CN101208437B - 检测大分子和其它分析物的生物传感器 - Google Patents

检测大分子和其它分析物的生物传感器 Download PDF

Info

Publication number
CN101208437B
CN101208437B CN2004800368747A CN200480036874A CN101208437B CN 101208437 B CN101208437 B CN 101208437B CN 2004800368747 A CN2004800368747 A CN 2004800368747A CN 200480036874 A CN200480036874 A CN 200480036874A CN 101208437 B CN101208437 B CN 101208437B
Authority
CN
China
Prior art keywords
fit
epi
construct
oligonucleotide
polypeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN2004800368747A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101208437A (zh
Inventor
T·黑杜克
E·黑杜克
E·克诺尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
St Louis University
Original Assignee
St Louis University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by St Louis University filed Critical St Louis University
Publication of CN101208437A publication Critical patent/CN101208437A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101208437B publication Critical patent/CN101208437B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3517—Marker; Tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6432—Quenching
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G01N2021/6441—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks with two or more labels

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

所述内容为可以使用一组共适体构建体用于鉴定和定量任何多肽或大分子复合物的组合物和方法。构建结合大分子构建体的多肽的独特表位的适体构建体。这些适体构建体含有表位结合位点、共适体结合位点和可检测标记。在同源多肽、分析物-多肽复合物或其它大分子复合物的存在下，共适体彼此结合以产生可检测的信号。共适体构建体可以通过接头连接以产生二价适体构建体。

