CN101144813A

CN101144813A - 一种荧光分子探针及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101144813A
Application number: CNA2007100359527A
Authority: CN
Inventors: 朱建华; 牛承岗; 曾光明; 秦品珠; 岳琳; 李慧霞; 彭博
Original assignee: Hunan University
Current assignee: Hunan University
Priority date: 2007-10-23
Filing date: 2007-10-23
Publication date: 2008-03-19

Abstract

本发明涉及一种荧光分子探针，具有右化学结构通式，式中R₁为荧光生色团；R₂为助色团；本发明还提供了一种制备所述荧光分子探针的方法及其应用方法。本发明建立了一种灵敏度高、选择性好且对仪器要求不高的测定羟自由基的新体系。

Description

一种荧光分子探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种荧光分子探针，具体为检测羟自由基的荧光探针以及合成方法和应用。

背景技术

羟自由基(·OH)是目前所知活性氧中对生物体毒性最强、危害最大的一种自由基，它可以通过电子转移、加成以及脱氢等方式与生物体内的多种分子作用，造成糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类等物质的氧化性损伤，使细胞坏死或突变。羟自由基还与衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬等有关，羟自由基消除率成为反映食物、药物抗氧化作用的重要指标。因此，羟自由基的研究在生命科学和环境科学等领域中引起了人们广泛的兴趣，寻找一种灵敏、快捷的表征羟自由基的方法已经逐渐成为了近年的研究热点。

目前，测定羟自由基的方法主要有光度法、荧光法、电子自旋捕集法(ESR)、气相色谱法、高效液相色谱法(HPLC)、电化学分析法以及化学发光分析法等。其中，电子自旋捕集法(ESR)、气相色谱法、高效液相色谱法(HPLC)等检测羟自由基的方法，所需仪器昂贵，操作复杂，一般实验室难以应用。荧光法则以其高灵敏性、选择性、分辨时间短、实时原位检测等突出优点而得到广范的应用。

徐向荣等采用用Ce³⁺荧光法测定Fenton反应产生的羟自由基，Ce³⁺在稀硫酸中能产生特征荧光，Fenton反应产生的羟自由基能将Ce³⁺氧化成Ce⁴⁺，用荧光法测定Ce³⁺的荧光强度变化进而间接测定羟自由基的产生量。然而，该方法容易受到分子氧及其它具有氧化性物质的干扰，对羟自由基的选择性较差。郭祥群等将顺磁性氮氧化合物与荧分子共价结合，形成荧光分子-氮氧自由基复合物(哌啶类氮氧自由基自旋标记荧光探针)，羟自由基先与二甲亚砜反应生成甲基自由基，再利用复合物与甲基自由基反应前后荧光量子产率的变化设计了一种间接表征羟自由基的荧光分子探针。该方法通过两步反应实现对羟自由基的间接表征，由于羟自由基的反应活性大、寿命短、存在浓度低，过长的反应路线会影响表征羟自由基的准确性。因此有必要寻求建立一种灵敏度高、选择性好且对仪器要求不高的测定羟自由基的新体系。

发明内容

本发明的目地在于解决上述现有技术的不足，提供一种稳定性好、灵敏度高、安全方便、具有良好的荧光强度响应和高特异选择性的荧光分子探针及其制备方法和应用。该荧光分子探针可与羟自由基反应导致自身荧光淬灭，添加羟自由基消除剂可以清除溶液中的羟自由基，从而使溶液荧光强度淬灭程度降低。据此原理建立一种测定各种抗氧化剂对羟自由基的消除率的方法。

为解决上述问题本发明采用以下技术方案：

一种荧光分子探针，具有以下化学结构通式：

式中，R₁和R₂分别表示荧光生色团和助色团。

所述R₁可以是苯环数为1-3的芳香烃，如苯，萘及蒽，最好是蒽；R₂可以是给电子取代基，如-N(CH₃)₂，-NH₂，-OH等，最好是-NH₂。

一种制备本发明荧光分子探针的方法，包括以下步骤：

把化合物II与有机溶剂(甲醇、乙醇、苯等)和碱性溶液(氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾等)混合，在20～50℃加入等物质的量的式III化合物，反应进行24～72小时，反应完毕后，分离，提纯，即可得到本发明化合物，

