CN101220077A - 苯并咪唑化合物及其作为色谱配体的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明是关于一种苯并咪唑化合物及其作为色谱配体的用途，是使用由式M－SP－L所示的固相基质从含有一种或一种以上免疫球蛋白的溶液中分离和/或纯化免疫球蛋白的方法，在所述式M－SP－L中，M表示基质主链，SP表示间隔基并且L表示经取代的苯并咪唑配体。

Description

苯并咪唑化合物及其作为色谱配体的用途
技术领域
本发明涉及一种苯并咪唑化合物及其作为色谱配体的用途。
背景技术
免疫球蛋白或抗体是一类极其重要的蛋白质，它存在于哺乳动物、鸟类和鱼类的各种体液中，起到对抗攻击动物的物质、细菌和病毒的动物保护剂的作用。免疫球蛋白通常存在于动物的血液、乳液和唾液以及其它体液和分泌物中。
现已在有关人类和兽类诊断、健康护理和治疗部门的多种不同应用中开发免疫球蛋白所具有的生物活性。
所有上文所提及的免疫球蛋白的应用都需要在一定程度上将抗体从对粗原材料中分离，但各类应用对于抗体产物的最终纯度和可允许的成本都有其自身不同的需要。
一般说来，存在许多种可用于分离免疫球蛋白从而得到具有多种最终纯度、产率和成本的产物的不同方法。
分离免疫球蛋白的传统方法是基于选择性可逆沉淀包含免疫球蛋白的蛋白质片断，同时使其它类别的蛋白质留在溶液中。典型的沉淀剂为乙醇、聚乙二醇、易溶(lyotropic)(抗离液(anti-chaotropic))盐(诸如硫酸铵和磷酸钾)，以及辛酸(caprylic acid)。
典型地，这些沉淀方法将提供极其不纯的产物，同时还费时费力。此外，将沉淀剂加到原材料中将使得难以将上清液用于其它目的并且会产生处理的问题。当论及从(例如)乳清和血浆中大规模纯化免疫球蛋白时，上述弊端将尤其明显。
离子交换色谱法是另一种众所周知的通常用于分离免疫球蛋白的蛋白质分级分离方法。然而，由于为确保抗体有效结合以及不同免疫球蛋白的不同等电点所需的离子强度和pH值存在限制，故这种方法通常并不适用。
蛋白质A和蛋白质G亲和色谱法主要由于使用简便性和所获得的高纯度而成为分离和纯化免疫球蛋白、尤其分离单克隆抗体的极其流行和普遍的方法。尽管十分流行，但普遍认为蛋白质A和蛋白质G会给用户带来若干问题，其中包括：极高的成本、不同单克隆抗体(尤其小鼠IgG1)的变化的结合效率、蛋白质A/蛋白质G漏入产物中和基质于典型清洗溶液(例如，1M的氢氧化钠)中的低稳定性。上述每个缺点都会在个别应用中引起特定结果，包括可忽略的到极其严重的并且超限的结果。
因此，需要分离和纯化免疫球蛋白的新颖方法。
发明内容
本发明是基于一种发现，即，可将通过使某些经取代苯并咪唑配体与固相材料连接所形成的固相基质用于从多种不同原材料中分离和/或纯化不同种类免疫球蛋白的方法中，这将提供高效率并且对于结合过程中使用少量盐或不使用盐(尤其易溶盐)以及对于结合多种免疫球蛋白的能力而言，提供特殊优势。此外，这些基质对于在NaOH中的稳定性也特别有益，这一益处在使用后使固相基质再生时尤为明显。
本发明的一个实施例是针对一种用于从含有一种或一种以上免疫球蛋白的溶液中分离免疫球蛋白的方法，其包含：a)使所述含有一种或一种以上免疫球蛋白的溶液与通式M-SP-L的固相基质接触；b)将结合有免疫球蛋白的固相基质与所述溶液分离；c)视情况洗涤所述固相基质；和d)使所述固相基质与洗脱液接触以便将所述一种或一种以上免疫球蛋白从所述固相基质释放。
M表示基质主链，SP表示间隔基，并且L表示由结构式(I)所示的配体：
Figure S2008100023370D00021
或其互变异构体，其中：
R1为-Z-N(R3)2、-Z-SR3或-Z-OR3；
R2为-H、-卤素(例如，-F、-Cl、-Br或-I)、-OR4、-NH2、-烷基、-NO2、-SO3H、-N(R3)C(O)N(R3)2，
或
Figure S2008100023370D00023
R3在每次出现时独立地为-H或视情况经取代的烷基；
R4在每次出现时独立地为-H或视情况经取代的烷基；
R5在每次出现时独立地为-H或视情况经取代的烷基；
Z为单键、视情况经取代的亚烷基、视情况经取代的亚烯基或视情况经取代的亚炔基；
n为0到4的整数；
条件是L不为2-巯基-5-硝基-苯并咪唑、2-氨基-苯并咪唑、2-巯基苯并咪唑和2-氨甲基-苯并咪唑。
本发明另外提供一种包含具有多个官能团的官能化基质主链的固相基质，由式M-SP-L表示。
本发明还针对一种由以下结构式表示的化合物：
Figure S2008100023370D00031
或
本发明的固相基质和方法可用于以高效率和高纯度分离和/或纯化免疫球蛋白。
附图说明
无
具体实施方式
本发明针对一种分离和/或纯化免疫球蛋白的方法，其包含使含有一种或一种以上免疫球蛋白的溶液与本文所述的固相基质接触。本发明还针对本文所述的固相基质。因此，下文的定义将涉及根据本发明的方法以及根据本发明的固相基质。本发明还针对用于制备本文所述的固相基质的某些配体。
固相基质
如上文所述，根据本发明的方法包括使用固相基质，其中所述固相基质包含具有多个官能团的官能化基质主链，如下式所示：
M-SP-L，
其中M表示基质主链，SP表示间隔基，并且L表示由以下结构式(I)所示的配体：
Figure S2008100023370D00041
或其互变异构体，其中：
R1为-Z-N(R3)2、-Z-SR3或-Z-OR3；
R2为-H、-卤素、-OR4、-NH2、-烷基、-NO2、-SO3H、-N(R3)C(O)N(R3)2或
Figure S2008100023370D00042
或
Figure S2008100023370D00043
R3在每次出现时独立地为-H或视情况经取代的烷基；
R4在每次出现时独立地为-H或视情况经取代的烷基；
R5在每次出现时独立地为-H或视情况经取代的烷基；
Z为单键、视情况经取代的亚烷基、视情况经取代的亚烯基或视情况经取代的亚炔基；
n为0到4的整数；
条件是L不为2-巯基-5-硝基-苯并咪唑、2-氨基-苯并咪唑、2-巯基苯并咪唑和2-氨甲基-苯并咪唑。
在一个实施例中，R1为-Z-N(R3)2、-Z-SR3或-Z-OR3。在另一个实施例中，R1为-NH2、-SH、-CH2SH或-CH2-NH2。
在一个实施例中，Z为单键、视情况经取代的亚烷基、视情况经取代的亚烯基或视情况经取代的亚炔基。在另一个实施例中，Z为C1-C10亚烷基。在另一个实施例中，Z为C1-C5亚烷基。在另一实施例中，Z为单键。
在一个实施例中，R2在每次出现时独立地为-H、-卤素、-OR4、-NH2、-烷基、-NO2、-SO3H、-N(R3)C(O)N(R3)2，
Figure S2008100023370D00051
或
在一个实施例中，R2为
Figure S2008100023370D00053
或
Figure S2008100023370D00054
优选R5为H。在另一个实施例中，R2为-H。在另一个实施例中，R2为C1-C10烷基。在另一个实施例中，R2为C1-C5烷基。
在一个实施例中，R3在每次出现时独立地为-H或视情况经取代的烷基。在一个实施例中，R3为-H。在另一个实施例中，R3为C1-C10烷基。在另一个实施例中，R3为C1-C5烷基。
在一个实施例中，R4在每次出现时独立地为-H或视情况经取代的烷基。在一个实施例中，R4为-H。在另一个实施例中，R4为C1-C10烷基。在另一个实施例中，R4为C1-C5烷基。
在一个实施例中，R5在每次出现时独立地为-H或视情况经取代的烷基。在一个实施例中，R5为-H。在另一个实施例中，R5为C1-C10烷基。在另一个实施例中，R5为C1-C5烷基。
在一个实施例中，n为0到4的整数。在另一实施例中，n为1。在另一实施例中，n为0。
在特定实施例中，Z为C1-C10烷基；R3在每次出现时独立地为-H或C1-C10烷基；R4在每次出现时独立地为-H或C1-C10烷基；R5在每次出现时独立地为-H或C1-C10烷基。
在另一特定实施例中，Z为C1-C5烷基；R3在每次出现时独立地为-H或C1-C5烷基；R4在每次出现时独立地为-H或C1-C5烷基；R5在每次出现时独立地为-H或C1-C5烷基。
在另一特定实施例中，配体L是由结构式(I)表示，其中Z为单键；n为1并且其它变量如上文关于结构式(I)所述。在更特定的实施例中，Z为单键；n为1；R3在每次出现时独立地为-H或C1-C10烷基；R4在每次出现时独立地为-H或C1-C10烷基；R5在每次出现时独立地为-H或C1-C10烷基。在另一个更特定的实施例中，Z为单键；n为1；R3在每次出现时独立地为-H或C1-C5烷基；R4在每次出现时独立地为-H或C1-C5烷基；R5在每次出现时独立地为-H或C1-C5烷基。
