以下结合实施例具体说明本发明。
实施例1.羟基桑根素(Hydroxy-morusin)的制备结构确定
桑白皮50kg用90%乙醇500kg回流提取三次,每次3小时,回收至干,得10.5kg浸膏。将该浸膏用8kg热水及90%的乙醇4kg溶解混悬,用50kg乙酸乙酯萃取3次,回收至干得4kg乙酸乙酯浸膏。所得浸膏用丙酮溶解,吸附与6kg硅胶上,室温挥发致干,经硅胶柱层析(30目,30kg),用石油醚:丙酮(V/V,8:2)洗脱,每50升为一流分,共计得27个流分Fr.1-Fr.27。Fr.5流分经硅胶柱层析,氯仿:甲醇(150:1)洗脱得化合物羟基桑根素(2,78mg)。
经此方法制得的羟基桑根素可以具有很高的浓度。在某些实施例中,经此方法制得的羟基桑根素的浓度高于98%。在某些其它实施例中,经此方法制得的羟基桑根素的浓度为50%-99.9%。在另一些实施例中,经此方法制得的羟基桑根素的浓度为75%-99.9%。
在上述实施例中,使用了桑白皮来提取羟基桑根素化合物。本领域的普通技术人员可以认识到,其他植物也可能是适用的,例如与桑白皮同属或同科的植物。
质谱(MS)用Auto SPEC3000型质谱仪测定。核磁共振谱(1H NMR和13C NMR)用Bruker DRX-500超导核磁共振仪测定,TMS作内标。柱层析材料和薄层层析用硅胶为青岛美高集团有限公司的产品。
羟基桑根素(Hydroxy-morusin)结构式:
性状:淡黄色粉末
分子式:C25H24O7
分子量:436
1H-NMR(CDCl3,500MHz)δ:7.65(1H,d,H-6′),6.77(1H,d,J=10.0Hz,H-14),6.56(1H,d,J=8.5Hz,H-5′),6.43(1H,s,H-6),6.26(1H,s,H-3′),6.24(1H,s,H-9),5.61(1H,d,J=10.5Hz,H-10),5.42(1H,d,J=9.5Hz,H-15),1.97(3H,s,H-12),1.70(3H,s,H-13),1.48(3H,s,H-17),1.47(3H,s,H-18)。
13C-NMR(CDCl3,100MHz)δ:161.4(s,C-2),108.8(s,C-3),178.2(s,C-4),105.1(s,C-4a),163.0(s,C-5),99.7(d,C-6),157.8(s,C-7),101.0(s,C-8),150.8(s,C-8a),69.2(t,C-9),124.7(d,C-10),138.4(s,C-11),25.6(q,C-12),18.3(q,C-13),114.5(d,C-14),127.2(d,C-15),77.6(s,C-16),27.8(s,C-17),27.8(s,C-18),107.1(s,C-1′),155.4(s,C-2′),104.2(d,C-3′),158.6(s,C-4′),110.0(d,C-5′),120.8(s,C-6′)。
根据本发明所披露的化合物结构式,本领域的技术人员可以无须经过创造性劳动即可轻易地通过化学方法合成所述化合物,以替代本发明中所使用的提取物或纯化物。故而,本领域的技术人员应当了解,除了本发明实施例所列出的从桑白皮中进行提取或纯化外,本发明还可以通过化学合成方法来实现。其它对本发明所披露的化合物的显而易见的修改也被包括在本发明的保护范围之内。
实施例2.羟基桑根素(Hydroxy-morusin)对口腔主要致病菌的抑制实验
