梯度来进行的等电电泳法，对通过实施例1所述方法获得的经提纯的酶级分A进行酶级分A的等电点测定。另外，采用280nm处的吸光度对经提纯的酶级分A进行蛋白质浓度测定。酶级分A的等电点和酶浓度之间的关系如图5所示。作为结果，采用280nm处的吸光度测定的所述蛋白质的pH与脂酶活性和PLB活性完全吻合，并且所述pH值(等电点)为4.21。从图5可以明显看出，所述蛋白质显示出与PLB和脂酶相同的峰，由此看出PLB和脂酶为相同的酶蛋白。

实施例6PI的定量测试

向0.5ml的染色液加入0.02ml的PI溶液，由此在37℃进行10分钟的反应，所述染色液含有0.1ml的1M Tris-HCl(pH 8)、0.05ml的10mMNAD、0.05ml的10mM氯化镁、0.05ml的2％Triton X-100、0.05ml的50U/ml PI特异性磷酸脂酶C、0.05ml的50U/ml碱性磷酸酶、0.05ml的50U/ml肌醇脱氢酶、0.05ml的5％氮蓝四唑和0.15ml的纯净水，所述PI溶液通过将含有PI的测试样品(1mg/ml～3mg/ml)溶解在2％TritonX-100而制得。使用0.5ml的0.5％SDS终止反应，然后测定550nm处的吸光度。用已知浓度的肌醇水溶液校准，然后定量分析PI的量。

实施例7GPC的定量分析

向0.5ml的反应溶液中加入25μl含有GPC的样品(0.3mg/ml～0.9mg/ml)，所述反应溶液含有0.1ml的1M Tris-HCl(pH 7.5)、0.025ml的1M氯化钙、0.05ml的0.2％TODB、0.05ml的0.2％4-氨基安替吡啉、0.025ml的6U/ml甘油磷酰胆碱磷酸二酯酶、0.05ml的100U/ml过氧化物酶、0.05ml的200U/ml胆碱氧化酶和0.15ml的纯净水。在37℃反应10分钟后，将0.5ml的0.5％SDS加入到反应溶液中，然后测定550nm处的吸光度。将已知浓度的胆碱水溶液用于校准，然后定量分析GPC。

实施例8制造PI的方法

在搅拌的同时，将40g来自大豆的磷脂悬浮在400ml的10mMAcetate(pH 5.8)中，然后加入1,400单位的作为本发明的磷脂加工剂的PLB(实施例1中获得的酶级分A)从而在45℃引发反应。20小时后，终止反应，然后加入200ml的乙醇和400ml的己烷，接着搅拌1小时。通过离心分离，将己烷层和水层彼此分离，由此回收有机溶剂层。在减压下浓缩所回收的有机溶剂，然后向浓缩液中加入150ml的丙酮。收集并干燥所得沉淀，由此获得含有高纯度PI的粉末(8.2g)。根据Standard Oiland Fat Analytical Test Method(由JAPAN Oil Chemists′Society确立，1996)，测定所得磷脂的纯度。结果，相对于总磷脂的纯度为86.8摩尔％。

实施例9制造GPC的方法

GPC、GPE和GP包含在通过对实施例8所述方法中的PLB反应物进行有机溶剂提取获得的水层中。使380ml的水层通过填充有活性炭的柱子(柱床体积：50ml)，由此获得无色的通过液体。在减压下浓缩所述液体，由此获得40ml的GPC溶液。根据实施例2中所述的GPC分析，GPC的纯度为55重量％。

实施例10制造溶血磷脂酰肌醇的方法

向10g在实施例8中获得的PI中加入20ml的水，然后充分搅拌，接着加入100mg由Sankyo LifeTech Co.，Ltd.制造的磷脂酶A1(11,900U/g)。然后在搅拌的同时于50℃进行酶反应。从反应开始24小时后，在80℃处理反应溶液30分钟，由此终止反应。干燥反应溶液，加入100ml丙酮并充分搅拌，随后经过滤得到固体。然后干燥所述固体，由此得到6g溶血磷脂酰肌醇。根据TLC分析的结果，证实未反应的PI和作为反应副产物的游离脂肪酸已被除去。