Description

检测大分子和其它分析物的生物传感器
专利案件文本
本专利申请要求于2003年12月12日提交的美国临时专利申请号60/529,076的优先权。
政府支持
该工作由U.S.Department of Health and HumanServices/National Institutes of Health资助号CA94356支持。美国政府对本发明拥有一定权利.
序列表
下文附加序列表的纸印本及相同序列表的计算机可读形式，并在此引用作为参考.根据37C.F.R.1.821(f)，计算机可读形式中记录的信息与书面序列表一致.
发明背景
1.发明领域
本发明涉及检测任何多肽、分析物、大分子复合物或其组合的试剂盒、分子信标(molecular beacons)和方法。本发明涉及生物医学研究工具和诊断试剂盒。
2.相关技术说明
在我们的环境、食品供应、水供应和生物样品(血液、脑脊液、尿液等)中特定分子的检测、鉴定和定量可能非常复杂、昂贵和耗费时间。这些方法包括气相层析、质谱分析法、DNA测序、免疫测定、基于细胞的测定、生物分子印迹和凝胶、以及无数其它多步骤化学和物理测定。
对检测和测量生物学和环境样品中特定蛋白质水平的简便方法一直存在高度需求。检测和测量蛋白质水平是生物医学研究中最基础和最常运用的方法之一。尽管在研究和医学诊断中广泛应用基于抗体的蛋白质检测方法，但这些方法并不非常适于快速、高通量的平行蛋白质检测。
以前，本专利发明人已经开发了检测蛋白质特定亚类即序列特异性DNA结合蛋白质(Heyduk，T.；Heyduk，E.NatureBiotechnology2002，20，第171-176页；Heyduk，E.；Knoll，E.；Heyduk，T.Analyt.Biochem.2003，316，第1-10页；美国专利号6,544,746和共同未决专利申请号10/062,064、PCT/US02/24822和PCT/US03/02157，在此引用作为参考)的荧光传感器方法。该方法基于将蛋白质的DNA结合位点***为两个DNA“半位点”。得到的每个“半位点”含有短的互补单链区，所述互补单链区长度的设计在于为两个DNA“半位点”引入一些结合倾向，从而重新产生含有完整功能的蛋白质结合位点的双链体。将该倾向设计为低的，从而当蛋白质不存在时仅有小部分DNA半位点会结合。当蛋白质存在于反应混合物中时，其将仅与含有完整功能结合位点的双链体结合。该选择性结合将驱使DNA半位点的结合，且所述蛋白质依赖性的结合可用于产生报告靶蛋白质存在的光谱信号。本领域中使用术语“分子信标”描述上述测定，藉以强调在该测定中选择性识别和报告该识别的信号的产生同时发生。已经对若干蛋白质开发了DNA结合蛋白质分子信标，显示了它们的广泛适用性(Heyduk，T.；Heyduk，E·NatureBiotechnology2002，20，第171-176页，在此引用作为参考)。已经确立了这些分子信标作用的物理机制，并将其用作检测存在与DNA结合蛋白质结合的配体的测定平台(Heyduk，E.；Knoll，E.；Heyduk，T，；Analyt.Biochem.2003，316，1-10；Knoll，E.；Heyduk，T.Analyt.Chem.2004，76，1156-1164；Heyduk，E.；Fei，Y.；Heyduk，T·CombinatorialChemistry and High-throughput Screening2003，6，183-194，在此引用作为参考)。尽管已经非常有用，但该测定局限于展示天然DNA结合活性的蛋白质。
以适体(aptamers)作为“分子信标”
为检测蛋白质开发方便、特异、灵敏的高通量测定仍然是极为重要的目标.这类测定应用于研究、药物开发及医学诊断中。识别靶蛋白质的抗体是到目前为止绝大部分蛋白质检测测定的中心。从随机序列核酸群体选择识别靶蛋白质的适体的体外方法的开发提供了第一个真正的抗体替代方案.适体潜在的重要优点之一是，适体由易于增殖并合成的寡核苷酸组成.另外，可以使用标准核酸化学程序工程改造适体以含有报告基团(例如荧光探针)。因此，将适体运用于多种形式的蛋白质检测测定中的巨大兴趣不足为奇。最有前景的路线之一是开发基于适体的、将识别靶蛋白质与产生报告该蛋白质存在的光学信号组合的传感器。
已有若干已公开的报告证明基于适体的“分子信标”的精巧设计，其与特定靶蛋白质结合后产生荧光信号.所有这些设计依赖于适体中由靶蛋白质诱导的构象转变以产生荧光信号的变化。Yamomoto和Kumar(Genes to Cells2000，5，389-396)描述了识别HIV Tat蛋白质后产生荧光增加的分子信标适体。由于荧光团·猝灭剂对接近度的改变产生荧光信号，而荧光团-猝灭剂对接近度的改变是由适体发夹和双链体形式之间由Tat蛋白质诱导的转变产生的。Hamaguchi等人(Analyt.Biochem.2001，294，126-131)描述了识别凝血酶后产生荧光增加的分子信标适体。靶蛋白质不存在时，将该信标设计为形成使荧光团和猝灭剂紧密接近的茎环结构。该蛋白质存在时，迫使信标成为配体结合构象，从而导致荧光团和猝灭剂之间的分离增加及荧光信号的增强。Li等人(Biochem.Biophys.Res.Commun.2002，292，31-40)描述了当靶蛋白质存在时从疏松的无规卷曲向紧密的单分子四元体(unimolecular quadruplex)转变的分子信标适体。这个由蛋白质诱导的适体构象变化导致附着到适体末端的荧光团探针之间接近度的变化，从而造成荧光信号改变。Fang等人使用类似方法(ChemBioChem.2003，4，829-834)设计识别PDGF的分子信标适体。这些例子说明了适体对于设计能够将蛋白质的存在转变为光学信号的传感器的巨大潜力。
发明概述
发明人成功地推广了传感器设计，以大大扩展这些传感器的适用性，所述传感器设计以前应用于检测与蛋白质结合的序列特异性多核苷酸和其它缺乏天然核酸结合活性的分析物。简而言之，通过体外选择从随机序列库中获得结合特定靶蛋白质的核酸，将所述核酸取代识别序列特异性DNA结合蛋白质的天然DNA序列。可以通过体外SELEX(通过指数富集的配体***进化(systematic evolutionof ligands by exponential enrichment))程序产生能够特异性结合缺少天然DNA结合活性的蛋白质的核酸(DNA或RNA)适体，这是充分确定的(Tuerk，C.；Gold，L.Science1990，249，505-510；Gold，L.；Polisky，B.；Uhlenbeck，O.；Yarus，M.Ann.Rev.Biochem.1995，64，763-797；Wilson，D.S.；Szostak，J.W.Ann.Rev.Biochem.1999，68，611-647)。SELEX涉及通过结合、洗去未结合序列及PCR扩增靶结合的序列的循环，从随机DNA(或RNA)序列库选择结合特异性靶的核酸序列。成功选择出与多种蛋白质和其它靶分子特异性结合的适体的众多实例(Turek1990、Polisky1995和Wilson1999)有力地指出，产生大量天然存在蛋白质的适体是可能的。
发明人已开发了组合物和方法，所述组合物和方法进一步使共同未决专利申请10/062,064(在此引用作为参考)中所述基于接近度的测定能够在核酸结合因子、其配体和共调节物(coregulators)之外延伸到包括任何多肽(包括朊病毒或其它错折叠蛋白质)、分析物、小分子配体或大分子复合物。本发明涉及一组标记的适体的用途，其在各适体远尖端含有短的(优选约5-7个核苷酸)互补单链多核苷酸序列(称为“信号传导寡核苷酸(signalingoligo)”)。该组适体中的各个适体结合多肽或大分子复合物的特异且不同的表位，即，该组的第一个适体结合多肽或大分子复合物的第一个表位，而该组第二个适体结合该多肽或大分子复合物的第二个表位。当该多肽或大分子复合物存在时，第一个适体结合第一个表位，且第二个适体结合第二个表位，从而各适体远尖端的短互补单链多核苷酸序列可以彼此稳定结合。第一个适体远尖端的短单链多核苷酸序列与第二个适体远尖端的短单链多核苷酸序列稳定结合后，第一个适体上的标记被引到第二个适体上的标记附近，从而产生可测量的信号。换言之，可以制备与任何多肽或大分子复合物结合的两个或更多个新核酸半位点，并将其用于基于接近度的测定中以检测任何多肽或大分子复合物。可以通过柔性接头连接这组适体以形成二价适体构建体。
本发明的一个实施方案是包括制备第一个适体和第二个适体的方法，所述适体分别结合多肽或生物分子大分子复合物的第一个表位和第二个表位。可以使用体外选择制备适体，例如通过指数富集的配体***进化(也称为SELEX；见Klug，S.；Famulok，M.，Allyou wanted to know about SELEX.Mol.Biol.Reports1994，20，97-107，在此引用作为参考。)。另外，一个或多个先前存在的适体或天然存在的同源核酸序列可以经过修饰而在远尖端含有标记和短单链多核苷酸序列，并用于检测多肽、分析物或大分子复合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含第一个适体构建体和第二个适体构建体的二价适体，第一个适体构建体识别多肽或大分子复合物的第一个表位，并含有第一个信号传导寡核苷酸，第二个适体构建体识别多肽或大分子复合物的第一个表位并含有第一个信号传导寡核苷酸，其中第一个适体构建体和第二个适体构建体通过柔性接头连接到一起.在优选的实施方案中，出于检测目的，第一个适体构建体含有第一个标记，且第二个适体构建体含有第二个标记。
可以预见该二价适体构建体可用于检测分子和大分子复合物之外的无数应用.可以在与抗体相同的许多途径中使用该二价适体，例如检测分子和复合物、纯化分子和复合物、封闭表位和抗原、促进生物的免疫应答(天然的和特异性的)、治疗疾病及赋予受试者被动免疫。优选的受试者为人类、农场动物或伴侣动物。
进而可以预见该二价适体可用作治疗组合物，该治疗组合物阻断细胞或组织中分子的相互作用，或是促进细胞或组织中分子的相互作用，以在患者体内实现所需治疗结果。优选的患者包括人类、农场动物或伴侣动物。
进而可以预见该适体构建体或二价适体构建体可以用于医学或兽医诊断学或药物筛选，以帮助鉴定潜在的安全且有效的药物产物。
附图简述
图1.检测蛋白质的分子信标的总体设计。(A)针对缺乏天然DNA结合活性的蛋白质所设计的变体。这种情况下的信标将由两个经开发识别该蛋白质两个不同表位的适体组成.(B)针对展示天然DNA结合活性的蛋白质所设计的变体。这种情况下的信标将由含有对应于蛋白质结合位点的DNA序列的短的DNA双链体以及经开发识别该蛋白质不同表位的DNA(RNA)适体组成.
图2.制备共适体(coaptamer)的方法，其中共适体针对(A)不同于第一个适体结合位点、或(B)不同于核酸结合位点的表位，所述核酸含有蛋白质天然结合位点。
图3.DNA结合蛋白质分子信标(A)和基于针对蛋白质两个不同表位的适体检测该蛋白质的分子信标(B)的设计比较。
图4.适体构建体，其含有在纤维蛋白原外部位(exosite)(60-18[29])和肝素外部位(G15D)结合凝血酶的适体。
图5.荧光素标记的适体与凝血酶的结合。(A)通过荧光偏振检测60-18[29]适体(THR1)(50nM)的结合；(B)通过荧光强度变化检测G15D适体(THR2)(50nM)的结合；(C)以凝血酶对荧光素标记的G15D适体(THR2)(20nM)的定量平衡滴定。实线代表实验数据对描述适体和凝血酶之间形成1：1复合物的方程式的非线性拟合(nonlinear fit)；(D)当十倍过量的未标记60-18[29]适体(THR3)存在时，以凝血酶对荧光素标记的G15D适体(THR2)(20nM)的定量平衡滴定。实线表示实验数据对描述适体和凝血酶之间形成1：1复合物的方程式的非线性拟合。
图6.凝血酶适体构建体与荧光素标记的G15D适体(THR2)之间竞争结合凝血酶的图解。不存在竞争剂(A)、存在150nM THR3(B)、存在150nM THR4(C)及存在150nM THR7(D)时，含有和不含有凝血酶的50nM荧光素标记的G15D(THR2)的荧光光谱。
图7.探测凝血酶适体构建体和荧光素标记的G15D适体(THR2)之间竞争结合凝血酶的实验概要。使用不存在和存在竞争剂(250nM)时荧光素标记的G15D适体(THR2)(50nM)的荧光强度确定存在竞争剂时结合的THR2百分数。凝血酶浓度为75nM。图中所示解离常数值是从独立实验计算而来的，所述实验中，使用200nM荧光素标记的G15D适体(THR2)、200nM竞争剂和150nM凝血酶。
图8.60-18[29]适体(THR3)对荧光素标记的G15D适体(THR2)和THR5构建体之间竞争结合凝血酶的影响。不存在竞争剂(A)、存在1000nM THR3和200nM THR5(B)、存在1000nMTHR3(C)及存在200nM THR5(D)时，含有和不含有凝血酶(150nM)的200nM荧光素标记的G15D(THR2)的荧光光谱。
图9.通过凝胶电泳迁移率变动分析检测THR7适体构建体与凝血酶的结合。将417nM THR7样品与各种量的凝血酶(0至833nM)温育，温育15分钟后上样于天然10％聚丙烯酰胺凝胶上。(A)以Sybr Green染色的凝胶图像。(B)对应于THR7-凝血酶复合物的条带的强度，其是凝血酶浓度的函数。
图10.二价凝血酶适体构建体家族，其中通过9-27个核苷酸长度的poly T接头将G15D和60-18[29]适体与20个碱基对的DNA双链体连接。
图11.通过电泳迁移率变动分析(EMSA)检测图8所示凝血酶与二价适体构建体(各33nM)的结合。星号标示出最好地说明凝血酶优先结合构建体的条带，凝血酶与含有27和17个核苷酸的poly T接头的构建体的结合优先于含有9个核苷酸的poly T接头的构建体。凝血酶浓度在0至400nM变化。
图12.凝血酶信标的设计，通过17个核苷酸的poly T接头将G15D和60-18[29]适体与9个碱基对的荧光团(或猝灭剂)标记的“信号传导”双链体连接。(A)荧光素标记的G15D构建体(THR9)和dabcyl标记的60-18[29]构建体(THR8)的核苷酸序列.(B)凝血酶信标信号传导机制。(C)向凝血酶信标添加凝血酶后检测的荧光信号变化。作为比较，也显示不存在dabcyl标记的60-18[29]构建体(THR8)时以凝血酶对荧光素标记的G15D构建体(THR9)的滴定(仅有供体的曲线)。
图13.凝血酶信标的设计，通过接头将G15D和60-18[29]适体与9个碱基对的荧光团(或猝灭剂)标记的“信号传导”双链体连接，其中接头含有5个间隔区18单位(Spacer18unit)。(A)荧光素标记的G15D构建体(THR21)和dabcyl标记的60-18[29]构建体(THR20)的核苷酸序列。(B)凝血酶信标信号传导机制。(C)向凝血酶信标添加凝血酶后检测的荧光信号变化。作为比较，也显示不存在dabcyl标记的60-18[29]构建体(THR20)时以凝血酶对荧光素标记的G15D构建体(THR21)的滴定(仅有供体的曲线)。插图显示在与主图数据点对应的各种凝血酶浓度所记录的荧光发射光谱。
图14.通过凝胶电泳迁移率变动分析检测凝血酶与图13所示信标(THR20/THR21)的结合.将凝胶对荧光素发射成像(即，仅信标中THR21成分可见)。
图15.(A)在信标的两个不同浓度检测凝血酶的灵敏度。红色圆圈：50nM THR21和95nM THR20。蓝色圆圈：5nM THR21和9.5nM THR20.(B)信标对凝血酶的特异性.以凝血酶(红色圆圈)和胰蛋白酶(蓝色圆圈)滴定50nM THR21和95nM THR20。
图16.由竞争剂适体构建体造成的凝血酶信标信号的反转(reversal).在逐渐增加的竞争剂DNA浓度测量50nM THR21、95nM THR20和100nM凝血酶的荧光强度。将数据作为关于起始信标与凝血酶混合物信号(F0)的相对荧光增加作图。空心蓝正方形：THR7；实心黑圆圈：THR14/THR15；实心红正方形：THR16/THR17；实心蓝三角形：THR18/THR19；空心洋红三角形：THR3；绿色实心倒三角形：THR4；空心黑色三角形：非特异性单链DNA。
图17描述用于检测蛋白质的分子信标。比较(A)DNA结合蛋白质分子信标，和(B)基于针对蛋白质两个不同表位的适体检测该蛋白质的分子信标的设计。
图18描述适体构建体与凝血酶的结合。(A)通过5′荧光素部分的荧光强度变化检测G15D适体(THR2)(50nM)的结合。实线表示实验数据对简单1:1结合等温线的最佳拟合(best fit)。(B)存在在10x过量的未标记60-18[29]适体时，G15D适体(THR2)的结合。实线表示实验数据对简单1:1结合等温线的最佳拟合。(C)探测凝血酶适体构建体和荧光素标记的G15D适体(THR2)之间竞争的实验概要。存在竞争剂(200nM)时，使用THR2(200nM)的荧光强度确定结合的THR2百分数.凝血酶为150nM。各条上方的标记指示与THR2适体亲和力相比的竞争剂的相对亲和力(表示为亲和常数的倍数增加)。(D)通过凝胶电泳迁移率变动分析检测THR7适体构建体与凝血酶的结合。将对应于THR7-凝血酶复合物条带的强度作为凝血酶浓度的函数作图.插图：以Sybr Green染色的凝胶图像。以100＊(I-I0)/I0计算荧光变化(％)，其中I和I0分别对应为当存在和不存在给定凝血酶浓度时观察到的经稀释校正的荧光发射强度。
图19描述凝血酶信标的设计。通过含有5个间隔区18单位的接头将G15D和60-18[29]适体与7个碱基对的荧光团(或猝灭剂)标记的“信号传导”双链体连接。(A)荧光素标记的G15D构建体(THR21)和dabcyl标记的60-18[29]构建体(THR20)的核苷酸序列。X对应于间隔区18部分.(B)凝血酶信标的信号传导机制。(C)向凝血酶信标添加凝血酶后检测的荧光信号变化.作为比较，也显示不存在dabcyl标记的60-18[29]构建体(THR20)时以凝血酶对荧光素标记的G15D构建体(THR21)的滴定(仅有供体的曲线)。以100＊(I0-I)/I0计算信号变化(％)，其中I和I0分别对应为存在和不存在给定凝血酶浓度时观察到的经稀释校正的荧光发射强度。插图显示在对应于主图数据点的各种凝血酶浓度记录的荧光发射光谱。
图20描述具有多种供体受体荧光团组合的凝血酶信标变体。(A)荧光素-dabcyl；(B)荧光素-德克萨斯红；(C)荧光素-Cy5；(D)Cy3-Cy5。显示存在(黑线)和不存在(红线)凝血酶时的信标发射光谱。插图显示微量培养板孔的假色图像(false color image)，微量培养板孔中含有相应信标及所示凝血酶浓度。使用下列激发-发射设置在Bio-Rad Molecular Imager FX上获得图像：(A)488nm激光器-530nm带通滤光片；(B)488nm激光器-640nm带通滤光片；(C)488nm激光器-695nm带通滤光片；(D)532nm激光器-695nm带通滤光片。荧光为任意单位(arbitrary unit)(做设备反应校正)，并在线性刻度内绘图。
图21描述具有多种供体-受体对组合的信标的反应曲线。(A)荧光素-dabcyl，(B)荧光素-德克萨斯红，(C)Cy3-Cy5，(D)荧光素-Cy5，(E)铕螯合物-Cy5，(F)在饱和凝血酶浓度对所示供体-受体对观察的倍数信号变化。插图显示低凝血酶浓度数据点的放大图。在所有实验中使用5nM供体标记及5.5nM受体标记的适体构建体。以I/I0计算信号变化(倍数)，其中I和I0分别对应为存在和不存在给定凝血酶浓度时观察到的经稀释校正的受体荧光发射强度(以供体激发测量)。计算信号变化前从I和I0减除缓冲液背景。
图22描述凝血酶信标灵敏度对供体·受体对的依赖。在低凝血酶浓度，使用以荧光素-dabcyl对(三角形)、荧光素-德克萨斯红对(倒三角形)和荧光素-Cy5对(圆圈)标记的信标测定10nM供体标记及11nM受体标记的信标的反应。显示四个独立实验的平均数和标准差.如图5所示计算信号变化(倍数)。
图23描述凝血酶信标的重复性和稳定性.(A)在四个不同的凝血酶浓度实施信标信号的五次独立测定。所示数据代表平均数+/-标准差。(B)随时间推移在四个凝血酶浓度监控凝血酶信标信号，直至最多24小时。所示数据代表5次独立测量的平均数+/-标准差。在所述实验中使用含有5nM荧光素标记适体(THR21)和5.5nM德克萨斯红标记适体(THR27)的信标。除了没有减除缓冲液背景，如图5所示计算信号变化(倍数)。
图24显示测定凝血酶信标的Z′-因子。图中部方格显示微量培养板孔的假色图像，对应于曲线图中所示实验(上半部分孔为+凝血酶，下半部分孔为-凝血酶)。在所述实验中使用含有5nM荧光素标记适体(THR21)和5.5nM德克萨斯红标记适体(THR27)的信标。信号代表以供体激发测量的受体对供体发射(任意单位)比。
图25描述在复杂混合物中检测凝血酶。(A)不存在和存在过量无关蛋白质时，凝血酶信标在1nM凝血酶浓度的反应。所示数据为4个独立实验的平均数和标准差。(B)在掺加各种量凝血酶的HeLa提取物中检测凝血酶。所示数据为3次独立测量的平均数和标准差.细胞提取物中的凝血酶浓度为：1.88nM(浅灰色条)；3.75nM(深灰色条)；7.5nM(黑色条)。单独信标混合物的信号比存在细胞提取物(未添加凝血酶)时低～25％(未显示)，这与存在细胞提取物和特异性竞争剂时观察的信号基本相同.(C)以凝血酶信标监控凝血酶原由因子Xa催化转化为凝血酶的时间进程。(D)检测血浆中的凝血酶。所示数据为4次独立测量的平均数和标准差。使用的血浆体积(每20μl测定混合物)为：0.005μl(浅灰色条)；0.015μl(深灰色条)；0.045μl(黑色条)。“特异性的”指未标记的凝血酶适体竞争剂(THR7)，而“非特异性的”指30个核苷酸的随机序列DNA。图A、B和D中的信号对应于以供体激发测量的受体对供体发射比。对于单独信标混合物(图A和D)和存在细胞提取物时的信标混合物(图B)，将信号对数值1标准化。图C显示粗受体荧光强度(具有供体激发)。
