CN101186605A - 2-乙烯基-8-羟基喹啉衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一系列2-乙烯基-8-羟基喹啉衍生物,该类化合物的制备方法为将2-甲基-8-羟基喹啉和芳醛加入乙酸酐中溶解后,于120~140℃下加热回流反应40~96小时后结束反应,反应产物经柱层析分离纯化得到所述的纯2-乙烯基-8-羟基喹啉衍生物。本发明的2-乙烯基-8-羟基喹啉衍生物的抗氧化作用显著,优于能清除自由基的强力抗氧化剂谷胱甘肽GSH,其可应用于制备抗氧化剂。该类化合物还可促进骨髓间充质干细胞增殖,可应用于制备骨髓干细胞增殖促进剂。
Description
技术领域
本发明属于具有抗氧化活性和促进干细胞增殖的有机化合物的制备领域,特别涉及2-乙烯基-8-羟基喹啉衍生物及其制备方法和其作为抗氧化剂和骨髓干细胞增殖促进剂的应用。
背景技术
英国人Harman于1956年提出了自由基学说,认为自由基攻击生命大分子造成组织细胞损伤,是引起机体衰老的根本原因,也是诱发肿瘤等恶性疾病的重要起因。人体内的自由基分为氧自由基和非氧自由基。氧自由基占主导地位,大约占自由基总量的95%。氧自由基包括超氧阴离子(O2 -·)、过氧化氢分子(H2O2)、羟自由基(OH·)、氢过氧基(HO2 -·)、烷过氧基(ROO·)、烷氧基(RO·)、氮氧自由基(NO·)、过氧亚硝酸盐(ONOO-)、氢过氧化物(ROOH)和单线态氧(1O2)等,它们又统称为活性氧(reactive oxygen species,ROS),都是人体内最为重要的自由基。非氧自由基主要有氢自由基(H·)和有机自由基(R·)等。正常情况下,人的抗氧化防御***能清除自由基,使自由基的产生和清除保持平衡。当自由基的产生和清除失衡时,就会引起机体损伤。自由基可以引起多种人类疾病:阿尔兹海默症(AD,也称老年性痴呆)、帕金森氏症(PD)、中风、衰老、老年斑等;同时自由基还与病毒感染以及肿瘤生成、癌症转移等有相当密切的关系;此外,随着氧自由基及其介导的脂质过氧化反应在疾病中的作用研究的日趋深入,越来越多的证据表明,氧自由基参与心血管***多种生理病理过程,引发多种心血管疾病,如高血压、动脉血管硬化、心肌梗死、心肌病等。自由基在炎症发生和发展过程中也起了重要作用。医学研究指出:高血糖状态下产生大量的ROS,促进了糖尿病血管并发症,从而使致残率和致死率逐年上升。因此,研究和发现新的抗氧化药物可以深入至保肝、防治老年性痴呆、预防心血管疾病、抗炎、抗病毒等多种用途。
通过组织工程技术体外分离和培养所需的靶细胞用于体内相关疾病的细胞或组织替代治疗已为多种临床疾病的治疗提供了新的途径,骨髓间充质干细胞由于来源较广,取材较方便,可分化为骨、软骨、腱、肌肉、韧带、血管内皮、肝、神经、皮肤和脂肪等多种组织细胞,分离培养较为容易,且植入反应较弱易于控制,是一种良好的替代治疗的靶细胞。目前通过动物实验证实骨髓间充质干细胞单独应用可以较好的促进骨折愈合和软骨组织损伤修复,通过体外培养使其覆盖于陶瓷支架和碳纤维网等再植入患处效果更明显。国外还开展了将骨髓间充质干细胞用于治疗I型胶原基因突变导致的儿童骨发育不良的临床实验。骨髓间充质干细胞有可能成为一种新型的基因治疗的靶细胞,这样再与其多向分化潜能相结合,通过导入目的基因,将细胞治疗和基因治疗结合起来,对上述疾病的治疗无疑将有更广阔的前景。尽管骨髓样品易获取,但其中间充质干细胞含量较少,约占骨髓单个核细胞的10万分之一;而且扩增速度慢,这也成为导致人类很多重大疾病(如神经损伤,神经退行性疾病、心脏损伤、骨质疏松、再障等)的主要原因。因此,获得充足的骨髓间充质干细胞是研究和应用骨髓间充质干细胞治疗疾病的前提条件。
研制出具有抗氧化作用和促进干细胞增殖作用的新化合物对人类健康意义重大。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点,提供一系列2-乙烯基-8-羟基喹啉衍生物。
本发明的另一目的在于提供所述2-乙烯基-8-羟基喹啉衍生物的制备方法。
