CN101134955A - 一种用于有机污染物生物降解的固体复合微生物微球及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于有机污染物生物降解的固体复合微生物微球及其制备方法。以海藻酸钠为包埋材料，固体碳酸钙为致孔剂，通过向包埋悬浊液中添加具有对有机污染物吸附能力的吸附剂和降解有机物的菌体制备超大孔生物包埋微球，实现污染物吸附和生物降解的耦合，提高环境中污染物的去除效率，这种耦合了富集污染物和生物降解能力的超大孔固体微生物制剂在有机污染物治理中具有速度快、效率高的优点。
Description
技术领域
本发明属于有机物污染的生物降解方法，具体地说涉及一种用于有机污染物生物降解的固体复合微生物微球及其制备方法。
背景技术
利用微生物进行生物降解是治理有机污染物环境污染的有效方法，但由于有机污染物的毒性，在有机污染物的生物治理中，微生物难以进行有效的生长，因而造成降解效率低等。以石油烃污染土壤的治理为例，石油烃组成复杂，生物毒性强，同时其生物可利用度低，因此外加菌种在恶劣的石油烃污染土壤中难以积累生物量，且降解转化效率低。目前，国外已经开发了针对石油烃生物降解的微生物制剂，这类制剂主要以菌液和干粉形式存在，在使用过程中不利于保存和运输，受土壤生态***影响大，活性诱导期长，且在与土著微生物相互作用过程中活性易丧失等缺点，需要大量施用和多次补加，造成治理效率低、成本高。
细胞固定化(immobilization)技术是20世纪70年代从固定化酶发展起来的。它是一种用化学或物理的手段将游离细胞定位于限定的空间领域，并使其保持活性，反复利用的方法。细胞固定化技术有利于提高生物反应器内的微生物细胞的浓度和纯度、保持高效菌种、微生物流失少、耐受环境冲击强、操作稳定性好、利于除氮和除去高浓度有机物或某些难降解物质。固定化细胞相对自由细胞具有许多优势，细胞固定化技术在环境治理方面已取得一定的进展。1997年Pometto等人公布了利用聚乙烯或聚丙烯等合成高分子材料与植物材料制备微生物细胞固定化载体的专利，得到的载体可用于生物膜反应器处理废气和废水处理(US5595893)，但这种载体为有机高分子材料合成载体，其生物相容性和生物可降解性较差，容易对环境造成二次污染。王新、李培军等人将动胶杆菌包埋在聚乙烯醇和硼酸复合载体中，并用于降解土壤中菲、芘污染物，结果表明在含有土著菌的自然土壤中，固定化微生物对污染物的降解有很大的优势。在细胞固定化应用过程中，由于包埋材料在一定程度阻碍底物和氧扩散，对大分子底物的生物降解产生阻碍作用。刘铮等人在专利申请《一种土壤修复用固体复合微生物微球及其制备方法》(专利申请号：200510130675.9)中公开了一种利用海藻酸钙制备超大孔包埋材料进行微生物固定化的一种新方法，开发了制备海藻酸钙超大孔微球技术，在传统的微生物包埋载体海藻酸钙微球上引入大孔道，解决了传质问题，可以提高微球中的氧传递以及底物传递过程。但对环境中难溶的有机污染物而言，底物与包埋微生物的接触仍然存在问题。因此如何提高污染环境中，固定化的微生物摄取污染底物的效率是石油烃生物降解的决定步骤。
发明内容
针对现有微生物包埋制剂中存在的底物与包埋微生物的接触问题，本发明目的在于提供一种用于有机污染物生物降解的固体复合微生物微球及其制备方法，该方法产生的超大孔微生物包埋载体能富集有机污染物、促进包埋微生物的生长，从而达到对有机污染物生物降解效率高和速度快的目的。
本发明可通过下述方案加以实现。
一种用于有机污染物生物降解的固体复合微生物微球，是以海藻酸钠为包埋材料，固体碳酸钙为致孔剂，包埋对有机污染物有吸附能力的吸附剂和具有生物降解能力的真菌和细菌菌种；该固体复合微生物微球直径为3～10mm，内部分布10～80μm的辐射状孔道。
一种用于有机污染物生物降解的固体复合微生物微球的制备方法，包括如下步骤：
1)平面培养：细菌采用LB固体培养基，真菌采用马铃薯固体培养基在培养皿中进行预培养，培养温度为25℃～30℃，培养2～10天，保存备用；
2)真菌孢子液制备：利用1)中得到的真菌培养平板制备真菌孢子液，利用灭菌5～50mM(pH＝7.0)PBS缓冲液冲洗孢子液，制备孢子悬浮液4℃保存备用；
3)细菌摇瓶培养：将步骤(1)中平板培养的细菌接种到LB液体培养基中振荡培养，培养温度20～30℃，转速130～180rpm；培养15～30小时收集处于平台期的菌体得细菌培养液，4℃保存备用；
4)配制海藻酸钠一吸附剂溶液：将海藻酸钠溶解于水中，其中海藻酸钠浓度为1～4％；待海藻酸钠完全溶解后，加入吸附剂，添加量优选为1～10％(w/v)，混合均匀；