TLC载体：Silica Gel60，层厚度为2mm(由Merck Co.，Ltd.制造)，展开剂∶氯仿∶甲醇∶水＝65∶35∶4，染色方法：碘染色，Rf值：溶血磷脂酰肌醇(0.12)、PI(0.28)、游离脂肪酸(0.81)。

实施例11由点青霉制造磷脂酶B的方法

基于已知方法，由点青霉如下制备磷脂酶B。将100ml预温育在锥形培养瓶(体积为500ml)中的点青霉(IFO-4640)转移到20升经高压灭菌器灭菌的培养液(3.5％玉米浆、5.5％乳糖、0.7％磷酸钾、0.3％硫酸镁、0.5％碳酸钙和0.25％大豆油，pH 5.4)中，然后在有氧条件下于26℃温育4天。终止温育后，通过过滤获得菌体。向所述菌体中加入10升纯净水，然后用均质器均化10分钟，以获得溶解化的酶，随后进行过滤。结果获得8升粗制的酶溶液。使所述滤液通过填充有2kg棕榈酰化的纤维素纤维的柱子以吸附酶，然后用纯净水洗涤柱子，接着用含有0.5％AdecatolSO120和0.2mM EDTA的1mM磷酸缓冲液(pH 7.0)将酶洗脱。将洗脱液(10升)装载到Q-Sepharose离子交换柱中，由此吸附酶。用含有0.2mMEDTA的1mM磷酸缓冲液(pH 7.0)洗涤柱子，然后用含有0.2M NaCl和2mM EDTA的10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)将酶洗脱。之后，用含有2mM-EDTA的10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)对酶进行透析，然后进行脱盐和冻干，由此获得酶粉末(3800U/g)。

实施例12制造甘油磷酰肌醇的方法

向10g在实施例8中获得的PI中加入100ml的2mM Acetate(pH4.0)，然后充分搅拌，接着加入200mg如实施例11所述由点青霉获得的磷脂酶B，从而在搅拌的同时于40℃进行酶反应。从反应开始24小时后，在80℃处理30分钟以终止反应。向反应溶液中加入50ml的己烷，然后搅拌，接着静置以除去己烷层。然后，回收水层。使水槽通过预先填充有活性炭的柱子，然后收集通过的液体，接着进行冻干。结果获得8g甘油磷酰肌醇。

食品制备例1含有磷脂酰肌醇(PI)的人造黄油

将实施例8中获得的PI加到植物油中，使之成为5重量％的人造黄油，然后用乳化器等搅拌均匀。通过常规方法制备人造黄油。

食品制备例2含有磷脂酰肌醇(PI)的面包

将1g在实施例8中获得的PI、15g糖、2g食盐和5g含脂肪的奶粉溶解在70g热水中，然后加入两个鸡蛋并充分混合。将所述混合物加入130g小麦面粉与2g干酵母的混合物中，接着用手揉捏。将约30g黄油加入到所述混合物中，并进一步揉捏所述混合物，然后制得30个用于面包卷的球形面团。之后，在发酵后用打碎的鸡蛋涂覆面团的表面。将面团在180℃的烤箱中烘烤15分钟，由此获得面包卷。

食品制备例3含有磷脂酰肌醇(PI)的乌冬面(日本小麦面条)

相对于400g小麦面粉，将2g在实施例8中获得的PI加入到200g水以及20g食盐中，接着进行揉捏并让所述混合物静置足够的时间。然后，抻拉面团并将其切成约6mm宽的小片，由此得到乌冬面。

食品制备例4含有磷脂酰肌醇(PI)的饮料

将30g在实施例8中得到的PI悬浮在5倍体积的橄榄油中，然后加热至50℃，由此得到油相。将10g作为乳化剂的甘油脂肪酸酯加入到90g甘油中，然后加热至70℃并溶解。在搅拌的同时，向所述溶液逐渐加入上述油相。使用乳化装置在高压下乳化所述混合物而获得经乳化的组合物。然后，将180ml水加入到20g经乳化的组合物中并搅拌，由此得到含有PI的饮料。