在另一个特定实施例中，配体L是由结构式(II)表示：
Figure S2008100023370D00061
或
Figure S2008100023370D00062
或其互变异构体，其中各变量如上文关于结构式(I)所述。在更特定的实施例中，R5为-H。在另一个更特定的实施例中，Z为单键或C1-C5烷基；且R5为-H。
在另一个特定实施例中，配体L是由结构式(III)表示：
Figure S2008100023370D00063
或
Figure S2008100023370D00064
或其互变异构体，其中各变量如上文关于结构式(I)所述。在更特定的实施例中，R5为-H。在另一个更特定的实施例中，Z为单键或C1-C5烷基；且R5为-H。
在某些实施例中，L是由以下结构式所示：
Figure S2008100023370D00071
或
Figure S2008100023370D00072
或其互变异构体。
尽管配体是通过本文中的结构式且在下文中使用与得到所述配体的个别不连续的化学化合物相应的命名法来进行命名或描述，但应了解实际的配体L是所述化合物的一个基团。配体可在所述配体的不同连接位置处与基质主链连接。所述连接位置视配体本身而不同。配体的连接位置是在用于连接配体与基质主链的反应条件下配体中最具反应性的位置。举例来说，由以下结构式所示，配体可在苯并咪唑的氮处连接，其中连接位置以“
Figure S2008100023370D00073
”表示：
Figure S2008100023370D00074
在某些实施例中，当R1是由-Z-NHR3、-Z-SH或-Z-OH(其中Z不为单键)表示时，-L可由以下结构式表示：
Figure S2008100023370D00081
或
Figure S2008100023370D00082
在某些情况中，存在所述配体的互变异构形式，诸如下式所示的互变异构结构：
X＝S、O或NR3
应了解，当通过本文的结构式命名或表示配体时，所述结构式涵盖所述化合物可能存在的所有其它互变异构形式。
固相基质可包含作为基质主链的本质上已知适用于固相分离蛋白质和其它生物分子的任何天然或合成的有机或无机材料，例如，天然或合成多糖，诸如琼脂-琼脂和琼脂糖；纤维素、纤维素醚，诸如羟丙基纤维素、羧甲基纤维素；淀粉；树胶，诸如瓜尔胶(guar gum)和***胶(gum arabic)、印度树胶(gum ghatti)、黄芪胶(gum tragacanth)、刺槐豆胶(locust beangum)、黄原胶(xanthan gum)；果胶；粘蛋白(mucin)；葡聚糖；甲壳素；壳聚糖；海藻酸盐；卡拉胶(carrageenan)；肝素(heparin)；明胶；合成聚合物，诸如聚酰胺，诸如聚丙烯酰胺和聚甲基丙烯酰胺；聚酰亚胺；聚酯；聚醚；聚合乙烯基化合物，诸如聚乙烯醇和聚苯乙烯；聚烯烃；无机材料，诸如含硅材料，诸如二氧化硅，包括非晶形二氧化硅和石英；硅石；金属硅酸盐，可控孔度玻璃和陶瓷；金属氧化物和硫化物；或这些天然或合成的有机或无机材料的组合。
基质主链优选是选自琼脂-琼脂、琼脂糖、纤维素、纤维素醚(诸如羟丙基纤维素、羧甲基纤维素)、聚酰胺(诸如聚(甲基)丙烯酰胺)、聚乙烯醇、硅石和可控孔度玻璃。
作为基质主链的特别值得关注的固相材料为(例如)琼脂或琼脂糖珠粒，诸如来自瑞典Pharmacia Biotech公司的Sepharose和Superose珠粒和来自美国Biorad公司的Biogel A；葡聚糖基珠粒，诸如PharmaciaBiotech公司的Sephadex；纤维素基珠粒和膜，诸如来自捷克斯洛伐克Secheza公司的Perloza纤维素；复合珠粒，诸如Pharmacia Biotech公司的Sephacryl和Superdex；合成有机聚合物的珠粒，诸如来自美国Toso-Haas公司的Fractogel；来自美国Perceptive Biosystems公司的POROS介质、来自Biorad公司的Bio-Rex、Bio-GelP和Macro Prep，以及来自TESSEK公司的HEMA和Separon，和来自美国BioSepra公司的HyperD和Trisacryl介质，来自美国3M公司的Enzacryl和Azlactone；含硅材料的珠粒，诸如可控孔度玻璃，来自英国Bioprocesing公司的PROSEP和来自BioSepra公司的Spherocil；和珠粒或膜形式的涂覆二氧化硅复合物，诸如来自美国Arbor Technologies公司的ACTI-DISK、ACTI-MOD和CycloSep。
典型地，基质主链以及所得官能化固相基质可例如为不规则颗粒或球形珠粒、膜或薄片、模制表面或杆的形式。此外，固相材料可完全或部分渗透蛋白质或完全不渗透蛋白质。在本发明的特别值得关注的实施例中，基质为尺寸在1-10000μm、优选为10-1000μm(诸如为10-60μm以用于高效能应用，且诸如为50-500μm、优选50-300μm以用于制备目的)的范围内的不规则球形珠粒的形式。
特别值得关注的基质形式为包含密度控制颗粒的集聚体形式的密度受控基质。WO 92/00799中描述了这些集聚体，它们特别适用于在非填充柱中进行的流化床或膨胀床色谱以及不同分批式色谱技术(例如，在搅拌罐中进行的简单分批吸附)的大规模操作，所述专利全部并入本文用作参考。
可通过本质上已知适用于连接目的的任何类型的共价键将配体L与固相材料连接在一起，这可通过配体与固相材料之间的直接化学反应或用本质上已知的可能将基质主链与配体连接一起的适当试剂进行固相材料或配体的先前活化来完成。所述适当活化剂的实例为表氯醇、表溴醇、烯丙基缩水甘油醚；双环氧化物类(bis-epoxide)，诸如丁二醇二缩水甘油醚；卤素取代的脂肪族化合物类，诸如二氯丙醇、二乙烯基砜；羰基二咪唑；醛类，诸如戊二醛；醌类；溴化氰；高碘酸盐类，诸如偏高碘酸钠；碳化二酰亚胺类；氯代三嗪类(chloro-triazine)，诸如三聚氯氰(cyanuricchloride)；磺酰氯类，诸如甲苯磺酰氯和三氟代乙烷磺酰氯(tresylchloride)；N-羟基琥珀酰亚胺类；2-氟-1-甲基吡啶鎓甲苯-4-磺酸盐；恶唑酮类；顺丁烯二酰亚胺类；二硫代吡啶类(pyridyl disulfide)；酰肼类；和烯丙基溴/溴。其中，活化试剂留下不同于单键的间隔基团SP，例如表氯醇、表溴醇、烯丙基缩水甘油醚、双环氧化物、卤素取代的脂肪族化合物、二乙烯基砜、醛、醌、溴化氰、氯代三嗪、恶唑酮、顺丁烯二酰亚胺、二硫代吡啶和酰肼。在特定实施例中，间隔基SP是以式-(O-CH2CH2(OH)-CH2)m-表示，其中m为1到10的整数。更具体说来，m为1到5的整数。甚至更具体地说，m为1到3的整数。
在某些情况中，例如在将二乙烯基砜用作活化试剂的情况下，活化试剂甚至可以是官能团的一部分，有助于使免疫球蛋白与固相基质结合。在其它情况中，在官能团与基质反应的过程中，活化试剂从基质中释放出来。当使用羰基二咪唑(carbodiimidazole)和碳化二酰亚胺时，情况就如此。
在特定实施例中，活化剂为烯丙基溴/溴。
上文所提及的可能性使得有必要对使基质M与配体L连接的可选间隔基SP的存在加以定义。在本文中，可将间隔基SP视作使基质与配体之间形成连接的活化试剂的一部分。因此，间隔基SP与所涉及的活化试剂和偶合反应相应。在某些情况中，例如当使用碳化二酰亚胺时，活化试剂将形成基质或配体试剂的活化形式。偶合后，配体与基质之间没有活化试剂的部分存留，因而SP只是一个单键。
在其它情况中，间隔基SP为影响结合特征的完整官能团部分(即配体)，并且当间隔基SP包含功能活性位点或取代基(诸如硫醇、胺、酸性基团、砜基、硝基、羟基、腈基或能够通过氢键、静电键合或静电排斥、电荷转移等相互作用的其它基团)时，这将特别明显。
在其它情况中，间隔基SP可包含芳香族或杂芳族环，对于固相基质的结合特征起到显著作用。将醌类或氯代三嗪类用作固相基质或配体的活化剂即为这种情况的实例。
在某些实施例中，间隔基SP为单键或得自选自以下物质的活化试剂的双自由基基团(biradical)：表氯醇、烯丙基缩水甘油醚、双环氧化物类(诸如丁二醇二缩水甘油醚)、卤素取代的脂肪族化合物类(诸如，1，3-二氯丙-2-醇)、醛类(诸如戊二醛)、二乙烯基砜、醌类、溴化氰、氯代三嗪类(诸如三聚氯氰)、2-氟-1-甲基吡啶鎓甲苯-4-磺酸盐、顺丁烯二酰亚胺类、恶唑酮类和酰肼类。
在某些实施例中，间隔基SP选自：短链脂肪族双自由基基团，例如式-CH2-CH(OH)-CH2-(得自表氯醇)、-(CH2)3-O-CH2-CH(OH)-CH2-(得自烯丙基缩水甘油醚)或-CH2-CH(OH)-CH2-O-(CH2)4-O-CH2-CH(OH)-CH2-(得自丁二醇二缩水甘油醚)的基团；或单键。