图26描述传感器变体。
图27描述图26F所示传感器设计的实验证明.(A)传感器功能的原理。(B)以浓度逐渐增加的DNA结合蛋白质滴定供体和受体标记的传感器成分的混合物时，敏化受体荧光的增加。
图28描述图26G所示传感器设计功能发挥的实验证明。(A)传感器功能的原理。(B)向两个供体和受体标记的传感器成分的混合物(以“-”标记的光谱)添加含有与传感器元件互补的两个不同序列元件的单链DNA后，敏化受体荧光(以“+”标记的发射光谱)的增加。
图29描述我们的传感器设计与基于单个靶大分子识别元件的测定相比特异性增加的实验证明。
图30描述制备图26所示传感器适体的方法.
图31概括了选择在不同于G15D适体结合位点的表位与凝血酶结合的适体。
图32描述功能性凝血酶传感器的证明，所述传感器含有德克萨斯红标记THR27和荧光素标记THR35或THR36，其中含有对应于图31C中克隆20-26的序列。
图33概括了同时选择在两个不同表位与凝血酶结合的两个适体.
图34概括了选择在不同于CRP蛋白质DNA结合位点的位点与该蛋白质结合的适体。
发明详述
除非另外定义，在此使用的所有技术和科学术语，均具有与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同的意义。尽管在实施或测试本发明中可以使用与此处所述方法或材料相似或等价的任何方法或材料，但在此描述优选的方法和材料.为了本发明目的，定义下列术语。
术语“适体”指任何多核苷酸，一般是在生物化学活性、分子识别或结合属性方面具有有用的生物活性的RNA或DNA。通常，适体具有分子活性，例如在多肽的特异性表位(区域)与该多肽结合，或具有酶活性。普遍接受的是可以通过体外进化方法合成和/或鉴定在其与任何多肽的结合中特异的适体。
短语“天然同源结合元件序列”指作为核酸结合因子结合位点的核苷酸序列。该天然同源结合元件序列优选为被天然存在的核苷酸结合因子识别的天然存在的序列。
术语“分子识别构建体”指含有“表位结合剂”、并可以作为“分子信标”的构建体。分子识别构建体也优选含有“信号传导寡核苷酸”和“标记”。第一个分子识别构建体和第二个分子识别构建体可以通过“接头”连接到一起形成“二价分子识别构建体”。“分子信标”指任何基于化学制剂的体系，该体系使用可测量的读出***作为检测方法对分析物、多肽或其它生物分子、含有生物分子的大分子复合物或生物共调节物的存在进行检测或定量。分子识别构建体或二价分子识别构建体是特异性和灵敏度改进的特定类型的分子信标。
术语“适体构建体”指含有适体或天然同源结合元件序列、并可以作为“分子信标”的构建体。适体构建体也优选含有“信号传导寡核苷酸”和“标记”。第一个适体构建体和第二个适体构建体可以通过“接头”连接到一起形成“二价适体构建体”。适体构建体是分子识别构建体的亚型。适体构建体或二价适体构建体也是特异性和灵敏度改进的特定类型的分子信标。
术语“抗体”一般指识别并且可以与抗原表位结合的多肽或蛋白质。此处所用的抗体可以是如本领域所理解的完整抗体，即，由两个重链和两个轻链组成；或者，抗体可以是完整抗体的片段，例如Fab片段或含有高变区的肽。
术语“表位结合剂”指能够与抗原、多肽、蛋白质或大分子复合物的特异性表位结合的任何物质.表位结合剂的非限制性实例包括配体和配体片段、受体和受体片段、抗体和抗体片段、适体和其它多核苷酸、辅酶和其它共调节物、以及变构分子和离子。优选的表位结合剂包括适体、天然同源结合元件序列、抗体及其片段。
术语“表位”一般指抗原、半抗原、分子、聚合物、朊病毒、病毒体、细胞、肽、多肽、蛋白质或大分子复合物的特定区域.表位可以由从大的多肽衍生的小肽组成。表位可以是多肽、蛋白质或大分子复合物的二维或三维表面或表面特征，其包含若干非邻接肽段或氨基酸基团。
术语“信号传导寡核苷酸”指短的(一般2至15个核苷酸、优选5至7个核苷酸长度)单链多核苷酸。优选第一个信号传导寡核苷酸序列与第二个信号传导寡核苷酸互补。优选第一个信号传导寡核苷酸序列与第二个信号传导寡核苷酸不能通过氢键结合形成稳定结合，除非通过第三方试剂的介导使第一个和第二个信号传导寡核苷酸彼此紧密接近。
此处所用的术语“接头”或“接头分子”指附着到适体或适体构建体上的任何聚合物。该附着可以是共价的或非共价的。预想接头可以是氨基酸或核苷酸的聚合物。优选的接头分子是柔性的，并且不干扰核酸结合因子与该组核酸成分的结合.优选的接头分子包含12个间隔区18氨基磷酸酯部分(Glen Research，Sterling，VA)。另一个优选的接头分子是poly dT。
短语“体外进化”一般指选择与生物分子、特别是肽或多肽结合的适体的任何方法.也将体外进化称作是“体外选择”、“SELEX”或“通过指数富集的配体***进化”。简而言之，体外进化涉及筛选随机多核苷酸库中与生物分子结合或具有特定的可选择活性的特定多核苷酸。一般而言，所述特定的多核苷酸(即适体)代表该库非常小的级分，因此，采用一轮适体扩增(通常通过聚合酶链反应)以增加潜在有用的适体的表现度。采用连续几轮选择和扩增从而指数增加特定且有用的适体的丰度.在Famulok，M.；Szostak，J.W.，InVitro Selection of Specific Ligand Binding Nucleic Acids，Angew.Chem.1992，104，1001.(Angew.Chem.Int Ed.Engl.1992，31，979-988)；Famulok，M.；Szostak，J.W.，Selection of Functional RNAand DNA Molecules from Randomized Sequences，Nucleic Acids andMolecular Biology，Vol7，F.Eckstein，D.M.J.Lilley编，SpringerVerlag，Berlin，1993，pp.271；Klug，S.；Famulok，M.，All you wantedto know about SELEX；Mol.Biol.Reports1994，20，97-107；及Burgstaller，P.；Famulok，M.Synthetic ribozymes and the firstdeoxyribozyme；Angew.Chem.1995，107，1303-1306(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1995，34，1189-1192)中描述了体外进化，在此引用作为参考。
在本发明的实践中，使用体外进化产生与任何给定多肽或大分子复合物的不同表位结合的适体。针对含有目的表位的“底物”选择适体.此处所用的“底物”是含有适体可以结合的表位、并且用于选择适体的任何分子实体.
此处所用的术语“标记”指可附着于多核苷酸、多肽、适体、核酸成分或其它底物材料的任何物质，其中底物可以通过检测方法检测。适用于本发明的标记的非限制性实例包括但是不限于发光分子、化学发光分子、荧光染料、荧光猝灭剂、有色分子、放射性同位素、闪烁体、质量标记(massive labels)(通过质量变化而检测)、生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、A蛋白、G蛋白、抗体或其片段、Grb2、聚组氨酸、Ni2+、Flag标记、myc标记、重金属、酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶、萤光素酶、电子供体/受体、吖啶鎓酯(acridinium esters)和比色底物。技术人员将易于识别可以在本发明的操作中采用的上文未提及的其它有用标记。
此处所用的“检测方法”指本领域已知的检测分子相互作用事件的任何方法。此处所用的短语“可检测的信号”基本等价于“检测方法”。检测方法包括检测质量改变(例如等离子体共振)、荧光改变(例如FRET、FCCS、荧光猝灭或荧光增强、荧光偏振)、酶活性(例如底物耗尽或产物形成，例如碱性磷酸酶的可检测染料-NBT-BCIP体系即为一例)、化学发光或闪烁现象改变(例如闪烁亲近测定、发光共振能量转移、生物发光共振能量转移等)。
此处所用术语“分析物”一般指配体、化学部分、化合物、离子、盐、金属、酶、细胞信号转导途径第二信使、药物、纳米颗粒(nanoparticle)、环境污染物、毒素、脂肪酸、类固醇、激素、糖类、氨基酸、肽、多肽、蛋白质或其它氨基酸聚合物、微生物、病毒或任何其它能与多肽、蛋白质、大分子复合物结合的试剂，其结合方式生成用于结合适体的表位或改变表位的可用性。
此处所用的术语“大分子复合物”指含有大分子的物质的任何组合物。大分子复合物优选为一个或多个大分子(例如多肽、脂质、糖类、核酸、天然或人工聚合物等)彼此结合的复合物。结合可能包括该大分子复合物组分之间的共价或非共价相互作用。大分子复合物可以相对简单(例如结合了配体的多肽)、相对复杂(例如脂质筏)或非常复杂(例如细胞表面、病毒、细菌、孢子等)。大分子复合物本质上可以是生物性的或非生物性的。
在一个实施方案中，本发明涉及检测样品中多肽的方法，其包括步骤：将样品与第一个分子识别构建体和第二个分子识别构建体接触，然后通过检测方法检测第一个和第二个分子识别构建体的稳定相互作用。发明人设想了若干有用的分子识别构建体组合(传感器)的变体，在图26中绘图描述了所述变体。图A描述了包含两个适体的传感器变体，所述适体识别一个蛋白质的两个不同表位。图B描述了包含双链多核苷酸和适体的传感器变体，所述双链多核苷酸含有用于DNA结合蛋白质的结合位点，且所述适体识别该蛋白质的不同表位。图C描述了包含识别蛋白质不同表位的抗体和适体的传感器变体。图D描述了包含双链多核苷酸和抗体的传感器变体，所述双链多核苷酸含有用于DNA结合蛋白质的结合位点，且所述抗体识别该蛋白质的不同表位。图E描述了包含两个抗体的传感器变体，所述抗体识别蛋白质的两个不同表位。图F描述了包含两个双链多核苷酸片段的传感器变体，所述双链多核苷酸片段识别蛋白质的两个不同位点。图G描述了含有两个单链多核苷酸元件的传感器变体，所述单链多核苷酸元件识别另一个单链多核苷酸的两个不同序列元件。图H描述了使得能够使用双链多核苷酸片段和蛋白质直接检测蛋白质-多核苷酸复合物形成的传感器变体，所述双链多核苷酸片段(含有蛋白质结合位点)用第一个信号传导寡核苷酸标记，且该蛋白质用第二个信号传导寡核苷酸标记。图I描述了使得能够使用用信号传导寡核苷酸标记的两个相应蛋白质直接检测蛋白质-蛋白质复合物形成的传感器变体.
在优选的实施方案中，第一个和第二个分子识别构建体是适体构建体，从而第一个适体构建体含有识别多肽表位(即第一个表位)的适体或天然存在的核酸序列，而第二个适体构建体含有识别相同多肽上独立表位(即第二个表位)的适体或天然存在的核酸序列(图26，图A和B)。优选第一个适体构建体和第二个适体构建体各含有短单链寡核苷酸序列(信号传导寡核苷酸)，从而第一个适体构建体的短单链寡核苷酸(即第一个信号传导寡核苷酸)与第二个适体构建体的短单链寡核苷酸(即第二个信号传导寡核苷酸)互补。不希望受理论束缚，信号传导寡核苷酸应当足够短，从而当能够使这两个适体构建体在一起的多肽不存在时，所述信号传导寡核苷酸不能彼此形成稳定的相互作用。优选信号传导寡核苷酸至少5个核苷酸长，并且不多于7个核苷酸长。
优选第一个适体构建体含有第一个标记且第二个适体构建体含有第二个标记，从而，当含有第一个表位和第二个表位的多肽存在时，第一个和第二个标记相互作用以产生可检测的信号，所述信号表示样品中多肽的存在或量.优选第一个标记是荧光供体，且第二个标记是荧光受体，并且检测方法是检测荧光信号输出的变化。
任选地，可以将第一个适体构建体固定于表面，可以将第二个适体构建体固定于表面，或可以将二者都固定于表面(表面可以是微量滴定板、试管、珠子、树脂和其它聚合物等)。在优选的实施方案中，可以通过柔性接头将第一个适体构建体与第二个适体构建体彼此连接以形成二价适体。优选的柔性接头包括间隔区18聚合物和脱氧胸苷(“dT”)聚合物。
在另一个实施方案中，可以使用第一个和第二个适体检测样品中的大分子复合物。在该实施方案中，第一个表位优选在一个多肽上，且第二个表位在另一个多肽上，从而当大分子复合物形成时，使一个和另一个多肽接近，导致第一个适体构建体和第二个适体构建体之间稳定的相互作用，以如上所述产生可检测的信号。同样，如上所述，可以将第一个和第二个适体构建体固定于表面或通过柔性接头彼此固定。
在另一个实施方案中，可以使用第一个和第二个适体检测样品中的分析物。在该实施方案中，当分析物结合多肽或大分子复合物时，第一个或第二个表位得以产生、或可以与第一个或第二个适体构建体结合。因此，当分析物存在于含有其同源多肽或大分子结合配偶体的样品中时，第一个适体构建体和第二个适体构建体处于稳定接近度，以如上所述产生可检测信号。同样，如上所述，可以将第一个和第二个适体构建体固定于表面或通过柔性接头彼此固定。
在另一个实施方案中，本发明涉及制备包含第一个和第二个适体构建体的一组适体构建体的方法，其包括步骤(a)选择针对第一个底物的第一个适体，所述底物包含第一个表位，并选择针对第二个底物的第二个适体，所述底物包含第二个表位，其中第一个适体能结合第一个表位，且第二个适体能结合第二个表位，(b)将第一个标记附着在第一个适体上，并将第二个标记附着在第二个适体上，(c)将第一个信号传导寡核苷酸附着在第一个适体上，并将第二个信号传导寡核苷酸附着在第二个适体上，其中第二个信号传导寡核苷酸与第一个信号传导寡核苷酸互补，以及(d)从而，(i)第一个适体构建体含有第一个适体、第一个标记和第一个信号传导寡核苷酸，及(ii)第二个适体构建体含有第二个适体、第二个标记和第二个信号传导寡核苷酸。优选使用体外进化方法选择适体(见上文)，然而，在本发明的实施中可以使用天然DNA结合元件。
在优选的实施方案中，第一个底物是多肽且第二个底物是与第一个适体结合的多肽，其中第一个适体遮蔽第一个表位，从而第一个表位不能供第二个适体结合。另外，可以用第一个适体构建体取代第一个适体，所述适体构建体含有(i)第一个适体和信号传导寡核苷酸，或(ii)第一个适体、信号传导寡核苷酸及标记，从而产生第二个底物，所述第二个底物能为信号检测选择最适宜的第二个适体或适体构建体。作为另一个步骤，如上所述，可以通过柔性接头将第一个和第二个适体构建体连接到一起。
在备选的优选实施方案中，第一个底物是基本由第一个表位组成的肽，且第二个底物是基本由第二个表位组成的肽。因此，在所述备选实施方案中，在适体的产生和选择中不需要遮蔽表位。同样，如上所述，可以通过柔性接头将以此方法产生的第一个和第二个适体构建体连接到一起。
在另一个实施方案中，本发明涉及二价适体构建体，所述适体构建体包含第一个适体、第一个标记、第一个信号传导寡核苷酸、第二个适体、第二个标记、第二个信号传导寡核苷酸和接头，其中第一个适体能结合第一个表位，且第二个适体能结合第二个表位。第一个和第二个表位可能位于相同多肽上、大分子复合物的不同多肽上、或存在于与分析物结合的多肽上。柔性接头优选为不干扰适体功能的聚合物。优选的柔性接头包括脱氧胸苷聚合物(poly dT)和间隔区18聚合物。然而，技术人员在本发明的实施中可以替换任意数目的接头。
另外，二价适体构建体可以不具有检测标记。预想可以与抗体非常类似地使用这些备选二价适体构建体来检测分子、结合分子、纯化分子(例如在柱子中或pull-down类型的程序)、阻断分子相互作用、促进或稳定分子相互作用、或赋予生物被动免疫.另外预想该二价适体构建体可以用于治疗目的.本发明的真正优势在于，它使得技术人员能够构建出任何识别任两个或更多不同表位的适体组合，将任何数目的分子形成二价、三价或其它多价适体构建体，从而将那些不同的分子集中在一起以测试效果或产生预期的治疗结果。例如，在配体与其受体的天然结合动力学并不有利的情况下(例如，糖尿病患者体内的胰岛素与胰岛素受体)，可以构建二价适体构建体以促进配体与其受体的结合。
在另一个实施方案中，本发明涉及包括第一个表位结合剂和第二个表位结合剂的试剂盒，第一个标记附着于第一个表位结合剂，第二个标记附着于第二个表位结合剂，其中(a)当第一个表位结合剂和第二个表位结合剂标记分别与多肽的第一个表位及该多肽的第二个表位结合时，(b)第一个标记和第二个标记相互作用以产生可检测的信号。在优选的实施方案中，表位结合剂是包含适体、标记和信号传导寡核苷酸的适体构建体。然而，表位结合剂可以是抗体或抗体片段。该试剂盒可用于多肽、分析物或大分子复合物的检测，并同样可用于研究或医学/兽医学诊断应用。
在另一个实施方案中，本发明涉及诊断疾病的方法，其包括步骤(a)从患者获得样品，(b)将样品与第一个表位结合剂和第二个表位结合剂接触，和(c)使用检测方法检测样品中的多肽、分析物或大分子复合物的存在，其中样品中多肽、分析物或大分子复合物的存在指示疾病是否存在于患者中.在优选的实施方案中，(a)第一个表位结合剂是附着有第一个标记和第一个信号传导寡核苷酸的第一个适体，(b)第二个表位结合剂是附着有第二个标记和第二个信号传导寡核苷酸的第二个适体，所述第二个信号传导寡核苷酸与第一个信号传导寡核苷酸互补，且(c)检测方法是荧光检测方法，其中，(d)当第一个适体结合多肽且第二个适体结合该多肽时，(e)第一个信号传导寡核苷酸与第二个信号传导寡核苷酸彼此结合，并且(f)使第一个标记与第二个标记接近，从而出现荧光的变化。优选的样品包括血液、尿液、腹水、细胞和组织样品/活组织检查。优选的患者包括人、农场动物和伴侣动物。
在另一个实施方案中，本发明涉及从样品中筛选有用试剂的方法，其包括步骤(a)将样品与第一个表位结合剂和第二个表位结合剂接触，和(b)使用检测方法检测样品中有用试剂的存在。优选的试剂包括多肽(包含第一个表位和第二个表位)、结合多肽的分析物(在这种情况下，该方法另外包括向筛选混合物添加多肽的步骤)和可能的治疗组合物.在优选的实施方案中，(a)第一个表位结合剂是附着有第一个标记和第一个信号传导寡核苷酸的第一个适体，(b)第二个表位结合剂是附着有第二个标记和第二个信号传导寡核苷酸的第二个适体，所述第二个信号传导寡核苷酸与第一个信号传导寡核苷酸互补，且(c)检测方法是荧光检测方法，其中，(d)当第一个适体结合多肽且第二个适体结合该多肽时，(e)第一个信号传导寡核苷酸与第二个信号传导寡核苷酸彼此结合，并且(f)使第一个标记与第二个标记接近，从而出现荧光的变化。
在下列实施例中描述了本发明的优选实施方案.从在此公开的本发明说明书或实践考虑，在此权利要求范围内的其它实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。本说明书及实施例意图仅为示例性的，本发明范围和精神在实施例后权利要求书中指出。
实施例1：制备特异性适体构建体的一般方法
介绍
以下公开的是检测样品中蛋白质、蛋白质复合物或者与蛋白质结合的分析物的快速且灵敏的方法。该方法基于由蛋白质驱动的两个核酸构建体的结合，所述两个核酸构建体含有能够识别蛋白质上两个不同表位的适体(也称为“适体构建体”)(图1A)。这两个适体建构体也包含通过柔性接头附着于适体的短互补信号传导寡核甘酸。两个适体同时与靶蛋白质结合后，使互补寡核甘酸(也称为“信号传导寡核甘酸”)相对接近，这促使其结合以形成稳定双链体。将荧光探针附着于信号传导寡核苷酸末端，提供了检测由蛋白质诱导的两个适体构建体结合的方法(图1A)。在蛋白质具有天然核酸结合活性的情况下，可以用含有该蛋白质天然结合位点的核酸序列取代适体之一(图1B).
开发或选择针对给定蛋白质两个不同表位的适体是开发图1所示适体构建体的必需步骤。可获得的关于适体的文献综述显示了至少两条实现该目标的可能途径。第一条途径是使用分离结合蛋白质的和未结合蛋白质的核酸适体的不同方法，进行核酸适体的体外选择(也称为体外进化).其基本原理是，在这些不同的区分方法中优先展示蛋白质的不同区域，从而导致适体被引导至该蛋白质表面的不同区域。选择凝血酶适体(见上文)是该途径的一个例子。
使用固定在琼脂糖珠子上的凝血酶作为底物体外选择第一个适体，导致适体在肝素外部位结合凝血酶.使用凝血酶-第一个适体复合物作为底物的另外的体外选择，导致第二个适体在纤维蛋白原外部位结合凝血酶，其中将凝血酶-第一个适体复合物与硝化纤维素结合作为区分方法。
所述区分途径尽管有用，但却依赖于不同表位的机会选择而非精巧的设计.第二条途径是使用对应于靶蛋白质分子选择区域的肽作为底物产生(raise)或选择适体.本领域有证据证实，可以使用该策略开发能够识别完整蛋白质的适体，用作适体开发底物的肽源自所述蛋白质.另外，该途径已被广泛用于产生识别完整蛋白质的抗体。
制备针对蛋白质表位的一组适体的一般方法也可以用于具有天然DNA结合活性的蛋白质，所述蛋白质表位不同于第一个适体的结合位点。即，可以产生在不同于天然DNA结合位点的位点结合底物蛋白质的共适体.为了在图1所示的分子检测方法中起作用，将通过该方法产生的共适体进行最优化。
结果与讨论
图2说明了上述方法的总体设计。使用预先结合在第一个适体上的底物蛋白质选择共适体(图2A).另外，使用预先结合在其天然核酸结合位点上的蛋白质选择共适体(图2B)。通过柔性接头将短(5-7个核苷酸)单链寡核苷酸(即信号传导寡核苷酸)(图2)附着于第一个适体。将用于共适体选择的随机DNA(或RNA)以均匀序列为侧翼以用于PCR扩增。这些均匀侧翼序列之一在其末端含有与第一个适体的信号传导寡核苷酸互补的序列(即另一个信号传导寡核苷酸)(图2).因此，使用这样的随机DNA(或RNA)构建体产生和选择共适体，向能在与第一个适体表位不同的位点结合底物蛋白质、并且能在第一个适体的信号传导寡核苷酸之间形成双链体的适体偏倚.通过改变第一个适体的信号传导寡核苷酸及第二个适体的互补信号传导寡核苷酸的长度，调整选择中偏倚的程度。
实施例2：检测凝血酶的方法和适体
介绍