5)常温下，将500～1500目的碳酸钙颗粒加入到0.1％～0.6％的span60溶液中，超声分散均匀后，添加到4)配制的溶液中，碳酸钙浓度为1％～10％；根据不同有机污染物的降解需要，在4)中加入2)中制备得到的真菌孢子悬浮液或3)中得到细菌培养液或2)和3)按照一定比例混匀后的混合液，搅拌制成分散均匀的悬浊液；
6)用滴管吸取经过步骤5)得到的悬浊液，滴加入浓度为1％～3％的氯化钙溶液中，液滴与氯化钙溶液接触后形成固体球形颗粒沉淀；
7)收集6)中得到的球形颗粒，并在0.1～0.5M盐酸中浸泡10～60min，待无明显的气泡生成后，过滤得到致孔的固体球形颗粒，无菌水冲洗1～5次，即得到耦合了有机污染物吸附与生物降解的微生物包埋微球。
上述真菌和细菌为具有降解石油烃能力的真菌和细菌。
上述真菌为刺孢小克银汉菌和黄孢原毛平革菌等真菌之一种。
上述细菌来自假单胞菌属(Newcombe D A等，AppliedMicrobiology and Biotechnology，1999，51：877-82)、红球菌属(Newcombe D A等，Applied Microbiology and Biotechnology，1999，51：877-82)、微球菌属(Torres LG等，Process Biochemistry 40(10)：3296-3302 OCT 2005)、肠杆菌属(Katsivela E等，Biodegradation 16(2)：169-180 MAR 2005)、棒状杆菌属(RahmanKSM等，Bioresource Technology 85(3)：257-261 DEC 2002)、黄质菌属(Rahman KSM等，Bioresource Technology 85(3)：257-261DEC 2002)和芽孢杆菌属(Das K等，Bioresource Technology 98(7)：1339-1345 MAY 2007)。
上述真菌和细菌均可从中国普通微生物菌种保藏中心购得。
上述步骤5)中所述的2)和3)按照一定比例混匀后的混合液按申请号为：200510130676.3的专利所述方法制备。
上述吸附剂为木质素、纤维素、活性炭等吸附剂中的1～3种。
本发明方法所得菌剂所具有的优点和有益效果为：(1)、在保留了超大孔微球固定化细胞既具有保护性又有高传质性的前提下，利用材料中添加的污染物吸附剂可以有效的富集环境中的污染物，减缓污染物在环境中的迁移，避免环境污染的扩散，同时又能提高包埋微生物生物转化污染物的效率。(2)、使用的包埋载体以及污染物吸附剂具有环境友好，生物相容性好等优点，不需要进行其他处理。(3)本发明在石油污染土壤的生物修复过程以及突发性环境污染的治理过程中都具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明制备的新型超大孔微生物包埋载体的照片。
图2为光学显微镜下本发明制备的超大孔固体微生物微球的照片(碳酸钙已除，放大倍数为4倍)。
图3超大孔包埋对真菌生长的促进柱形图
1：未包埋真菌；
2：海藻酸钙包埋；
3：超大孔海藻酸钙包埋
图4为光学显微镜下本发明制备的超大孔固体微生物微球在25℃～30℃下经过48小时培养的照片(放大倍数为10倍)。
图5本发明载体对菲的吸附特性曲线图。
具体实施方式
下面的实例针对有机污染物菲制备新型微生物包埋制剂对本发明提供的方法予以进一步的说明，但不限制本发明。
实施例1
(1)平面培养：采用黄孢原毛平革菌(phanerochaetechrysosoporium，购自中国普通微生物菌种保藏中心)作为石油烃降解的真菌。制备马铃薯平面培养基(PDA)，将黄孢原毛平革菌接种到PDA平面培养基上，在28℃培养6天，保存备用；
(2)利用灭菌20mMPBS(pH＝7.0)冲洗培养好的PDA平板，制得孢子液，孢子浓度为10个/ml；
(3)配制海藻酸钠一吸附剂溶液，其中海藻酸钠浓度为2％，吸附剂选择对菲有较强吸收的木质素类生物高分子，含量为5％；
(4)在常温下，将800目碳酸钙微粒均匀分散于(3)所述溶液中，碳酸钙浓度为5％；然后在溶液中加入(2)中得到的孢子悬浮液，使悬浊液中的孢子浓度为106个/ml，充分搅拌制成分散均匀的悬浮液。
(5)用滴管吸取(4)中得到的悬浮液，滴加入浓度为1.1 ％的氯化钙溶液中，液滴与氯化钙溶液接触后立即形成固体球形颗粒沉淀(如图1所示)。