本发明的再一目的在于提供所述2-乙烯基-8-羟基喹啉衍生物在制备抗氧化剂或骨髓干细胞增殖促进剂中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现:所述2-乙烯基-8-羟基喹啉衍生物,其特征在于由下述通式表示:
其中,R=2-甲基-5-取代8-羟基喹啉()、3-取代-吲哚()、1-甲基-2-取代苯并咪唑()、1-取代-4-2’-(4’,5’二苯基咪唑基)苯()、3-取代-9-对甲苯基咔唑()、 3-取代-9(4’-甲氧基苯基)咔唑()、6-取代-3-(2’-乙烯基-8-羟基喹啉)-N-乙基咔唑()、2-溴-5-取代-噻吩()、2-(2’-溴-噻吩基)-5-取代-噻吩()、5-取代-2-羧基噻吩()3-取代菲()、2-取代芴()、1-取代-2-溴-4-氟苯(,)或者3-取代苯并噻吩(),上述不同R取代基的2-乙烯基-8-羟基喹啉衍生物依次编号为化合物1~14。
上述2-乙烯基-8-羟基喹啉衍生物的制备方法,其特征在于包括下述步骤:将2-甲基-8-羟基喹啉和芳醛加入乙酸酐中溶解后,所加入的2-甲基-8-羟基喹啉与芳醛的摩尔比为1∶2~6∶1,每毫摩尔2-甲基-8-羟基喹啉需要加入乙酸酐2~4.5mL,于120~140℃下加热回流反应40~96小时后结束反应,反应产物经柱层析分离纯化得到所述的纯2-乙烯基-8-羟基喹啉衍生物。
所述芳醛为2-甲基-5-甲酰基-8-羟基喹啉、3-甲酰基吲哚、1-甲基-2-甲酰基-苯并咪唑、2,4,5-三芳基咪唑醛、3-甲酰基-9-对甲苯基咔唑、3-甲酰基-9(4’-甲氧基苯基)咔唑、3,6-二甲酰基-N-乙基咔唑、5-溴噻吩-2-醛、2-(5’-溴噻吩基)-2-噻吩醛、5-甲酰基-2-羧基噻吩、菲醛、芴醛、1-甲酰基-2-溴-4-氟苯或者3-甲酰基苯并噻吩。
所述柱层析为硅胶柱层析。
本发明中2-位乙烯基-8-羟基喹啉衍生物通过初步药效学研究(亚油酸模型、DPPH模型、邻苯三酚模型和脱氧核糖-铁离子模型),结果显示这类化合物具有抗氧化活性和自由基清除活性,其作用优于体内重要的抗氧化剂谷胱甘肽,说明2-位乙烯基-8-羟基喹啉衍生物可应用于制备抗氧化剂。
本发明中以噻唑蓝(MTT)比色法作为细胞增殖指标,检测所合成的2-位乙烯基-8-羟基喹啉衍生物对骨髓间充质干细胞增殖的促进效应,各化合物能明显促进骨髓间充质干细胞增殖,并具有显著的剂量依赖性,表明2-位乙烯基-8-羟基喹啉衍生物可应用于制备骨髓干细胞增殖促进剂。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果:
1、提供了系列新型的简单且容易制备的2-乙烯基-8-羟基喹啉衍生物,并将其应用于抗氧化和促进干细胞增殖。
2、这种2-乙烯基-8-羟基喹啉衍生物的抗氧化作用显著,优于能清除自由基的强力抗氧化剂谷胱甘肽GSH。
附图说明
图1为化合物10与对照物GSH,GSSG清除·O2自由基的作用图。
图2为化合物1~3、化合物5~7、化合物10、化合物13与对照物BHA清除OH自由基的作用图。
图3为化合物2、化合物3及对照物GSH,GSSG清除DPPH自由基的作用图。
图4为化合物1~3和对照物GSH抗脂质过氧化作用图。
图5为化合物2促进干细胞增殖作用图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述,但发明的实施方式不限于此。
实施例1
2″-[2′-5-(2-甲基-8-羟基喹啉)-乙烯基]-8″-羟基喹啉(化合物1)的制备
称取2.340g 2-甲基-5-甲酰基-8-羟基喹啉和1.790g 2-甲基-8-羟基喹啉溶于35mL乙酸酐,搅拌,使其完全溶解,在N2保护下,于130℃加热回流反应40h。反应过程中用薄层层析法对反应进行监控,结束反应,冷却到室温,然后将反应混合液倒入50mL的冰水中,搅拌3~4h,倾出上层清液,得到棕黑色粘稠状沉淀,用石油醚/乙酸乙酯(V∶V=9∶1)做洗脱剂进行硅胶柱层析分离,得到纯的目的产物1.325g,产率32.3%。m.p.187~189℃。Rf=0.45(V石油醚/V乙酸乙酯=3∶1)。ESI-MSm/z:329.4(M+H)。IR(KBr)v(cm-1):3410.37,2925.50,1631.78,1592.55,1501.37,1462.00,1202.20,1181.52。1H NMR(CDCl3,400 MHz)δppm:8.52(d,1H,J=8.68Hz,Ar-H),8.33(d,1H,J=15.88Hz,CH=CH),8.12(d,1H,J=8.52Hz,Ar-H),7.84(d,1H,J=8.04Hz,Ar-H),7.63(d,1H,J=8.52Hz,Ar-H),7.39(t,2H,J=7.84Hz,Ar-H),7.30(d,1H,J=15.92Hz,CH=CH),7.29(d,1H,J=8.56Hz,Ar-H),7.15-7.18(m,2H,Ar-H),2.74(s,3H,CH3)。
实施例2
2″-[2′-3-(1-氢-吲哚)-乙烯基]-8″-羟基喹啉(化合物2)的制备
称取0.795g 2-甲基-8-羟基喹啉和0.725g 3-甲酰基吲哚溶于20mL乙酸酐,在N2保护下,于125℃磁力搅拌回流反应40h。冷却后,将反应混合液倒入250mL的冰水中,搅拌过夜,得到的棕色沉淀用蒸馏水洗涤,再用石油醚/乙酸乙酯(V∶V=8∶1)做洗脱剂进行硅胶柱层析分离,得到0.61g 2″-[2′-3-(1-乙酰基-吲哚)-乙烯基]-8″-羟基喹啉乙酸酯,产率32.8%。m.p.194~196℃。UV(DMF)λmax:306 nm,361nm。1H NMR(CDCl3,400MHz)δppm:2.577(s,3H),2.686(s,3H),7.425(m,4H),7.670(m,3H),7.817(d,J=16.4Hz,1H),7.958(d,J=7.6Hz,1H),8.134(d,J=8.4Hz,1H),8.483(d,J=7.6Hz,1H)。IR(KBr)v(cm-1):3050.34(芳环上C-H伸缩振动);1746.05,1641.81(C=O);1615.44(C=C键伸缩振动);1590.51,1449.64(芳环骨架伸缩振动);1123.90(C-O伸缩振动);976.60(烯烃双键的C-H反式振动)。ESI-MS m/z(%):371.24[(M+H)+,100],329.34[M+H-42)+,40]。
将0.555g 2″-[2′-3-(1-乙酰基-吲哚)-乙烯基]-8″-羟基喹啉乙酸酯(0.0015mol)溶解在15mlN,N-二甲基甲酰胺中,加热至80℃。在溶液中加入15ml浓盐酸,在80~90℃反应5h。反应完毕后除去水,再加入15ml三乙胺加热到70~80℃搅拌4h。冷却后倒入100mL冰水,得到黄色沉淀用蒸馏水洗涤,再用硅胶柱柱层析分离,用石油醚/乙酸乙酯(V∶V=10∶1)做洗脱剂进行硅胶柱层析分离,得到目的产物0.48 g,产率86%。m.p.181~182℃。UV(DMF)λmax:326nm,364nm。1H NMR(DMSO,400MHz)δppm:7.327(s,2H),7.483(s,2H),7.582(s,2H),7.979(d,2H),8.259(s,1H),8.443(s,1H),8.520(d,J=16Hz,1H),8.779(d,J=8.4Hz,1H)。IR(KBr)v(cm-1):3168.87(N-H伸缩振动),3 043.51,(芳环上C-H伸缩振动);1633.74(C=C键伸缩振动);1575.93,1521.33,1446.25(芳环骨架伸缩振动);1127.43(C-O伸缩振动);ESI-MS m/z(%):287.35[(M+H)+,100],286.53[M+,24]。
实施例3
2″-[2′-2-(1-甲基-苯并咪唑)-乙烯基]-8″-羟基喹啉(化合物3)的制备
将0.795 g 2-甲基-8-羟基喹啉和0.80g1-甲基-2-甲酰基-苯并咪唑溶于20ml乙酸酐,在氮气保护下,于130℃磁力搅拌回流反应48h。冷却后倒入250ml冰水搅拌过夜,得到黄色沉淀,用蒸馏水洗涤后,用石油醚/乙酸乙酯(V∶V=3∶1)做洗脱剂进行硅胶柱层析分离得到目的产物0.692g,产率46%。m.p.207~208℃。UV(DMF)λmax:321nm,367nm。1H NMR(CDCl3,400MHz)δppm:8.183(d,J=8.4Hz,1H),8.128(d,J=15.2Hz,1H),7.890(d,J=16.0Hz,1H),7.817(m,1H),7.618(d,J=8.4Hz,1H),7.455(t,J=7.6Hz,1H),7.392(m,1H),7.333(m,3H),7.207(d,J=8.8Hz,1H),1.591(S,3H)。IR(KBr)v(cm-1):34 07.75(O-H伸缩振动);1637.87(C=C键伸缩振动);1557.56,1464.87(芳环骨架伸缩振动);1122.22(C-O伸缩振动);955.86(烯烃双键的C-H反式振动)。ESI-MS m/z(%):302.35[M+H)+,100]。
实施例4
2″-[4′-2-(4,5-二苯基-1-氢-咪唑)-苯乙烯基]-8″-羟基喹啉(化合物4)的制备
称取0.954g(6mmol)的2-甲基-8-羟基喹啉和1.95g(6mmol)的2,4,5-三芳基咪唑醛,放入到三口烧瓶中,然后再向三口瓶中加入25mL的乙酸酐使其完全溶解,在氮气保护,搅拌下加热至125℃使其回流反应约40h,反应过程中用薄层色谱分析跟踪反应,反应结束后,待冷却到室温,将其倒入100ml冰水中,搅拌,离心分离得暗绿色沉淀。用石油醚/乙酸乙酯(V∶V=4∶1)做洗脱剂进行硅胶柱层析分离,得到0.95g黄色固体即化合物4,产率:34%。Rf=0.22(乙酸乙酯/石油醚=3∶8,V/V)。ESI-MS m/z:467[M+H]。IR(KBr)v(cm-1):3342.28(O-H伸缩振动),3049(芳环上C-H伸缩振动),1623.94(C=C键伸缩振动),1506.72(芳环骨架伸缩振动),968.51(烯烃双键的C-H反式振动),836.42,766.45,697.62。1HNMR(CDCl3,400MHz)δppm:12.85(s,1H),8.32(d,J=8.4 Hz,1H),8.19(t,d=8Hz,3H),7.84(d,J=13.5Hz,1H),7.82(d,J=13.5 Hz,1H),7.59-7.33(m,14H),7.11(d,J=7.2Hz,1H)。
实施例5
3″,6″-[二-(2′-2-乙烯基-8-羟基喹啉)]-N-乙基咔唑(化合物7)的制备
称取0.50g(2.0mmol)3,6-二-甲酰基-N-乙基咔唑和1.89g(12.0mmol)2-甲基-8-羟基喹啉,溶于25mL乙酸酐中,搅拌,使化合物完全溶解,在氮气保护下,加热至130℃回流反应4天。待其冷却后,将反应混合物倾入200mL的冰水中,搅拌,得到的黑色沉淀用石油醚/乙酸乙酯(V∶V=5∶1)做洗脱剂进行硅胶柱层析分离,得目的产物0.32g,Rf=0.56(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=5∶3),产率28%。m.p.210~212℃。1HNMR(DMSO,400 MHz)δppm:1.37(t,J=7.2Hz,3H,-CH3),4.48-4.53(m,2H,-NCH2-),7.10(d,J=7.6Hz,2H,芳环上H),7.34-7.39(m,2H,芳环上H),7.53(d,J=16.0Hz,2H,C=C双键上H),7.72(d,J=8.8Hz,2H,ArH),7.80(d,J=8.0Hz,4H,ArH),7.88-7.89(m,4H,ArH),8.30(t,J=16.0Hz,C=C双键上H),9.50(s,H,-OH)。IR(KBr)v(cm-1):3387,2925,1621,1591,1512 cm-1。ESI-MS m/z(%):534[(M+H)+,61.65.],535(50.72),579(100)。元素分析C36H27N3O2:计算值为C 81.03,H5.10,N 7.87;实测值为:C 80.80,H 5.12,N 7.90。
实施例6
2″-[2′-2-(5-溴噻吩)-乙烯基]-8″-羟基喹啉(化合物8)的制备
称取0.764g(4mmol)2-甲基-8-羟基喹啉,0.645g(4mmol)5-溴噻吩-2-醛,放入到三口烧瓶中,然后再向三口瓶中加入15mL乙酸酐使其完全溶解,在氮气保护,搅拌加热至134℃使其回流反应约42h,反应过程中用薄层色谱跟踪反应,待反应物冷却后,将其倒入100ml冰水中搅拌过夜。离心分离得黄色沉淀。用乙酸乙酯/石油醚作为洗脱剂(1∶50 v/v)进行硅胶柱层析分离,得到0.39 g黄色针状物质即化合物8,Rf=0.42(乙酸乙酯/石油醚=1∶5),产率30%。m.p.151~152℃。IR(KBr)v(cm-1):3351(vO-H);3042,3003(vAr-H),1630-1548(vC=C,vC=N)。1HNMR(CDCl3,400 MHz)δppm:8.08(d,J=8.4 Hz,1H),7.73(d,J=15.6Hz,1H),7.382(t,1H),7.502(d,J=8.8Hz,1H),7.267(d,J=7.2Hz,1H),7.158(d,J=7.6Hz,1H),6.993(m,3H)。ESI-MS m/z(%):334.51(100)[M+2]+,252.57[M-79]+。
实施例7
2-{2″-[2′-5′-(2-5-溴噻吩)噻吩]-乙烯基}-8-羟基喹啉(化合物9)的制备
称取0.764g(4mmol)2-甲基-8-羟基喹啉,0.68g(4mmol)2-(5’-溴噻吩基)-2-噻吩醛,放入到三口烧瓶中,然后再向三口瓶中加入15mL乙酸酐使其完全溶解,在氮气保护下,搅拌加热至138℃使其回流反应约40h,反应过程中用薄层色谱跟踪反应,待反应物冷却后,将其倒入100ml冰水中搅拌过夜,离心分离得黄色沉淀,用乙酸乙酯/石油醚作为洗脱剂(1∶25v/v)进行硅胶柱层析分离,得到0.168g黄色物质即化合物9,Rf=0.76(乙酸乙酯/正己烷=2∶5),产率10%。IR(KBr)v(cm-1):3342.28(vO-H),3049(vAr-H),1653-1465(vC=C,vC=N)。1HNMR(CDCl3,400 MHz)δppm:8.106(dJ=8.4Hz,1H),7.810(d,J=15.6Hz,1H),7.542(d,J=8.4Hz,1H),7.391(t,1H),7.258(m,1H),7.126(m,4H),6.917(m,2H)。ESI-MSm/z(%):414.5(100)[M]+,336.55[M-79]+。
实施例8
2″-[2′-2-(5-羧基噻吩)-乙烯基]-8″-羟基喹啉(化合物10)的制备
本实施例除下述特征外同实施例3:将0.80g 2-甲基-8-羟基喹啉和0.69g 2-(5’-溴噻吩基)-2-噻吩醛溶于20mL乙酸酐中,所得到黄色固体产物为1.37g,产率为93%。m.p.217~218℃。UV(DMF)λmax:322,368nm。1H NMR(DMSO,400(MHz)δppm:9.533(s,1H),8.300(d,1H,J=15.6),8.238(d,1H,J=8.8),7.712(d,1H,J=8.4),7.670(d,1H,J=4),7.347(m,4H),7.059(d,1H,J=7.6);IR(KBr)v(cm-1):3388.84-255 1.84(游离羧酸O-H伸缩振动);1611.58(C=C键伸缩振动);1574.01,1505.80,1455.43(芳环骨架伸缩振动);1159.97(C-O伸缩振动);947.31(烯烃双键的C-H反式振动)。ESI-MS m/z(%):296.31[M+H+,100]。
实施例9
2″-(2′-2-芴基-乙烯基)-8″-羟基喹啉(化合物12)的制备
称取1.431g(9mmol)2-甲基-8-羟基-喹啉和1.746g(9mmol)芴醛,溶解在30ml乙酸酐中,搅拌,溶解,在N2保护下,加热至135℃使其回流反应40h,反应过程中用薄层色谱对反应进行监控,结束反应,待冷却到室温,将其倒入100ml冰水中,搅拌,产生粘稠状固体粘在玻璃壁上,洗涤多次,得到棕黑色粘稠状沉淀物,用石油醚/乙酸乙酯(V∶V=18∶1)做洗脱剂进行硅胶柱层析分离,得到1.62g 2-[(2’-芴基)-乙烯基]-8-乙酰氧基喹啉,淡黄色固体,Rf=0.50(乙酸乙酯/石油醚=1/3,V/V),产率51%。m.p.164~166℃;IR(KBr)v(cm-1):3040.32,1683.76,1633.05,1555.06;ESI-MS m/z(%):378.2[(M+1)+,100],376.1[(M-1)+,30];1H NMR(CDCl3,400MHz)δppm:8.15(d,J=8.94Hz,1H),7.65(d,J=8.70Hz,2H),7.58(d,J=7.2Hz,1H),7.178(d,J=6.4Hz,1H),7.30-7.34(m,2H),7.38-7.48(m,3H),7.79-7.85(m,4H),3.97(s,2H),2.61(s,3H)。元素分析C26H19NO2: 计算值为:C,82.74;N,3.71;H,5.07。实测值为:C,82.80;N,3.70;H,5.05。
称取0.754g(2mmol)的2-[(2’-芴基)-乙烯基]-8-乙酰氧基喹啉,溶解在20ml DMF中,搅拌,使其完全溶解,溶液呈黄色,升温至125℃,溶液变为无色。向溶液中加入浓度为36%~38%的浓盐酸3ml,溶液中立刻出现橘红色沉淀,逐渐升温至150℃,溶液变为悬浊液,再向沸腾的悬浊液中加入0.75g(5mmol)的三乙胺,悬浊液立即变为澄清,在此温度下继续反应2h。停止反应,冷却至室温,将其倒入50ml冰水中,搅拌,立刻出现黄色沉淀,离心分离出沉淀,得到黄色的2-[(2’-芴基)-乙烯基]-8-羟基喹啉,用石油醚/乙酸乙酯(V∶V=20∶1)做洗脱剂进行硅胶柱层析分离,得到纯的目的产物0.60g,产率80%,Rf=0.45(乙酸乙酯/石油醚=1/5,V/V),m.p.160~162℃,UV-vis(THF)λmax:368nm,319nm;IR(KBr)v(cm-1):3407.69,3050.32,2927.29,1633.02,1555.06;ESI-MSm/z(%):337.40[(M+1)+,25],336.39[M+,100];1H NMR(CDCl3,400MHz)δppm:8.13(d,J=8.80Hz,1H,),7.67(d,J=8.80Hz,2H),7.58(d,J=7.2Hz,1H),7.178(d,J=6.4Hz,1H),7.28-7.36(m,2H),7.38-7.48(m,3H),7.79-7.85(m,4H),3.97(s,2H)。元素分析C24H17NO:计算值为C,85.94;N,4.18;H,5.11。实测值为:C,85.90;N,4.20;H,5.15。
实施例10
2-乙烯基-8-羟基喹啉衍生物对·O2自由基的清除
采取邻苯三酚自氧化法,其作用原理如下:邻苯三酚在碱性条件下迅速自氧化,自氧化过程中产生·O2,·O2加速邻苯三酚自氧化速率,同时生成有色中间产物,中间产物的积累在滞后30~45s与时间成良好的线性关系,一般维持4min左右,随后减慢。有色产物在325nm有强烈的光吸收。由于自氧化速率依赖于·O2的浓度,清除·O2则抑制自氧化反应,阻止中间产物的积累,从而评价受试物清除·O2的能力。
将2-乙烯基-8-羟基喹啉衍生物用95%乙醇溶解,配成10mg/6mL溶液。取xμL(x=0、2、5、10、20、30、40)样品液,加入到(1475-x)μL Tris-HCl缓冲液中(0.05mol/L,pH8.2,含1mmol/L EDTA),若有细微颗粒,过微孔滤膜,再加25μL连苯三酚溶液,迅速混合,开始计时。从60秒开始,此后,每隔30秒读数一次A值(325nm),到300秒为止。以Tris-HCl缓冲液为空白,0μL样品液为阳性对照组。每个样设六个浓度,每个浓度测三个平行样,取平均值。样品的抑制率依下式计算:
实验样品对自由基有不同程度的清除作用,并呈明显的量效关系,且优于对照物氧化型谷胱甘肽GSSG和还原型谷胱甘肽GSH。其中实施例8中化合物10清除·O2自由基效果如附图1所示,半有效清除浓度为14.9ug/ml,比还原型谷胱甘肽的半有效清除浓度16.1ug/ml低。由此可见,2-位乙烯基8-羟基喹啉衍生物对·O2自由基具有良好的清除效果。
实施例11
2-乙烯基-8-羟基喹啉衍生物对·OH自由基的清除
采用脱氧核糖分析法评价2-乙烯基-8-羟基喹啉衍生物对·OH自由基的清除能力,用Fe3+-EDTA-抗坏血酸-过氧化氢体系产生·OH。此方法中脱氧核糖作为·OH的攻击靶。脱氧核糖受·OH攻击后裂解,在酸性、加热的条件下可与硫代巴比妥酸反应生成红色化合物,可用分光光度计在532nm处测定吸光值。
本实验所用的水均为脱氧蒸馏水。将2-乙烯基-8-羟基喹啉衍生物用95%乙醇溶解,配成100mg/mL溶液。样品液均取0.01mL,加入到0.49mL的KH2PO4-Na2HPO4缓冲液(0.2mol/L,pH7.4)中,再依次加入:0.1mL Na2EDTA溶液(1.0mmol/L)、0.1mL FeCl3溶液(1.0mmol/L)、0.1mL维生素C溶液(1.0mmol/L)、0.2mL H2O2溶液(12.0mmol/L)、0.2mL脱氧核糖溶液(20.0mmol/L),共1.2mL。于50℃水浴20min,取出,冷却。再加0.1mL三氯乙酸(TCA)溶液(5g/100mL),0.1mL硫代巴比妥酸(TBA)溶液(1%,W/V,内含100mmol/LNaOH)。沸水浴中加热15min,显色。在530nm处测A值,以KH2PO4-Na2HPO4缓冲液为空白。叔丁基羟基茴香醚(BHA)为阳性对照组。每个样设六个浓度,每个浓度测三个平行样,取平均值。依下式计算抑制率:
抑制率%=(A0-A)/A0×100
式中,A0为0mL样品液时所测A值,A为0.01mL样品液时所测A值。
结果表明,2-乙烯基-8-羟基喹啉衍生物均具有清除·OH自由基的能力,且在浓度为0.83ug/ml时化合物5和化合物6的抑制率分别为78.2%和77.2%,高于对照物叔丁基羟基茴香醚(BHA)此浓度下的抑制率52.5%。其中优选的实施例1~3,实施例5~8中所述的化合物1~3、化合物5~7、化合物10、化合物13与对照物BHA清除OH自由基的作用图如附图2所示。
实施例12
2-乙烯基-8-羟基喹啉衍生物对DPPH·自由基的清除
DPPH(1,1-二苯基苦基苯肼,1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl)为一种稳定的以氮为中心的自由基,通过检测生物试剂对DPPH自由基的清除能力可以表示其抗氧化能力的强弱。一般若分子结构中不含氢供体的官能团,则不表现清除DPPH自由基的活性。
2-乙烯基-8-羟基喹啉衍生物用95%乙醇溶解,配成10mg/6mL溶液。取DPPH1mg溶于24mL95乙醇溶剂中,超声振荡5min,充分振摇,使上下各部分均匀。避光保存。在1mLDPPH溶液中,加入不同量的样品液,再加95%乙醇使混合液总体积为1.5mL。混合,在室温下静置30分钟,于519nm处测A值。以95%乙醇为空白调零。样品对DPPH自由基的清除率依下式计算:清除率=[1-(A-A样)/A0]×100%。式中:A0为未加样时DPPH自身的A值;A样为未加DPPH时,样品自身的A值;A为样品加DPPH的A值。每样设六个浓度,每个浓度测三个平行样,取平均值。
结果表明,2-乙烯基-8-羟基喹啉衍生物均表现出很强的清除DPPH自由基活性,在浓度较低时,存在明显的量效关系。与阳性对照GSH半有效抑制浓度64.1ug/ml相比,化合物1、化合物2、化合物8明显下降,分别为11ug/ml、32ug/ml和61ug/ml。其中如实施例2,3中所述化合物2、化合物3及对照物GSH,GSSG清除DPPH自由基的作用图如图3所示。
实施例13
2-乙烯基-8-羟基喹啉衍生物的抗脂质过氧化作用
采用亚油酸的硫氰酸铵分析法,其作用原理如下:亚油酸是多不饱和脂肪酸,能够发生自动氧化,生成不稳定的氢过氧化物。氢过氧化物能够将Fe2+氧化成Fe3+,Fe3+与硫氰酸铵反应,生成的硫氰酸铁在500nm处有强吸收,如果被测物具有抗氧化活性,它就能够延缓或抑制体系中过氧化物的产生,影响显色物质的生成,通过500nm吸光度的变化,就能表示被测样品抗氧化活性的强弱。
将2-乙烯基-8-羟基喹啉衍生物用95%乙醇(或DMF)溶解,配成5mg/6mL溶液。取208.4mg亚油酸加52.1mg Tween20,溶于20mL30%乙醇(V/V)中,混合,用超声波振荡3分钟,得均匀亚油酸乳液(20mmol/L)。取1500μL亚油酸乳液,加入xμL(x=0、40、80、120、160、200、300)样品液,再加入(500-x)μL水,使总反应体积为2000μL,混合后,室温敞口静置72小时。取150μL反应液,加3650μL75%乙醇(V/V)以终止反应。再加100μLNH4SCN溶液(30g/100mL)、100μL FeSO4溶液(0.02mol/L,用3.6%HCl配制)静置3min,充分显色后。在500nm处,测A值。以75%乙醇为空白。每一个样一般设六个浓度,每个浓度测三个平行样,取平均值。
抑制率%=(A0-A)/A0×100
式中,A0为0μL样品液时所测A值,A为样品液所测A值。
结果表明,2-乙烯基-8-羟基喹啉衍生物具有不同程度的抗脂质过氧化作用,都明显强于阳性对照GSH。其中如实施例1~3所述的化合物1~3和对照物GSH抗脂质过氧化作用图如附图4所示。
实施例14
MTT法测定对鼠骨髓间充质干细胞增殖作用
将大鼠骨髓用低糖达氏修正依氏培养基(L-DMEM)冲出,充分混匀,转入离心管,300g离心10min,去上清,D-Hanks液重悬,离心去上清后,加4ml D-Hanks液混匀。Percoll贮存液按0.56∶0.44混合,取4ml放入10ml离心管内,吸骨髓液在离液面2cm处贴管壁缓缓加入。水平离心机900g离心30min,收集单核细胞层,用达氏修正依氏培养基(DMEM)洗涤两次。然后计数细胞,调整密度,按1×106/cm2密度接种,37℃、5%饱和湿度的CO2孵箱培养,培养液为含10%胎牛血清(FBS)的L-DMEM,3d后更换培养液,弃去未贴壁细胞,2-3d换液1次,接近融合的骨髓间充质干细胞(MSC)用含0.1mmol/LEDTA的0.25%胰酶室温消化2-3min,按1×104/cm2传代,传至第3代得到1×107/cm2个细胞。将骨髓间充质干细胞以1×108/L密度接种于用96孔培养板中,37℃、5%CO2孵箱中培养至细胞贴壁,加入2-乙烯基-8-羟基喹啉衍生物,使之终浓度分别为0.15,0.30mg/ml,每一浓度重复5孔。37℃、5%CO2孵箱中培养72小时,每孔加入四甲基偶氮唑盐MTT(5mg/ml)20μL,继续培养4小时。吸弃培养基,加入DMSO150μL,振摇10min。用酶标仪检测各组细胞490nm处的OD吸光值,以490nm处的OD值代表细胞活力,并以0mmol/L药物作为空白对照组,不含细胞的药物组为阳性对照组,所得数据用均数±标准(X±S)表示,采用方差分析,作图。
由于2-乙烯基-8-羟基喹啉衍生物自身有紫外吸收,引入阳性对照组,如果吸光度大于阳性对照组及空白对照组则表明该物质能促进干细胞增殖。结果表明,2-乙烯基-8-羟基喹啉衍生物能促进鼠骨髓间充质干细胞体外增殖,且与空白对照组相比具有显著性差异(p<0.001)。其中实施例2中的化合物2促进干细胞增殖作用效果图如图5所示,两个浓度下在490nm处吸光度均强于空白对照组和阳性对照组的吸光度,表明化合物具有干细胞促进作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
2.权利要求1所述的2-乙烯基-8-羟基喹啉衍生物的制备方法,其特征在于包括下述步骤:将2-甲基-8-羟基喹啉和芳醛加入乙酸酐中溶解后,所加入的2-甲基-8-羟基喹啉与芳醛的摩尔比为1∶2~6∶1,每毫摩尔2-甲基-8-羟基喹啉需要加入乙酸酐2~4.5mL,于120~140℃下加热回流反应40~96小时后结束反应,反应产物经柱层析分离纯化得到所述的纯2-乙烯基-8-羟基喹啉衍生物。
3.根据权利要求2所述的2-乙烯基-8-羟基喹啉衍生物的制备方法,其特征在于:所述芳醛为2-甲基-5-甲酰基-8-羟基喹啉、3-甲酰基吲哚、1-甲基-2-甲酰基-苯并咪唑、2,4,5-三芳基咪唑醛、3-甲酰基-9-对甲苯基咔唑、3-甲酰基-9(4’-甲氧基苯基)咔唑、3,6-二甲酰基-N-乙基咔唑、5-溴噻吩-2-醛、2-(5’-溴噻吩基)-2-噻吩醛、5-甲酰基-2-羧基噻吩、菲醛、芴醛、1-甲酰基-2-溴-4-氟苯或者3-甲酰基苯并噻吩。
4.根据权利要求2所述的2-乙烯基-8-羟基喹啉衍生物的制备方法,其特征在于:所述柱层析为硅胶柱层析分离。
5.权利要求1所述的2-乙烯基-8-羟基喹啉衍生物在制备抗氧化剂中的应用。
6.权利要求1所述的2-乙烯基-8-羟基喹啉衍生物在制备骨髓干细胞增殖促进剂中的应用。
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