制剂例1含有磷脂酰肌醇(PI)的片剂

在实施例8中得到的PI         120g

微晶纤维素                  330g

羧甲基纤维素钙              15g

羟丙基纤维素                10g

纯净水                      60ml

采用常规方法混合上述组合物，然后干燥，接着加入10g硬脂酸镁。将所述混合物制成片剂，由此得到100mg片剂，每片剂含有20mg量的PI。

制剂例2含有磷脂酰肌醇(PI)的软胶囊

将在实施例8中得到的PI悬浮在5倍体积的橄榄油中，然后充分混合均匀。然后，利用胶囊填充器以所述混合物填充胶囊，得到含量为300mg的胶囊。

化妆品制备例含有磷脂酰肌醇(PI)的药用乳膏(化妆品)

将在实施例8中得到的PI加入到白凡士林中使得其量为10重量％，然后和芳香族化合物等一起搅拌均匀。通过常规方法制得药用乳膏。

食品制备例5含有溶血磷脂酰肌醇的人造黄油

将在实施例10中获得的溶血磷脂酰肌醇加入到植物油中，使之成为5重量％的人造黄油，然后用乳化器等搅拌均匀。通过常规方法制得人造黄油。

食品制备例6含有溶血磷脂酰肌醇的面包

将1g在实施例10中获得的溶血磷脂酰肌醇、15g糖、2g食盐和5g含有脂肪的奶粉溶解在70g热水中，然后加入两个鸡蛋并充分混合。将所述混合物加入130g小麦面粉与2g干酵母的混合物中，接着用手揉捏。将约30g黄油加入到所述混合物中，并进一步揉捏所述混合物，然后制得30个用于面包卷的球形面团。之后，在发酵后用打碎的鸡蛋涂覆面团的表面。将面团在180℃的烤箱中烘烤15分钟，由此获得面包卷。

食品制备例7含有溶血磷脂酰肌醇的乌冬面(日本小麦面条)

相对于400g小麦面粉，将2g在实施例10中获得的溶血磷脂酰肌醇加入到200g水以及20g食盐中，接着进行揉捏，然后让所述混合物静置足够的时间。然后，抻拉面团并将其切成约6mm宽的小片，由此得到乌冬面。

食品制备例8含有溶血磷脂酰肌醇的饮料

将30g在实施例10中得到的溶血磷脂酰肌醇悬浮在5倍体积的橄榄油中，然后加热至50℃，由此得到油相。将10g作为乳化剂的甘油脂肪酸酯加入到90g甘油中，然后加热至70℃并溶解。在搅拌的同时，向所述溶液逐渐加入上述油相。使用乳化装置在高压下乳化所述混合物而获得经乳化的组合物。然后，将180ml水加入到20g经乳化的组合物中并搅拌，由此得到含有溶血磷脂酰肌醇的饮料。

制剂例3含有溶血磷脂酰肌醇的片剂

在实施例10中得到的溶血磷脂酰肌醇    120g

微晶纤维素                          330g

羧甲基纤维素钙                      15g

羟丙基纤维素                        10g

纯净水                              60ml

采用常规方法混合上述组合物，然后干燥，接着加入10g硬脂酸镁。将所述混合物制成片剂，由此得到100mg片剂，每片剂含有20mg量的溶血磷脂酰肌醇。

制剂例4含有溶血磷脂酰肌醇的软胶囊

将在实施例10中得到的溶血磷脂酰肌醇悬浮在5倍体积的橄榄油中，然后充分混合均匀。然后，利用胶囊填充器以所述混合物填充胶囊，得到含量为300mg的胶囊。

化妆品制备例含有溶血磷脂酰肌醇的乳膏(化妆品)

将在实施例10中得到的溶血磷脂酰肌醇加入到白凡士林中使得其量为10重量％，然后和芳香族化合物等一起搅拌均匀。通过常规方法制得乳膏。

食品制备例9含有甘油磷酰肌醇的人造黄油

将实施例12中获得的甘油磷酰肌醇加到植物油中，使之成为5重量％的人造黄油，然后用乳化器等搅拌均匀。通过常规方法制备人造黄油。

食品制备例10含有甘油磷酰肌醇的面包

将1g在实施例12中获得的甘油磷酰肌醇、15g糖、2g食盐和5g含脂肪的奶粉溶解在70g热水中，然后加入两个鸡蛋并充分混合。将所述混合物加入130g小麦面粉与2g干酵母的混合物中，接着用手揉捏。将约30g黄油加入到所述混合物中，并进一步揉捏所述混合物，然后制得30个用于面包卷的球形面团。之后，在发酵后用打碎的鸡蛋涂覆面团的表面。将面团在180℃的烤箱中烘烤15分钟，由此获得面包卷。