A.菌种的培养:
表1:相关的口腔致病菌
从日常储存菌种的胰酶解大豆蛋白胨琼脂血平板(简称TSA5B)中挑取单菌落到相应肉汤培养基中,于37.0℃±1.0℃,95%空气,5%CO2微需氧环境中培养(P.g需厌氧培养),其中S.m培养18-24h,其余两种培养40-48h。然后用相应肉汤培养基调节菌悬液的混浊度到0.5#McFarland standard,相当于1.0X108CFU/mL。
B.实验方法:肉汤稀释法(Broth dilution)
在肉汤中将抗菌药物进行一系列二倍稀释后再定量接种检测菌,37℃孵育18-24h后观察,抑制检测菌肉眼可见生长的最低药物浓度为测定药物对检测菌的最低抑菌浓度(MIC)。操作步骤为:
a.抗菌药物原液的配制:配制1%各种抗菌药物原液,溶剂为100%纯乙醇。原液配制好后过滤除菌,小量分装备用。
b.测定浓度的范围:本实验选择250ppm作为抗菌药物测定浓度的上限。
c.测定方法:微量稀释法。
先于96孔板上的每个孔加100μl肉汤培养基,再在第一列的每个孔加100μl经10倍稀释过的无菌抗菌药液(1000mg/l),然后用多道微量移液器在第一列的每个孔上反复吹打7-8次,使药品与TSB充分混合后移取100μl样品到第二列,同样反复吹打7-8次后再移取100μl样品到第三列,以此类推到最后一列,这样药品的浓度就被二倍梯度稀释了,从第一列的500mg/l到最后一列(第12列)的0.24mg/l。
待测菌和标准菌准备如上。用肉汤培养基将菌液稀释,达到含菌量约106CFU/ml。然后每孔接种100μl。这样每排抗菌药物的最终稀释浓度为250,125,62.5...0.12mg/L,最终接种菌量约5x107CFU/ml或每孔5x106个菌;将96孔板置微型振荡器上振荡1min,使各孔内溶液混匀,微孔板加盖并用胶纸密封以减少孵育过程中的蒸发并置湿盒内,于37.0℃±1.0℃,95%空气,5%CO2微需氧(或90%N2,5%H2,5%CO2厌氧)环境中培养18-24小时。将96孔板置于酶标仪下,对照检测菌和标准菌的生长特性,以无菌生长孔所含最低抗菌药物浓度即为MIC。
C.实验结果(见表2)
表2 化合物羟基桑根素对口腔致病菌的作用
| A.vATCC27044 | S.mATCC25175 | P.gATCC33277 |
阴性对照(DMSO) | - | - | - |
阳性对照(Triclosan) | 3.9 | 3.9 | 7.8 |
羟基桑根素 | 7.8 | 31.25 | 62.5 |
实施例3.羟基桑根素(Hydroxy-morusin)的抗炎试验
A.实验采用KB细胞(人口腔上皮癌细胞):
实验时对接种于培养板中的KB细胞予以化合物羟基桑根素(Hydroxy-morusin)处理或不予化合物羟基桑根素处理(对照),处理结束后,收集培养液上清并保存于-80℃冰箱。上清中的PGE2用酶联免疫吸附法检测,上清中的GM-CSF、TNF-α、IL-1β和IL-6的检测则使用Luminex多功能液相芯片分析***[结果见表3]。
B.PGE2的酶联免疫吸附法检测:
按照标准的酶联免疫吸附法进行。
结果(数值越小抗炎活性越好):化合物羟基桑根素(对口腔KB细胞生长的半数抑制浓度为0.02ppm,和阳性对照品玉洁纯相当。结果表明化合物羟基桑根素具有显著的抗炎活性。
C.GM-CSF、TNF-α、IL-1和IL-6的Luminex多功能液相芯片分析:
封闭液封闭96孔板30min。荧光微球稀释后加入96孔板。加入标准品和待测样品,4℃过夜。第二天,弃去上清,每孔加入50μl GM-CSF、TNF-α、IL-1β和IL-6抗体。清洗4次后,96孔板放入摇床室温避光1小时,清洗4次,加入链亲和素标记的PE室温避光15分钟。清洗4次,微球悬于清洗缓冲液中,96孔板立刻置于Luminex(Luminex Corporation,Austin,Tx.)上分析。
D.结果:化合物羟基桑根素具有很强的抗炎能力。具体结果见表3。
表3:化合物羟基桑根素的抗炎作用(此数值越大表明抗炎能力越强)
提取物/化合物 | GM-CSF | IL-1β(白介素) | IL-6(白介素) | TNF-α(肿瘤坏死因子) |
化合物羟基桑根素 | 11% | 21% | 52% | 89% |
玉洁纯(阳性对照) | 5% | 7% | 31% | 81% |
从上述实验结果可以证实:本发明的化合物羟基桑根素对口腔致病菌(粘性放线菌,伴生放线线杆菌,变链球菌,牙龈卟啉单胞菌)具有很好的抑制作用,对口腔KB细胞具有显著的抗炎活性,以及对炎症因子也有明显的抑制作用。
实施例4.羟基桑根素(Hydroxy-morusin)的应用
本发明化合物羟基桑根素用作药物时,可以直接使用,也可以作为有效成分应用于口腔药物或口腔护理产品中,如牙膏、漱口水,糊剂,速溶片或薄膜,香口胶等。可以以有效量与其它成分如保湿剂,摩擦剂,表面活性剂,药学上可接受的载体和/或添加剂等混合制得口腔药物或口腔卫生产品,所制得的口腔药物或口腔卫生产品包括但不限于牙膏,漱口水,口香糖,口腔糊剂等。
本发明所指的有效量是指足以产生一正面效果的剂量。该有效量可因具体应用方式的改变而改变。并且,对于某一具体应用方式,可以有多个有效剂量或者有效剂量范围。在某些实施例中,羟基桑根素可以以0.0005-20%(质量百分比)的添加量与其它成分相混合。在某些其它实施例中,羟基桑根素的含量为0.001-10%(质量百分比)。在某些优选实施例中,羟基桑根素的含量为0.025-5%(质量百分比)。在另一些实施例中,羟基桑根素的含量为0.05-0.5%(质量百分比)。
优选地,在片剂中,羟基桑根素的含量为4%(质量百分比);在鼻喷雾剂中,羟基桑根素的含量为4%(质量百分比);在滴丸中,羟基桑根素的含量为10%(质量百分比);在牙膏中,羟基桑根素的含量为0.5%(质量百分比);在漱口水中,羟基桑根素的含量为0.5%(质量百分比);在口腔糊剂中,羟基桑根素的含量为0.01%(质量百分比)。
其它有效剂量也可应用于本发明中。
本发明所涉及的配方组成成分也可能含有阳离子表面活性剂和/或非离子表面活性剂。阳离子表面活性剂包括,但不限于此,鲸蜡基三甲基氯化铵,二异丁苯氧乙氧乙基二甲苯苄基溴化铵。非离子表面活性剂包括泊洛沙姆,多乙氧基醚,和乙氧基脂肪酸等,泊洛沙姆是聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物,具有工业效用。如BASF生产的商品名为Pluronic,多乙氧基醚包括聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(典型的聚多乙氧基醇单酯),是由ICL公司生产的商品名是Tween,其他的非离子表面活性剂包括聚氧乙烯烷基酚,聚氧乙烯醇类,脂肪酸,聚氧乙烯酯类,聚氧乙烯烷基胺甘油酯,聚甘油酯,丁糖醇脂,戊糖醇酯,己糖醇酯,无水三糖醇酯和聚氧烷基胺多烃酯。