(6)收集球形颗粒，在0.5M HCl溶液中浸泡20min，待无明显的气泡生成，收集除去碳酸钙固体微粒的球形颗粒，并用无菌水冲洗2次，即制成固体复合微生物微球(如图2所示)。
实施例2
将实施例1所得的固体复合微生物微球置于30℃培养24小时后，通过称重法比较了自由孢子(样品一)、无孔海藻酸钠包埋孢子(样品二)以及实施例1所制备的固体复合微生物微球的真菌生物量，结果(见图3)显示，本发明所制备的固体复合微生物微球能很好的促进真菌的生长，24h真菌生物量分别为样品一和样品二的28.6和2.5倍。培养48小时后，显微镜观察实施例1所制备的固体复合微生物微球中的真菌形态(如图4所示)。
实施例3
有机污染物菲的吸附动力学实验
将实施例1所得的固体复合微生物微球0.4g(湿重)置于20ml含有5mg/L菲、200mg/LTween80以及200mg/L NaN3(抑制包埋微生物活性)的5mM PBS(pH＝7.0)缓冲液中，考察载体对有机污染物菲的吸附动力学，其中对照为不添加任何吸附剂时液相体系，还有按照专利200510130675.9(CN)中制得的仅为超大孔，不含有有机污染物类吸附剂的载体。结果(见图5)添加实施例1所制备的复合微生物微球的溶液中，残余菲含量10h时为初始菲含量的12％，说明本发明所制备的载体对菲具有很好的吸附能力，而对照和添加了按照专利200510130675.9(CN)制备的载体的溶液中菲含量几乎没有变化。
Claims (8)
1.一种用于有机污染物生物降解的固体复合微生物微球及其制备方法，是以海藻酸钠为包埋材料，固体碳酸钙为致孔剂，包埋对有机污染物有吸附能力的吸附剂和具有生物降解能力的真菌和细菌菌种；该固体复合微生物微球直径为3～10mm，内部分布10～80μm的辐射状孔道。
2.按照权利要求1所述的固体复合微生物微球，其特征在于所述的吸附剂为木质素、纤维素、活性炭等吸附剂之1～3种。
3.按照权利要求1或2所述的固体复合微生物微球，其特征在于所述的具有石油烃降解能力的真菌为刺孢小克银汉菌和黄孢原毛平革菌等真菌之一种。
4.按照权利要求1或2所述的固体复合微生物微球，其特征在于所述的具有石油烃降解能力的细菌来自：假单胞菌属、红球菌属、微球菌属、肠杆菌属、棒状杆菌属、黄质菌属和芽孢杆菌属等之一种或几种。
5.权利要求1所述的用于有机污染物生物降解的固体复合微生物微球的制备方法，包括如下步骤：
1)平面培养：细菌采用LB固体培养基，真菌采用马铃薯固体培养基在培养皿中进行预培养，培养温度为25℃～30℃，培养2～10天，保存备用；
2)真菌孢子液制备：利用1)中得到的真菌培养平板制备真菌孢子液，利用灭菌5～50mM(pH＝7.0)PBS缓冲液冲洗孢子液，制备孢子悬浮液4℃保存备用；
3)细菌摇瓶培养：将步骤(1)中平板培养的细菌接种到LB液体培养基中振荡培养，培养温度20～30℃，转速130～180rpm；培养15～30小时收集处于平台期的菌体得细菌培养液，4℃保存备用；
4)配制海藻酸钠一吸附剂溶液：将海藻酸钠溶解于水中，其中海藻酸钠浓度为1～4％；待海藻酸钠完全溶解后，加入吸附剂，添加量优选为1～10％(w/v)，混合均匀；
5)常温下，500～1500目的碳酸钙颗粒加入到0.1％～0.6％的span60溶液中，超声分散均匀后，添加到4)配制的溶液中，碳酸钙浓度为1％～10％；根据不同有机污染物的降解需要，在4)中加入2)中制备得到的孢子悬浮液或3)中得到细菌培养液或2)和3)按照一定比例混匀后的混合液，搅拌制成分散均匀的悬浊液；
6)用滴管吸取经过步骤(5)得到的悬浊液，滴加入浓度为1％～3％的氯化钙溶液中，液滴与氯化钙溶液接触后形成固体球形颗粒沉淀；
7)收集5)中得到的球形颗粒，并在0.1～0.5M盐酸中浸泡10～60min，待无明显的气泡生成后，过滤得到致孔的固体球形颗粒，无菌水冲洗1～5次，即得到耦合了有机污染物吸附与生物降解的固体微生物包埋微球。
6.按照权利要求5所述的固体复合微生物微球的制备方法，其特征在于所述的吸附剂为木质素、纤维素、活性炭等吸附剂之1～3种。
7.按照权利要求5所述的固体复合微生物微球的制备方法，其特征在于所述的具有石油烃降解能力的真菌为刺孢小克银汉菌和黄孢原毛平革菌等真菌之一种。
8.按照权利要求5所述的固体复合微生物微球的制备方法，其特征在于所述的具有石油烃降解能力的细菌来自：假单胞菌属、红球菌属、微球菌属、肠杆菌属、棒状杆菌属、黄质菌属和芽孢杆菌属等之一种或几种。
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