食品制备例11含有甘油磷酰肌醇的乌冬面(日本小麦面条)

相对于400g小麦面粉，将2g在实施例12中获得的甘油磷酰肌醇加入到200g水以及20g食盐中，接着进行揉捏，然后让所述混合物静置足够的时间。然后，抻拉面团并将其切成约6mm宽的小片，由此得到乌冬面。

食品制备例12含有甘油磷酰肌醇的饮料

将30g在实施例12中得到的甘油磷酰肌醇悬浮在5倍体积的橄榄油中，然后加热至50℃，由此得到油相。将10g作为乳化剂的甘油脂肪酸酯加入到90g甘油中，然后加热至70℃并溶解。在搅拌的同时，向所述溶液逐渐加入上述油相。使用乳化装置在高压下乳化所述混合物而获得经乳化的组合物。然后，将180ml水加入到20g经乳化的组合物中并搅拌，由此得到含有甘油磷酰肌醇的饮料。

制剂例5含有甘油磷酰肌醇的片剂

在实施例12中得到的甘油磷酰肌醇    120g

微晶纤维素                        330g

羧甲基纤维素钙                    15g

羟丙基纤维素                      10g

纯净水                            60ml

采用常规方法混合上述组合物，然后干燥，接着加入10g硬脂酸镁。将所述混合物制成片剂，由此得到100mg片剂，每片剂含有20mg量的甘油磷酰肌醇。

制剂例6含有甘油磷酰肌醇的软胶囊

将在实施例12中得到的甘油磷酰肌醇悬浮在5倍体积的橄榄油中，然后充分混合均匀。然后，利用胶囊填充器以所述混合物填充胶囊，得到含量为300mg的胶囊。

化妆品制备例含有甘油磷酰肌醇的乳膏(化妆品)

将在实施例12中得到的甘油磷酰肌醇加入到白凡士林中使得其量为10重量％，然后和芳香族化合物等一起搅拌均匀。通过常规方法制得乳膏。

工业实用性

本发明的磷脂加工剂适合用于使用来自大豆的磷脂作为原料的功能性磷脂的制造。

序列表

<110>旭化成制药株式会社

<120>含有磷脂酶B的新型试剂

<130>F106074

<140>

<141>

<150>JP2005-208913

<151>2005-7-19

<150>JP2006-057141

<151>2006-3-3

<160>3

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>549

<212>PRT

<213>假丝酵母

<220>

<223>发明人：今村茂行

<400>1

Met Glu Leu Ala Leu Ala Leu Leu Leu Ile Ala Ser Val Ala Ala Ala

  1               5                  10                  15

Pro Thr Ala Thr Leu Ala Asn Gly Asp Thr Ile Thr Gly Leu Asn Ala

             20                  25                  30

Ile Ile Asn Glu Ala Phe Leu Gly Ile Pro Phe Ala Glu Pro Pro Val

         35                  40                  45

Gly Asn Leu Arg Phe Lys Asp Pro Val Pro Tyr Ser Gly Ser Leu Asp

     50                  55                  60

Gly Gln Lys Phe Thr Leu Tyr Gly Pro Leu Cys Met Gln Gln Asn Pro

 65                  70                  75                  80

Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Asn Leu Pro Lys Ala Ala Leu Asp Leu Val