一般表面活性剂在配方中的质量含量为0.001%到3.0%。配方中可能含有二价金属离子,如锌,铜,硒,钙或镁。它们会以可溶性无机盐的形式如氯化锌或有机/无机化合物的形式。二价金属离子在混合物中的加入量将是0.001%到3.0%。配方中可能含有低聚糖,低聚糖将会以水溶的状态,有可能转化成可溶性盐,如果加入的话最少加入0.01%。
本发明产品可包含各种常用的口腔药物或口腔卫生产品,如:漱口水,口腔喷雾,牙膏,禇哩,口腔粘膜贴片,口腔膜剂,速溶片和膜,香口胶,等用于哺乳类尤其人和动物的抑制菌斑,预防龋齿,牙周病的产品。
由于方法不同可能使用其他添加物:漱口水可能含有酸性物质,漱口水还可能含有脱敏物质如硝酸钾,牙膏可能含有磨擦剂如碳酸钠,磷酸钙,氧化铝,二氧化硅;增溶剂如PEG,甘油,乙醇;其他矫味剂如木糖醇,增稠剂如卡拉胶,表面活性剂如SLS等都可能使用。
在牙膏或口腔粘膜贴片中都可能用到蜡,如蜂蜡;增稠剂,成膜剂也可能加入如卡拉胶,CMC,HPMC,黄原胶等。
香精可能会使用如薄荷,留兰香,桉叶油,薄荷脑,香芹酮,冬青,丁香,肉桂,柠檬,西柚,橙子及一些由酵母和蛋白分解消化出的香精。
在片剂和膜剂中,惰性赋形剂可能用于产品的成形。主要包括一些着色剂,矫味剂等辅料以改善口味和外观。
本发明用于片剂所涉及的配方组成成分可能包含填充剂,粘合剂,润滑剂,崩解剂。填充剂包括,但不限于此,淀粉,乳糖,微晶纤维素等。粘合剂包括,但不限于此,淀粉浆,纤维素衍生物,聚维酮,明胶等。润滑剂包括,但不限于此,硬脂酸镁,微粉硅胶,滑石粉,聚乙二醇类等。崩解剂包括,但不限于此,羧甲基淀粉钠,低取代羟丙基纤维素,交联聚维酮,交联羧甲基纤维素钠等。这些成分都是中国药典及英、美等许多国家药典收载的药用辅料。
其它有效剂量也可应用于本发明中。
本发明所涉及的配方组成成分也可能含有阳离子表面活性剂和/或非离子表面活性剂。阳离子表面活性剂包括,但不限于此,鲸蜡基三甲基氯化铵,二异丁苯氧乙氧乙基二甲苯苄基溴化铵。非离子表面活性剂包括泊洛沙姆,多乙氧基醚,和乙氧基脂肪酸等,泊洛沙姆是聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物,具有工业效用。如BASF生产的商品名为Pluronic,多乙氧基醚包括聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(典型的聚多乙氧基醇单酯),是由ICL公司生产的商品名是Tween,其他的非离子表面活性剂包括聚氧乙烯烷基酚,聚氧乙烯醇类,脂肪酸,聚氧乙烯酯类,聚氧乙烯烷基胺甘油酯,聚甘油酯,丁糖醇脂,戊糖醇酯,己糖醇酯,无水三糖醇酯和聚氧烷基胺多烃酯。一般表面活性剂在配方中的质量含量为0.001%到3.0%。配方中可能含有二价金属离子,如锌,铜,硒,钙或镁。它们会以可溶性无机盐的形式如氯化锌或有机/无机化合物的形式。二价金属离子在混合物中的加入量将是0.001%到3.0%。配方中可能含有低聚糖,低聚糖将会以水溶的状态,有可能转化成可溶性盐,如果加入的话最少加入0.01%。
本发明产品可包含各种常用的口腔药物或口腔卫生产品,如:漱口水,口腔喷雾,牙膏,禇哩,口腔粘膜贴片,口腔膜剂,速溶片和膜,香口胶,等用于哺乳类尤其人和动物的抑制菌斑,预防龋齿,牙周病的产品。