由于存在材料(例如配体和/或间隔基)从固相基质漏入洗脱产物(例如免疫球蛋白)中的风险，故有利地选择分子量尽可能小的配体(或配体+可选间隔基)。使用蛋白质A、蛋白质G、合成肽和其它具有相对较高分子量的配体(例如，染料)的主要缺点在于，由于各组分的各自分子量和各组分彼此结合的自然倾向之间差异较小，故可能很难或者甚至不可能将任何释放的配体(视情况包括间隔基)与洗脱的免疫球蛋白分离。这在打算将免疫球蛋白用作治疗剂的情况中可能具有有害作用，可能会引起患者过敏性休克或其它严重症状。配体(包括其间隔基)的分子量越小，那么将任何泄露的配体与免疫球蛋白产物分离就越有效。具有最小可能分子量的配体(或配体-间隔臂结合物)的另一显著优势在于，在注入/摄入患者体内之前，可能未与免疫球蛋白分离的任何泄露的材料将引起最小抗原性，因此一般来说，与较高分子量的配体相比，较小分子量的配体所引起的抗原性相对更易于为生物体所接受。
因此，优选配体L具有低于500道尔顿(Dalton)、优选低于400道尔顿、更优选低于300道尔顿，诸如低于250道尔顿或甚至低于200道尔顿的分子量。
对于配体-间隔臂结合物(-SP-L)来说，优选分子量低于500道尔顿，更优选低于400道尔顿，诸如低于300道尔顿或甚至低于260道尔顿。
根据本发明，基质包含单独或与间隔基SP(甚至和基质主链)组合从而使得可能结合免疫球蛋白的配体。已发现，配体的重要部分为经取代的苯并咪唑。
预期将两种或两种以上不同的本文所定义的配体组合于同一基质主链上可能对免疫球蛋白的高结合效率和/或高纯度具有某些益处。然而，在本发明的重要实施例中，固相基质上的所有官能团都实质上相同。
还发现，通过将配体与已包含带负电荷或带正电荷的部分(诸如带正电的氨基或带负电的羧酸基、磺酸基或膦酸基)的基质偶合将增强产物的结合效率和纯度。
配体浓度对于本发明基质的功能特征也具有重要意义，例如，在一种配体浓度下，配体可展现对免疫球蛋白的较高程度的结合选择性，而增加配体浓度将导致结合选择性降低。如所属领域技术人员众所周知，过高的配体浓度可能通过多个结合点的机制而导致不合需要的杂质的强结合，这是由所述配体在固相主链上过于接近所引起。如果保持较低的配体浓度，那么各配体将间隔较大的距离，且因此不会因多个位点处的结合而引起杂质的结合。过高配体浓度的另一负面影响在于通过多个结合位点结合所需蛋白质(例如，免疫球蛋白)的风险。所述多处结合可能导致难以用适当洗脱缓冲液释放蛋白质(例如免疫球蛋白)。在某些情况中，甚至可能需要利用较强的变性条件和/或有机溶剂来使产物从高度取代的固相基质释放出来，但这将以损失生物活性为代价。
固相基质的配体浓度可以几种不同的方式表示。一种描述配体浓度的方式是以每克干物质中存在的配体的量(例如，微摩尔/克干物质)表示。举例来说，当通过固相基质的干燥(例如，冷冻干燥)样本的元素分析来测量配体浓度时，所述浓度是直接获得的结果。然而，配体浓度还可以1毫升潮湿沉降固相基质(通常也称为1毫升填料床基质)上存在的配体的量表示。如果同时已测定水合固相基质的干物质含量(即，干物质克数/潮湿沉降固相基质的毫升数)，那么所述配体的量为易于根据干固相基质的测定值(例如，微摩尔/克干物质)计算的数值。另一种表示配体浓度的方式是以1克潮湿但经抽吸排干的基质中存在的配体的量表示。如果同时已测定每克潮湿但经抽吸排干的基质的固相干物质含量，那么这一数值也易于根据干物质的测定值计算。
因此，本发明固相基质的配体浓度优选在10-990μmol/g固相基质干物质的范围内，诸如为100-990μmol/g，更优选为200-980μmol/g，尤其250-975μmol/g；或本发明固相基质的配体浓度优选在1-145μmol/ml水合沉降固相基质的范围内，诸如10-120μmol/ml，更优选为15-100μmol/ml，尤其20-80μmol/ml；或本发明固相基质的配体浓度优选在1-130μmol/g潮湿但经抽吸排干的固相基质的范围内，诸如为10-110μmol/g，更优选为20-100μmol/g，尤其20-90μmol/g。
固相基质的合成
一般来说，可根据本质上已知的方法，对固相基质进行衍生化从而使其包含共价连接的本发明的配体，例如通过以下步骤完成：用本质上已知的适当试剂活化基质主链，随后使配体与经活化的基质主链偶合，视情况通过首先将间隔基与经活化的基质主链偶合，随后经由适当的缩合试剂使所述配体与间隔基偶合，或甚至再次活化间隔基随后偶合配体，将间隔基SP并入配体与基质主链之间。
所述次序和试剂的选择可视待偶合的实际配体和待衍生化的基质主链而定，并且应考虑(例如)反应性基团(诸如羟基、氨基、巯基和硅烷醇)的含量。在某些情况中，可优选活化或衍生化配体而非基质主链，随后使衍生化配体与固相基质主链反应。
因此，在根据本发明合成固相基质的优选方法中，首先使基质主链与能够与基质主链反应的试剂反应，且由此使基质主链活化以进一步与配体反应，视情况洗去活化试剂，随后使活化的基质主链与包含配体的溶液反应，并且视情况随后用一种或一种以上适当溶液洗涤包含共价固定配体的固相基质，以清洗掉基质中过剩的反应物。
在某些情况中，可能通过混合两种试剂来组合配体的活化和偶合反应并且使所述反应平行发生。由于这种方式节约成本和时间，并且使废水的体积减到最少，故特别有益。因此，优选以一个组合步骤进行活化和偶合步骤。
此外，如果能够在无需向反应介质中添加有机溶剂加的情况下进行活化和/或偶合反应，那么这种方式将更为有益。这些有机溶剂通常用于溶解反应性试剂或者确保将反应性物质的水解保持在最低限度。然而，使用有机溶剂将因***风险、健康损害风险、废料问题和溶剂本身的相对高成本而使所述方法的成本和风险增加。因此，优选在不向反应介质中添加任何有机溶剂的情况下进行活化和/或偶合程序。
在某些实施例中，本发明针对一种由上文所述的结构式(I)、(II)和(III)所示的化合物。在特定实施例中，本发明的化合物选自以下结构式：
或
Figure S2008100023370D00141
上文所述的化合物可充当制备本文所述的本发明固相基质的配体。
免疫球蛋白的分离
一般说来，用于分离免疫球蛋白的本发明的方法可分成若干个步骤：(a)平衡固相基质；(b)使固相基质与免疫球蛋白溶液接触；(c)洗涤固相；(d)使固相与溶液分离；(d)洗脱已结合的免疫球蛋白；(e)使固相基质再生。
然而，是否每次或完全地进行所有步骤可视特定应用而定。因此，必须进行的步骤只是接触、分离和洗脱步骤，而平衡、洗涤和再生步骤可根据与实际应用相关的特定需求进行或不进行。分离步骤的类型将视实际配置(set-up)(见下文)而定。
平衡
在使固相基质与含有免疫球蛋白的溶液接触之前，优选确保基质与溶液都处于引起所需的免疫球蛋白结合的条件下。就这点看，因此可能需要调节诸如pH值、离子强度和温度等参数，并且在一些情况中，可能需要加入不同类物质以促进免疫球蛋白的结合和/或防止杂质结合。
因此，通过用溶液(例如，用于调节pH值、离子强度等或用于引入清洁剂的缓冲液)洗涤固相基质从而赋予固相所需的特性来进行固相基质的平衡是一个可选步骤。
接触
当固相基质为球形颗粒或不规则的颗粒形式时，含有一种或一种以上免疫球蛋白的溶液的接触可在含有固相基质的填充床柱或流化床/膨胀床柱中进行。所述接触还可以在简单的分批式操作中进行，其中将固相基质与溶液混合一段时间以使免疫球蛋白结合。
只要固相基质为渗透或半渗透膜或薄片的形式，那么通常可通过以下步骤实现接触：抽吸含有免疫球蛋白的溶液/向含有免疫球蛋白的溶液施加压力使其穿过膜或薄片的表面和/或通过膜或薄片的多孔结构，以确保免疫球蛋白与固定于表面上和/或多孔结构中的配体紧密接触。
关于本方法的其它准则提供于“Purification Tools for MonoclonalAntibodies”，Gagnon，P.，Validated Biosystems，1996中。
洗涤
在使固相基质与含有免疫球蛋白的溶液接触之后，视情况进行洗涤程序以便去除基质中未结合或松散结合的物质，诸如其它蛋白质、脂质、核酸或其它杂质。然而，在不需要免疫球蛋白具有极高纯度的一些情况中，可省略洗涤程序，从而节省工序以及洗涤溶液。
在需要具有极高纯度的免疫球蛋白的其它情况中，可以在进行洗脱之前，用不同洗涤缓冲液进行若干个不同的洗涤程序。
所使用的洗涤缓冲液将视色谱吸附剂和结合免疫球蛋白的配体的性质而定。洗涤缓冲液应当不干扰免疫球蛋白与吸附剂的结合，即，应对pH值、盐浓度和其它添加剂进行调节，从而使得通过用洗涤缓冲液简单地替代含有存在于吸附剂中和吸附剂周围的杂质的溶液，或者同此方法结合还释放与吸附剂结合的杂质，仅去除非所需的杂质。可通过改变pH值和/或离子强度，或通过将与吸附剂或杂质竞争性相互作用的物质加到洗涤缓冲液中，从而将杂质从吸附剂中置换出来，来实现与基质结合的杂质的释放。
优选进行洗涤(本发明方法中的操作(c))以便从含有免疫球蛋白的溶液中去除其余物质，并且去除其它类型的生物分子。
洗脱