                 85                  90                  95

Met Gln Ser Lys Val Phe Glu Ala Val Leu Pro Leu Ser Glu Asp Cys

            100                 105                 110

Leu Thr Ile Asn Val Val Arg Pro Pro Gly Thr Lys Ala Gly Ala Asn

        115                 120                 125

Leu Pro Val Met Leu Trp Ile Phe Gly Gly Gly Phe Glu Val Gly Gly

    130                 135                 140

Thr Ser Thr Phe Pro Pro Ala Gln Met Ile Thr Lys Ser Ile Ala Met

145                 150                 155                 160

Gly Lys Pro Ile Ile His Val Ser Val Asn Tyr Arg Val Ser Ser Trp

                165                 170                 175

Gly Phe Leu Ala Gly Asp Glu Ile Lys Ala Glu Gly Ser Ala Asn Ala

            180                 185                 190

Gly Leu Lys Asp Gln Arg Leu Gly Met Gln Trp Val Ala Asp Asn Ile

        195                 200                 205

Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro Thr Lys Val Thr Ile Phe Gly Glu Leu

    210                 215                 220

Ala Gly Ser Met Ser Val Met Cys His Ile Leu Trp Asn Asp Gly Asp

225                 230                 235                 240

Asn Thr Tyr Lys Gly Lys Pro Leu Phe Arg Ala Gly Ile Met Gln Leu

                245                 250                 255

Gly Ala Met Val Pro Leu Asp Ala Val Asp Gly Ile Tyr Gly Asn Glu

            260                 265                 270

Ile Phe Asp Leu Leu Ala Ser Asn Ala Gly Cys Gly Ser Ala Ser Asp

        275                 280                 285

Lys Leu Ala Cys Leu Arg Gly Val Leu Ser Asp Thr Leu Glu Asp Ala

    290                 295                 300

Thr Asn Asn Thr Pro Gly Phe Leu Ala Tyr Ser Ser Leu Arg Leu Leu

305                 310                 315                 320

Tyr Leu Pro Arg Pro Asp Gly Val Asn Ile Thr Asp Asp Met Tyr Ala

                325                 330                 335

Leu Val Arg Glu Gly Lys Tyr Ala Asn Ile Pro Val Ile Ile Gly Asp

            340                 345                 350

Gln Asn Asp Glu Gly Thr Phe Phe Gly Thr Leu Leu Leu Asn Val Thr

        355                 360                 365

Thr Asp Ala Gln Ala Arg Glu Tyr Phe Lys Gln Leu Phe Val His Ala

    370                 375                 380

Ser Asp Ala Glu Ile Asp Thr Leu Met Thr Ala Tyr Pro Gly Asp Ile

385                 390                 395                 400

Thr Gln Gly Leu Pro Phe Asp Thr Gly Ile Leu Asn Ala Leu Thr Pro

                405                 410                 415

Gln Phe Lys Arg Ile Leu Ala Val Leu Gly Asp Leu Gly Phe Thr Leu

            420                 425                 430

Ala Arg Arg Tyr Phe Leu Asn His Tyr Thr Gly Gly Thr Lys Tyr Ser

        435                 440                 445

Phe Leu Leu Lys Gln Leu Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Thr Phe His

    450                 455                 460

Ser Asn Asp Ile Val Phe Gln Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Gly Ser Leu