本发明的发明人已开发了检测DNA结合蛋白质的方法，所述方法描述于Heyduk，T.和Heyduk，E.Molecular beacons fordetecting DNA binding proteins.Nature Biotechnology，20，171-176，2002、Heyduk，E.，Knoll，E.，和Heyduk，T.Molecular beacons fordetecting DNA binding proteins：mechanism of action，Analyt.Biochem.316，1-10，2003、及共同未决专利申请号09/928,385(其以美国专利号6,544,746授权)、10/062,064、PCT/US02/24822和PCT/US03/02157中，所有文献均在此引用作为参考。该方法基于将蛋白质的DNA结合位点***为两个DNA“半位点”(图3A)。得到的每个“半位点”含有短的互补单链区，所述互补单链区长度的设计在于为两个DNA“半位点”引入一些结合倾向，从而重新产生含有完整功能性同源蛋白质结合位点的双链体。将该倾向设计为低的，从而当蛋白质不存在时将仅有小部分DNA半位点结合.当蛋白质存在于反应混合物中时，其将仅与含有完整且功能性结合位点的双链体结合。所述选择性结合将驱使DNA半位点的结合，且该蛋白质依赖性的结合可用于产生报告靶蛋白质存在的光谱或其它信号。
科学文献中使用术语“分子信标”描述该测定，藉以强调选择性识别和报告信号的产生同时发生这一事实.已经为若干蛋白质开发了DNA结合蛋白质分子信标(Heyduk和Heyduk，2002)，显示了它们的广泛适用性。已经确立了这些分子信标作用的物理机制(Heyduk，Knoll和Heyduk，2003)，并也已将其用作检测存在与DNA结合蛋白质结合的配体的测定平台(Heyduk，E.，Fei，Y.，和Heyduk，T.Homogenous fluorescence assay for cAMP.CombinatorialChemstry and High-throughput Screening6，183-194，2003)。尽管已经非常有用，但该测定局限于展示天然DNA结合活性的蛋白质。
已经充分确定，可以通过体外选择方法产生能够特异性结合缺少天然DNA结合活性的蛋白质的核酸(DNA或RNA)适体(Ellington，A.D.，和Szostak，J.W.Invitro selection of RNAmolecules that bind specific ligands.Nature 346，818-822，1990；Tuerk，C.，和Gold，L.Systematic evolution of ligands by exponentialenrichment：RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.Science249，505-510，1990；Gold，L.，Polisky，B.，Uhlenbeck，O.和Yarus，M.Diversity of Oligonucleotide Function.Ann.Rev.Biochem.64，763-797，1995；及Wilson，D.S.和Szostak，J.W.In vitro selectionof functional nucleic acids.Ann.Rev.Biochem.68，611-647，1999；所有文献均在此引用作为参考)。体外选择涉及通过结合、洗去未结合序列及PCR扩增靶结合的序列的循环，从随机DNA序列库选择结合特异性底物靶的核酸序列。成功选择出与多种蛋白质和其它靶分子特异性结合的适体的众多实例(Ellington和Szostak，1990；Tuerk和Gold，1990；Gold等人，1995；Wilson和Szostak，1999)有力地指出，产生任何及所有蛋白质的适体是可能的。
在本实施例中描述了基于核酸的蛋白质检测分子信标的崭新概念，其中蛋白质不限于具有天然DNA结合活性的蛋白质。凝血酶的例子(见上文)为本发明提供了实验验证。
结果与讨论
图3B阐明了识别任何靶蛋白质的分子信标的总体概念。该设计与前面及上文所述DNA结合蛋白质的分子信标具有一些相似性(图3A)。使用识别蛋白质两个不同表位的两个适体作为“半位点”的功能性等价物，而不是将含有天然蛋白质结合位点的DNA双链体***为两个“半位点”。通过柔性接头将含有荧光团(第一个标记)和猝灭剂(第二个标记)的短互补寡核苷酸(信号传导寡核苷酸)附着于这两个适体(图3B)。靶蛋白质不存在时，由于互补信号寡核苷酸太短不能促进结合，所以这两个适体构建体不结合。当靶蛋白质存在时，该蛋白质与两个适体的优先结合将驱动这两个适体构建体的结合，从而由于使第一个和第二个标记紧密接近而导致荧光信号变化。
选择凝血酶作为模式非DNA-结合-蛋白质体系以提供图3B所述概念的实验验证。以前已经有两个实验室鉴定了选择性识别该蛋白质两个不同表位的DNA适体(Bock，L.C.，Griffin，L.C.，Latham，J.A.，Vermass，E.H.，和Toole，J.J.Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin，Nature 355，564-566，1992；及Tasset，D.M.，Kubik，M.F.，和Steiner，W.Oligonucleotide inhibitors of human thrombin that bind distinctepitopes，J.Mol.Biol.272，688-98，1997，在此引用作为参考)。显示一个适体(G15D；图4中的THR4)与肝素外部位结合，而显示其它适体(60-18[29]；图4中的THR3)与纤维蛋白原外部位结合。作为开发可用于识别凝血酶的一组适体构建体的第一个步骤，我们制备了多种适体构建体，其中上述适体通过柔性接头共价连接(图4)。这些实验的第一个目的是：确定以柔性接头连接两个适体构建体，是否将真正产生二价适体构建体，所述二价适体构建体与一组单独适体构建体相比，能够以更高的亲和力结合凝血酶。这些实验的第二个目的是：确定合适的接头长度、以及两个适体的5′和3′末端关于接头的合适定向。
用荧光素标记单独的适体(图4中的THR1和THR2)以便于确定多种凝血酶构建体的亲和力。凝血酶和荧光素标记的60-18[29]适体(THR1)之间形成复合物可方便地继之以荧光偏振(图5A)，而荧光素标记的G15D适体(THR2)结合可继之以荧光强度的变化(图5B)。两个适体均在纳摩尔浓度范围内结合凝血酶(图5A和5B).在THR2情况下，结合的定量分析(图5C)获得Kd值为6.3nM。这是比先前所提出的略高的亲和力(Bock等人，1992)，这可以通过我们使用的真正平衡结合测定对比先前使用的非平衡测定来解释。在10倍过量的未标记60-18[29]适体(THR3)的存在下结合THR2时(图5D)，仅观察到亲和力的微小且不显著的降低。这显示G15D和60-18[29]适体确实独立地与凝血酶的两个不同表位结合。
在下一步骤中，评价图4所示多种适体构建体与THR2竞争结合凝血酶的能力。图6说明了实施这些实验的方式。记录存在和不存在凝血酶时的HR2荧光光谱(图6A)。凝血酶引起THR2荧光增强约50％。然后加入未标记的竞争剂适体构建体(图6B-D)。凝血酶在竞争剂存在下对THR2荧光的微小作用将是有效竞争剂的特点。与图5C和D所示数据相符，THR3不是竞争剂(图6B)。THR4(未标记的THR2变体)如预期能够竞争(图6C)。然而，THR7(二价适体构建体之一)是比THR4好得多的竞争剂(图6D)。当THR7存在于溶液中时，在凝血酶存在下没有检测到THR2荧光变化。图7显示以图4所示所有构建体进行竞争实验的概括.
显示所有二价适体构建体比单独适体更紧密地与凝血酶结合(Kd在pM范围内)，从而为以下预期提供了验证：以柔性接头连接识别蛋白质两个不同表位的适体，将产生高亲和力凝血酶配体。另外，这些数据显示通过含有10个间隔区18单位的较长接头连接两个适体，产生对凝血酶的稍好的亲和力(比较THR5与THR6的结合)。同样，这些数据显示，如THR7中那样的适体关于接头的定向产生较好的亲和力(比较THR6与THR7的亲和力)。因此，在所有后续实验中使用具有如THR7中适体定向的构建体。
图8所示实验的目的是证实凝血酶的两个表位对于二价适体构建体的高亲和力结合均很重要。THR2和二价适体构建体的结合之间的直接竞争证实，由THR2(肝素外部位)识别的表位对于二价适体结合是必要的。为了证明第二个表位也是重要的，我们比较了不存在和存在过量未标记的THR3时，二价适体构建体(THR5)与THR2竞争结合凝血酶的能力。我们预期，如果THR5的高亲和力结合需要两个凝血酶表位，则当THR3存在时，人们应当观察到THR5与THR2竞争的能力降低。这的确是在图8所示实验中观察到的。单独的THR5是非常有效的THR2竞争剂(比较图8D与8A)。THR3单独不是THR2的竞争剂(比较图8A和C)。在THR3存在下，THR5是比单独的THR5较差的竞争剂(比较图8B与8C)。我们因此推断二价适体构建体与凝血酶的高亲和力结合涉及第一个和第二个适体表位。
二价适体构建体-凝血酶复合物足够稳定以在天然聚丙烯酰胺凝胶电泳后仍存在(图9A)。我们利用这一特征使用EMSA确定该复合物的化学计量，以观察THR7-凝血酶复合物形成。我们以凝血酶滴定THR7，其中两种分子均为高浓度。在这种条件下，该结合是化学计量的。形成的复合物关于凝血酶与THR7比率的作图确实显示该复合物的1:1化学计量(图9B).
进行图10和11所示实验以测试是否可以使用二价适体构建体的备选设计来制备这些构建体。我们设计了图10所示的二价适体构建体，从而所述二价适体构建体完全由DNA制成，避免使用非DNA接头(在此情况下使用poly dT作为接头)(图10)。这样可以为设计这种构建体潜在地提供更多柔性，并且可以降低制备适体构建体的成本.通过柔性接头末端的DNA双链体将两个适体连接到一起(图10)。本发明该方面旨在模仿信号传导“信标”的设计(图3B)，其中信号传导功能涉及接头末端DNA双链体的形成，所述接头将适体与双链体连接.测试三个不同长度的poly dT接头(7、17和27个核苷酸)以确定高亲和力结合的最小接头长度要求。图11显示以凝血酶同时滴定图10所示构建体的结果。适体构建体-凝血酶复合物形成后继之为EMSA。各构建体以高亲和力结合凝血酶.然而，与具有17和27个核苷酸接头的构建体相比，具有7个核苷酸poly dT接头的构建体对凝血酶显然具有显著较低的亲和力。检查以星号标记的条带最好地说明了这一点，所述条带显示，在凝血酶的这个特定浓度，几乎所有17和27个核苷酸poly dT接头构建体都被凝血酶结合，而大部分(～50％)7个核苷酸poly dT构建体保持未结合。概括而言，图10和11中所示结果显示，图10所示二价适体构建体的备选设计是可行的，并且至少17个核苷酸长的poly dT接头对于构建体与凝血酶的结合更是最理想的，所述poly dT接头将适体与DNA双链体连接。
图3-11所示实验数据证明，在凝血酶及与凝血酶两个不同区域结合的两个适体的情况下，图3B所示信号传导信标发挥功能的所有必要条件均符合。基于图3-11所示实验提供的信息，我们设计并测试了凝血酶信号传导信标。图12A和B所示信标是THR16/THR17二价适体构建体的衍生物.使用17个核苷酸长的polydT接头将适体与7个核苷酸的互补寡核苷酸(信号传导寡核苷酸)连接，所述互补寡核苷酸的5′和3′分别用荧光素和dabcyl标记。向THR8和THR9的混合物添加凝血酶，导致蛋白质依赖性的荧光强度猝灭。不存在dabcyl标记的配偶体(THR8)时，向THR9添加凝血酶后，没有观察到荧光变化.这些数据显然显示，的确观察到预期的THR8和THR9之间由凝血酶驱动的结合(如图12B所示)，并由此获得功能性凝血酶信号传导信标。
尽管非常可重复并且特异，但由凝血酶诱导的荧光变化的量级最初并不很大(～20％)。我们因此通过用更柔性的间隔区18接头取代poly dT接头以求改进凝血酶信号传导信标的这一特性(图13A和B)。我们推论，poly dT接头尽管是柔性的，但是也展示一些残留的刚性(Mills，J.B.，Vacano，E.，和Hagerman，P.J.Flexibilityof single-stranded DNA：use of gapped duplex helices to determine thepersistence lengths of poly(dT)and poly(dA)，J.Mol.Biol.285，245-57，1999；在此引用作为参考)，当两个适体与凝血酶结合时，所述残留的刚性可能阻止信号传导双链体的结合。图13所示信标仅在接头性质上不同于图12所示信标.其余另外序列相同。图13C显示，向THR20和THR21的混合物添加凝血酶后，观察到蛋白质浓度依赖性的荧光猝灭，而当凝血酶仅加入THR21时，没有检测到荧光变化。在此特定信标的情况下，该信标对凝血酶的反应要大很多(荧光降低约2倍)。该情况下的荧光信号变化程度与我们以前用检测DNA结合蛋白质的信标(见上文)所观察到的相当。我们由此推论获得了功能性凝血酶信标，且与具有poly dT接头的设计相比，利用更柔性的间隔区18接头的设计在凝血酶结合后产生更好的信号变化。我们接下来实施了一系列实验以进一步表征该凝血酶信标的行为.
实施图14所示实验，以证实当存在THR20和凝血酶时，荧光素标记的适体构建体(THR21)的确被整合到稳定的复合物中。图15显示了说明凝血酶检测的灵敏度(图15A)和凝血酶检测的特异性(图15B)的结果。因为凝血酶与二价适体构建体的结合非常紧密(pM Kd)，而且由于测定似乎仅受荧光素信号检测灵敏度限制，所示可以通过改变适体构建体的浓度来控制凝血酶检测的灵敏度。这在图15中得到说明，其中使用50nM THR21和75nM THR20，可以检测到约10nM的凝血酶，而当使用浓度为1/10的适体构建体时(5nM THR21和7.5nM THR20)，可以检测到1/10浓度(约1nM)的凝血酶。使用甚至更低的适体构建体浓度(500pM THR21和750pM THR22)，可以检测到约100pM的凝血酶(未显示)，但是荧光素标记的适体构建体的这个低浓度接近我们仪器的灵敏度极限，而且数据质量相应降低。我们比较了适体构建体对凝血酶的反应与对胰蛋白酶的反应，以证明凝血酶检测的特异性，所述胰蛋白酶是与凝血酶属于相同家族、并且与凝血酶共有结构同源性的蛋白酶。添加胰蛋白酶后没有检测到信号(图15B)，显示适体构建体对凝血酶的高度特异性。
图16显示竞争实验的结果，其中测试了多种适体构建体解离预先形成的凝血酶-适体构建体复合物的能力。所获数据显示所有二价适体构建体到目前为止都是远比任何单独的表位特异性适体更有效的竞争剂，与以荧光素标记的单独适体(见上文，THR2；图6)进行的类似实验一致。在二价适体构建体中，THR18/THR19(具有27个核苷酸长的poly dT接头的构建体)和THR16/THR17(具有17个核苷酸长的poly dT接头的构建体)是最有效的竞争剂，随后为THR14/THR15(具有7个核苷酸长的poly dT接头的构建体)和THR7(具有间隔区18接头的构建体)。因此，看来尽管间隔区18接头增加的柔性对荧光信号变化的量级有益，但其也导致比含有更刚性的poly dT接头的构建体略为降低的凝血酶结合亲和力，所述荧光信号变化由适体构建体信号变化产生。
结论
我们获得了提供二价适体构建体的基本物理化学表征的数据，所述二价适体构建体含有识别凝血酶两个不同表位的两个适体。该二价构建体对凝血酶具有比该二价构建体的单独适体成分高很多的亲和力。这提示向适体“半位点”的混合物添加凝血酶应当诱导两个“半位点”的结合，从而作为使荧光团和猝灭剂紧密接近的结果，所述结合产生荧光信号。使用信标构建体的实验充分证实了这个预测。我们预期可能为大量靶蛋白质开发类似信标。我们也指出，也可以采用在此描述的信标设计来改进检测展示天然DNA结合活性的蛋白质的信标(图1A)。在此情况下，可以用DNA双链体(含有蛋白质结合位点序列)取代适体“半位点”之一，所述DNA双链体通过柔性接头与信号传导互补寡核苷酸连接。
实施例3：样品中的分析物检测
材料
纯化的凝血酶由Dr.Ray Rezaie(St.Louis University)赠送。因子Xa、凝血酶原、卵清蛋白、牛血清清蛋白、SSB、胰蛋白酶和血浆均购自Sigma(St.Louis，MO)。HeLa细胞提取物来自ProteinOne(College Park，MD)。德克萨斯红-NHS和Sybr Green来自molecular Probes(Eugene，OR)，Cy5-NHS和Cy3-NHS来自Amersham Biosciences(Piscataway，NJ)，及AMCA-sulfoNHS来自Pierce(Rockford，IL).所有其它试剂均为可通过商业获得的分析级。
在该工作中使用的寡核苷酸构建体列于表1。寡核苷酸从耶鲁大学Keck Oligonucleotide Synthesis Facility或从IDT(Coralville，IA)获得。在寡核苷酸合成中使用适当的氨基磷酸酯整合5′荧光素和3′dabcyl。使用染料的NHS酯通过寡核苷酸合成后修饰将所有其它荧光团整合到寡核苷酸中，所述寡核苷酸在适当位点含有5′氨基或C6氨基-dT。如前所述(Heyduk，E.；Heyduk，T.Anal.Biochem.1997，248，216-227)通过反相HPLC纯化用荧光探针标记的寡核苷酸。通过Heyduk，E.；Heyduk，T.；Claus，P.；Wisniewski，J.R.J.Biol.Chem.1997，272，19763-19770中所述两步法以铕螯合物((Eu3+)DTPA-AMCA)修饰寡核苷酸。对荧光团在260nm的吸光度贡献校正后，从在260nm的UV吸光度计算所有寡核苷酸的浓度.
表1
Figure S04836874720060620D000281
Figure S04836874720060620D000291
Figure S04836874720060620D000301
Figure S04836874720060620D000311
荧光测量
在50mM Tris(pH7.5)、100mM NaCl、5mM KCl、1mM MgCl2中进行所有荧光测量。在Aminco Bowman Series2荧光分光光度计(Spectronic Instruments，Rochester，NY)上记录荧光光谱。对缓冲液和仪器反应校正光谱。以Tecan Spectra FluorPlusmicroplate reader(Research Triangle Park，NC)读取微量培养板中的荧光。另外，在Molecular Imager FX(BioRad，Hercules，CA)上对微量培养板成像，并且通过使用QuantityOne软件(BioRad)积分对应于单独孔图像的区域，来确定荧光强度。分别以100μl和20μl体积进行96孔板和384孔板中的实验。依赖于特定仪器，由于以不同仪器得到的不同缓冲液背景读数(取决于仪器的灵敏度)、以及各仪器可用的不同的激发和发射波长，记录到略为不同的信标信号变化。
在铕螯合物-Cy5标记的信标的情况下，在实验室建立的仪器(Heyduk，T.；Heyduk，E.Analytical Biochemistry 2001，289，60-67)上记录时间分辨的荧光，所述仪器采用脉冲氮激光器作为激发源。以激光脉冲后延迟30μs将发射积分100μs。
确定凝血酶适体解离常数的竞争测定
测定竞争剂存在和不存在时的THR2荧光强度。凝血酶、THR2和竞争剂(存在时)的浓度分别为150nM、200nM和200nM。在这些条件下，适体与凝血酶的结合基本是化学计量的。使用前述方法(Matlock，D.L.；Heyduk，T.Biochemistry 2000，39，12274-12283)计算这些实验条件下THR2解离常数与竞争剂解离常数的比率。
由电泳迁移率变动分析(EMSA)测定凝血酶适体结合
将5微升417nM的THR7样品与各种量的凝血酶(0至833nM)温育。温育15分钟后，加入1μl30％的Ficoll，并于TBE缓冲液中在10％聚丙烯酰胺凝胶上运行样品。运行后用Sybr Green将凝胶染色30分钟，并使用Moleculae Imager FX(BioRad)获得凝胶图像。通过使用QuantityOne软件(BioRad)积分对应于单独条带图像的区域，来确定凝胶条带强度。
基于适体的分子信标设计
图17B说明了缺少天然序列特异性DNA结合活性的蛋白质的分子信标总体概念。该设计与发明人先前所述DNA结合蛋白质分子信标(Heyduk，T.；Heyduk，E.Nature Biotechnology 2002，20，171-176；Heyduk，E.；Knoll，E.；Heyduk，T.Analyt.Biochem.2003，316，1-10；Knoll，E.；Heyduk，T.Analyt.Chem.2004，76，1156-1164；Heyduk，E.；Fei，Y.；Heyduk，T.Combinatorial Chemistry andHigh-throughput Screening 2003，6，183-194)共有一些普遍相似性(图17A)。使用识别蛋白质的两个非重叠表位的两个适体作为“半位点”的功能性等价物，而不是将含有天然蛋白质结合位点的DNA双链体***为两个“半位点”.通过柔性接头将含有荧光团和猝灭剂的短互补“信号传导”寡核苷酸附着于这两个适体(图17B).靶蛋白质不存在时，由于互补寡核苷酸太短而不能促进有效退火，所以所述两个适体“半位点”不能结合.适体“半位点”与靶蛋白质的结合使这两个“信号传导”寡核苷酸相对接近而增加其局部浓度。这导致“信号传导”寡核苷酸的退火，这使荧光团和猝灭剂紧密接近而导致荧光信号变化。
二价凝血酶适体的特性