所结合的免疫球蛋白的洗脱通常是通过使包含已结合免疫球蛋白的固相基质与将免疫球蛋白从基质上的配体释放出来的溶液接触来进行。由此将免疫球蛋白释放到溶液中并且能够将其从基质中洗出来。用于释放免疫球蛋白的溶液通常应具有与用于结合免疫球蛋白的溶液所不同的特征，例如，所述溶液可具有不同的pH值、不同的离子强度、不同的温度和/或其可包含有机溶剂(优选仅包含少量)、清洁剂、离液剂或其它变性试剂。通常还使用这些不同参数的变化组合。
还可以通过施加将条件从结合逐渐变为不结合条件的溶液来进行洗脱，这种程序通常称为梯度洗脱。
将免疫球蛋白从固相基质释放到洗脱溶液中后，可通过可选的本质上已知的不同方式从洗脱溶液回收免疫球蛋白。在最简单的情况中，可直接使用免疫球蛋白而不需要进行任何改变，但在许多情况中，优选进行某种浓缩程序，例如超滤、冷冻干燥或沉淀(例如，盐析)。也可以在具有可选特性的另一处理步骤中对免疫球蛋白溶液进行彻底纯化。
再生
在洗脱免疫球蛋白之后，可视情况对固相基质进行清洗，即再生。通常定期进行这一程序以使污染固相表面的杂质的积累减到最少，和/或使基质灭菌以避免产物被固相和所述过程中所使用的设备中增殖和从固相和设备中逃逸的微生物所污染。进行所述再生步骤的标准方法为用能够清洗基质和/或杀死微生物的溶液洗涤固相基质。用于这些目的的典型溶液例如为，0.1-1.0M的氢氧化钠；高酸溶液或过氧化氢；变性剂，诸如盐酸胍；包含活性氯的溶液，诸如次氯酸盐溶液；有机溶剂，诸如乙醇；清洁剂等。用于这一目的的特别优选的方法是使用0.1-1.0M氢氧化钠，这是因为它具有极高的效率、低成本、易于用盐酸中和并且无废料问题。
在本发明的特定实施例中，所述方法包括：(i)平衡(可选步骤)、(ii)接触、(iii)洗涤(可选步骤)、(iv)分离、(v)洗脱和(vi)再生，其中在再生之前可重复步骤(i)-(v)的循环一次或数次，并且在再生后将固相基质重复使用。
在结合、洗涤和洗脱步骤中使用的条件对于所得免疫球蛋白结合效率、产率和纯度极为重要。根据本发明的不同固相基质可能需要不同的结合、洗涤和洗脱条件以确保最佳结果。同样，原材料的性质将对选择用于特定分离程序的条件具有极为显著的影响，例如，在杂交瘤细胞培养物上清液中极稀的单克隆抗体溶液(通常为10-100μg/ml)与存在于较浓溶液(诸如，腹水，1-5mg/ml)中的相同类型的抗体具有不同的表现，并且例如存在于乳清(1-2mg/ml)中的免疫球蛋白需要不同于血浆/血清(5-20mg/ml)等中的免疫球蛋白的条件。
而且，不同类杂质的组成(即含量)可随不同原材料而显著不同，例如与杂交瘤细胞培养物上清液相比，蛋黄具有极为不同的组成。
如上文所提及，通常可能将不同物质加到含有免疫球蛋白的溶液中以增强抗体与固相基质的结合。
在某些实施例中，本发明涉及分离免疫球蛋白从而得到纯度为至少10％，诸如至少30％，优选为至少50％，诸如至少70％，更优选为至少80％，诸如90％，尤其为至少99％的经分离免疫球蛋白的方法。
如上文所提及，据悉固相基质最大结合效率pH值在2.0到10.0的范围内，最可能在3.0到9.0的范围内。因此，在接近所述最大值(当然，不同免疫球蛋白/固相基质组合的最大值可能不同)处进行分离过程最为适合。因此，含有免疫球蛋白(或一般说来，蛋白质)的溶液的pH值优选在2.0到10的范围内，诸如在3.0到9.0的范围内。然而，视配体类型和基质主链而定，pH值的范围优选为3.0到7.0或6.0到9.0。
据悉，当配体含有酸性基团时，含有免疫球蛋白的溶液的pH值优选在2.0到6.0的范围内，更优选在2.5到5.5的范围内，诸如在3.0到5.5的范围内，或在4.0到5.5的范围内，这与所述特定类型基质的预期最大结合效率相对应。
如本文所使用，“酸性基团”是指pKa值小于约6.0的基团。
对于上述接触步骤，已发现，不需要加入过量的易溶盐来使免疫球蛋白与基质结合。因此，含有免疫球蛋白的溶液的总含盐量(包括例如NaCl)只需要与至多2.0、优选在0.05到2.0的范围内，诸如为0.05到1.4，尤其在0.05到1.0的范围内的离子强度相对应。因而，作为另一个替代性要求，易溶盐的浓度应尽可能低，由此，经证实，用易溶盐的浓度为至多0.4M，优选为至多0.3M，尤其为至多0.2M，诸如为至多0.1M的含有免疫球蛋白的溶液操作是可能的。在特定实施例中，不使用易溶盐。
易溶盐的实例提供于“Purification Tools for MonoclonalAntibodies”，Gagnon，P.，Validated Biosystems，1996中，其中提供霍夫迈斯特系列(Hofmeister series)感胶离子(lyotropic ion)。
在特定实施例中，含有一种或一种以上免疫球蛋白的溶液的pH值在2.0到10.0的范围内并且总含盐量与至多为2.0的离子强度相对应。
对于溶液中免疫球蛋白的浓度，据悉固相基质能够在极宽的浓度范围内操作，因此，认为对于含有免疫球蛋白的溶液中免疫球蛋白的浓度而言，固相基质在浓度在0.001到0.2mg/ml、优选0.01到0.1mg/ml的范围内的杂交瘤细胞培养物上清液中操作与其在浓度范围为0.2到2.0mg/ml的乳液和乳清中以及浓度范围为5.0到20mg/ml范围内的不同动物血清和血浆中并且甚至在浓度范围为20-80mg/ml的初乳中操作同样有效。
已发现，本发明尤其适于包含每克固相基质免疫球蛋白在0.1到30mg的范围内，诸如每克固相基质免疫球蛋白在0.2到2mg的范围内或在5.0到25mg的范围内的溶液。
因此，含有免疫球蛋白的溶液可以是通过人工方法以及生物学方法衍生化等得到的免疫球蛋白溶液，诸如粗发酵肉汤；哺乳动物细胞培养物，诸如杂交瘤细胞培养物；来自经基因工程设计的微生物(诸如大肠杆菌(E.coli))培养物的发酵肉汤；腹水，诸如小鼠和大鼠腹水；人类、小鼠、大鼠、牛、猪、兔、山羊、豚鼠和驴的乳液、乳清、血液、血浆和血清；和蛋黄，诸如鸡蛋黄。
此外，当含有免疫球蛋白的溶液包含带负电的清洁剂时，可获得高纯度免疫球蛋白。不希望受任何理论的束缚，据悉清洁剂将抑制其它生物分子粘附到基质上。所述清洁剂的实例为硫酸辛酯、溴酚蓝、辛烷磺酸盐、月桂酰肌氨酸钠和己烷磺酸盐。在某些实施例中，不使用带负电的清洁剂。
同样，在本发明方法的洗涤步骤中，可能出于相同的原因而有利地使用带负电的清洁剂。所述清洁剂可单独使用或与缓冲剂(例如，易溶盐缓冲剂)组合使用。与在结合过程(操作(a))中使用易溶盐相比，洗涤步骤中使用易溶盐(小体积)仅产生极小废物问题(因为在大多数情况中，结合过程包括使用大体积易溶盐)。在某些实施例中，并未将清洁剂和易溶盐用于洗涤步骤中。
而且，甚至在洗脱步骤中不使用有机溶剂的情况下，也可表现用于本发明方法中的固相基质的优良特性，因此，优选所使用的洗脱液包含小于10％(v/v)、更优选小于5％的有机溶剂。最优选根本不使用有机溶剂。
或者，可使用较大量的无毒溶剂(例如，丙二醇)，例如多达40％的丙二醇。
可以各种方式进行接触步骤以及后续步骤，即分离、洗涤和洗脱。所选择的物理措施通常受规模和是否需要重复所述过程支配。根据本发明的固相基质可用于几乎任何用于研发和工业目的的配置中。因此，可(例如)在经搅拌的分批方法、填充床色谱柱方法或流化床方法中使固相基质与含有免疫球蛋白的溶液接触。其它准则提供于“Purification Tools forMonoclonal Antibodies”，Gagnon，P.，Validated Biosystems，1996中。
根据本发明进行免疫球蛋白分离的其它必需措施将遵循常规方法。
对于免疫球蛋白的一些应用来说，免疫球蛋白极纯，例如具有大于99％的纯度，显得特别重要。在打算将免疫球蛋白用作治疗剂时，更是如此，而且极高纯度也是其它应用所必需的。在诊断领域中，所需纯度可视多种因素而定，诸如是否使用未衍生化的抗体，在使用未衍生化抗体的情况中，可能不需要高纯度，即小于50％的纯度；或是否用信号分子(诸如，酶，例如辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase))标记所述抗体，在标记抗体的情况中，通常需要抗体具有至少80％或更高的纯度。对于其它应用来说，对于纯度的需要可能相应地不同。不过，免疫球蛋白的纯度以干物质计为至少10％从而能够适当使用所述产物似乎为一般的要求。然而，因为应当清楚明了，所以本发明提供解决这些问题的准则。
如从上文所了解，本发明的目标是提供具有高结合效率的固相基质。此外，本发明的固相基质具有高稳定性。更具体来说，本发明的固相基质在能使基质再生的1M NaOH中稳定。
在用于分离免疫球蛋白的方法中，含有蛋白质的溶液的总含盐量优选与至多2.0，诸如在0.05到2.0的范围内、尤其在0.05到1.4的范围内、尤其在0.05到1.0的范围内的离子强度相对应，和/或易溶盐的浓度优选为至多0.4M，诸如为至多0.3M、尤其为至多0.2M，特别为至多0.1M。在某些实施例中，不使用易溶盐来分离免疫球蛋白。
