CN101169391A

CN101169391A - 一种二维高效液相色谱***及其应用

Info

Publication number: CN101169391A
Application number: CNA2006101340275A
Authority: CN
Inventors: 许国旺; 王媛
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2006-10-25
Filing date: 2006-10-25
Publication date: 2008-04-30
Anticipated expiration: 2026-10-25
Also published as: CN101169391B

Abstract

本发明涉及高效液相色谱，具体地说是一种二维高效液相色谱***及其应用，由五个高压液相色谱溶剂输送泵、一个溶剂混合器、一个十通阀、一个六通阀、两根分别适用于疏水性组分和亲水性组分分离的液相色谱分析柱和一根组分转移柱构成。本发明***适用于复杂体系样品中多种不同疏水性小分子组分的分离检测，应用时操作简便，灵活性好，普适性强，耗时短，可以自动在两根色谱柱上同时分离复杂体系样品中的亲水性和疏水性组分，在满足样品组分定性定量分析要求的基础上，显著提高分析的分辨率和峰容量。

Description

一种二维高效液相色谱***及其应用

技术领域

本发明涉及高效液相色谱，具体地说是一种二维高效液相色谱***及其应用。

背景技术

随着蛋白质组学、中药现代化、环境保护等领域研究的迅速发展，面对非挥发性极端复杂体系样品高效分离与高灵敏检测的要求，多维液相色谱技术迅速成为色谱科学研究领域的热点之一。该技术的核心思想是将分离机理不同而又互相独立的两根色谱柱偶联在一起，通过设计阀/柱接口和优化流程参数，达到提高峰容量和分离选择性的目的。

目前主要有两种二维液相色谱构建方式。传统的二维色谱采用“中心切割”(Heart-cutting)技术(文献1.郑育芳，基于尿中核苷对恶性肿瘤诊断及随访的研究.中国科学院研究生院博士学位论文.2003年.)，将第一维色谱柱所分离出的组分中某些感兴趣的部分离线或在线切入第二维色谱柱进行进一步的分离。这种模式比较适合目标组分分析，流路相对简单，但峰容量的增加十分有限，第一维分离能力利用不足，且必须事先了解目标组分的保留窗口等信息，分析未知组分样品时则容易丢失样品信息。

20世纪90年代初期，在此基础上又发展出全二维液相色谱(Comprehensive two-dimensional chromatography，LC×LC)技术(文献2.M.Bushey，J.W.Jorgenson.Anal.Chem.1990，62：161.)，它采用分离机理不同的两维色谱柱构成分离***。通过调制器或阀切换，第一维色谱柱分离出的所有组分都被在线引入第二维色谱柱中进行再次分离，得到的数据通常被处理为包含所有分离信息的三维图像或等高线图。但LC×LC的构建涉及到流动相的变化，需综合考虑分析对象、柱***、流动相互溶性、流速、阀切换频率等多个因素间的匹配，流路的设计相对较为复杂。此外，由于两维之间没有独立的调制器，不易实现柱头聚焦，适用样品的范围较窄。加上通常所需分析时间长，峰容量难以得到充分利用等问题的存在，使得到目前为止，绝大多数的研究仍局限于蛋白质组学领域中对蛋白质和肽的分离鉴定(文献3.Opiteck G J，Jorgenson J W.Anal.Chem.1997，69：2283-2291.文献4.Opiteck G J，Ramirez S M，JorgensonJ W，M.Moseley III A.Anal.Biochem.1998，258：349-361.文献5.WagnerK，Miliotis T，Marko-Varga G，Bischoff R，Unger K K.Anal.Chem.2002，74：809-820.文献6.Machtejevas E，John H，Wagner K，