我们使用凝血酶作为模式***进行图17B所示概念的“理论证据”证明。凝血酶是涉及凝血级联***的蛋白水解酶，并且天然不结合DNA或RNA。两个实验室以前已开发了选择性识别该蛋白质两个不同表位的DNA适体(Bock，L.C.；Griffin，L.C.；Latham，J.A.；Vermass，E.H.；Toole，J.J.Nature1992，355，564-566，Tasset，D.M.；Kubik，M.F.；Steiner，W.J.Mol.Biol.1997，272，688-698)。显示一个适体(G15D；THR4，表1)与肝素结合外部位结合(Bock，1992)，而显示另一个(60-18[29]；THR3，表1)与纤维蛋白原结合外部位结合(Tasset 1997)。作为开发识别凝血酶的信标的第一个步骤，我们已制备了多种适体构建体，其中上列适体通过柔性接头共价连接。这些实验的第一个目的是：确定以柔性接头将识别蛋白质表面上两个不同表位的两个适体连接是否将产生二价适体，该二价适体能够以比单独适体更高的亲和力结合该蛋白质。这类二价适体构建体的该特性是图17B所述测定工作所必需的必要条件。因为不可能预测长的柔性接头对这些二价构建体亲和力的影响，所以有必要通过实验来解决这个问题。这些实验的第二个目的是确定合适的接头长度及两个适体的5′和3′末端关于接头的合适定向。
用荧光素标记单独适体(THR1(表1)，对纤维蛋白原结合外部位特异，及THR2(表1)，对肝素结合外部位特异)以便于确定多种凝血酶构建体的亲和力。凝血酶和荧光素标记的60-18[29]适体(THR1)之间形成复合物可以方便的继之为荧光偏振(未显示)，而荧光素标记的G15D适体(THR2)结合后可以继之为荧光强度的变化(图18A)。两个适体均在纳摩尔浓度范围内结合凝血酶(未显示关于THR1和图18A的数据)。在THR2的情况下，结合的定量分析(图18A)获得Kd值6.3nM。所述Kd比先前提出的略高(Bock 1992，Tasset 1997)，这可能是因为我们使用真正平衡结合测定而先前使用的是非平衡方法。当在10倍过量未标记的60-18[29]适体(THR3)中结合THR2时(图18B)，仅观察到亲和力微小且不显著的降低(Kd为17.7nM).如前所述，这证实G15D和60-18[29]适体独立地结合凝血酶的两个不同表位。
在下一步骤中，评价多种适体构建体与THR2竞争结合凝血酶的能力。测量存在和不存在竞争剂时添加凝血酶后THR2荧光强度的变化，并且按照材料和方法中所述计算存在竞争剂时与凝血酶结合的THR2的量。在这些实验中所用的适体浓度下，通过荧光偏振测定检测不到适体-适体相互作用(未显示)，说明竞争数据正确地报告了THR2和竞争剂结合凝血酶的相对亲和力。THR3不是竞争剂(图18C)，与图18A和B中所示数据一致。THR4(未标记的THR2变体)能够如所预期地发生竞争(图18C)。在此情况下，竞争的定量分析显示THR4结合凝血酶是THR2的1.7倍，说明用荧光素标记该适体对适体与凝血酶的结合具有微小的(不显著的)负作用。显然所有二价适体构建体都是优于THR4的竞争剂(图18C)。THR7似乎是最好的竞争剂，在1:1比时基本完全阻断了THR2的结合。在此情况下，竞争的定量分析揭示THR7结合凝血酶的紧密性至少是THR2的65倍(估计的THR7Kd<97pM).图18C所示数据证实了预期，即以柔性接头连接识别蛋白质上两个不同表位的两个适体将产生高亲和力的凝血酶配体。另外，这些数据显示通过较长接头(含有10个间隔区18单位与5个间隔区18)连接两个适体，产生对凝血酶稍好的亲和力(比较THR5与THR6的结合)。同样，这些数据显示，如THR7中那样的适体关于接头的定向产生较好的亲和力(比较THR6与THR7的亲和力)。因此，在所有后续构建体中，使用如THR7中那样的适体定向。
二价适体构建体(THR7)与凝血酶之间的复合物足够稳定以在天然聚丙烯酰胺凝胶电泳后仍存在(图18D)。我们利用这一观察并使用电泳迁移率变动分析(EMSA)(Fried，M.G；Crothers，D.M.Nucleic Acid Res.1981，9，6505-6525)确定复合物的化学计量，以观察THR7-凝血酶复合物形成。我们以凝血酶滴定THR7，其中两种分子均为高浓度。在这种条件下，该结合是化学计量的.形成的复合物关于凝血酶与THR7比率的作图显示该复合物的1:1化学计量(图18D)，与以下观点一致，即两个适体(THR7组分)在THR7-凝血酶复合物中结合其各自表位。
检测凝血酶的基于适体的分子信标
上述实验数据证明，使图17B所示信号传导信标设计成功执行的所有必要条件均符合。基于这些数据，我们设计了图19A所示凝血酶信标。使用5个间隔区18接头将凝血酶适体与7个核苷酸(“ut”)的互补寡核苷酸连接，所述互补寡核苷酸的5′和3′分别用荧光素和dabcyl标记.与单独适体相比，这两种构建体的混合物结合凝血酶紧密得多(～36倍)(图18C)，这与对二价适体构建体观察到的高亲合力凝血酶结合一致，其中两个适体以柔性接头永久连接。向荧光团和猝灭剂标记的THR20和THR21的混合物添加凝血酶，导致蛋白质浓度依赖性的荧光强度猝灭(图19C)。观察到的最大猝灭为约40％。不存在dabcyl标记的配偶体(THR20)时，向THR21添加凝血酶后，没有观察到荧光变化(图19C)，提示由于蛋白质诱导的信号传导寡核苷酸接近度的增加导致其退火而发生荧光猝灭，如图19B所示。在信标组分和凝血酶的纳摩尔浓度，约15分钟的温育足以产生信标的最大反应.我们也测试了与图19中所示类似的凝血酶信标，但是其中使用17个核苷酸的poly dT接头取代间隔区18接头。尽管观察到凝血酶依赖性的荧光猝灭，但猝灭为含有间隔区18接头的构建体的约1/2。可能是poly dT接头尽管是柔性的，但是展示一些残留的刚性(Mills，J.B.；Vacano，E.；Hagerman，P.J.J.Mol.Biol.1999，285，245-257)，当两个适体与凝血酶结合时，所述残留的刚性可能阻止信号传导双链体的结合。当以胰蛋白酶(与凝血酶结构相似的蛋白水解酶)滴定图19所示信标时，没有观察到荧光强度的改变。我们推断获得了图17B所示设计的功能性凝血酶信标。
信标性能的改进
在接下来一组实验中，我们寻求通过使用备选供体-受体标记对改进信标的性能。以前已显示，在采用FRET作为读出的测定中，受体发射的增强提供了可能更好的信号背景比、更高的动态范围和更好的灵敏度(Heyduk，E.；Knoll，E.；Heyduk，T.Analyt.Biochem.2003，316，1-10)。我们制备了一系列与图17B所示类似的凝血酶信标构建体，但是其中将多种荧光供体和荧光受体的组合整合到信号传导寡核苷酸中来取代荧光素-dabcyl对.使用用适当染料的NHS酯标记的THR21(或用适当染料的NHS酯标记的THR28)和THR27制备这些信标。图20显示信标的荧光光谱(不具有和具有凝血酶添加物)，所述信标用：荧光素-德克萨斯红(图20B)、荧光素-Cy5(图20C)和Cy3-Cy5(图20D)标记。在所有情况下均获得功能性信标。在各个具有荧光供体和荧光受体的信标的情况下，观察到敏化受体发射的凝血酶浓度依赖性的大增加(图20插图和图21A-D)。作为比较，图20A说明了在荧光团-猝灭剂对(荧光素-dabcyl)情况下存在凝血酶时观察到的荧光猝灭。图21E说明了以铕螯合物-Cy5供体-受体对获得的结果，所述供体-受体对使得能使用时间分辨的FRET(TR-FRET)作为检测方法(Selvin，P.R.；Rana，T.M.；Hearst，J.E.J.Am.Chem.Soc.1994，116，6029-6030；Selvin，P.R.；Hearst，J.E.Proc.Natl.Acad.Sci USA 1994，91，10024-10028；Matthis，G.Clinic.Chem.1995，41，1391-1397)。利用TR-FRET可能消除由于光散射产生的背景并促进直接激发的受体荧光从而进一步改善信标的信号背景比。图21F概括了具有多种供体和受体探针组合的信标变体的性能。图形显示与不存在蛋白质时观察到的信标背景信号相比，存在饱和浓度的凝血酶时的信号变化倍数。该比率在约2(在荧光素-dabcyl对的情况下)至约22(在铕螯合物-Cy5对的情况下)之间变化。因此，可以通过选择最佳供体-受体对和使用敏化受体发射作为信号检测模式而获得信标性能的相当大改进。具有荧光供体和荧光受体的信标变体的其它优点是，可以通过受体与供体信号比的双色测定测量其反应。这种比率表(ratiometric)测量提供了更加抵抗非特异性作用的更稳定的信号，所述非特异性作用由样品中存在的添加剂造成的光吸收、光散射或荧光猝灭引起。以最优化的供体-受体对获得的信号背景比增加导致该信标灵敏度增加。这在图22中得到说明，图22显示三种选择的信标变体对低浓度凝血酶的反应。在荧光素-dabcyl标记的信标的情况下(存在饱和浓度的凝血酶时最低的(约2倍)信号变化)，仅可以在测试的最高凝血酶浓度(1nM)检测到统计学显著的信号变化。在用荧光素-德克萨斯红标记的信标的情况下(在饱和凝血酶浓度约5倍信号变化)，可以在较低的凝血酶浓度(200pM)检测到统计学显著的信号变化。在用荧光素-Cy5标记的信标的情况下(在饱和凝血酶浓度约15倍信号变化)，已经可以在最低的凝血酶浓度(50pM)检测到统计学显著的信号变化。
图23说明了凝血酶信标信号极好的重复性和稳定性。以5个独立测量在4个凝血酶浓度测量信标信号。变异系数在测定的各个蛋白质浓度都小(图23A).信标信号稳定至少24小时(图23B)。
以图17B所示的信标产生信号要求三个分子接触的同时存在：各适体与蛋白质之间的两个接触以及两个互补“信号传导”寡核苷酸之间的接触。这些接触的每一个为信标-蛋白质复合物的总稳定性提供其自己的自由能贡献。由于自由能与复合物平衡解离常数之间的指数关系，所以如果缺少任何上列三个分子接触，则复合物的总稳定性将大大降低。因此预期，这里描述的分子信标应当比基于单个分子接触的测定(例如基于单个适体的测定)展示更高的蛋白质检测特异性。为了说明所述概念，我们比较了单个凝血酶适体和凝血酶信标对SSB(大肠杆菌(E.coli)的单链DNA结合蛋白质)的反应，所述SSB是具有结合单链DNA的高度非特异性亲和力的蛋白质(数据未显示)。纳摩尔浓度的SSB与单独的荧光素标记的适体(THR1，表1)产生大信号(如通过荧光偏振测定所测得的)。SSB在与结合该适体所需的凝血酶浓度非常相似的浓度范围产生反应。因此，单个凝血酶适体在SSB和凝血酶之间展示非常低的分辨力。相反，凝血酶信标暴露于纳摩尔SSB浓度不产生任何显著的信标反应，而在相同浓度范围内的凝血酶产生大的信标反应.因此，凝血酶信标在SSB和凝血酶之间展示极好的分辨力，说明该信标的增强的特异性。
在此所述测定设计的第一个应用是均匀高通量蛋白质检测。Zhang等人(Biomol.Screening 1999，4，67-73)开发了简单的统计学参数，可以使用所述参数评价测定在高通量方式中的用途。在该蛋白质存在和不存在时从大量重复测量计算Z′-因子.Z′值为1表示理想的测定，Z′值为0.5至1表示很好的测定。Z′值低于0.5表示不是很适于高通量应用的测定。凝血酶信标Z′值为0.94(图24)，这显示其将是卓越的高通量测定。
检测复合物混合物中的凝血酶
接下来的一系列实验解决了凝血酶信标的特异性及其检测细胞提取物和血浆中凝血酶的能力。信标对1nM凝血酶的反应不受100和1000倍过量的无关蛋白质影响(卵清蛋白，图25A)。同样，100倍过量的因子Xa(另一个与凝血酶结构相似的凝血蛋白酶)不影响信标对1nM凝血酶的反应(图25A)。1000倍过量的因子Xa轻微地削弱信标反应，但是在这些条件下仍然可容易检测1nM凝血酶(图25A)。不存在凝血酶时，最高达1μM浓度的卵清蛋白和因子Xa对信标信号没有影响(图25A)。我们推断该信标对凝血酶具有高度选择性。
为了测试是否该信标可以检测复合物混合物中的凝血酶，我们以各种量的凝血酶掺加到HeLa细胞提取物中并测定信标对该混合物的反应(图25B)。低纳摩尔浓度的凝血酶易于检测。将总共8μg蛋白质加入20μl测定，该量属于使用细胞提取物的实验的一般范围内。添加细胞提取物后观察到的信号可以通过添加特异性竞争剂(未标记的凝血酶适体)而完全消除，证实在细胞提取物中观察到的信号是由于凝血酶。在以细胞提取物进行工作时，我们遇到的一个困难是细胞提取物中存在的核酸酶降解寡核苷酸(测定成分)。我们测试了多种缓冲液添加剂以发现凝血酶信标在细胞提取物存在下在足够长的时期保持稳定的条件。我们发现，添加高浓度的随机序列30个碱基对双链DNA(10μM)、高浓度的20个核苷酸随机序列单链DNA(0.1μM)和2.5mM EGTA，在细胞提取物存在下保护凝血酶信标免于降解，而不显著影响该信标对凝血酶的反应。在上列添加剂存在下获得图25B所示数据。
由于凝血酶是血浆蛋白质，所以我们确定了是否该可以使用该信标检测血浆中的该蛋白质。血浆中所有凝血酶以其前体凝血酶原的形式存在，所述凝血酶原经因子Xa蛋白水解加工转化为凝血酶。尽管与凝血酶相比灵敏度大大降低(>20倍)(数据未显示)，但凝血酶信标识别凝血酶原。图25C所示实验充分说明这一点，所述实验中，作为时间的函数监控凝血酶原存在时的信标的敏化受体发射。在箭标标记的点将因子Xa加入混合物，启动凝血酶原向凝血酶的转化。所述转化导致时间依赖性的信标信号增加，这与该信标对凝血酶高很多的灵敏度一致。因此，为了检测血浆中的凝血酶，将因子Xa包括于测定混合物中(图25D)。加入的血浆量增加导致信标信号的成比例增加(图25D)。仅当测定中存在因子Xa时，添加血浆引起信标反应。添加血浆后观察到的信号可以通过添加特异性竞争剂(未标记的凝血酶适体)而完全消除，证实在细胞提取物中观察到的信号是由于凝血酶。20μl反应体积中，5nL血浆样品引起可测量的信标反应.总而言之，图25所示实验证实了凝血酶信标检测复杂生物混合物中蛋白质的功能性.
讨论
此处所述基于适体的分子信标设计是我们以前开发的分子信标的推广，所述分子信标用于检测序列特异性DNA结合蛋白质(图17).在此提出的以凝血酶作为模式蛋白质的实验为该设计的可行性提供了理论根据。我们相信该设计将具有若干重要的优势。由于在此所述的分子信标设计不限于任何特异性蛋白质，其将可普遍应用于很多蛋白质。我们的信标在靶蛋白质存在下的信号传导，要求两个不同适体协同识别该蛋白质的两个单独表位。这将引起该信标的特异性增强和亲和力(即检测灵敏度)增加。两个适体的这种协同行为，也将使得能够使用具有适度亲和力的适体以产生以高亲和力和特异性结合靶蛋白质的分子信标。适体(信标组分)在其结构上不要求任何加工来修整其构象分布以允许蛋白质存在时不同状态之间的“转换”。这类加工可以依赖于该适体的特定序列(结构)，且这种核酸构象改变的能力学平衡不一定是微不足道的问题。由于目前信标设计中的信号传导元件(“信号传导”寡核苷酸)与其适体组分分离，所以任何适体序列(及结构)应当与我们的信标设计一致。添加“信号传导”寡核苷酸同样未必将对适体(信标组分)的亲和力和特异性产生不利影响。因此，任何蛋白质(可能为其获得识别该蛋白质两个不同表位的两个适体)将是根据图17方案开发分子信标的良好靶。
可以相对简单地获得识别该蛋白质不同表位的抗体。类似地，没有理由不能为许多靶蛋白质开发识别不同表位的适体，而且已经提供了若干实例(Jayasena，S.D.Clinical Chem.1999，45，1628-1650)。有几种可能的途径实现该目标。第一条途径使用分离结合和未结合蛋白质的核酸的不同方法进行体外选择(SELEX)。这里的基本原理是，在不同的区分方法中，可以优先展示蛋白质的不同区域，从而导致适体被引导至该蛋白质表面的不同区域。选择的凝血酶适体是这类途径的实例(Bock，1992；Tasset，1997)。第二条途径可以是产生对应于靶蛋白质分子不同区域的肽的适体。有实验证据显示可以使用这种策略开发能够识别完整蛋白质的适体，用作开发适体的靶的肽源自所述蛋白质(Wei，X.；Ellington，A.D.Proc.NatL.Acad.Sci.USA 1996，93，7475-7480).这种途径已被广泛用于产生识别蛋白质的抗体。也可以通过两步连续SELEX产生识别蛋白质不同表位的两个适体，所述两步连续SELEX中，第二步涉及在第一步所选适体的饱和浓度存在下选择适体。我们确认了所述使用凝血酶作为模式体系的程序(Heyduk，E.和Heyduk，T.，未发表)。最后，我们开发了全新的体外选择策略，以产生经过特定设计以在我们的分子信标设计中起作用的适体对(Heyduk，E.，Kalucka，J.，Kinnear，B.，Knoll，E.，和Heyduk，T.，未发表)。因此，可利用多种路线获得识别蛋白质非重叠表位的适体对。
实施例4：传感器设计变化
本分子信标的多种变化可应用于本发明的实践中。图26中描述了这些传感器设计的变体，并在此概括(见上文)。经证实，图26F所示传感器设计有效地检测DNA结合蛋白质。向供体和受体标记的传感器组分的混合物滴定cAMP反应元件结合蛋白质(CRP)(DNA结合蛋白质的实例)后，伴随敏化受体荧光强度增加(图27)。
在图28中证实了图26G所示传感器设计。图A描述了传感器功能的原理。向两个供体和受体标记的传感器组分的混合物添加单链DNA后，伴随着敏化受体荧光强度的增加(图28，B，带+号的线)，所述单链DNA含有与传感器元件互补的两个不同序列元件。在此特定情况下的传感器含有德克萨斯红标记的THR29和THR32。
通过实验证实了本分子信标传感器设计与基于单靶大分子识别元件的测定相比增加的特异性(图29)。传感器识别靶分子包括三个分子接触的同时存在，所述分子接触的每一个为该复合物的总稳定性提供自由能(ΔG)贡献。由于自由能与复合物平衡解离常数之间的指数关系，所以如果缺少任何上列三个分子接触，则导致分子识别高特异性的复合物总稳定性将大大降低。纳摩尔浓度的非特异性单链DNA结合蛋白质(“SSB”)与单个荧光素标记的适体(THR1，表1)产生大信号(如通过荧光偏振测定所测得的)。SSB在与凝血酶结合该适体所需浓度非常相似的浓度范围内产生反应。因此，单个凝血酶适体在SSB和凝血酶之间展示非常低的分辨力。(图B)凝血酶传感器(THR21(荧光素标记的)和德克萨斯红标记的THR27的混合物)暴露于纳摩尔SSB浓度，不产生任何显著的信标反应(虚线)，而凝血酶在相同浓度范围内产生大的信标反应。(图C)。因此，凝血酶信标在SSB和凝血酶之间表现出极好的分辨力，说明该信标的增强的特异性。
制备变体传感器适体的方法
图30概括了选择可用于实施本发明的适体的方法。图A描述了在与第一个适体结合的蛋白质存在下选择第二个适体。信号传导寡核苷酸位于含随机序列构建体的5′末端，且互补信号传导寡核苷酸通过长的柔性接头附着于第一个适体。使用该型随机DNA(或RNA)构建体选择共适体，将向能够在不同于第一个适体表位的位点结合蛋白质、并且将在图26A所示传感器中起作用的适体偏倚。
图B中描述了备选情况，该图描述同时选择与蛋白质两个不同表位结合的两个适体。条(在引物1和引物4末端)表示含随机序列的适体构建体5′末端和3′末端的短互补序列。使用这类随机DNA(或RNA)构建体选择适体，将向能同时在蛋白质两个不同表位结合该蛋白质、并且将在图26A所示传感器中起作用的适体偏倚。
在另一个备选实施方案中，可以在与双链DNA结合的蛋白质存在下选择第二个适体(图30，图C)。条表示与信号传导寡核苷酸互补的短序列(在含随机序列的构建体的5′末端)，所述信号传导寡核苷酸通过长的柔性接头附着于双链DNA。使用这类随机DNA(或RNA)构建体选择共适体将向能够在不同于蛋白质的双链DNA结合位点的位点结合该蛋白质、并且将在图17B所示传感器中起作用的适体偏倚。
在另一个备选实施方案中，可以在与抗体结合的蛋白质的存在下选择第二个适体，所述蛋白质在该蛋白质的不同表位与抗体结合(图30，图D)。条表示与信号传导寡核苷酸互补的短序列(在含有随机序列的构建体的5′末端)，所述信号传导寡核苷酸通过长的柔性接头附着于该抗体。使用这类随机DNA(或RNA)构建体选择共适体将向能在不同于抗体表位的位点结合该蛋白质、并且将在图17C所示传感器中起作用的适体偏倚。
在过量含G15D适体的构建体(THR22)存在下，使用SELEX程序，从含有33个核苷酸随机序列的构建体(THR11)开始，选择在不同于G15D适体结合位点的表位结合凝血酶的适体(图31，图A)。图B描述所示各轮选择后获得的单链DNA的凝血酶结合活性。可测量的凝血酶结合活性在第4轮选择后出现，并且在第12轮选择后达到最大值。在过量THR22存在下测量结合。克隆第12轮选择后获得的DNA，并且对从单独克隆获得的DNA进行测序.图C描述了单独克隆的序列比对(使用ClustalX)。显示从四个独立选择实验获得的克隆。使用下列适体构建体对与含随机序列的构建体进行这些选择：THR22和THR11；THR25和THR11；THR42和THR11；THR43和THR11。若干高度保守序列家族在图C中显而易见。
图32中描述了功能性凝血酶传感器，其包含德克萨斯红标记的THR27和荧光素标记的THR35或THR36，所述THR27和THR35或THR36含有对应于图31C克隆20-26的序列。THR35与THR36区别在于克隆20-26序列侧翼DNA序列长度。显示含有20nM(图A)或100nM(图B)所示凝血酶传感器及所示凝血酶浓度的微量培养板孔的荧光图像(敏化受体发射)。作为比较，显示包含THR21和THR27的传感器.
图33概括了同时选择在两个不同表位结合凝血酶的两个适体。使用SELEX程序，从两个含有30个核苷酸随机序列的构建体(THR49和THR50)开始选择适体(图A)。图B显示所示各轮选择后获得的单链DNA混合物的凝血酶结合活性。可测量的凝血酶结合活性在第6轮选择后出现，并且在第14轮选择后达到最大值。克隆第14轮选择后获得的DNA，并且将从单独克隆获得的DNA进行测序。图C描述了克隆的序列比对(使用ClustalX)。若干高度保守序列家族显而易见。
为cAMP反应元件结合蛋白(“CRP”)开发基于适体的分子信标.选择适体以在不同于该蛋白质的DNA结合位点的位点结合。在过量含CRP结合位点的构建体(与MIS11杂交的MIS10X3)存在下，使用SELEX程序，从含有33个核苷酸随机序列的构建体(MIS12)开始进行选择(图34，图A).图34，图B中描述了所示各轮选择后获得的单链DNA的CRP结合活性。可测量的CRP结合活性在第6轮选择后出现，并且在第12轮选择后达到最大值。在过量与MIS11杂交的MIS10X3存在下测量结合。克隆第12轮选择后获得的DNA，并且将从单独克隆获得的DNA进行测序。图C描述了克隆的序列比对(使用ClustalX)。可以确定约16个核苷酸的保守核心序列。