用于分离蛋白质和其它生物分子的方法可用于多种蛋白质，所述蛋白质的实例为蛋白酶，诸如酶原(proenzyme)、胰蛋白酶(trypsin)、糜蛋白酶(chymotrypsin)、枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、胃蛋白酶(pepsin)、血纤维蛋白溶酶原(plasminogen)、木瓜蛋白酶(papain)、肾素(renin)、凝血酶(thrombin)和弹性蛋白酶(elastase)；脂肪酶(lipase)、葡糖苷酶(glucosidase)；木聚糖酶(xylanase)；凝集素(lectin)；白蛋白；来自发酵肉汤的蛋白质；来自乳液和乳清的蛋白质；来自血液、血浆和血清的蛋白质；来自鱼类废弃物的蛋白质；来自屠宰场废弃物的蛋白质，诸如器官和组织提取物，例如来自牛肠的碱性磷酸酶；和来自植物(诸如马铃薯、番茄、椰子)提取物的蛋白质，诸如辣根过氧化物酶。
如本文所使用，术语“烷基”是指饱和直链、支链或环状烃。优选烷基为C1-C10烷基。甚至更优选烷基为C1-C5烷基。术语“C1-C10烷基”是指具有1-10个碳原子的烷基，其可为直链、支链或环状，诸如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、辛基、十二烷基、环戊基、环己基、十氢化萘基等。术语“C1-C5烷基”是指具有1-5个碳原子的烷基，其可为直链、支链或环状，诸如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、环戊基等。本发明化合物中所包括的烷基可视情况经一个或一个以上取代基取代。
术语“视情况经取代”旨在表示可经一个或一个以上、优选1-3个选自以下基团的基团取代的烷基：羧基；经保护羧基，诸如羧酸酯，例如(C1-C6)烷氧羰基；氨基羰基；单-和二((C1-C6)烷基)-氨基羰基；氨基-(C1-C6)烷基-氨基羰基；单-和二((C1-C6)烷基)氨基-(C1-C6)烷基-氨基羰基；氨基；单-和二((C1-C6)烷基)氨基；(C1-C6)烷基羰基氨基；羟基；经保护羟基，诸如酰氧基，例如(C1-C6)烷酰氧基；砜基；(C1-C6)烷基磺酰氧基；硝基；苯基；苯基-(C1-C6)烷基；卤素；次氮基；和巯基。
如本文所使用，术语“亚烷基”是指具有两个连接点的烷基。术语“(C1-C10)亚烷基”是指具有1到10个碳原子的亚烷基。亚烷基的非限制性实例包括亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2CH2-)、亚正丙基(-CH2CH2CH2-)、亚异丙基(-CH2CH(CH3)-)等。术语“(C1-C5)亚烷基”是指具有1到5个碳原子的亚烷基。亚烷基的非限制性实例包括亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2CH2-)、亚正丙基(-CH2CH2CH2-)、亚异丙基(-CH2CH(CH3)-)等。亚烷基可视情况经一个或一个以上取代基取代。
如本文所使用，术语“烯基”表示具有至少一个碳碳双键的饱和直链、支链或环状烃。优选烯基为C2-C10烯基。术语“C2-C10烯基”是指具有2到10个碳原子的烯基。代表性直链和支链(C2-C10)烯基包括乙烯基、烯丙基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2，3-二甲基-2-丁烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1-庚烯基、2-庚烯基、3-庚烯基、1-辛烯基、2-辛烯基、3-辛烯基、1-壬烯基、2-壬烯基、3-壬烯基、1-癸烯基、2-癸烯基、3-癸烯基等。烯基可视情况经一个或一个以上取代基取代。
如本文所使用，术语“亚烯基”是指具有两个连接点的烯基。亚烯基可视情况经一个或一个以上取代基取代。
如本文所使用，术语“炔基”表示具有至少一个碳碳三键的饱和直链、支链或环状烃。优选炔基为C2-C10炔基。术语“C2-C10炔基”是指具有2到10个碳原子的炔基。代表性直链和支链炔基包括乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1-丁炔基、4-戊炔基、1-己炔基、2-己炔基、5-己炔基、1-庚炔基、2-庚炔基、6-庚炔基、1-辛炔基、2-辛炔基、7-辛炔基、1-壬炔基、2-壬炔基、8-壬炔基、1-癸炔基、2-癸炔基、9-癸炔基等。炔基可视情况经一个或一个以上取代基取代。
如本文所使用，术语“亚炔基”是指具有两个连接点的炔基。亚炔基可视情况经一个或一个以上取代基取代。
如本文所使用，术语“卤素”是指-Cl、-F、-Br或-I。
实例
实例1    配体的合成
(1)(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-甲烷硫醇(4)
Figure S2008100023370D00201
向在50％v/v盐酸(20ml)中的1，2-苯二胺(1.88g，17mmol)中加入2-巯基乙酸(1.3ml，1.7g，19mmol)。在氮气氛下，在60℃下将反应混合物加热，随后在90℃下加热，历时48小时。此时再加入2-巯基乙酸(400μl，530mg，6mmol)。通过HPLC分析样本。将反应混合物冷却并且用40％v/v NaOH中和到pH5。将所得固体用水(50ml)洗涤并且在真空下干燥得到(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-甲烷硫醇1.95g，93％产率，Rt＝7.6min，纯度＞95％；以及二硫化物(Rt＝8.0min)4％。1H NMR(d6-DMSO，400MHz)14.3ppm(bs，0.5H)，7.46ppm(m，2H)，7.13(m，2H)，4.17ppm(s0.1H)。MS(电喷雾+)164mz(M+)，131m/z(M-SH)。
(2)5-(2H-四唑-5-基)-1，3-二氢苯并咪唑-2-硫酮
Figure S2008100023370D00211
向在2-丙醇(15ml)和水(30ml)中的4-氨基-3-硝基苄腈(4.98g，36mol)中加入溴化锌(13.80g，61mmol)，随后加入叠氮化钠(5.81g，89mmol)。在80℃下将反应混合物加热10小时。将反应冷却且随后通过HPLC进行分析。加入水(15ml)并且用50％(v/v)HCl将橙色混合物调到pH3.0。将固体用水(50ml)洗涤并且在烘箱中于90℃下干燥得到橙黄色固体2-硝基-4-(2H-四唑-5-基)-苯胺(6.59g)，Rt＝8.8min，1H NMR(d6-DMSO，400MHz)8.47ppm(1H，d，2Hz)，7.86ppm(1H，d of d，9Hz，2Hz)，7.58ppm(2.3H bs)，6.96ppm(1H d，9Hz)。MS(电喷雾+)206m/z(M+)，228m/z(M+Na)。
向在甲醇(450ml)和40％(v/v)盐酸(20ml)中的2-硝基-4-(2H-四唑-5-基)-苯胺(6.80g)中加入碳载钯(10％)。将反应容器排空并且使用气球向其中装入氢气。4小时后，通过HPLC分析反应。加入水(100ml)并且过滤反应混合物。用50％v/v甲醇水溶液(100ml)洗涤催化剂。在减压(175毫巴(mBar)，随后50毫巴)下于40℃下蒸发溶剂得到褐色固体4-(2H-四唑-5-基)-苯-1，2-二胺二盐酸盐(6.45g)，Rt＝4.9min。1HNMR(d6-DMSO，400MHz，)7.82ppm(1H d，2Hz)，7.67ppm(1H，d of d，8.5Hz，2Hz)，7.03ppm(1H，d，8.4Hz)，MS：(电喷雾+)176.8m/z(M+)，198.7m/z(M+Na)。
向在乙腈(100ml)中的4-(2H-四唑-5-基)-苯-1，2-二胺二盐酸盐(6.40g，25mmol)中加入硫代羰基二咪唑(4.86g，28mmol)。再加入100ml乙腈。随后将反应搅拌5小时并且通过HPLC分析反应。减压去除溶剂并且加入水(100ml)。将反应混合物的pH值调到pH2.0并且将固体过滤并用水(50ml)洗涤。干燥所述物质得到5-(2H-四唑-5-基)-1，3-二氢苯并咪唑-2-硫酮(3.35g，61％产率)。将所述物质悬浮于水(300ml)中并且用40％(v/v)NaOH将pH值调到11.0。接着加入甲醇(15ml)，随后加入活性碳(0.38g)并且将混合物搅拌1小时。过滤混合物并且在减压下将溶剂去除到其体积的一半。用50％(v/v)盐酸将pH值调到2.0得到灰白色固体。将固体滤出并且用水洗涤。通过HPLC分析，纯度＞98％，Rt＝7.8min。干燥所述物质得到5-(2H-四唑-5-基)-1，3-二氢苯并咪唑-2-硫酮(2.37g)。1H NMR (d6-DMSO，400MHz) 12.88ppm (1H，s)，12.84ppm(1H，s)，7.82ppm(1H，dd，8.4Hz，1.6Hz)，7.78ppm(1H，m)，7.30ppm(1H，d，8Hz)。MS(高分辨率EI)：实验值218.036514m/z C8H6N6S，质量准确度+4ppm。