R₁-CHO II

本发明荧光分子探针用于检测反应产生羟自由基，包括以下步骤：

分别测出空白荧光分子溶液和加入不同量产羟自由基溶液的荧光分子溶液的荧光强度，反应前后的荧光淬灭量ΔF与产羟自由基溶液中H₂O₂的量在一定条件下呈良好的线性关系，由于反应物H₂O₂与产物·OH的物质的量之间有1∶1的化学计量关系，因此，间接得出反应前后的荧光淬灭量ΔF与体系中的·OH的物质的量之间的定量关系。

具体包括以下步骤：

取适当数量干净的相同比色管，分别加入相同摩尔含量的荧光分子探针溶液，第一支比色管，直接加去离子水稀释至刻度；其余各支比色管，依次加入H₂O₂浓度递增的Fenton试剂后再加去离子水稀释至刻度，每加一种试剂后均应摇匀；在荧光分子最大发射波长(λ_max)处分别测得第一支比色管中溶液的荧光强度(F)，及其余各支比色管中溶液的荧光强度(F₁、F₂、F₃……)，则反应前后荧光淬灭量ΔF可表示为：

ΔF＝F-F` (F`＝F₁、F₂、F₃……)

将荧光淬灭量ΔF对H₂O₂的浓度做图，得到一定H₂O₂浓度范围内两者之间的线性关系图，由于Fenton反应中反应物H₂O₂与产物·OH的物质的量之间有1∶1的化学计量关系，因此，该线性关系图可用作定量检测体系中该浓度范围内的·OH浓度的工作曲线。

本发明荧光分子探针用于测定羟自由基清除率，包括以下步骤：

分别测出空白荧光分子溶液、加入Fenton试剂的荧光分子溶液、同时加入羟自由基消除剂和Fenton试剂的荧光分子溶液的荧光强度，通过计算，间接得出羟自由基的消除率。

具体包括以下步骤：

取三支干净的相同比色管，分别加入相同摩尔含量的荧光分子探针溶液，第一支比色管，直接加去离子水稀释至刻度；第二支比色管，加入足量Fenton试剂后再加去离子水稀释至刻度，每加一种试剂后均应摇匀；第三支比色管，加入一定量的羟自由基消除剂、足量Fenton试剂后再加去离子水稀释至刻度，每加一种试剂后均应摇匀；分别测定三支比色管中溶液在荧光分子最大发射波长(λ_max)处的荧光强度F、F₀、F_S，则该羟自由基消除剂对羟自由基的清除率计算如下：

本发明所用Fenton试剂，是以过氧化氢作氧化剂，以亚铁盐为催化体系产生羟自由基的经典方法制得的，其反应机理如下：

Fe²⁺+H₂O₂→Fe³⁺+·OH+OH^-。

本发明的原理为：碳碳双键与吸电子性的羰基相联，构成一个π-π共轭体系(又称α，β-不饱和酮)，这两个官能团的相互影响不仅使各自的化学性质有不同程度的改变，还表现出α，β-不饱和酮具有的特性，易与亲电试剂发生加成反应。羟自由基是一种强氧化剂，具有很高的亲电性，容易进攻高电子云密度点，是生物体内的多种大分子物质氧化性损伤、细胞坏死或突变的诱因。

本发明设计合成了具有α，β-不饱和酮结构的荧光分子探针I。以Fenton体系作为生成羟自由基的来源，在酸性条件下，羟自由基可与I发生亲电加成反应，破坏了I原有的共轭结构，导致其荧光淬灭。其可能的反应途径如下：

反应前后荧光强度变化量(ΔF)与Fenton体系中所用H₂O₂的量在一定条件下呈良好的线性关系。而H₂O₂与Fenton体系反应产生的羟自由基的物质的量之间有1∶1的化学计量关系，因此，ΔF与体系中的羟自由基的物质的量之间也存在着良好的定量关系，从而实现对羟自由基的定量检测。

本发明的优点是：1.本发明经过特殊设计合成了一种新型荧光分子探针，它能将微环境中羟自由基的变化信息转变为荧光信号，从而实现对羟自由基的表征；2.在表征羟自由基中表现出高度灵敏度、高特异选择性、安全方便等特点，架起宏观世界与微观世界的桥梁；3.本发明荧光分子探针可通过比较各种天然食物对羟自由基的消除率，筛选出其中能高效消除羟自由基的物质；4.本发明荧光分子探针具有活性基团(R₂)，有利于标记蛋白质等生物活性分子，进一步用于生物体内的羟自由基检测。