L，Marko-Varga G，Forssmann W，Bischoff R，Unger K K.J.Chromatog.B.2004，803(1)：121-130.)，在其它复杂体系的研究领域却进展缓慢，只有少数文献报道用于分析高聚物的组成(文献7.Horst A，Schoenmakers PJ.J.Chromatog.A.2003，1000：693-709.)，分离结构异构体(文献8.GrayM J，Sweeney A P，Dennis G R，Slonecker P J，Shalliker R.A.Analyst.2003，128：598-604.)，分析表面活性剂(文献9.Haefliger O P.，Anal.Chem.2003，75：371-378.)、测定环境样品中的多环芳烃(文献10.TsuyoshiMurahashi.Analyst.2003，128：611-615.)和分离某些类脂化合物(文献11.Paola Dugo et al.Anal.Chem.，2004，76，2525-2530.文献12.P.Dugo et al.，J.Chromatogr.A，2006，1112，269-275.)等。但对于复杂样品(尤其是生物样品)中功能重要的(分子量低于1000的)小分子物质，尤其是亲水性的小分子物质，却没有提出一种相应的分离方法，导致这部分组分信息丢失，不利于全面了解样品性质。

发明内容

本发明的目的是提供一种二维高效液相色谱***及其应用，新的***适用于复杂体系样品中多种不同疏水性小分子组分的分离检测，可以自动在两根色谱柱上同时分离复杂体系样品中的亲水性和疏水性组分，在满足样品组分定性定量分析要求的基础上，显著提高分析的分辨率和峰容量。

为实现上述目的，发明技术方案如下：

一种二维高效液相色谱***，由五个高压液相色谱溶剂输送泵、一个溶剂混合器、一个十通阀、一个六通阀、两根分别适用于疏水性组分和亲水性组分分离的液相色谱分析柱和一根组分转移柱构成，第一维高压梯度溶剂输送泵和自动进样器、第一维分析柱依次连接，第一维分析柱后接十通阀的⑥位；十通阀的⑦位与②位、④位与⑩位分别连通，③位接混合器的一个入口，混合器的另一个入口接一个溶剂输送泵，混合器的出口接六通阀的⑥位，六通阀的①位和④位接组分转移柱，②位和③位分别接第二维分析柱和第二维高压梯度溶剂输送泵，第二维分析柱后接第二维检测器，⑤位与十通阀的①位相连，十通阀的⑤位接检测器，⑧位为废液出口，⑨位堵死。

第一维中的色谱分析柱可以是性能类似的所有亲水反应色谱柱；第二维中的色谱分析柱可以是性能类似的所有反相色谱柱；

第一维分析柱采用内径为2.1mm的亲水反应色谱(如：HILIC Si)柱，用于亲水性组分的分离；第二维采用内径为4.6mm的反相色谱分析柱(如：十八烷基硅胶键合相C18柱)，用于疏水性组分的分离；组分转移柱采用与第二维分析柱内径和填料相同的色谱柱(如：C18柱)，用于疏水性样品在两维间的转移。

所述二维高效液相色谱***可用于同时分离检测复杂体系样品中不同疏水性的小分子组分，即同时分析其中的疏水性组分和亲水性组分。

所述复杂体系样品为生物样品、环境样品、天然产物提取液或体液等；小分子组分是指复杂体系样品中分子量小于1000的，性质各异，含量不等，蕴含大量样品信息、单根色谱柱选择性有限、分辨率和峰容量难以满足分离要求的非挥发性小分子物质，或某些特定样品中亲/疏水性相差极大的几类组分的同时定性和定量分析。

本发明具有如下优点：

本发明***适用于复杂体系样品中多种不同疏水性小分子组分的分离检测，应用时操作简便，只需两次预实验，分别确定两维的分离条件和十通阀的切阀时间，即可实现自动批量分析工作；灵活性好，可以根据具体分析对象的特点和分析要求调整多个实验参数，从而达到针对特定样品的优化分离结果；由于亲水性组分和疏水性组分分别在各自适用的色谱柱上进行分离，利于分别调整两维的分离条件，获得更好的分离效果；普适性强，既可以用于复杂体现样品中非挥发性小分子物质的全组分分析，为代谢组学、***生物学等研究领域提供全面和可靠的样品信息，也可以实现某些特定样品中亲/疏水性相差极大的几类组分的同时定性和定量分析；耗时短，可以自动在两根色谱柱上同时分离复杂体系样品中的亲水性和疏水性组分，在不明显增加总分析时间的前提下，显著提高分析的分辨率和峰容量；减少工作量，提高工作效率，简化了样品的预处理过程，无需手动控制疏水性组分在两维间的转移，进一步降低分析过程中的偶然误差；易于实现，本发明***所采用的所有组件均为商品化模块，此外，还可以根据具体的分析对象采用不同填料的商品化色谱分析柱完成两维分析。本发明***为代谢组学、***生物学等目前热点研究领域所关注的具有重要意义的非挥发性小分子物质的分离分析提供了新的研究工具。