(3)5-(2H-四唑-5-基)-1H-苯并咪唑-2-基-胺(1)
将在水(45ml)中的4-(2H-四唑-5-基)-苯-1，2-二胺盐酸盐(8.56g，34mmol)调到pH6.0。加入溴化氰(3.91g，37mmol)并且将混合物搅拌4小时。通过HPLC分析反应混合物。用40％(v/v)氢氧化钠将反应混合物的pH值调到pH4.0。将混合物冷却到4℃并且将褐色固体过滤并用水洗涤。干燥所述物质得到褐色固体5-(2H-四唑-5-基)-1H-苯并咪唑-2-基-胺(4.10g)，纯度为88％，Rt＝7.3mi n。用50％(v/v)盐酸将粗品5-(2H-四唑-5-基)-1H-苯并咪唑-2-基胺(4.10g)于水(40ml)中的悬浮液的pH值调到1.2。随后加入活性碳(0.2g)并且将混合物搅拌18小时。过滤混合物并且将滤液的pH值调到pH3.7得到棕褐色固体。将所述物质(3.01g)干燥并且通过HPLC分析，纯度大于97％。1HNMR(d6-DMSO，400MHz)13.04ppm(0.3H，s)，12.99ppm(0.3H，s)，8.85ppm(1H，s)，8.074ppm(1H，s)，7.96ppm(dd，8.4Hz，1.2Hz)，7.55ppm(d，8.4Hz)。MS(电喷雾+)201.8m/z(M+)，223.7rn/z(M+Na)。
(4)[5-(2H-四唑-5-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-甲烷硫醇盐酸盐(3)
Figure S2008100023370D00231
向在50％(v/v)(50％)盐酸(105ml)中的4-(2H-四唑-5-基)-苯-1，2-二胺二盐酸盐(9.40g，37.7mmol)中加入2-巯基乙酸(2.4ml，3.18g，34.5mmol)并且在氮气氛下于110℃下将反应混合物加热48小时。24小时后再加入巯基乙酸(0.5ml，0.66g，7.20mmol)。将反应混合物冷却且通过HPLC分析样本。将绿色固体滤出并用水洗涤。在真空(90毫巴)下于50℃下干燥固体得到[5-(2H-四唑-5-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-甲烷硫醇盐酸盐(5.27g，65％产率)，Rt＝7.4min，通过HPLC分析，纯度大于97％。1H NMR(d6-DMSO，400MHz)8.49ppm(1H，m)，8.22ppm(1H，dd，8.8Hz，1.6Hz)，7.95ppm(1H，m，9.2Hz)，4.67ppm(0.3H，s)，4.24ppm(2H，s)。MS：(电喷雾+)233.0m/z(M+H)，463.0m/z(2M-H)。
(5)[5-(2H-四唑-5-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-甲胺(2)
Figure S2008100023370D00232
向在50％(v/v)盐酸(50ml)中的4-(2H-四唑-5-基)-苯-1，2-二胺二盐酸盐(6.40g，25.7mmol)中加入甘氨酸(2.60g，34mmol)并且将混合物加热到130℃历时120小时。在所述时间过半时再加入甘氨酸(2.01g，26.7mmol)。此后，通过HPLC分析反应。用40％v/v NaOH将反应混合物的pH值调到4.0。将反应混合物冷却到4℃并且将深色产物滤出并用水(100ml)洗涤。将粗产物(5.62g)干燥并且纯度为93％，Rt＝7.0min。将所述粗产物悬浮于水(50ml)中并且用50％v/v盐酸将pH值调到1.4。随后加入活性碳(0.59g)并且在20-25℃下将混合物搅拌18小时。将碳滤出并用水洗涤。用40％(v/v)NaOH将pH值调到4.0得到浅橙色固体，在真空下进行干燥得到[5-(2H-四唑-5-基)-1H-苯并咪唑1-2-基]-甲胺(4.22g)。通过HPLC分析，纯度大于98％。1H NMR(d6-DMSO，400MHz)8.31ppm(1H，s)，7.96ppm(1H，d，6.4Hz)，7.70ppm(1H，d，6.4Hz)，4.38(2H，s)。MS：(电喷雾+)216.2m/z(M+H)，239.2m/z(M+Na)。MS(高分辨率EI)：实验值215.092339m/z C9H9N7，质量准确度-1.8ppm。
实例2    配体在固相主链上的固定
通用程序
向在NMP(2ml)中的配体(4.1mmol)中加入水(7ml)，随后加入溴活化的烯丙基化交联琼脂糖(10ml，150μmol/ml烯丙基)。随后加入10M氢氧化钠(1ml)并且在20-25℃使混合物翻滚18小时。[对于含有硫醇官能团的配体，加入少量NaBH4]。用10cv NMP、水、0.5M HCl、水、0.5MNaOH且随后20cv水洗涤凝胶。通过HPLC分析滤液配体。将凝胶悬浮于含有0.5M HCl的50％乙醇中，随后用10cv乙醇、水、0.5M NaOH和20cv水洗涤。通过酸量滴定和元素分析来分析凝胶。
5-(2H-四唑-5-基)-1H-苯并咪唑-2-基-胺(1)
向在NMP(2ml)和水(7ml)中的5-(2H-四唑-5-基)-1H-苯并咪唑-2-基-胺(838mg，4.1mmol)中加入10ml溴活化的烯丙基化[150μmol/ml烯丙基]交联6％琼脂糖，随后加入10M氢氧化钠(1ml)。20-25℃下使混合物翻滚18小时。用10cv NMP、水、0.5M HCl、水、0.5M NaOH且随后20cv水洗涤凝胶。通过HPLC分析滤液配体。将凝胶悬浮于含有0.5M HCl的50％乙醇中，随后用10cv乙醇、水、0.5M NaOH和20cv水洗涤。
滴定得到77μmol/ml的值，基于氮进行元素分析得到61μmol/ml。
5-(2H-四唑-5-基)-1，3-二氢苯并咪唑-2-硫酮
以与上述类似的程序，使用5-(2H-四唑-5-基)-1，3-二氢苯并咪唑-2-硫酮(676mg，4.1mmol)和NaBH4(3mg)进行制备。滴定得到133μmol/ml的值，基于氮进行元素分析得到177μmol/ml。
[5-(2H-四唑-5-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-甲烷硫醇盐酸盐(3)
以与上述类似的程序，使用[5-(2H-四唑-5-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-甲烷硫醇盐酸盐(1.142g，4.2mmol)和NaBH4(3mg)进行制备。滴定得到78μmol/ml的值，基于氮进行元素分析得到61μmol/ml。
[5-(2H-四唑-5-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-甲胺(2)
以与上述类似的程序，使用[5-(2H-四唑-5-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-甲胺(545mg，4.6mmol)进行制备。滴定得到76μmol/ml的值，基于氮进行元素分析得到49μmol/ml。
根据上文所述的程序制备具有2-氨基苯并咪唑或1H-苯并[d]咪唑-2，6-二胺(5)作为配体的固相基质。
实例3    免疫球蛋白结合容量和纯度的测量
静态hIgG容量的测量
用2mL配体-琼脂糖样本填充两个一次性柱(柱烧结料(column frit)以上46mm)以供各基质样本的测试，包括一个参考柱。使琼脂糖在重力作用下在pH值为7.4的PBS缓冲液中沉降。对各柱进行适当标记。
将350mg人类IgG溶解于7ml pH值为7.4的PBS缓冲液中以供各柱的测试。使人类IgG溶液滤过0.22μm的过滤器。
通过连续稀释制备经过滤IgG溶液的1∶50稀释液并且如下计算IgG的浓度：
人类IgG浓度(mg/mL)＝OD280nm×50/1.38。
IgG溶液的浓度为35-45mg/mL。
用5mL PBS缓冲液洗涤各柱4次。将5mL IgG溶液装载于各柱上并且将流出液(flowthrough，FT)收集于万能玻璃容器(glass universal)中。用5mL PBS缓冲液洗涤各柱4次以去除任何未结合的IgG并且将洗涤液收集到含有流出液的万能玻璃容器中。