附图说明

图1为：荧光分子探针V的质谱图。

图2为：荧光分子探针V的核磁共振谱图。

图3为：荧光分子探针V的荧光光谱图：a为空白荧光分子探针V(5.0×10^-5mol/L)的荧光光谱；b为荧光分子探针V(5.0×10^-5mol/L)加入H₂O₂(3.0×10^-5mol/L)后的荧光光谱；c为荧光分子探针V(5.0×10^-5mol/L)加入Fe(II)(5.0×10^-3mol/L)后的荧光光谱；d为荧光分子探针V(5.0×10^-5mol/L)加入H₂O₂(3.0×10^-5mol/L)和Fe(II)(5.0×10^-3mol/L)后的荧光光谱。

图4为：加入不同量H₂O₂后荧光分子探针V的激发和发射光谱图：[H₂O₂]1-17依次为0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、1.00、1.25、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50×10^-5mol/L。

图5为：荧光淬灭量ΔF与H₂O₂浓度的关系图。

具体实施方式

实施例1：

荧光分子探针的制备在250ml三口烧瓶中，将1.00g对氨基苯乙酮和1.57g9-蒽甲醛溶于70ml甲醇中，加入溶有40g氢氧化钾的40ml水溶液，搅拌，在40℃下反应48h，反应完毕，有大量橙黄色沉淀产生，过滤，水洗，抽干，得2.01g的粗结晶物，用无水乙醇重结晶，得1.89g本发明荧光分子探针V，产率79.0％。

用质谱、核磁共振谱对上述所得荧光分子探针V的结构进行表征，并研究其荧光光谱特征，如图1，图2和图3所示：

图1中，m/z323是分子离子，m/z120是基峰。在含有羰基的化合物中，羰基氧上的n电子容易失去，游离基和正电荷定位在氧原子上，由游离基引发的α断裂和正电荷引发的i断裂质是羰基化合物的主要碎裂方式。在本发明荧光分子中，芳基与羰基相连形成共轭，因此发生α断裂生成的对氨基苯甲酰基离子(m/z120)稳定性大于i断裂生成的蒽乙烯基离子(m/z202)，因而α断裂占优势，质谱中m/z120和202两个离子的相对丰度比约为100∶25。

图2中，荧光分子中各类质子化学位移的范围，从高场到低场依次为-NH₂基上的氢(δ＝4.277)，-CH＝CH-双键上的烯氢(δ约为6.706～6.727)及蒽环和苯环上的芳氢(δ约为7.259～8.467)。

图3中，在反应体系中缺少Fe(II)、H₂O₂中的任何一种物质时，体系荧光强度变化很小(a，b，c)，这是因为缺少以上2个组分中的任何一种，体系难以产生羟自由基，因而不能发生加成反应，所以荧光强度淬灭程度很小。当Fe(II)与H₂O₂同时存在于酸性体系中时，荧光强度显著降低(d)，这是由于反应体系中产生的羟自由基与荧光分子探针V发生了加成反应，破坏了探针分子原有的共轭结构，所以体系荧光强度降低。

实施例2

1.0.50mmol/L的荧光分子探针溶液：称16.2mg(0.050mmol)荧光分子探针V置于烧杯中，加适量无水乙醇溶解后，移入100ml棕色容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度；0.10mol/L H₂O₂：移取1.10ml的30％(v/v)H₂O₂于100ml容量瓶中，用去离子水定容至刻度；0.10mol/LFe²⁺溶液：称取9.804g(NH₄)₂Fe(SO₄)₂·6H₂O，溶于适量水中，加10ml浓硫酸，再用水稀释至250ml，混匀，用时新配；

2.取17支相同的干净10ml比色管，均分别加入1.0ml0.50mmol/L的荧光分子探针V溶液，且在不同编号的比色管中再分别加入以下物质：1号比色管，直接加去离子水稀释至刻度；2～17号比色管，依次加入0.10ml、0.20ml、0.30ml、0.40ml、0.50ml、0.60ml、0.70ml、0.80ml、0.90ml、1.00ml、1.25ml、1.50ml、2.00ml、2.50ml、3.00ml和3.50ml0.10mmol/L的H₂O₂，再分别加入0.50ml0.10mol/LFe²⁺溶液，用去离子水稀释至刻度，每加一种试剂后均应摇匀。