Claims (78)

1.检测样品中多肽的方法，其包括步骤：
(a)将样品与第一个适体构建体和第二个适体构建体接触，及
(b)通过检测方法检测第一个适体构建体、第二个适体构建体及多肽的结合；其中
(c)第一个适体构建体能够结合多肽的第一个表位，且第二个适体构建体能够结合该多肽的第二个表位，
(d)第一个适体构建体包含(i)能够结合第一个表位的第一个适体、(ii)第一个信号传导寡核苷酸和(iii)第一个标记，所述第一个适体通过第一个柔性接头与所述第一个信号传导寡核苷酸连接，其中所述第一个信号传导寡核苷酸为由2至15个核苷酸组成的单链多核苷酸，以及
(e)第二个适体构建体包含(iv)能够结合第二个表位的第二个适体、(v)与第一个信号传导寡核苷酸互补的第二个信号传导寡核苷酸，但仅当通过结合多肽使之非常接近所述第一个信号传导寡核苷酸时，其与所述第一个信号传导寡核苷酸形成稳定结合，和(vi)第二个标记，所述第二个适体通过第二个柔性接头与所述第二个信号传导寡核苷酸连接，其中所述第二个信号传导寡核苷酸为由2至15个核苷酸组成的单链多核苷酸，
其中当所述第一个适体构建体、第二个适体构建体和多肽结合，由此使所述第一个标记和第二个标记非常接近时，所述第一个标记和第二个标记产生的信号与所述第一个适体构建体、第二个适体构建体和多肽不结合时所产生的信号不同。
2.权利要求1的方法，其中所述第一个和第二个信号传导寡核苷酸各由至少5个核苷酸且不多于7个核苷酸组成。
3.权利要求1的方法，其中所述第一个适体包含天然同源结合元件序列，且使用体外进化选择第二个适体。
4.权利要求1的方法，其中所述第一个标记是荧光供体，且所述第二个标记是荧光接纳体。
5.权利要求1的方法，其中所述第一个标记是荧光接纳体，且所述第二个标记是荧光供体。
6.权利要求1的方法，其中所述检测方法检测荧光变化。
7.权利要求1的方法，其中所述检测方法是FRET。
8.权利要求1的方法，其中使用体外进化选择第一个适体和第二个适体。
9.权利要求1的方法，其中所述多肽不天然结合天然同源结合元件序列。
10.权利要求9的方法，其中所述多肽是凝血酶。
11.权利要求10的方法，其中所述第一个适体结合凝血酶的肝素外部位且第二个适体结合凝血酶的纤维蛋白原外部位。
12.权利要求11的方法，其中所述第一个标记是荧光素。
13.权利要求12的方法，其中所述检测方法是荧光偏振。
14.权利要求12的方法，其中所述第二个标记是dabcyl，且所述检测方法是检测荧光素荧光强度的变化。
15.权利要求1的方法，其中所述第一个适体构建体和第二个适体构建体通过接头连接在一起。
16.权利要求15的方法，其中所述接头是柔性的间隔区18。
17.检测样品中分析物的方法，其包括步骤
(a)将样品与第一个分子识别构建体和第二个分子识别构建体接触，及
(b)通过检测方法检测第一个分子识别构建体、第二个分子识别构建体及多肽的结合；其中
(c)第一个分子识别构建体能够结合多肽的第一个表位，且第二个分子识别构建体能够结合该多肽的第二个表位，
(d)第一个分子识别构建体包含(i)能够结合第一个表位的第一个表位结合剂，(ii)第一个信号传导寡核苷酸，和(iii)第一个标记，所述第一个表位结合剂通过第一个柔性接头与所述第一个信号传导寡核苷酸连接，其中所述第一个信号传导寡核苷酸为由2至15个核苷酸组成的单链多核苷酸，以及
(e)第二个分子识别构建体包含(iv)能够结合第二个表位的第二个表位结合剂，(v)与第一个信号传导寡核苷酸互补的第二个信号传导寡核苷酸，但仅当通过结合多肽使之非常接近所述第一个信号传导寡核苷酸时，其与所述第一个信号传导寡核苷酸形成稳定结合，和(vi)第二个标记，所述第二个表位结合剂通过第二个柔性接头与所述第二个信号传导寡核苷酸连接，其中所述第二个信号传导寡核苷酸为由2至15个核苷酸组成的单链多核苷酸，
其中当所述第一个分子识别构建体、第二个分子识别构建体和多肽结合，由此使所述第一个标记和第二个标记非常接近时，所述第一个标记和第二个标记产生不同信号，并且，其与所述第一个分子识别构建体、第二个分子识别构建体和多肽不结合时所产生的信号不同，其中所述第一表位结合剂和第二表位结合剂选自适体和多肽。
18.权利要求17的方法，其中所述第一表位结合剂和/或第二表位结合剂选自多肽时为抗体或抗体片段。
19.权利要求17的方法，其中所述第一个信号传导寡核苷酸和第二个信号传导寡核苷酸各由至少5个核苷酸且不多于7个核苷酸组成。
20.权利要求17的方法，其中所述第一个分子识别构建体为适体，其包含天然同源结合元件序列，且第二个分子识别构建体为使用体外进化选择的适体。
21.权利要求17的方法，其中所述第一个标记是荧光供体，且所述第二个标记是荧光接纳体。
22.权利要求17的方法，其中所述第一个标记是荧光接纳体，且所述第二个标记是荧光供体。
23.权利要求17的方法，其中所述检测方法检测荧光变化。
24.权利要求23的方法，其中所述检测方法是FRET。
25.权利要求20的方法，其中使用体外进化选择第一个适体和第二个适体。
26.权利要求17的方法，其中所述多肽不天然结合天然同源结合元件序列。
27.权利要求17的方法，其中所述多肽在结合分析物后经历构象变化。
28.权利要求27的方法，其中所述分析物是药物且该多肽能结合该药物。
29.权利要求28的方法，其中所述分析物是抑制素药物且该多肽是HMG-CoA还原酶。
30.权利要求17的方法，其中所述分析物是见于环境中的毒素。
31.权利要求17的方法，其中所述第一个分子识别构建体和第二个分子识别构建体通过接头连接到一起。
32.权利要求31的方法，其中所述接头是柔性的间隔区18。
33.二价适体构建体，其包含第一个构建体、第二个构建体和第三个接头，其中所述第一个构建体包含第一个适体、第一个标记和第一个信号传导寡核苷酸，其中所述第一个信号传导寡核苷酸为由2至15个核苷酸组成的单链多核苷酸，且其中所述第一个适体通过第一个柔性接头与第一个信号传导寡核苷酸连接，所述第二个构建体包含第二个适体、第二个标记和第二个信号传导寡核苷酸，其中所述第二个信号传导寡核苷酸为由2至15个核苷酸组成的单链多核苷酸，且其中所述第二个适体通过第二个柔性接头与第二个信号传导寡核苷酸连接，以及所述第三个接头连接第一个构建体和第二个构建体，其中第一个适体能结合目标多肽上的第一个表位且第二个造体能结合目标多肽上的第二个表位。
34.权利要求33的二价适体构建体，其中所述第一个表位和第二个表位是相同多肽的不同且非重叠表位。
35.权利要求33的二价适体构建体，其中所述第三个接头是柔性接头。
36.权利要求35的二价适体构建体，其中所述第三个接头是间隔区18。
37.权利要求35的二价适体构建体，其中所述第三个接头是脱氧胸苷聚合物。
38.权利要求33的二价适体构建体，其中所述第一个标记是荧光供体。
39.权利要求38的二价适体构建体，其中所述第二个标记是荧光接受体。
40.权利要求33的二价适体构建体，其中所述第一个和第二个信号传导寡核苷酸长度至少为5个核苷酸且长度不多于7个核苷酸。
41.权利要求33的二价适体构建体，其中所述第一个适体包含天然同源结合元件序列。
42.权利要求41的二价适体构建体，其中使用体外进化选择第二个适体。
43.权利要求33的二价适体构建体，其中使用体外进化选择第一个适体。
44.权利要求33的二价适体构建体，其中所述多肽是凝血酶，所述第一个标记是荧光素，所述第二个标记是dabcyl，所述第一个表位是肝素外部位，所述第二个表位是纤维蛋白原外部位，且所述第三个接头是间隔区18。
45.权利要求34的二价适体构建体，其中所述多肽是凝血酶，所述第一个标记是荧光素，所述第二个标记是dabcyl，所述第一个表位是肝素外部位，所述第二个表位是纤维蛋白原外部位，且所述第三个接头是间隔区18。
46.试剂盒，其包括第一个分子识别构建体和第二个分子识别构建体，其中所述第一个分子识别构建体包含(i)能够结合第一个表位的第一个表位结合剂，(ii)第一个信号传导寡核苷酸，其中所述第一个信号传导寡核苷酸为由2至15个核苷酸组成的单链多核苷酸，和(iii)第一个标记，所述第一个表位结合剂通过第一个柔性接头与所述第一个信号传导寡核苷酸连接，以及第二个分子识别构建体包含(iv)能够结合第二个表位的第二个表位结合剂，(v)与第一个信号传导寡核苷酸互补的第二个信号传导寡核苷酸，但仅当通过结合多肽使之非常接近所述第一个信号传导寡核苷酸时，其与所述第一个信号传导寡核苷酸形成稳定结合，其中所述第二个信号传导寡核苷酸为由2至15个核苷酸组成的单链多核苷酸，和(vi)第二个标记，所述第二个表位结合剂通过第二个柔性接头与所述第二个信号传导寡核苷酸连接，其中(a)当第一个表位结合剂和第二个表位结合剂分别结合多肽的第一个表位及该多肽的第二个表位时，(b)第一个标记和第二个标记相互作用以产生可检测的信号。
47.权利要求46的试剂盒，其中所述第一个表位结合剂是抗体。
48.权利要求46的试剂盒，其中所述第一个信号传导寡核苷酸和第二个信号传导寡核苷酸长度至少为5个核苷酸且长度不多于7个核苷酸。
49.权利要求46的试剂盒，其中所述第一个表位结合剂是包含天然同源结合元件序列的适体。
50.权利要求46的试剂盒，其中所述第二个表位结合剂是使用体外进化选择的适体。
51.权利要求46的试剂盒，其中所述第一个标记是荧光供体，且所述第二个标记是荧光接受体。
52.权利要求51的试剂盒，其中所述第一个标记是荧光素，且所述第二个标记是dabcyl。
53.权利要求46的试剂盒，另外包括一多肽，其中该多肽能结合分析物。
54.权利要求46的试剂盒，另外包括一套使用所述试剂盒的印刷说明书。
55.检测样品中多肽的方法，其包括步骤(a)将样品与第一个分子识别构建体和第二个分子识别构建体接触，并且(b)通过检测方法检测第一个分子识别构建体、第二个分子识别构建体及多肽的结合；其中(c)第一个分子识别构建体能结合该多肽的第一个表位，且第二个分子识别构建体能结合该多肽的第二个表位，(d)第一个分子识别构建体包含(i)能结合第一个表位的第一个表位结合剂、(ii)第一个信号传导寡核苷酸和(iii)第一个标记，所述第一个表位结合剂通过第一个柔性接头与所述第一个信号传导寡核苷酸链接，其中所述第一个信号传导寡核苷酸为由2至15个核苷酸组成的单链多核苷酸，且(e)第二个分子识别构建体包含(iv)能结合第二个表位的第二个表位结合剂、(v)与第一个信号传导寡核苷酸互补的第二个信号传导寡核苷酸，但仅当通过结合多肽使之非常接近所述第一个信号传导寡核苷酸时，其与所述第一个信号传导寡核苷酸形成稳定结合，和(vi)第二个标记，所述第二个表位结合剂通过第二个柔性接头与所述第二个信号传导寡核苷酸连接，其中所述第二个信号传导寡核苷酸为由2至15个核苷酸组成的单链多核苷酸，
其中当所述第一个分子识别构建体、第二个分子识别构建体和多肽结合，由此使所述第一个标记和第二个标记非常接近时，所述第一个标记和第二个标记产生的信号与所述第一个分子识别构建体、第二个分子识别构建体和多肽不结合时所产生的信号不同。
56.权利要求55的方法，其中所述第一个表位结合剂是适体。
57.权利要求56的方法，其中所述第二个表位结合剂是适体。
58.权利要求56的方法，其中所述第二个表位结合剂是抗体。
59.权利要求56的方法，其中所述第二个表位结合剂是含有多肽结合位点的双链多核苷酸。
60.权利要求55的方法，其中所述第一个表位结合剂是抗体。
61.权利要求60的方法，其中所述第二个表位结合剂是第二个抗体。
62.权利要求60的方法，其中所述第二个表位结合剂是含有多肽结合位点的双链多核苷酸。
63.权利要求55的方法，其中所述第一个表位结合剂是含有多肽第一个结合位点的双链多核苷酸。
64.权利要求63的方法，其中所述第二个表位结合剂是含有多肽第二个结合位点的双链多核苷酸。
65.权利要求55至64中任一项的方法，其中所述检测方法选自等离子体共振、荧光共振能量转移(“FRET”)、FCCS、荧光猝灭、荧光偏振、产生有色产物、化学发光、闪烁现象、生物发光和发光共振能量转移。
66.权利要求65的方法，其中所述检测方法是发光共振能量转移。
67.权利要求55至64中任一项的方法，其中所述多肽是凝血酶或cAMP反应元件结合蛋白质(“CRP”)。
68.权利要求55至64中任一项的方法，其中所述样品选自血液、尿液、腹水、细胞样品和组织样品。
69.分子信标，其包括第一个分子识别构建体和第二个分子识别构建体；其中
(a)第一个分子识别构建体能结合多肽的第一个表位，且第二个分子识别构建体能结合该多肽的第二个表位，
(b)第一个分子识别构建体包含(i)能结合第一个表位的第一个表位结合剂、(ii)第一个信号传导寡核苷酸和(iii)第一个标记，所述第一个表位结合剂通过第一个柔性接头与第一个信号传导寡核苷酸连接，其中所述第一个信号传导寡核苷酸为由2至15个核苷酸组成的单链多核苷酸，及
(c)第二个分子识别构建体包含(iv)能结合第二个表位的第二个表位结合剂、(v)与第一个信号传导寡核苷酸互补的第二个信号传导寡核苷酸，但仅当通过结合多肽使之非常接近所述第一个信号传导寡核苷酸时，其与所述第一个信号传导寡核苷酸形成稳定结合，和(vi)第二个标记，所述第二个表位结合剂通过第二个柔性接头与第二个信号传导寡核苷酸连接，其中所述第二个信号传导寡核苷酸为由2至15个核苷酸组成的单链多核苷酸，
其中当所述第一个分子识别构建体、第二个分子识别构建体和多肽结合，由此使所述第一个标记和第二个标记非常接近时，所述第一个标记和第二个标记产生的信号与所述第一个分子识别构建体、第二个分子识别构建体和多肽不结合时所产生的信号不同。
70.权利要求69的分子信标，其中所述第一个表位结合剂是适体。
71.权利要求70的分子信标，其中所述第二个表位结合剂是适体。
72.权利要求70的分子信标，其中所述第二个表位结合剂是抗体。
73.权利要求70的分子信标，其中所述第二个表位结合剂是含有多肽结合位点的双链多核苷酸。
74.权利要求69的分子信标，其中所述第一个表位结合剂是抗体。
75.权利要求74的分子信标，其中所述第二个表位结合剂是第二个抗体。
76.权利要求74的分子信标，其中所述第二个表位结合剂是含有多肽结合位点的双链多核苷酸。
77.权利要求69的分子信标，其中所述第一个表位结合剂是含有多肽第一个结合位点的双链多核苷酸。
78.权利要求77的分子信标，其中所述第二个表位结合剂是含有多肽第二个结合位点的双链多核苷酸。
CN2004800368747A 2003-12-12 2004-12-10 检测大分子和其它分析物的生物传感器 Expired - Fee Related CN101208437B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US52907603P 2003-12-12 2003-12-12
US60/529,076 2003-12-12
PCT/US2004/041315 WO2005059509A2 (en) 2003-12-12 2004-12-10 Biosensors for detecting macromolecules and other analytes