用10mL 0.1M甘氨酸/HCl缓冲液(pH2)洗脱结合的IgG并且将洗脱液收集到万能玻璃容器中。
将两个万能玻璃容器混合约5分钟。
使用分光光度计和1.5mL石英比色管测量各万能玻璃容器中IgG的OD280nm。当测量流出液和洗涤液时，将PBS用作空白对照，而当测量洗脱液时，将0.1M甘氨酸/HCl缓冲液用作空白对照。
通过测量床高(mm)来测定所述柱中配体-琼脂糖的体积。用流出液、洗涤液和洗脱液中IgG的总量除以所装载IgG的总量，计算回收百分比。用洗脱液中IgG的量除以柱体积，计算IgG容量(mg/mL)。用基质中配体的量(mg)除以所洗脱IgG的量，计算配体利用值(mg/ml)。
多克隆动态容量的测量
使用标准动态容量方法(20％穿透(breakthrough，BT)，10％BT+10％非结合)和标准缓冲液，将2ml各样本填充到Omnifit柱中并且将hIgG施加到20％穿透。随后洗脱蛋白质并且清洗柱，测量洗脱液的OD280并且记录所施加hIgG的体积。测量条件如下：
流速2.5min停留时间(0.8ml/min)
平衡缓冲液PBS pH7.4
装载量    1mg/ml IgG PBS pH7.4
洗涤液PBS pH7.4
洗脱液    0.1M甘氨酸，pH2
清洗液    0.5M NaOH
通过以下程序测定为达到20％BT所需的IgG的量。
使IgG溶液以旁通模式通过含有所关注的固相基质的测试柱，直到达到平稳水平。测量IgG的量(以mAU为单位)。将等于流出液中IgG量的20％的量的IgG装载于填充有固相基质的另一个柱上，随后洗涤柱并将IgG从柱上洗脱。
进料容量的分析
使用标准进料方法和标准缓冲液，将2ml各样本填充到Omnifit柱(0.66cm)中并且施加Anti-nip进料直到达到20％穿透(如通过单独蛋白质A柱所测定)。随后洗脱蛋白质并且清洗柱。分析条件如下：
流速2.5min停留时间(0.8ml/min)
平衡缓冲液PBS pH7.4
装载量    Anti-nip(波动74&75)pH7.4
洗涤液PBS pH7.4
洗脱液    0.1M柠檬酸钠pH3
清洗液    0.5M NaOH
通过以下程序测定为达到20％BT所需的Anti-nip进料的量。
将Anti-nip进料装载于含有所关注的固相基质的测试柱中直到流出液达到稳定。将流出液按等分试样收集并且分析IgG含量(使用蛋白质A亲和柱)。当开始进料中IgG的mAu(于蛋白质A亲和柱上分析)等于测试柱流出液中IgG的mAu时，确定为100％BT。将与20％BT对应的Anti-nip进料的量装载于填充有所关注的固相基质的另一个柱上，随后洗涤柱并将IgG从柱上洗脱。
用CHO培养基5进行杂质结合研究
使用CHO培养基5研究本发明基质的颜色结合和杂质结合。收集穿透液(BT)和洗涤液、洗脱液、清洗液(含1％十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethylammonium bromide，hexa)，pH1.5)和最终0.5M NaOH洗涤液，并且记录OD280nm值。
测量步骤
1.在小型重力进料柱中测量1ml各基质样本并且使用15ml PBS(pH7.4)进行平衡。
2.施加10ml CHO培养基5并使其滴过所述柱，将BT收集于万能玻璃容器中，随后施加10ml PBS并且将此流出液(FT)收集于同一容器中。
3.施加10ml洗脱缓冲液0.1M甘氨酸(pH2)并且收集FT。
4.施加10ml hexa(pH1.5)并且收集起来用于清洗基质。
5.随后施加10ml 0.5M NaOH并且收集起来以确保所有结合的污染物都被洗掉，从而能够进行质量平衡计算
6.随后读取所有样本的OD280nm，以便进行直接比较。将OD280nm值转换成占所获得总OD280nm的百分比。
数据说明
1.在每个阶段读取各样本的OD280nm，即BT+W、洗脱液、清洗液和NaOH洗涤液。
2.随后将此值乘以任何稀释倍数。
3.经稀释倍数调整后，接着将OD值乘以所述部分的毫升数，即BT+W为20ml，其它步骤为10ml。
4.然后将总OD计算为各部分的OD值乘以各部分的毫升数之后的总和。
5.随后使用总OD计算各阶段中污染物的百分比。
实例4    本发明基质的结合性能
静态容量
根据上文所述的程序测量具有配体的基质1、2、3、4或5(样本1、2、3、4或5)的静态容量。还测量具有2-氨基苯并咪唑作为配体L的固相基质的静态容量作为对照。
表1-5概述静态容量数据
样本 静态容量(mg/ml) 洗脱回收％ 配体(μmol/ml) IgG结合(mg IgG/μmol配体)
对照 65 95 115 0.6
1 68 90 77 0.9
表1.样本1的静态IgG结合容量
样本 静态容量(mg/ml) 洗脱回收％ 配体(μmol/ml) IgG结合(mg IgG/μmol配体)
对照 63 103 97 0.7
2 58 102 76 0.76
表2.样本2的静态IgG结合容量
样本 静态容量(mg/ml) 洗脱回收％     配体(μmol/ml) IgG结合(mg IgG/μmol配体)
对照     66     101     107     0.62
3     52     103     78     0.67
表3.样本3的静态IgG结合容量
样本    静态容量(mg/ml)   洗脱回收％     配体(μmol/ml)    IgG结合(mg IgG/μmol配体)
对照    69   95     114    0.61
4    55   103     118    0.47
表4.样本4的静态IgG结合容量
样本    静态容量(mg/ml)   洗脱回收％     配体(μmol/ml)     IgG结合(mg IgG/μmol配体)
对照    65   95     115     0.6
5    44   93     40     1.1
表5.样本5的静态IgG结合容量
如表1-4中所示，样本1-5具有可与对照样本比拟或优于对照样本的静态结合容量。具体说来，样本1和5具有比对照样本高得多的配体利用值。
进料容量
使用Anti-nip进料测量样本1-5的进料容量并且将数据概括于表6中。还测量具有2-氨基苯并咪唑作为配体的固相基质的进料容量作为对照。使用PrA柱测定所洗脱IgG的纯度。通过用与PrA柱结合的IgG的量除以由测量OD280nm所测定的经洗脱IgG的总量来计算纯度百分比。
    样本     前沿分析DBC 20％BT，2.5minRT(mg/ml)    洗脱(mg IgG/ml)     IgG纯度％
    对照     31    34     64
    1     31    34     70
    2     26    12     74
    3     38    12     80
    4*     24，24    29，38     46，68
    5     27    45     60
表6.样本1-4的进料IgG结合容量。*基于两次测定。
如表6中所示，样本1和5具有与对照品类似的Anti-nip容量。然而，从样本1洗脱的IgG的纯度高于从对照样本洗脱的IgG的纯度。样本2和3具有与对照样本类似的前沿分析值和较低的洗脱值，这表明，样本2和3与IgG的结合比对照样本与IgG的结合强。然而，从样本2和3洗脱的IgG的纯度显著高于对照样本。与对照样本相比，样本4具有略低的Anti-nip结合容量。
还通过观察洗脱溶液(用pH值为3的0.1M柠檬酸钠洗脱的溶液)的颜色和解吸溶液(strip solution)(用0.5M NaOH洗涤液收集的溶液)的颜色来比较样本1-5的杂质结合与对照样本的杂质结合。对照样本的洗脱溶液和解吸溶液浑浊并且呈黄色。样本1的洗脱溶液和解吸溶液澄清并且略带黄色。样本2的洗脱溶液澄清并且略带黄色。样本3的洗脱溶液澄清并且无色。样本4的洗脱溶液无色并且略显浑浊。样本5的洗脱溶液澄清并且无色。因此，样本1-5都具有比对照样本弱的颜色结合。
多克隆动态结合容量
测量样本1-4的多克隆动态结合容量并且与对照样本(具有2-氨基苯并咪唑作为配体L的固相基质)相比较。室温下用20％BT和2.5min的停留时间得到的结合容量数据列于表7中。
    样本    前沿分析(mg/ml)     洗脱(mg/ml)
    对照    39     34
    1    34     27
    2    19     17
    3    19     6
    4    29     26
    5    30     21
表7.样本1-4和对照样本的多克隆IgG动态结合容量数据。