附图说明

图1a为本发明***的结构及操作流程示意图之一；

图1b为本发明***的结构及操作流程示意图之二；

图1c为本发明***的结构及操作流程示意图之三。

图2为HILIC色谱柱单独分离混合标样色谱图；图中数字代表：1.尿嘧啶，2.尿苷，3.对羟基苯甲酸，4.对氯苯甲酸，5.假尿苷，6.巴马汀，7.propanolol，8.尼古丁，9.马尿酸，10.Trp-Phe，11.异烟酸，12.atenolol；

图3.为反相(RP)色谱柱单独分离混合标样色谱图；图中数字代表：13.苯酚，14.2，6-二甲基苯酚，15.苯，16.甲苯，17.萘，18.邻氯甲苯，19.联苯，20.1，2，4-三甲苯，21.苊，22.2，3-二甲萘，23.4-氯代联苯，24.荧蒽，25.芘。

图4为组分转换柱的捕集能力考察图，为十通阀切换信号，用于标示十通阀的切换时间。

图5-1为二维***同时分离混合标样的亲水性组分色谱图；

图5-2为二维***同时分离混合标样的疏水性组分色谱图。

图6-1为HILIC柱单柱分析忍冬提取液的色谱图；

图6-2为C18柱单柱分析忍冬提取液的色谱图；

图6-3为二维***同时分析忍冬提取液中的亲水性组分色谱图；

图6-4为二维***同时分析忍冬提取液中的疏水性组分色谱图。

具体实施方式

如图1所示，两维同时分离HPLC***由以下三部分组成。

1.高效液相色谱仪。基本配置包括五个高压溶剂输送泵、一个混合器、两个检测器。可以选配自动进样器。

2.电动二位高压切换阀。包括一个六通阀和一个十通阀。

3.色谱柱。包括一根用来分析疏水性组分的反相(RP)色谱分析柱、一根用来分析亲水性组分的亲水反应色谱(HILIC)分析柱以及一根组分转移柱。两根分析柱的尺寸以及组分转移柱的类型和尺寸取决于两维分析柱的设置顺序。基本原则是，第一维分析柱内径较细(在常规液相色谱中为2.1mm I.D.)，第二维分析柱内径较粗(在常规液相色谱中为4.6mm I.D.)，两根分析柱的柱长没有特殊要求，但在满足仪器适用的条件下优先选择较长的分析柱以获得较高峰容量。组分转移柱的填料类型与第二维分析柱一致，内径与第二维分析柱一致，长度没有特殊要求，但在满足捕集组分要求的条件下，优先选择较短的柱子。

一种二维高效液相色谱***，由五个高压液相色谱溶剂输送泵、一个溶剂混合器、一个十通阀、一个六通阀、两根分别适用于疏水性组分和亲水性组分分离的液相色谱分析柱和一根组分转移柱构成，

第一维高压梯度溶剂输送泵9和自动进样器11、第一维分析柱10依次连接，第一维分析柱10后接十通阀1的⑥位；十通阀1的⑦位与②位、④位与⑩位分别连通，③位接混合器2的一个入口，混合器2的另一个入口接一个溶剂输送泵3，混合器2的出口接六通阀4的⑥位，六通阀4的①位和④位接组分转移柱5，②位和③位分别接第二维分析柱6和第二维高压梯度溶剂输送泵7，第二维分析柱6后接第二维检测器12，⑤位与十通阀1的①位相连，十通阀1的⑤位接检测器8，⑧位为废液出口，⑨位堵死。