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101208437A CN101208437A (zh) 2008-06-25
CN101208437B true CN101208437B (zh) 2012-07-04

Family

ID=34699935

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2004800368747A Expired - Fee Related CN101208437B (zh) 2003-12-12 2004-12-10 检测大分子和其它分析物的生物传感器

Country Status (7)

Country Link
US (2) US7939313B2 (zh)
EP (1) EP1692486B1 (zh)
JP (2) JP2007525661A (zh)
CN (1) CN101208437B (zh)
CA (1) CA2545006C (zh)
HK (1) HK1120568A1 (zh)
WO (1) WO2005059509A2 (zh)

Families Citing this family (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101208437B (zh) 2003-12-12 2012-07-04 圣路易斯大学 检测大分子和其它分析物的生物传感器
CA2610027A1 (en) * 2005-05-26 2006-11-30 Ensemble Discovery Corporation Biodetection by nucleic acid-templated chemistry
US8956857B2 (en) 2005-06-06 2015-02-17 Mediomics, Llc Three-component biosensors for detecting macromolecules and other analytes
US7795009B2 (en) 2005-06-15 2010-09-14 Saint Louis University Three-component biosensors for detecting macromolecules and other analytes
WO2006135527A2 (en) 2005-06-10 2006-12-21 Saint Louis University Methods for the selection of aptamers
US7811809B2 (en) 2005-06-15 2010-10-12 Saint Louis University Molecular biosensors for use in competition assays
WO2007025049A2 (en) * 2005-08-26 2007-03-01 Archemix Corp. Aptamers that bind thrombin with high affinity
CA2660129C (en) 2006-08-09 2015-11-10 Saint Louis University Molecular biosensors for detecting macromolecules and other analytes
EP2111553B1 (en) 2007-01-24 2018-09-19 Carnegie Mellon University Optical biosensors
DE102007041476B4 (de) 2007-08-31 2017-03-30 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Aptamere, die an ein an der Hämostase beteiligtes Zielmolekül binden
DE102007063902B3 (de) * 2007-08-31 2017-11-23 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Aptamere, die an ein an der Hämostase beteiligtes Zielmolekül binden
BRPI0819739A2 (pt) * 2007-11-21 2017-05-09 Univ Erasmus Med Ct Rotterdam sondas de fret otimizadas e usos das mesmas
US8426153B2 (en) * 2007-12-03 2013-04-23 Carnegie Mellon University Linked peptides fluorogenic biosensors
JP5210620B2 (ja) * 2007-12-19 2013-06-12 独立行政法人科学技術振興機構 ペプチドアプタマーライブラリーの作製方法および用途
US20140128280A1 (en) * 2008-04-23 2014-05-08 Arizona Board of Regents, a body corporate of the State of Arizona, acting for and on behaif of Ariz Synthetic Antibodies
EP2703816B1 (en) 2008-11-21 2016-10-05 Saint Louis University Biosensor for detecting multiple epitopes on a target
WO2010059944A1 (en) * 2008-11-21 2010-05-27 Columbia University A split dna enzyme for visual single nucleotide polymorphism typing
US9040287B2 (en) 2010-02-12 2015-05-26 Mediomics, Llc Molecular biosensors capable of signal amplification
US20190300945A1 (en) 2010-04-05 2019-10-03 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially Encoded Biological Assays
US10787701B2 (en) 2010-04-05 2020-09-29 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
CA2794522C (en) 2010-04-05 2019-11-26 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
TWI497076B (zh) 2010-06-25 2015-08-21 Univ Nat Cheng Kung 適合體及ｃ－反應蛋白檢測方法
JP5766296B2 (ja) * 2010-12-23 2015-08-19 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ポリペプチド−ポリヌクレオチド複合体、およびエフェクター成分の標的化された送達におけるその使用
EP2479914B1 (en) * 2011-01-21 2015-03-04 Alcatel Lucent Method and transmitter element for transmitting channel information for link adaption, method and receiver element for receiving the channel information
GB201106254D0 (en) 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
FR2977674B1 (fr) * 2011-07-06 2015-08-14 Cisbio Bioassays Methode amelioree de detection et/ou de quantification d'un analyte present a la surface d'une cellule
ES2700792T3 (es) * 2011-11-11 2019-02-19 Eli N Glezer Procedimientos de ensayo asistidos por coagente de unión
CN103160512B (zh) * 2011-12-15 2014-09-24 国家纳米科学中心 一种核酸及药物载体和药物组合物及其制备方法
WO2014102806A1 (en) * 2012-12-31 2014-07-03 Yeda Research And Development Co. Ltd. Protein biosensors, cross reactive sensor arrays and methods of use thereof
CN105378477B9 (zh) * 2013-03-11 2021-08-06 梅索磅秤技术有限公司 用于进行多路测定法的改进方法
US10114015B2 (en) 2013-03-13 2018-10-30 Meso Scale Technologies, Llc. Assay methods
US9879313B2 (en) 2013-06-25 2018-01-30 Prognosys Biosciences, Inc. Methods and systems for determining spatial patterns of biological targets in a sample
WO2015066027A2 (en) * 2013-10-28 2015-05-07 Dots Devices, Inc. Allergen detection
CN103630517B (zh) * 2013-11-15 2015-12-09 南京邮电大学 一种基于拆分适配体和水溶性共轭聚合物的凝血酶检测方法
CN104020293A (zh) * 2014-03-25 2014-09-03 李根喜 基于多肽的黑色素瘤生物标记物传感器
US11639929B2 (en) 2014-04-29 2023-05-02 Yeda Research And Development Co. Ltd. Universal histidine-tag binding compounds and methods of use thereof as fluorescent probes and sensors
CN106456699B (zh) 2014-05-05 2021-07-02 生物风险投资有限责任公司 作为抗老化剂抑制抗凋亡的Bcl-2蛋白的组合物和方法
AU2015259048B2 (en) 2014-05-15 2021-09-09 Meso Scale Technologies, Llc. Improved assay methods
AU2015292710A1 (en) 2014-07-22 2017-02-16 Bioventures, Llc. Compositions and methods for selectively depleting senescent cells
EP2980218A1 (en) * 2014-07-30 2016-02-03 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Aptamer thrombin complex for use as an antidote to direct acting thrombin inhibitors
EP3939593A1 (en) 2014-09-10 2022-01-19 Washington University Compositions and methods for treatment of pre-cancerous skin lesions
EP3191843A1 (en) 2014-09-12 2017-07-19 Mediomics, LLC Molecular biosensors with a modular design
CA2958042C (en) * 2014-09-22 2022-05-31 Japan Science And Technology Agency Method for detecting target molecule, and kit for use in said method
JP6640843B2 (ja) * 2014-09-30 2020-02-05 コーニンクレッカ フィリップス エヌ ヴェＫｏｎｉｎｋｌｉｊｋｅ Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｎ．Ｖ． 第１及び第２のエピトープの空間的近接を検出する方法
WO2016109378A1 (en) 2014-12-29 2016-07-07 North Carolina State University Multiplexed diagnostic to recognize concentrations of related proteins and peptides
CN104569430B (zh) * 2015-01-04 2017-01-04 深圳市艾瑞生物科技有限公司 一种快速定量检测心脏型脂肪酸结合蛋白的均相荧光免疫试剂组及其制备方法
EP4119677B1 (en) 2015-04-10 2023-06-28 Spatial Transcriptomics AB Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens
US20180251765A1 (en) * 2015-09-08 2018-09-06 BellBrook Labs High-throughput split aptamer screening assay
US11938193B2 (en) 2016-01-08 2024-03-26 Washington University Compositions comprising chemerin and methods of use thereof
CN105543231B (zh) * 2016-01-11 2019-07-05 河南省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 伏马毒素b1核酸适配体链置换探针的筛选及应用
US11137408B2 (en) 2016-01-29 2021-10-05 Washington University GDF15 in glaucoma and methods of use thereof
US10807977B2 (en) 2016-04-21 2020-10-20 Bioventures, Llc Compounds that induce degradation of anti-apoptotic Bcl-2 family proteins and the uses thereof
WO2017189846A1 (en) 2016-04-27 2017-11-02 Thaddeus Stappenbeck Methods for prognosing crohn's disease comprising human defensin 5 (hd5)
EP3485282A4 (en) * 2016-07-15 2020-02-19 Ji Hoon Lee CHEMOLUMINESCENT BIOCAPTOR FOR DETECTING COAGULATION FACTORS
US11058653B2 (en) 2016-10-26 2021-07-13 Washington University Compositions comprising desaminotyrosine and uses thereof to enhance type I interferon stimulation
US11175296B2 (en) 2016-10-26 2021-11-16 Washington University Methods of diagnosing and treating cancer comprising ME1
JP2020513764A (ja) 2016-12-30 2020-05-21 クイデル コーポレーション ファージ媒介性イムノアッセイ及び抗生物質又はプロバイオティック薬剤に対する細菌の感受性を決定するための方法
WO2018158771A1 (en) 2017-02-28 2018-09-07 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd Conjugates comprising ocular angiogenesis growth factor aptamers and uses thereof in the detection and treatment of ophthalmological angiogenesis indications
WO2019103131A1 (ja) * 2017-11-24 2019-05-31 国立大学法人 東京大学 アプタマーの結合部位判別方法、アプタマーペアおよび目的物質からなる三元錯体の解離定数等の測定方法並びに最適なアプタマーペアの選択方法
US11085935B2 (en) 2018-05-03 2021-08-10 Washington University Methods of treating based on site-specific tau phosphorylation
CN108956991B (zh) * 2018-07-25 2021-04-27 南通大学 一种荧光共振能量转移生物传感器及其应用
CN109444103B (zh) * 2018-12-18 2021-09-28 咸阳师范学院 一种pei功能化绿色荧光碳点制备方法及基于该碳点的凝血酶检测方法
WO2020243579A1 (en) 2019-05-30 2020-12-03 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
EP3980451A1 (en) * 2019-06-05 2022-04-13 Yeda Research and Development Co. Ltd Artificial receptors, recombinant cells comprising thereof, methods for their preparation, and method of using thereof
JP2022535131A (ja) 2019-06-05 2022-08-04 リブ・プロセス・インコーポレイテッド クロストリジウム・ディフィシル菌に対するアプタマー
WO2020252086A1 (en) 2019-06-10 2020-12-17 Washington University Microbiota-directed foods to repair a subject's gut microbiota
CN110672567B (zh) * 2019-09-26 2022-01-11 南通大学 低分子量肝素金纳米材料及其在乙酰肝素酶检测中的应用
WO2021097183A1 (en) * 2019-11-15 2021-05-20 President And Fellows Of Harvard College Device and method for analyte detection
WO2021150578A1 (en) * 2020-01-20 2021-07-29 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Fluorescently-labeled f-actin protein biosensors and methods of high-throughput drug discovery
CN113624724A (zh) * 2020-05-07 2021-11-09 廖世奇 一种适配体分子信标对靶分子的多元检测分析方法
CN116249785A (zh) 2020-06-02 2023-06-09 10X基因组学有限公司 用于抗原-受体的空间转录组学
AU2021283174A1 (en) 2020-06-02 2023-01-05 10X Genomics, Inc. Nucleic acid library methods
EP4162074B1 (en) 2020-06-08 2024-04-24 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
US11898146B2 (en) 2020-12-03 2024-02-13 Liv Process, Inc. Aptamers against Clostridium difficile, compositions comprising aptamers against Clostridium difficile and methods of using the same
CN113702308B (zh) * 2021-08-25 2024-01-30 青岛大学 用于大肠杆菌检测的适配体纳米比色生物传感器及应用
NL2032916B1 (en) * 2022-08-31 2024-03-15 Univ Delft Tech Single-molecule aptamer FRET for protein identification and structural analysis