由于方法不同可能使用其他添加物:漱口水可能含有酸性物质,漱口水还可能含有脱敏物质如硝酸钾,牙膏可能含有磨擦剂如碳酸钠,磷酸钙,氧化铝,二氧化硅;增溶剂如PEG,甘油,乙醇;其他矫味剂如木糖醇,增稠剂如卡拉胶,表面活性剂如SLS等都可能使用。
在牙膏或口腔粘膜贴片中都可能用到蜡,如蜂蜡;增稠剂,成膜剂也可能加入如卡拉胶,CMC,HPMC,黄原胶等。
香精可能会使用如薄荷,留兰香,桉叶油,薄荷脑,香芹酮,冬青,丁香,肉桂,柠檬,西柚,橙子及一些由酵母和蛋白分解消化出的香精。
在片剂和膜剂中,惰性赋形剂可能用于产品的成形。主要包括一些着色剂,矫味剂等辅料以改善口味和外观。
本发明用于片剂所涉及的配方组成成分可能包含填充剂,粘合剂,润滑剂,崩解剂。填充剂包括,但不限于此,淀粉,乳糖,微晶纤维素等。粘合剂包括,但不限于此,淀粉浆,纤维素衍生物,聚维酮,明胶等。润滑剂包括,但不限于此,硬脂酸镁,微粉硅胶,滑石粉,聚乙二醇类等。崩解剂包括,但不限于此,羧甲基淀粉钠,低取代羟丙基纤维素,交联聚维酮,交联羧甲基纤维素钠等。这些成分都是中国药典及英、美等许多国家药典收载的药用辅料。
羟基桑根素 | 0.0005 |
山梨醇 | 70 |
水,香料,调味料 | 适量 |
羟基桑根素牙膏配方6:
配料 | 含量(质量百分比,%) |
羟基桑根素 | 20 |
摩擦剂 | 25 |
保湿剂 | 55 |
羟基桑根素牙膏配方7:
配料 | 含量(质量百分比,%) |
羟基桑根素 | 0.025 |
二氧化硅 | 20 |
甘油 | 5 |
山梨醇 | 60 |
氟化钠 | 0.221 |
糖精钠 | 0.3 |
水 | 7.954 |
聚乙二醇 | 3 |
十二烷基硫酸钠 | 2 |
香精 | 1.5 |
羟基桑根素牙膏配方8:
配料 | 含量(质量百分比,%) |
羟基桑根素 | 0.3 |
二氧化硅 | 20 |
甘油 | 5 |
山梨醇 | 60 |
氟化钠 | 0.221 |
糖精钠 | 0.3 |
水 | 7.679 |
聚乙二醇 | 3 |
十二烷基硫酸钠 | 2 |
香精 | 1.5 |
羟基桑根素牙膏配方9:
配料 | 含量(质量百分比,%) |
羟基桑根素 | 0.5 |
二氧化硅 | 20 |
甘油 | 5 |
山梨醇 | 60 |
氟化钠 | 0.221 |
糖精钠 | 0.3 |
水 | 7.479 |
聚乙二醇 | 3 |
十二烷基硫酸钠 | 2 |
香精 | 1.5 |
羟基桑根素漱口水配方1
配料 | 含量(质量百分比,%) |
羟基桑根素 | 0.0005-20 |
水 | 70-94 |
其它添加剂 | 适量 |
羟基桑根素漱口水配方2
配料 | 含量(质量百分比,%) |
羟基桑根素 | 5 |
水 | 80 |
普流尼克 | 3.00 |
其它添加剂 | 适量 |
羟基桑根素漱口水配方3
配料 | 含量(质量百分比,%) |
羟基桑根素 | 0.001 |
水 | 94 |
酒精 | 5.00 |
其它添加剂 | 适量 |
羟基桑根素漱口水配方4
配料 | 含量(质量百分比,%) |
羟基桑根素 | 0.5 |
水 | 90 |
普流尼克 | 3.00 |
酒精 | 3.00 |
羟基桑根素漱口水配方5
配料 | 含量(质量百分比,%) |
羟基桑根素 | 0.025 |
水 | 85 |
普流尼克 | 5.00 |
酒精 | 3.00 |