3.荧光测量是在带计算机数据处理***的Perkin Elmer LS-55荧光仪上进行，光源为脉冲氙灯，检测器为R928F红外敏感光电倍增管；设置激发波长为395nm，发射波长为565nm处的荧光强度，1～17号比色管荧光分子探针V的激发、发射光谱如图4所示。以荧光淬灭量ΔF对H₂O₂的浓度做图，结果如图5所示，H₂O₂浓度在1.0×10^-6-1.0×10^-5mol/L范围内时，两者之间呈良好的线性关系(ΔF＝1.28×10⁷c(H₂O₂)+17.34，R＝0.9956)，由于反应物H₂O₂与产物·OH的物质的量之间有1∶1的化学计量关系，因此，反应前后的ΔF与体系中的·OH的物质的量之间也存在着良好的定量关系，从而实现对该浓度范围内·OH的定量检测。

实施例3

1.同实施例2配制0.50mmol/L的荧光分子探针V溶液、0.10mol/L H₂O₂和0.10mol/LFe²⁺溶液。取天然食物核桃、花生、生姜各2.0g，分别粉碎，各加去离子水20ml，浸泡30min，然后以3500r/min转速离心30-45min，至溶液澄清，分别取其上清夜5.0ml用于实验。

2.取五支相同的干净10ml比色管，均分别加入1.0ml 0.50mmol/L的荧光分子探针V溶液，且第一支比色管中，直接加去离子水稀释至刻度；第二支比色管中，加入1.0ml0.10mmol/L H₂O₂，0.5ml0.10mol/L Fe²⁺溶液后再加去离子水稀释至刻度，每加一种试剂后均应摇匀；第三支比色管，加入1.00ml核桃的上清液，1.0ml0.10mmol/L H₂O₂，0.5ml0.10mol/LFe²⁺溶液后再加去离子水稀释至刻度，每加一种试剂后均应摇匀；第四支比色管，加入1.00ml花生的上清液，1.0ml0.10mmol/LH₂O₂，0.5ml 0.10mol/L Fe²⁺溶液后再加去离子水稀释至刻度，每加一种试剂后均应摇匀；第五支比色管，加入1.00ml生姜的上清液，1.0ml 0.10mmol/L H₂O₂，0.5ml 0.10mol/L Fe²⁺溶液后再加去离子水稀释至刻度，每加一种试剂后均应摇匀。

3.同实施例2步骤3所述，设置激发波长为395nm，分别测定五支比色管中溶液在波长565nm处的荧光强度，根据如下公式分别计算核桃、花生、生姜三种天然食物对羟自由基的消除率：

其中F`表示一号比色管中溶液荧光强度、F₀`表示二号比色管中溶液荧光强度、F_S`表示三至五号比色管中溶液荧光强度。结果如表1所示。

表1天然食物对羟自由基的消除率的比较

食物名称	提取液体积	羟自由基消除率(％)
食物名称	提取液体积	羟自由基消除率(％)	核桃	1.0ml	53.7％
花生	1.0ml	17.2％	核桃	1.0ml	53.7％
花生	1.0ml	17.2％	生姜	1.0ml	29.8％

Claims

1.一种荧光分子探针，其特征在于具有以下化学结构通式：

式中R₁为荧光生色团；R₂为助色团。

2.根据权利要求1所述的荧光分子探针，其特征在于R₁可以是苯环数为1-3的芳香烃；R₂可以是给电子取代基。

3.根据权利要求1或2所述的荧光分子探针，其特征在于所述R₁最好是蒽；所述R₂最好是-NH₂。

4.一种制备权利要求1所述荧光分子探针的方法，其特征在于包括以下步骤：将化合物II与有机溶剂和碱性溶液混合；加入等物质的量的式III化合物；反应完毕后，分离，提纯即可得到本发明化合物，

R₁-CHO II

5.根据权利要求4所述的制备荧光分子探针的方法，其特征在于所述有机溶剂可为甲醇、乙醇或苯；所述碱性溶液可为氢氧化钠、氢氧化钾或碳酸钾。

6.根据权利要求4或5所述的制备荧光分子探针的方法，其特征在于所述反应时间为24～72小时，反应温度为20～50℃。

7.权利要求1所述的荧光分子探针用于检测反应产生羟自由基。

8.权利要求1所述的荧光分子探针用于测定羟自由基清除率。