样本1和4具有与对照样本类似或略低的多克隆动态结合容量。
用CHO 5培养基进行杂质结合
使用CHO 5培养基测量样本1、2和4的杂质结合。还对对照样本和XL烯丙基化琼脂糖珠粒(未固定有配体但经历固定程序的琼脂糖珠粒)的杂质结合进行测量。将结合数据概述于表8-10中。
  总计   BT％     洗脱液％   清洗液％   NaOH解吸液％   所结合的总污染物(％)
XL烯丙基化   97.66   97.3     1.45   0.9   0.3   2
对照   90.47   75.8     20.34   2.5   1.3   23
1   90.99   85.1     10.65   2.5   1.8   13
表8.使用CHO 5培养基进行的样本1、对照样本和XL烯丙基化琼脂糖的杂质结合。
总计   BT％     洗脱液％   清洗液％     NaOH解吸液％   所结合的总污染物(％)
  对照 86.27   74.9     20.29   4.0     0.82   25.12
  2 95.58   98.1     1.22   0.6     0.08   1.86
表9.使用CHO 5培养基进行的样本1、对照样本和XL烯丙基化琼脂糖的杂质结合。
    总计  BT％     E％     Hexa％     NaOH   所结合的总污染物(％)
  对照     97.13  75.4     18.78     5.9     0.00   24.64
  4     101.39  96.3     2.06     1.7     0.00   3.74
表10.使用CHO 5培养基进行的样本4、对照样本和XL烯丙基化琼脂糖的杂质结合。
如表8-10中所示，与对照样本相比，样本1、2和4结合显著较少的杂质。
本文所提及的所有参考文献都全部并入本文用作参考。
尽管已参考本发明的实例实施例特别展示和描述本发明，但所属领域技术人员应了解，在不偏离随附权利要求书所涵盖的本发明范围的情况下，可对形式和细节进行各种变更。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (25)

1.一种从含有一种或一种以上免疫球蛋白的溶液中分离出免疫球蛋白的方法，其包含：
a)使所述含有一种或一种以上免疫球蛋白的溶液与以下通式的固相基质接触：
M-SP-L，
其中M表示所述基质的主链，SP表示间隔基，且L表示由结构式(I)所示的配体：
Figure S2008100023370C00011
或其互变异构体，其中：
R1为-Z-N(R3)2、-Z-SR3或-Z-OR3；
R2为-H、-卤素、-OR4、-NH2、-烷基、-NO2、-SO3H、-N(R3)C(O)N(R3)2，
或
Figure S2008100023370C00013
R3在每次出现时独立地为-H或视情况经取代的烷基；
R4在每次出现时独立地为-H或视情况经取代的烷基；
R5在每次出现时独立地为-H或视情况经取代的烷基；
Z为单键、视情况经取代的亚烷基、视情况经取代的亚烯基或视情况经取代的亚炔基；
n为0到4的整数；
条件是L不为2-巯基-5-硝基-苯并咪唑、2-氨基-苯并咪唑、2-巯基苯并咪唑和2-氨基甲基-苯并咪唑；
b)使结合有免疫球蛋白的所述固相基质与所述溶液分离；
C)视情况洗涤所述固相基质；和
d)使所述固相基质与洗脱液接触以便将所述一种或一种以上免疫球蛋白从所述固相基质释放，由此分离所述免疫球蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其中L表示由结构式(II)所示的配体：
Figure S2008100023370C00021
或
Figure S2008100023370C00022
或其互变异构体。
3.根据权利要求3所述的方法，其中L表示由以下结构式所示的配体：
Figure S2008100023370C00023
或
Figure S2008100023370C00024
或其互变异构体。
4.根据权利要求3所述的方法，其中R5为-H。
5.根据权利要求1所述的方法，其中Z为单键并且n为1。
6.根据权利要求5所述的方法，其中R3为-H。
7.根据权利要求1所述的方法，其中L表示由以下结构式所示的配体：
Figure S2008100023370C00025
或
Figure S2008100023370C00031
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述含有一种或一种以上免疫球蛋白的溶液的pH值在6.0到10.0的范围内。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述基质主链为琼脂糖。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述间隔基SP是由下式表示：
-(O-CH2CH2(OH)-CH2)m-，其中m为1到10的整数。
11.根据权利要求1所述的方法，其中：
所述基质主链为琼脂糖；
所述间隔基SP是由下式表示：
-(O-CH2CH2(OH)-CH2)m-，其中m为1到3的整数；且
所述配体L是由以下结构式表示：
Figure S2008100023370C00032
或
Figure S2008100023370C00033
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述含有一种或一种以上免疫球蛋白的溶液具有在2.0到10.0的范围内的pH值。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述含有一种或一种以上免疫球蛋白的溶液具有与至多2.0的离子强度对应的总含盐量，并且易溶盐的浓度为至多0.4M。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述含有一种或一种以上免疫球蛋白的溶液不具有易溶盐。
15.一种由以下通式表示的固相基质：
M-SP-L，
其中M表示所述基质的主链，SP表示间隔基，且L表示由结构式(I)所示的配体：
Figure S2008100023370C00041
或其互变异构体，其中：
R1为-Z-N(R3)2、-Z-SR3或-Z-OR3；
R2为-H、-卤素、-OR4、-NH2、-烷基、-NO2、-SO3H、-N(R3)C(O)N(R3)2，
Figure S2008100023370C00042
或
Figure S2008100023370C00043
R3在每次出现时独立地为-H或视情况经取代的烷基；
R4在每次出现时独立地为-H或视情况经取代的烷基；
R5在每次出现时独立地为-H或视情况经取代的烷基；
Z为单键、视情况经取代的亚烷基、视情况经取代的亚烯基或视情况经取代的亚炔基；
n为0到4的整数；
条件是L不为2-巯基-5-硝基-苯并咪唑、2-氨基-苯并咪唑、2-巯基苯并咪唑和2-氨基甲基-苯并咪唑。
16.根据权利要求15所述的固相基质，其中L表示由结构式(II)所示的配体：
Figure S2008100023370C00051
或
Figure S2008100023370C00052
或其互变异构体。
17.根据权利要求16所述的固相基质，其中L表示由以下结构式所示的配体：
或
Figure S2008100023370C00054
或其互变异构体。
18.根据权利要求17所述的固相基质，其中R5为-H。
19.根据权利要求15所述的固相基质，其中Z为单键并且n为1。
20.根据权利要求19所述的固相基质，其中R3为-H。
21.根据权利要求15所述的固相基质，其中L表示由以下结构式所示的配体：
或
Figure S2008100023370C00061
22.根据权利要求15所述的固相基质，其中所述基质主链为琼脂糖。
23.根据权利要求15所述的固相基质，其中所述间隔基SP是由下式表示：
-(O-CH2CH2(OH)-CH2)m-，其中m为1到10的整数。
24.根据权利要求15所述的固相基质，其中：
所述基质主链为琼脂糖；
所述间隔基SP是由下式表示：-(O-CH2CH2(OH)-CH2)m-，其中m为1到3的整数；且
所述配体L是由以下结构式表示：
Figure S2008100023370C00062
或
Figure S2008100023370C00063
25.一种由以下结构式所示的化合物：
Figure S2008100023370C00071
或
Figure S2008100023370C00072
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