具体工作过程如附图1所示，流程如下：

第一步，如附图1a所示，上样。样品进入第一维分析柱，用第一维的初始流动相将没有保留的疏水性组分冲出第一维分析柱，这部分组分通过混合器时，与溶剂输送泵3输出的流动相混合，使得这部分组分的溶剂转换为在第二维分析柱上洗脱能力相对较弱的流动相，然后进入组分转移柱并保留在柱上。与此同时，第二维分析柱用其相应初始流动相进行平衡。

第二步，如附图1b所示，组分转移。当第一维分析柱上无保留的组分全部流出后，切换十通阀，第一维分析柱用预实验中优化的条件进行分离，检测器8用来监测这一过程第一维分析柱的分离结果。与此同时，溶剂输送泵3继续提供流动相，一方面将残存在混合器中的样品组分彻底冲洗到组分转移柱上；另一方面，进一步降低组分转移柱上流动相相对于第二维分析柱的洗脱强度。这一过程可以有效降低第二维分析时由于组分溶剂过强造成的峰展宽和峰前伸现象。而第二维分析柱继续用初始流动相进行平衡。这一过程所需的时间由混合器体积决定，确保混合器中的所有组分全部转移到组分转移柱中即可。

第三步，如附图1c所示，各自分离。第二步完成后，切换六通阀，开始第二维分析。组分转移柱上保留的样品被冲入第二维分析柱进行进一步分离，分离结果由第二维检测器12记录。

这样，便实现了复杂样品中的亲水性组分和疏水性组分分别在两维色谱柱上同时进行分离并记录结果的目的。

通过商品化高效液相色谱仪的***控制器，即可实现自动批量分析。

实施例1：单柱分离条件优化

配制含25个组分的标准样品混合溶液，其中包括12种亲水性样品(尿嘧啶、尿苷、假尿苷、盐酸巴马汀、尼古丁、proparolol、atenolol、对氯苯甲酸、对羟基苯甲酸、马尿酸、异烟酸、Trp-Phe)和13种疏水性样品(苯、苯酚、2，6-二甲基苯酚、甲苯、邻氯甲苯、1，2，4-三甲苯、联苯、4-氯代联苯、萘、2，3-二甲萘、苊、芘、荧蒽)。

分别用单根色谱柱对该混合标样进行分离。

HILIC柱分离条件如下：Atlantis^TM HILIC Silica色谱柱(3μm，2.1×150mm)，A相100mM NH₄COOH水溶液，B相乙腈。梯度洗脱(93％B相保持8min，然后在12min内降至85％B，保持5min)。流速0.25mL/min，检测波长254nm。分离谱图见附图2。

RP柱分离条件如下：Hypersil ODS2色谱柱(5μm，4.6×150mm)，A相20mM TEAP水溶液(用三乙胺将20mM磷酸水溶液的pH值调至4.0)，B相乙腈。梯度洗脱(60％B相保持5min，然后在20min内升至80％B)。流速1mL/min，检测波长254nm。分离谱图见附图3。

对于全部25种组分，单根柱无法实现全分离。

实施例2组分转移柱的捕集能力考察

以HILIC柱为第一维分析柱，根据单柱分离谱图，确定十通阀切换时间为2.7min，此时HILIC柱上无保留的组分全部流出，组分转移柱采用与第二维分析柱内径和填料相同的C18色谱柱(柱长50mm)，用于疏水性样品在两维间的转移。为考察组分转移柱对此部分组分的捕集能力，在六通阀的⑤位连接检测器，观察是否有组分流出。流路中与P5相连的混合器体积为2.6mL，P5流量设为0.75mL/min，因此，从十通阀切换开始计时，经过3.5min，混合器中的残留组分将被全部冲至组分转移柱上。如果此柱不能完全捕集组分，在6.2min之内会观察到峰信号。如附图4所示，在30min内没有观察到峰，说明该柱能够完全捕集第一维流出的组分。

实施例3用同时分离流路平台分离该混合标样。

根据单根柱分离优化结果，设定分析条件如下。流路如附图1所示。第一维用HILIC柱，流动相条件与实施例1相同。第二维用RP柱，流动相A为水，其它色谱条件与实施例1相同，但梯度与实施例1相比，延迟6.2min。设定泵5流速为0.75mL/min，流动相为含5％乙腈的水溶液。十通阀切换时间为2.7min，六通阀切换时间为6.2min。第一维检测器采用半微量检测池，第二维检测器采用常规检测池，检测波长均为254nm。如附图5-1和5-2所示，在25min之内，所有25种组分得到分离。

实施例4自动批次分离样品能力及分离重现性的考察

通过***控制器，在室温下对该混合标样进行连续自动进样分析。考察10次进样所有25种组分的保留时间和峰面积的重现性。结果如附表1所示，保留时间的相对标准偏差(RSD，％)为0.03-0.90％，峰面积的相对标准偏差(RSD，％)为0.19-6.65％。结果表明，该方法可同时满足复杂样品组分定性定量分析的要求。

附表1 25种组分的分析重现性(n＝10)

实施例5应用该方法同时分离分析忍冬提取液中的疏水性和亲水性组分

如附图6-1和6-2所示，用HILIC柱和C18柱对忍冬提取液分别进行分析，HILIC柱在55min内分离得到87个峰，C18柱在70min内分离得到142个峰。如附图6-3和6-4所示，用本发明的二维高效液相色谱方法，用HILIC柱和C18柱同时分离忍冬提取液，在90min内分别检测到79个亲水性组分峰和109个疏水性组分峰，共计188个峰。

Claims

1.一种二维高效液相色谱***，其特征在于：由五个高压液相色谱溶剂输送泵、一个溶剂混合器、一个十通阀、一个六通阀、两根分别适用于疏水性组分和亲水性组分分离的液相色谱分析柱和一根组分转移柱构成；

第一维高压梯度溶剂输送泵(9)和自动进样器(11)、第一维分析柱(10)依次连接，第一维分析柱(10)后接十通阀(1)的⑥位；十通阀(1)的⑦位与②位、④位与⑩位分别连通，③位接混合器(2)的一个入口，混合器(2)的另一个入口接一个溶剂输送泵(3)，混合器(2)的出口接六通阀(4)的⑥位，六通阀(4)的①位和④位接组分转移柱(5)，②位和③位分别接第二维分析柱(6)和第二维高压梯度溶剂输送泵(7)，第二维分析柱(6)后接第二维检测器(12)，⑤位与十通阀(1)的①位相连，十通阀(1)的⑤位接检测器(8)，⑧位为废液出口，⑨位堵死。

2.按照权利要求1所述二维高效液相色谱***，其特征在于：第一维分析柱采用内径为2.1mm的亲水反应色谱柱，用于亲水性组分的分离；第二维采用内径为4.6mm的反相色谱分析柱，用于疏水性组分的分离；组分转移柱采用与第二维分析柱内径和填料相同的色谱柱，用于疏水性样品在两维间的转移。

3.按照权利要求1所述二维高效液相色谱***，其特征在于：第一维中的色谱分析柱可以是性能类似的所有亲水反应色谱柱；第二维中的色谱分析柱可以是性能类似的所有反相色谱柱。

4.一种权利要求1所述二维高效液相色谱***的应用，其特征在于：所述二维高效液相色谱***用于同时分离检测复杂体系样品中不同疏水性的小分子组分，即同时分析其中疏水性组分和亲水性组分。

5.按照权利要求4所述二维高效液相色谱***的应用，其特征在于：所述复杂体系样品为生物样品、环境样品、天然产物提取液或体液。

6.按照权利要求4所述二维高效液相色谱***的应用，其特征在于：所述小分子组分是指复杂体系样品中分子量小于1000的非挥发性小分子物质。