其它添加剂 | 适量 |
羟基桑根素漱口水配方6
配料 | 含量(质量百分比,%) |
羟基桑根素 | 0.05 |
水 | 91.7 |
普流尼克 | 3.00 |
酒精 | 5.00 |
香精 | 0.25 |
羟基桑根素漱口水配方7
配料 | 含量(质量百分比,%) |
羟基桑根素 | 0.0005 |
水 | 94 |
酒精 | 5.00 |
其它添加剂 | 适量 |
羟基桑根素漱口水配方8
配料 | 含量(质量百分比,%) |
羟基桑根素 | 20 |
水 | 70 |
普流尼克 | 3.00 |
酒精 | 3.00 |
其它添加剂 | 适量 |
羟基桑根素糊剂配方1
配料 | 含量(质量百分比,%) |
羟基桑根素 | 10 |
聚乙二醇 | 90 |
[0104]羟基桑根素糊剂配方2
配料 | 含量(质量百分比,%) |
羟基桑根素 | 0.001 |
聚乙二醇 | 80 |
其它添加剂 | 适量 |
羟基桑根素糊剂配方3
配料 | 含量(质量百分比,%) |
羟基桑根素 | 0.01 |
聚乙二醇 | 90 |
其它添加剂 | 适量 |
羟基桑根素糊剂配方4
配料 | 含量(质量百分比,%) |
羟基桑根素 | 5 |
聚乙二醇 | 95 |
羟基桑根素糊剂配方5
配料 | 含量(质量百分比,%) |
羟基桑根素 | 0.025 |
聚乙二醇 | 99.975 |
羟基桑根素糊剂配方6
配料 | 含量(质量百分比,%) |
羟基桑根素 | 20 |
聚乙二醇 | 80 |
羟基桑根素糊剂配方7
配料 | 含量(质量百分比,%) |
羟基桑根素 | 0.0005 |
聚乙二醇 | 99 |
其它添加剂 | 适量 |
羟基桑根素片剂:
片剂:活性成分羟基桑根素10mg、乳糖180mg、淀粉55mg、硬脂酸镁5mg。
制备方法:将活性成分、乳糖和淀粉混合,用水均匀湿润,把湿润后的混合物过筛并干燥,再过筛,加入硬脂酸镁,然后将混合物压片,每片重250mg,活性成分含量为10mg。
羟基桑根素鼻喷雾剂:
羟基桑根素 80mg
氯化钠 8mg
EDTA 1mg
磷酸钠缓冲液(pH6.5) 10mg
多乙氧基醚 10mg
重蒸馏水 至2ml
制备方法:搅拌下于适当体积的重蒸馏水中每次加入一种成分,直至完全深解,然后再加入另一种成分。加水至2ml后,将该溶液在无菌过滤器上过滤,装入瓶中并按照适当的剂量分隔。
羟基桑根素滴丸:
羟基桑根素 1g
聚乙二醇6000 9g
制法:羟基桑根素与聚乙二醇6000熔融液的制备:按上述处方量称取羟基桑根素加入适量无水乙醇,微热溶解后,加入处方量的聚乙二醇熔融液中(60℃水浴保温),搅拌混合均匀,直至乙醇挥尽为止,静置于60℃水浴中保温30分钟,待气泡除尽,然后将除尽气泡的上述混匀熔融液转入贮液筒内,在保温80-85℃的条件下,控制滴速,一滴滴地滴入冷凝液中,等冷凝完全,倾去冷凝液,收集滴丸,沥净和用滤纸除去丸上的冷凝液,放置硅胶干燥器中或自然干燥即可。
以上对本发明的详细描述中阐述了大量具体的细节,其目的是为了对本发明作出清楚完整的解释,以便公众阅读理解。但是,本领域的技术人员将清楚的是,在某些情况下,没有这些具体的细节,或对这些具体的细节进行非本质的变更或替换,也可以实现本发明。这些变体方案都应被认为落入本发明的精神和范围内。本发明的范围应由所附权利要求书的平实语言来决定,而不应限于说明书中所提供的具体实施例。