Family Cites Families (93)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US6261774B1 (en) 1990-06-11 2001-07-17 Gilead Sciences, Inc. Truncation selex method
US6001577A (en) 1998-06-08 1999-12-14 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: photoselection of nucleic acid ligands and solution selex
US5750342A (en) 1990-06-11 1998-05-12 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligands of tissue target
US5763566A (en) 1990-06-11 1998-06-09 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue SELEX
US5705337A (en) 1990-06-11 1998-01-06 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chemi-SELEX
US6465188B1 (en) 1990-06-11 2002-10-15 Gilead Sciences, Inc. Nucleic acid ligand complexes
US5688935A (en) 1990-06-11 1997-11-18 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligands of tissue target
US5962219A (en) 1990-06-11 1999-10-05 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chemi-selex
US6127119A (en) 1990-06-11 2000-10-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligands of tissue target
US5660985A (en) 1990-06-11 1997-08-26 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands containing modified nucleotides
US5650275A (en) 1990-06-11 1997-07-22 Nexstar Pharmacueticals Inc Target detection method using spectroscopically detectable nucleic acid ligands
US6147204A (en) 1990-06-11 2000-11-14 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligand complexes
US6011020A (en) 1990-06-11 2000-01-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligand complexes
US5874218A (en) 1990-06-11 1999-02-23 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Method for detecting a target compound in a substance using a nucleic acid ligand
US5712375A (en) 1990-06-11 1998-01-27 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
US5789157A (en) 1990-06-11 1998-08-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
US5637459A (en) 1990-06-11 1997-06-10 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chimeric selex
US5641629A (en) 1990-06-11 1997-06-24 Nexstar Pharmacueticals Inc Spectroscopically detectable nucleic acid ligands
US5723289A (en) 1990-06-11 1998-03-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Parallel selex
US5683867A (en) 1990-06-11 1997-11-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: blended SELEX
US5567588A (en) 1990-06-11 1996-10-22 University Research Corporation Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Solution SELEX
US5476766A (en) 1990-06-11 1995-12-19 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Ligands of thrombin
US5864026A (en) 1990-06-11 1999-01-26 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
ES2110444T3 (es) 1990-06-11 1998-02-16 Nexstar Pharmaceuticals Inc Ligandos de acidos nucleicos.
US5496938A (en) 1990-06-11 1996-03-05 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligands to HIV-RT and HIV-1 rev
US5853984A (en) 1990-06-11 1998-12-29 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Use of nucleic acid ligands in flow cytometry
US6030776A (en) 1990-06-11 2000-02-29 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Parallel SELEX
US5270163A (en) 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
US5861254A (en) 1997-01-31 1999-01-19 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Flow cell SELEX
US5543293A (en) 1990-06-11 1996-08-06 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. DNA ligands of thrombin
US6083696A (en) 1990-06-11 2000-07-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands exponential enrichment: blended selex
US5840867A (en) 1991-02-21 1998-11-24 Gilead Sciences, Inc. Aptamer analogs specific for biomolecules
US5582981A (en) 1991-08-14 1996-12-10 Gilead Sciences, Inc. Method for identifying an oligonucleotide aptamer specific for a target
US5756291A (en) 1992-08-21 1998-05-26 Gilead Sciences, Inc. Aptamers specific for biomolecules and methods of making
US5998142A (en) 1993-09-08 1999-12-07 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chemi-SELEX
US6048698A (en) 1994-09-20 2000-04-11 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Parallel SELEX™
US6013443A (en) 1995-05-03 2000-01-11 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue SELEX
CA2645735A1 (en) 1995-05-03 1996-11-07 Gilead Science, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
US5582961A (en) * 1995-06-06 1996-12-10 Eastman Kodak Company Photographic elements which achieve colorimetrically accurate recording
SE504798C2 (sv) 1995-06-16 1997-04-28 Ulf Landegren Immunanalys och testkit med två reagens som kan tvärbindas om de adsorberats till analyten
US6001570A (en) 1997-02-18 1999-12-14 Invitro Diagnostics, Inc. Compositions, methods, kits and apparatus for determining the presence or absence of target molecules
US6261783B1 (en) 1997-12-15 2001-07-17 Gilead Sciences, Inc. Homogeneous detection of a target through nucleic acid ligand-ligand beacon interaction
US5989823A (en) 1998-09-18 1999-11-23 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Homogeneous detection of a target through nucleic acid ligand-ligand beacon interaction
US6225058B1 (en) 1998-01-13 2001-05-01 Invitro Diagnostics, Inc. Compositions, methods, kits and apparatus for determining the presence or absence of target molecules
EP1051515A2 (en) * 1998-01-27 2000-11-15 Cytocell Limited Modified nucleic acid probes and uses thereof
US6287772B1 (en) 1998-04-29 2001-09-11 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions for detecting and quantitating target sequences
US6287765B1 (en) 1998-05-20 2001-09-11 Molecular Machines, Inc. Methods for detecting and identifying single molecules
US6399302B1 (en) 1998-08-21 2002-06-04 University Of Virginia Patent Foundation Signal generating oligonucleotide-based biosensor
US6867289B1 (en) 1998-10-26 2005-03-15 Board Of Regents, The University Of Texas Systems Thio-modified aptamer synthetic methods and compositions
US6329145B1 (en) 1999-02-09 2001-12-11 Gilead Science, Inc. Determining non-nucleic acid molecule binding to target by competition with nucleic acid ligand
US6680377B1 (en) 1999-05-14 2004-01-20 Brandeis University Nucleic acid-based detection
EP1183521B1 (en) 1999-05-14 2014-03-19 Brandeis University Aptamer-based detection
US6506887B1 (en) 1999-07-29 2003-01-14 Somalogic, Incorporated Conditional-selex
US20030232388A1 (en) 1999-09-27 2003-12-18 Kreimer David I. Beads having identifiable Raman markers
US7306904B2 (en) 2000-02-18 2007-12-11 Olink Ab Methods and kits for proximity probing
AU2001257091A1 (en) 2000-04-18 2001-10-30 Gilead Sciences, Inc. Aptamer based two-site binding assay
US20020022224A1 (en) 2000-04-28 2002-02-21 Hornby David P. Method for isolating single-stranded DNA
US6511809B2 (en) * 2000-06-13 2003-01-28 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for the detection of an analyte by means of a nucleic acid reporter
US20030207271A1 (en) 2000-06-30 2003-11-06 Holwitt Eric A. Methods and compositions for biological sensors
US6451588B1 (en) * 2000-06-30 2002-09-17 Pe Corporation (Ny) Multipartite high-affinity nucleic acid probes
US6380377B1 (en) 2000-07-14 2002-04-30 Applied Gene Technologies, Inc. Nucleic acid hairpin probes and uses thereof
US7125660B2 (en) 2000-09-13 2006-10-24 Archemix Corp. Nucleic acid sensor molecules and methods of using same
WO2002022882A2 (en) 2000-09-13 2002-03-21 Archemix Corporation Target activated nucleic acid biosensor and methods of using same
US6376190B1 (en) 2000-09-22 2002-04-23 Somalogic, Inc. Modified SELEX processes without purified protein
DE10048944A1 (de) 2000-10-03 2002-04-18 Andreas Kage Verfahren zur Selektion hochaffin an ein Target bindender Nukleinsäuren durch zweidimensionale Auftrennung
JP2004537257A (ja) 2000-10-06 2004-12-16 ニューゲン テクノロジーズ， インコーポレイテッド 核酸配列の検出および／または定量のための、方法およびプローブ
EP1352242A2 (en) * 2001-01-12 2003-10-15 Affibody AB Detection methods
AU2775402A (en) 2001-06-29 2003-01-02 Medimolecular Pty Ltd Nucleic acid ligands to complex targets
US6544746B2 (en) 2001-08-13 2003-04-08 St. Louis University Rapid and sensitive proximity-based assay for the detection and quantification of DNA binding proteins
US7172865B2 (en) 2001-08-13 2007-02-06 Saint Louis University Rapid and sensitive assay for the detection and quantification of coregulators of nucleic acid binding factors
US6593091B2 (en) 2001-09-24 2003-07-15 Beckman Coulter, Inc. Oligonucleotide probes for detecting nucleic acids through changes in flourescence resonance energy transfer
US20030232383A1 (en) 2001-11-02 2003-12-18 Sylvia Daunert Novel reagentless sensing system for measuring carbohydrates based on the galactose/glucose binding protein
DE10161424A1 (de) * 2001-12-13 2003-07-03 Winkler & Duennebier Ag Verfahren und Vorrichtung zum Erkennen von Produktfehlern bei der Herstellung von Briefhüllen, Versandtaschen und dergleichen
US6688081B2 (en) * 2001-12-18 2004-02-10 Schmalbach-Lubeca Ag Method for reducing headspace gas
JP4128959B2 (ja) 2002-01-31 2008-07-30 セント・ルイス・ユニバーシテイ 核酸結合因子の補調節因子を検出し定量するための、迅速かつ鋭敏なアッセイ
US20030224435A1 (en) 2002-05-16 2003-12-04 Scott Seiwert Detection of abused substances and their metabolites using nucleic acid sensor molecules
US7435542B2 (en) 2002-06-24 2008-10-14 Cornell Research Foundation, Inc. Exhaustive selection of RNA aptamers against complex targets
DE60324810D1 (de) 2002-09-20 2009-01-02 New England Biolabs Inc HELICASE-ABHuNGIGE AMPLIFIKATION VON NUKLEINSUREN
EP1581548A4 (en) 2002-11-21 2008-04-23 Archemix Corp MULTIVALENT APTAMER THERAPEUTIC WITH IMPROVED PHARMACODYNAMIC PROPERTIES AND METHOD FOR THE PRODUCTION AND USE THEREOF
CA2522753C (en) 2003-04-18 2014-06-10 Becton, Dickinson And Company Immuno-amplification
US20050106594A1 (en) 2003-08-22 2005-05-19 Andrew Ellington In vitro selection of aptamer beacons
WO2005074417A2 (en) 2003-09-03 2005-08-18 Salk Institute For Biological Studies Multiple antigen detection assays and reagents
US7419835B2 (en) 2003-11-21 2008-09-02 Palo Alto Research Center Incorporated Screening for ligand binding at specific target sites
CN101208437B (zh) 2003-12-12 2012-07-04 圣路易斯大学 检测大分子和其它分析物的生物传感器
WO2005089524A2 (en) 2004-03-19 2005-09-29 U.S. Genomics, Inc. Compositions and methods for detection of single molecules
CA2610027A1 (en) 2005-05-26 2006-11-30 Ensemble Discovery Corporation Biodetection by nucleic acid-templated chemistry
US7795009B2 (en) 2005-06-15 2010-09-14 Saint Louis University Three-component biosensors for detecting macromolecules and other analytes
WO2006135527A2 (en) 2005-06-10 2006-12-21 Saint Louis University Methods for the selection of aptamers
US7811809B2 (en) 2005-06-15 2010-10-12 Saint Louis University Molecular biosensors for use in competition assays
CA2660129C (en) 2006-08-09 2015-11-10 Saint Louis University Molecular biosensors for detecting macromolecules and other analytes
EP2083269B1 (en) 2006-09-27 2013-09-04 National University Corporation Tokyo University of Agriculture and Technology Method of assaying target substance in sample, aptamer molecule and method of constructing the same
EP2703816B1 (en) 2008-11-21 2016-10-05 Saint Louis University Biosensor for detecting multiple epitopes on a target

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Daniels Dion A et al.Geneartion of RNA aptamers to the G-protein-coupled receptor for neurotensin，NTS-1.《Analytical Biochemistry》.2002,第305卷214-226. *
Ellington Andrew D ＆Szostak Jack W.In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.《Nature》.1990,第346卷818-822. *
Li J W et al.Molecular aptamer beacons for real-time protein recognition.《Biochemical and Biophysical Research Communication》.2002,第292卷31-40. *
Sayer N et al.Structural characterization of a 2"F-RNA aptamer that binds a HIV-1 SU glycoprotein,gp120.《Biochemical and Biophysical Research Communication》.2002,第293卷924-931. *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2005059509A3 (en) 2007-11-15
WO2005059509A2 (en) 2005-06-30
JP2007525661A (ja) 2007-09-06
US20110091893A1 (en) 2011-04-21
EP1692486A4 (en) 2008-05-21
EP1692486B1 (en) 2015-10-28
US7939313B2 (en) 2011-05-10
CA2545006C (en) 2013-09-17
CN101208437A (zh) 2008-06-25
EP1692486A2 (en) 2006-08-23
HK1120568A1 (en) 2009-04-03
JP2012115269A (ja) 2012-06-21
US8592202B2 (en) 2013-11-26
US20060110739A1 (en) 2006-05-25
CA2545006A1 (en) 2005-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101208437B (zh) 检测大分子和其它分析物的生物传感器
US7795009B2 (en) Three-component biosensors for detecting macromolecules and other analytes
US7811809B2 (en) Molecular biosensors for use in competition assays
US9618505B2 (en) Biosensors for detecting macromolecules and other analytes
Zhou et al. Aptamer-based biosensors for biomedical diagnostics
Hesselberth et al. In vitro selection of nucleic acids for diagnostic applications
Hamula et al. Selection and analytical applications of aptamers
Huang et al. Time-resolved fluorescence aptamer-based sandwich assay for thrombin detection
US20190276901A1 (en) Rapid low-cost detection of valley fever using isothermal amplification and sensing methods
Nie et al. A self-assemble aptamer fragment/target complex based high-throughput colorimetric aptasensor using enzyme linked aptamer assay
CA2660129C (en) Molecular biosensors for detecting macromolecules and other analytes
JP2001103975A (ja) モジュレートアプタマー及びこれを用いた標的タンパク質の検出方法
EP3191843A1 (en) Molecular biosensors with a modular design
Wang et al. A novel RNA aptamer-modified riboswitch as chemical sensor
JP2021535409A (ja) 核酸に基づく検出方法
Xu et al. Hypersensitive detection of transcription factors by multiple amplification strategy based on molecular beacon
Meir et al. Aptameric biosensors
Abe et al. Aptamer sensors combined with enzymes for highly sensitive detection
Tombelli et al. Analytical applications of aptamers
KR20210018327A (ko) 단백질-폴리뉴클레오티드 접합체에 대한 검출 검정
Mascini Analytical applications of aptamers
Sharma et al. Nucleic Acid-Based Biosensors and Molecular Devices
Conforti et al. Aptamer-based technologies as new tools for proteomics in diagnosis and therapy

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1120568

Country of ref document: HK

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1120568

Country of ref document: HK

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20120704

Termination date: 20161210

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee