CN101169403B - 一种微流控芯片及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微流控芯片，具体地说是一种微流控芯片及其制备和作为固相萃取柱的应用，芯片由上、下二层基片封接而成，其上层基片设有进样口、出样口及微通道，在上层基片的微通道上设有微粒引入通道及其入口，在微粒引入通道的入口与进样口和出样口之间分别设有坝结构，二个坝结构形成了一双围堰式结构，二个坝结构之间的微通道形成填充柱床通道；在下层基片对应于坝结构的位置分别设有微通道，坝结构的顶面与下层基片的微通道间存有缝隙；所述缝隙的深度小于上层基片中微通道的深度。本发明的主要优点是：制作简便、快速、重复性好，适用范围广，应用效果好。
Description
技术领域
本发明涉及微流控芯片，具体地说是一种微流控芯片及其制备和作为固相萃取柱的应用。
背景技术
固相萃取(SPE，或称液-固萃取)，是指利用选择性吸附和选择性脱附的分离原理，纯化或浓集液态样品中的微量组分的过程。固相萃取(SPE)技术广泛应用于分离/纯化、浓缩或富集痕量被测物、除去干扰物(如盐等)，提高被测物的浓度和检测灵敏度，是一种常用的样品预处理方法。SPE技术的微型化，即微流控芯片SPE技术，是指利用芯片微加工技术所形成的微通道结构以及微阀/微泵等控制单元，在微流控芯片平台上完成SPE操作的一种微型化样品处理技术。芯片SPE技术具有许多常规SPE技术所不及的优点，比如速度快、样品/试剂消耗低、可与其他操作单元集成、可阵列化等，是实现微全分析***(μ-TAS)的一种必不可少的操作单元。
目前，已经出现了多种形式的基于微流控芯片的SPE方法，不仅应用于小分子的分离/富集，而且已应用到蛋白质、核酸等大分子的分析中。根据固相萃取柱的不同制作方法，这些基于微流控芯片的SPE方法可分为开口管柱、填充柱、整体柱芯片SPE方法三种类型。比如文献[1KutterJ P，Jacobson S C，Ramsey J M.J Microcolumn Sep.2000，12：93-97。2BroylesB C，Jacobson S C，Ramsey J M.Anal.Chem.2003，75：2761-2767。]报道在芯片通道内壁涂渍C18硅烷作为开口管柱SPE固定相，用于萃取和富集小分子。该芯片固相萃取柱的制作相对简单；但较小的比表面积导致其固定相负载容量偏低，因而在一定程度上限制了其在芯片SPE技术上的应用。为提高固定相的比表面积，采用特殊的微加工技术，可在芯片制作过程中直接在通道内形成特殊的微结构，用以阻挡填充的固定相微粒，从而形成填充型固相萃取柱[3 Oleschuk R D，Shultz-Lockyear L L，Ning Y，et al..Anal.Chem.2000，72：585-590。4Jemere A B，Oleschuk R D，Ouchen F，et al..Electrophoresis2002，23：537-3544。]。由于填充柱萃取效率较高，可利用的填料种类多且填充过程相对简单，可利用电渗流或压力引入填充微粒，而且可通过反压冲出使用过的填充微粒，从而可不断更新填充柱。但该方法采用“差异刻蚀”法制作芯片中的双围堰式微结构，需要在同一芯片表面连续两次进行光刻/蚀刻过程，制作难度大、周期长、成本高，仍然限制了其广泛应用。通过光引发[5Yu C，Davey M H，Svec F，Frechet J M J.Anal.Chem.2001，73：5088-5096。]和热诱导[6Wolfe K A，Breadmorel M C，FerranceJ P，et al..Electrophoresis 2002，23：727-733。7Breadmore M C，Wolfe K A，Arci bal I G，et al..Anal.Chem.2003，75：1880-1886。]等方式在芯片通道内发生聚合反应，形成整体柱固定相，不仅丰富了芯片SPE固定相的种类，而且避免了复杂微加工技术的使用。虽然该方法发展较快，但由于聚合反应体系有限，同时有机聚合物整体柱对有机溶剂的耐受性较差，而热诱导聚合的整体柱在微通道内定位较难，使其很难成为一种通用的芯片SPE方法。
发展一种简便易行而通用性好的芯片SPE柱制作方法，不仅为芯片SPE技术的广泛使用提供更多的可能，而且为其进一步集成化打下良好的基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微流控芯片及其制备和应用，其制作方法简便、快速、重复性好，无需任何复杂的芯片微加工技术；同时，作为SPE柱应用时可不断更新使用，从而进一步降低使用成本；适用范围广，应用效果好。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种微流控芯片，芯片由上、下二层基片封接而成，其上层基片设有进样口、出样口及微通道，在上层基片的微通道上设有微粒引入通道及其入口，在微粒引入通道的入口与进样口和出样口之间分别设有坝结构，二个坝结构形成了一双围堰式结构，二个坝结构之间的微通道形成填充柱床通道；在下层基片对应于坝结构的位置分别设有微通道，坝结构的顶面与下层基片的微通道间存有缝隙；所述缝隙的深度小于上层基片中微通道的深度。
所述微流控芯片的制作方法，采用“双面刻蚀/对准”的芯片制作方法，将设计好的上、下两层基片结构制成掩膜，按照标准的玻璃光刻/湿法刻蚀工艺刻蚀出所需图案，刻蚀好的上层基片用超声波打孔器在所需位置打孔，清洗后，两玻璃基片在显微镜下对准，使上层基片中的坝结构和下层基片中微通道的中心垂直线重合，从而形成含有双围堰式结构的连续通道；然后将对准的芯片依次放入真空烘箱和程序控温炉中进行贴合和热键合，即可得到所需的微流控芯片。
通过微粒引入通道在芯片的填充柱床通道中填入各种大小和种类的固定相微粒，采用可逆的方式密封微粒引入通道的入口，即形成芯片SPE柱。
所述芯片的缝隙深度应小于所填充固定相微粒的最小直径；芯片材料可为硅、石英、玻璃、各种聚合物或它们的复合体。
本发明具有如下优点：
1.本发明在芯片微通道内制作出双围堰式结构，其围堰深度可控且小于所填充微粒的最小直径；双围堰式结构可阻挡微粒的的流失并将其固定在填充柱床范围内；本发明固相萃取芯片中，微粒引入通道的入口采用可逆密封的方式，使SPE柱中的固定相微粒可实现不断更新。
2.制作方法简单。芯片由刻有不同深度的上、下两层基片对准并封接而成，上片含有两个未被刻蚀的坝结构，下片含有两个深度可控的连接通道；两片对准并封接后，坝结构完全位于连接通道的范围内，形成含有双围堰式结构的连续通道。
3.本发明采用上、下两层基片同时刻蚀/对准的芯片加工方法，在芯片微通道内制作双围堰式结构，下层基片的刻蚀深度可控，使其围堰深度小于所填充微粒的最小直径；通过微粒引入通道填充固定相微粒时，该双围堰式结构即可阻挡微粒的的流失，从而将其固定在填充柱床范围内，并形成芯片SPE柱。
4.本发明中用于填充的微粒适用于不同种类和大小的色谱固定相。
附图说明
图1为微流控芯片固相萃取柱的结构示意图，其中1为进样口，2为出样口，3为微粒引入通道的入口，4为双围堰式结构，5为填充柱床通道；
图2分别为上、下两层基片的结构示意图；
图3为上层基片刻蚀并打孔后的截面示意图，其中1、2分别为进样口和出样口，4为未被刻蚀的坝结构，5为填充柱床通道；
图4为下层基片刻蚀后的截面示意图，其中6为深度可控的连接通道；
图5为上、下两层基片对准并封接后的截面示意图；
图6为填充固定相微粒后芯片SPE柱的截面图；
图7为λ-DNA芯片固相萃取所得萃取效率的结果图；
图8为用芯片SPE方法所得DNA样品的PCR扩增产物的芯片电泳图。
具体实施方式
实施例1
如图1所示，一种微流控芯片，芯片由上、下二层基片封接而成，其上层基片设有进样口1、出样口2及微通道，在上层基片的微通道上设有微粒引入通道及其入口3，在微粒引入通道的入口3与进样口1和出样口2之间分别设有坝结构，二个坝结构形成了一双围堰式结构4，二个坝结构之间的微通道形成填充柱床通道5；在下层基片对应于坝结构的位置分别设有微通道，坝结构的顶面与下层基片的微通道间存有缝隙；所述缝隙的深度小于上层基片中微通道的深度。
微流控芯片SPE柱的制作(以玻璃芯片SPE柱的制作为例)：将设计好的上、下两层基片(如图2所示)分别制成掩膜，按照标准的玻璃光刻/湿法刻蚀工艺刻蚀出所需图案(如图3、图4所示)，其中上、下两片的刻蚀深度分别为70μm和4μm，微粒引入通道的长度和宽度分别为3mm和160μm；刻蚀好的上层基片用超声波打孔器在相应位置打孔；经过严格的清洗过程后，两片在显微镜下对准，使上片中的坝结构和下片中的连接通道的中心垂直线基本重合(如图5所示)，从而形成含有双围堰式结构的连续通道；然后将对准好的芯片依次放入真空烘箱和程序控温炉中进行贴合和热键合，即可得到所需的玻璃芯片。
本发明固相萃取芯片中，双围堰式结构的围堰深度也可以为其他值，只要控制围堰深度小于微粒的直径；微粒引入通道的长度和宽度也可以为其他值。
在制得含有双围堰式结构的芯片后，采用如下方法制作芯片SPE柱：将混有固定相微粒(直径5μm的未改性硅胶)的悬浮液加在微粒引入通道的入口3，然后在进样口1和出样口2加上真空，抽几分钟后即可填满柱床，随后在微粒引入通道的入口3用注射器施加正压力，以密实填充的微粒；柱床填充均匀后，用加热固化的环氧胶密封微粒引入通道的入口3，即可得到芯片SPE柱(如图6所示)。需要更新固定相微粒时，将已填充的SPE芯片置于100℃烘箱中约15分钟，以软化密封用的环氧胶，随即用刀片将其去除；在进样口1和出样口2同时加上水，并在微粒引入通道入口3用真空抽，必要时可在进样口1和出样口2施加正压力，这样，可清除已填充的固定相微粒；再重复上述填充过程，就能得到更新的SPE柱。
本发明基于微流控芯片的SPE柱的特点如下：
1.SPE芯片的制作只需采用一步标准的光刻/蚀刻工艺，该方法简便、快速、重复性好，无需任何复杂的微加工技术；
2.芯片SPE柱的制作采用简便而快速的填充方法，从而避免了复杂的聚合反应技术；
3.芯片SPE柱中微粒引入通道的入口3使用可逆方式密封，从而实现了芯片SPE柱的重复使用，降低了使用成本。
4.该方法可应用于不同材料的微流控芯片，并适用于不同种类和大小的固定相微粒，从而拓展了其应用范围。
实施例2未改性硅胶(直径5μm)填充的芯片SPE柱用于λ-DNA的萃取
本例中所用上样、冲洗和洗脱缓冲液分别为6M盐酸胍(溶于10mMTris-1mM EDTA缓冲液中，pH6.1)、80％异丙醇的水溶液以及TE缓冲液(10mM Tris-1mM EDTA，pH7.5)；用于萃取的样品为溶于上样缓冲液中的λ-DNA(终浓度为0.5ng/μL)。采用自制的芯片接口将SPE芯片与注射泵相连，控制流速为3μL/min；所用上样、冲洗和洗脱溶液的体积分别为12μL、15μL和15μL，整个芯片萃取过程所用时间不到15分钟。收集洗脱出的DNA样品，并用嵌入式荧光染料进行荧光光度法定量，以测定该芯片SPE方法的萃取效率和重复性。
从实验结果(如图7所示)可知，利用本发明制作的玻璃芯片SPE柱进行λ-DNA萃取时，可得到较高的萃取效率(平均回收率为84.7％，n＝12)和较好的重复性(不同芯片SPE柱的RSD为1.95％，n＝3；同一芯片SPE柱的RSD为12.21％，n＝4)；同时，该方法所需样品体积小(每次只需12μL样品)、萃取速度快(不到15分钟)。
实施例3硅胶填充的芯片SPE柱用于从实际样品中纯化基因组DNA
本例中所用样品为人全血样品，其处理方法为：4.6μL全血样品溶于500μL上样缓冲液(6M盐酸胍，10mM Tris-1mM EDTA缓冲液，pH6.1)中，再加入10μL蛋白酶K(20mg/mL)，然后在56℃水浴中保持10分钟，即可得到用于萃取的样品溶液。所用上样、冲洗和洗脱溶液的体积分别为15μL、20μL和15μL，流速为3μL/min，洗脱出的DNA样品每5μL收集一份，每份取2.5μL用于PCR扩增。所用引物序列为：
5’-AACTGTTGCTTTATAGGATTTT-3’(正义链)，
5’-AGGAGCTTATTGATAACTCAGAC-3’(反义链)；
扩增产物为人类基因组β-球蛋白基因的650bp片段。PCR反应溶液(25μL)的组成为：10×PCR缓冲液2.5μL，dNTP混合物(每种10mM)0.5μL，引物(每种20μM)0.5μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，DNA模板2.5μL。PCR扩增在商品化PCR仪(GeneAmp TM2700，ABI)上进行，反应条件为：95℃×5分钟(预变性)，94℃×30秒/55℃×30秒/72℃×30秒(循环35次)，72℃×10分钟(后延伸)。所得PCR产物用PMMA芯片电泳分离/激光诱导荧光(LIF)检测，电泳筛分介质为：100mM TBE缓冲液中加入2％羟丙基甲基纤维素(HPMC)和1μM荧光染料；分离条件为：电场强度160V/cm，有效分离长度3.5cm.，结果示于图8。
从芯片电泳结果(如图8所示)可以看出，利用本发明芯片SPE柱从人全血样品中纯化的基因组DNA可成功地进行PCR扩增，并且扩增产物(650bp)的量与常规方法(阳性对照)相当，表明该芯片SPE柱对基因组DNA的纯化和萃取效率较高，从而为本发明在核酸分析中的应用奠定了基础。
Claims (3)
1.一种微流控芯片，芯片由上、下二层基片封接而成，其上层基片设有进样口(1)、出样口(2)及微通道，其特征在于：在上层基片的微通道上设有微粒引入通道及其入口(3)，在微粒引入通道的入口(3)与进样口(1)和出样口(2)之间分别设有坝结构，二个坝结构形成了一双围堰式结构(4)，二个坝结构之间的微通道形成填充柱床通道(5)；在下层基片对应于坝结构的位置分别设有微通道，坝结构的顶面与下层基片的微通道间存有缝隙；所述缝隙的深度小于上层基片中微通道的深度；
所述芯片材料为硅、石英、玻璃、各种聚合物或它们的复合体。
2.一种权利要求1所述微流控芯片的制作方法，其特征在于：采用“双面刻蚀/对准”的芯片制作方法，将设计好的上、下两层基片结构制成掩膜，按照标准的玻璃光刻/湿法刻蚀工艺刻蚀出所需图案，刻蚀好的上层基片用超声波打孔器在所需位置打孔，清洗后，两基片在显微镜下对准，使上层基片中的坝结构和下层基片中微通道的中心垂直线重合，从而形成含有双围堰式结构的连续通道；然后将对准的芯片依次放入真空烘箱和程序控温炉中进行贴合和热键合，即可得到所需的微流控芯片。
3.一种权利要求1所述微流控芯片的应用，其特征在于：通过微粒引入通道在芯片的填充柱床通道(5)中填入固定相微粒，采用可逆的方式密封微粒引入通道的入口(3)，即可形成芯片SPE柱；
所述芯片的缝隙深度应小于所填充固定相微粒的最小直径。
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