465                 470                 475                 480

Ile Tyr Asn Asn Ala Phe Ile Ala Phe Ala Thr Asp Leu Asp Pro Asn

                485                 490                 495

Thr Ala Gly Leu Leu Val Lys Trp Pro Glu Tyr Thr Ser Ser Leu Gln

            500                 505                 510

Leu Gly Asn Asn Leu Met Met Ile Asn Ala Leu Gly Leu Tyr Thr Gly

        515                 520                 525

Lys Asp Asn Phe Arg Thr Ala Gly Tyr Asp Ala Leu Phe Ser Asn Pro

    530                 535                 540

Pro Leu Phe Phe Val

545

<210>2

<211>549

<212>PRT

<213>假丝酵母

<220>

<223>发明人：今村茂行

<400>2

Met Lys Leu Ala Leu Ala Leu Leu Leu Ile Ala Ser Val Ala Ala Ala

  1               5                  10                  15

Pro Thr Ala Lys Leu Ala Asn Gly Asp Thr Ile Thr Gly Leu Asn Ala

             20                  25                  30

Ile Ile Asn Glu Ala Phe Leu Gly Ile Pro Phe Ala Glu Pro Pro Val

         35                  40                  45

Gly Asn Leu Arg Phe Lys Asp Pro Val Pro Tyr Ser Gly Ser Leu Asn

     50                  55                  60

Gly Gln Lys Phe Thr Leu Tyr Gly Pro Leu Cys Met Gln Gln Asn Pro

 65                  70                  75                  80

Glu Gly Thr Phe Glu Glu Asn Leu Gly Lys Thr Ala Leu Asp Leu Val

                 85                  90                  95

Met Gln Ser Lys Val Phe Gln Ala Val Leu Pro Gln Ser Glu Asp Cys

            100                 105                 110

Leu Thr Ile Asn Val Val Arg Pro Pro Gly Thr Lys Ala Gly Ala Asn

        115                 120                 125

Leu Pro Val Met Leu Trp Ile Phe Gly Gly Gly Phe Glu Ile Gly Ser

    130                 135                 140

Pro Thr Ile Phe Pro Pro Ala Gln Met Val Thr Lys Ser Val Leu Met

145                 150                 155                 160

Gly Lys Pro Ile Ile His Val Ala Val Asn Tyr Arg Val Ala Ser Trp

                165                 170                 175

Gly Phe Leu Ala Gly Asp Asp Ile Lys Ala Glu Gly Ser Gly Asn Ala

            180                 185                 190

Gly Leu Lys Asp Gln Arg Leu Gly Met Gln Trp Val Ala Asp Asn Ile

        195                 200                 205

Ala Gly Phe Gly Gly Asp Pro Ser Lys Val Thr Ile Phe Gly Glu Leu

    210                 215                 220

Ala Gly Ser Met Ser Val Leu Cys His Leu Ile Trp Asn Asp Gly Asp

225                 230                 235v240

Asn Thr Tyr Lys Gly Lys Pro Leu Phe Arg Ala Gly Ile Met Gln Leu

                245                 250                 255

Gly Ala Met Val Pro Leu Asp Pro Val Asp Gly Thr Tyr Gly Asn Glu

            260                 265                 270

Ile Tyr Asp Leu Phe Val Ser Ser Ala Gly Cys Gly Ser Ala Ser Asp

        275                 280                 285

Lys Leu Ala Cys Leu Arg Ser Ala Leu Ser Asp Thr Leu Leu Asp Ala

    290                 295                 300

Thr Asn Asn Thr Pro Gly Phe Leu Ala Tyr Ser Ser Leu Arg Leu Leu

305                 310                 315                 320

Tyr Leu Pro Arg Pro Asp Gly Lys Asn Ile Thr Asp Asp Met Tyr Lys

                325                 330                 335

Leu Val Arg Asp Gly Lys Tyr Ala Ser Val Pro Val Ile Ile Gly Asp

            340                 345                 350

Gln Asn Asp Glu Gly Thr Ile Phe Gly Leu Leu Leu Leu Asn Val Thr

         355                 360                 365

Thr Asn Ala Gln Ala Arg Ala Tyr Phe Lys Gln Leu Phe Ile His Ala

    370                 375                 380

Ser Asp Ala Glu Ile Asp Thr Leu Met Ala Ala Tyr Pro Gln Asp Ile

385                 390                 395                 400

Thr Gln Gly Leu Pro Phe Asp Thr Gly Ile Phe Asn Ala Ile Thr Pro

                405                 410                 415

Gln Phe Lys Arg Ile Leu Ala Val Leu Gly Asp Leu Ala Phe Ile His

            420                 425                 430

Ala Arg Arg Tyr Phe Leu Asn His Phe Gln Gly Gly Thr Lys Tyr Ser

        435                 440                 445

Phe Leu Leu Lys Gln Leu Leu Gly Leu Pro Ile Met Gly Thr Phe His

    450                 455                 460

Ala Asn Asp Ile Val Trp Gln Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Gly Ser Val

465                 470                 475                 480

Ile Tyr Asn Asn Ala Phe Ile Ala Phe Ala Thr Asp Leu Asp Pro Asn

                485                 490                 495

Thr Ala Gly Leu Leu Val Asn Trp Pro Lys Tyr Thr Ser Ser Leu Gln

                500                 505                 510

Leu Gly Asn Asn Leu Met Met Ile Asn Ala Leu Gly Leu Tyr Thr Gly

        515                 520                 525

Lys Asp Asn Phe Arg Thr Ala Gly Tyr Asp Ala Leu Met Thr Asn Pro

    530                 535                 540

Leu Leu Phe Phe Val

545

<210>3

<211>1650

<212>DNA

<213>假丝酵母

<220>

<223>发明人：今村茂行

<400>3

atggagctcg ctcttgcgct cctgctcatt gcctcggtgg ctgctgcccc caccgccacg 60

ctcgccaacg gcgacaccat caccggtctc aacgccatca tcaacgaggc gttcctcggc 120

attccctttg ccgagccgcc ggtgggcaac ctccgcttca aggaccccgt gccgtactcc 180

ggctcgctcg atggccagaa gttcacgctg tacggcccgc tgtgcatgca gcagaacccc 240

gagggcacct acgaggagaa cctccccaag gcagcgctcg acttggtgat gcagtccaag 300

gtgtttgagg cggtgctgcc gctgagcgag gactgtctca ccatcaacgt ggtgcggccg 360

ccgggcacca aggcgggtgc caacctcccg gtgatgctct ggatctttgg cggcgggttt 420

gaggtgggtg gcaccagcac cttccctccc gcccagatga tcaccaagag cattgccatg 480

ggcaagccca tcatccacgt gagcgtcaac taccgcgtgt cgtcgtgggg gttcttggct 540

ggcgacgaga tcaaggccga gggcagtgcc aacgccggtt tgaaggacca gcgcttgggc 600

atgcagtggg tggcggacaa cattgcggcg tttggcggcg acccgaccaa ggtgaccatc 660

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ttctccaacc cgccgctgtt ctttgtgtaa                                  1650

Claims (28)

1.一种磷脂加工剂，所述磷脂加工剂含有来自假丝酵母属(Candida)且具有磷脂酶B(PLB)活性的酶。

2.一种磷脂加工剂，所述磷脂加工剂含有具有磷脂酶B(PLB)活性的酶，所述酶基本上仅仅不分解磷脂混合物中的磷脂酰肌醇。

3.如权利要求1或2所述的磷脂加工剂，其中，具有磷脂酶B(PLB)活性的酶还具有脂酶活性。

4.如权利要求1～3任一项所述的磷脂加工剂，其中，具有磷脂酶B活性的酶具有下述的物理化学性质：

(1)作用：将磷脂水解成2摩尔比的游离脂肪酸和等摩尔比的甘油磷酰胆碱的作用；

(2)分子量：53,000±3,000(根据SDS电泳法测定)；

(3)等电点：pH4.21±0.2；

(4)最佳pH：约pH 5.5～6.5；

(5)pH稳定性：约pH 5～9(37℃处理90分钟)；

(6)稳定性：55℃(在pH 5处理10分钟)；和

(7)底物特异性：对磷脂酰肌醇的活性比为对磷脂酰胆碱的活性比的10％以下。

5.一种磷脂加工剂，所述磷脂加工剂含有由柱状假丝酵母(Candidacylindracea)的培养液得到的酶。

6.一种磷脂加工剂，所述磷脂加工剂通过以下步骤得到：

(1)培养柱状假丝酵母；

(2)浓缩所述柱状假丝酵母的培养液；

(3)用有机溶剂使酶沉淀；

(4)用疏水色谱法对步骤(3)得到的粗制酶溶液进行提纯；和

(5)用离子交换色谱法对步骤(4)得到的酶进行分离和提纯。

7.一种磷脂加工剂，所述磷脂加工剂含有选自以下酶中的至少一种酶：具有SEQ ID No.1的氨基酸序列的酶；与SEQ ID No.1的氨基酸序列的同源性为75％以上且具有磷脂酶B活性的酶；具有SEQ ID No.1的氨基酸序列中缺失、置换或增加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列且具有磷脂酶B活性的酶。

8.一种磷脂加工剂，所述磷脂加工剂含有选自以下酶中的至少一种酶：具有SEQ ID No.2的氨基酸序列的酶；与SEQ ID No.2的氨基酸序列的同源性为75％以上且具有磷脂酶B活性的酶；具有SEQ ID No.2的氨基酸序列中缺失、置换或增加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列且具有磷脂酶B活性的酶。

9.一种制造磷脂酰肌醇和甘油磷酰胆碱的方法，所述方法包括使权利要求1～8任一项所述的磷脂加工剂作用于磷脂混合物。

10.一种制造磷脂酰肌醇的方法，所述方法包括使权利要求1～8任一项所述的磷脂加工剂作用于磷脂混合物。

11.一种制造磷脂酰肌醇的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)使权利要求1～8任一项所述的磷脂加工剂作用于磷脂混合物；

(2)使用有机溶剂提取磷脂酰肌醇；和

(3)通过水溶性或水混和性烷基羰基烷基溶剂处理，沉淀并回收磷脂酰肌醇。

12.如权利要求9～11任一项所述的制造磷脂酰肌醇的方法，其中，所述磷脂混合物来自大豆。

13.一种磷脂酰肌醇，所述磷脂酰肌醇是通过权利要求10～12任一项所述的制造方法得到的，其中，所述磷脂酰肌醇在总磷脂中的纯度为50摩尔％以上。

14.一种制造甘油磷酰胆碱的方法，所述方法包括使权利要求1～8任一项所述的磷脂加工剂作用于磷脂混合物。

15.一种制造甘油磷酰胆碱的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)使权利要求1～8任一项所述的磷脂加工剂作用于磷脂混合物；

(2)用含有有机溶剂的溶剂提取并除去脂质组分，并且将甘油磷酰胆碱收集到水层中；和

(3)将步骤(1)中发挥作用的磷脂加工剂吸附在活性炭上，并除去所述磷脂加工剂。

16.如权利要求9、14或15所述的制造甘油磷酰胆碱的方法，其中，所述磷脂混合物来自大豆。

17.一种甘油磷酰胆碱，所述甘油磷酰胆碱是通过权利要求14～16任一项所述的制造方法得到的，并具有55重量％以上的甘油磷酰胆碱纯度。

18.权利要求13所述的磷脂酰肌醇在制备高纯度甘油磷酸肌醇中的应用。

19.权利要求17所述的甘油磷酰胆碱在制备高纯度胆碱磷脂中的应用。

20.含有通过权利要求10～12任一项所述的制造方法制造的磷脂酰肌醇的食品、药品或化妆品。

21.含有通过权利要求14～16任一项所述的制造方法制造的甘油磷酰胆碱的食品、药品或化妆品。

22.一种溶血磷脂酰肌醇，所述溶血磷脂酰肌醇是通过使具有磷脂酶A1或磷脂酶A2活性的酶作用于通过权利要求10～12任一项所述的制造方法制造的磷脂酰肌醇而得到的。

23.一种制造溶血磷脂酰肌醇的方法，所述方法包括使具有磷脂酶A1或磷脂酶A2活性的酶作用于通过权利要求10～12任一项所述的制造方法制造的磷脂酰肌醇。

24.含有通过权利要求23所述的制造方法制造的溶血磷脂酰肌醇的食品、药品或化妆品。

25.一种甘油磷酰肌醇，所述甘油磷酰肌醇是通过使对磷脂酰肌醇具有充分作用的具有磷脂酶B活性的酶作用于通过权利要求10～12任一项所述的制造方法制造的磷脂酰肌醇而得到的。

26.一种制造甘油磷酰肌醇的方法，所述方法包括使对磷脂酰肌醇具有充分作用的具有磷脂酶B活性的酶作用于通过权利要求10～12任一项所述的制造方法制造的磷脂酰肌醇。

27.含有通过权利要求26所述的制造方法制造的甘油磷酰肌醇的食品、药品或化妆品。

28.一种食品、药品或化妆品，所述食品、药品或化妆品含有选自以下物质组成的组中的两种以上物质：通过权利要求10～12任一项所述的制造方法制造的磷脂酰肌醇；通过权利要求14～16任一项所述的制造方法制造的甘油磷酰胆碱；通过权利要求23所述的制造方法制造的溶血磷脂酰肌醇；和通过权利要求26所述的制造方法制造的甘油磷酰肌醇。

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