CN101131384A - 利用发光细菌检测水中急性生物毒性的方法 - Google Patents

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Abstract

一种环境监测技术领域的利用发光细菌检测水中急性生物毒性的方法，首先制备发光细菌新鲜菌悬，然后将测试水样pH调整为：水样中的含Cu量高于其他金属以及有机物含量时为4.5，水样中不含Cu同时其它金属含量高于有机物含量时为5.4，水样中有机物含量高于金属含量时为7.0；采用ZnSO4作为参比毒物，配制参比毒物系列标准溶液后分别置于管中，每管中加入发光细菌新鲜菌悬液，充分混匀后进行相对发光度测定，各测试水样的发光强度变化以相对发光度表示，计算公式为：样品管相对发光度＝样品管的发光度/对照管的发光度。本发明回避了剧毒物质的使用，并应用发光细菌达到同样的对水质急性生物毒性进行测定的目的。

Description

利用发光细菌检测水中急性生物毒性的方法
技术领域
本发明涉及一种生物技术领域的检测方法，具体是一种利用发光细菌检测水中急性生物毒性的方法。
背景技术
发光细菌是一种特殊的海洋细菌，它能在清洁的水中存活并发光，当水质受到污染时其发光能力会减弱。利用发光细菌在不同受污染水体中发光强度的差异可以显示水质生物急性毒性的情况。采用发光细菌法对水质进行监测具有时间短、灵敏度高的特点，而且还能弥补常规理化监测的不足，因此被广为采用。目前传统发光细菌监测方法存在结果重现性不高、使用剧毒物质氯化汞作为毒性参照物毒性较高、容易造成环境污染等问题。因此有必要对现行检测方法作进一步改进，降低参照物毒性，优化检测方法。
经对现有技术文献检索发现，GB/T 15441-1995《中华人民共和国国家标准水质急性毒性的测定发光细菌法》规定，基于发光细菌相对发光度与水样毒性组分总浓度呈显著负相关(P≤0.05)，因而可通过生物发光度计测定水样的相对发光度，以此表示其急性毒性水平。水质急性毒性水平选用相当的参比毒物氯化汞浓度(以mg/L为单位)来表征，以测试样品相对HgCl2浓度来划分毒性等级。氯化汞是剧毒物质，购买需要繁琐的环节，使用过程中和使用后都存在一定的风险。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种利用发光细菌检测水中急性生物毒性的方法，使其可取代剧毒物质氯化汞作为毒性参照物，并且可有效提高检测结果精度。本发明采用毒性相对较低的ZnSO4代替氯化汞HgCl2作为毒性参比，通过实验确定ZnSO4与HgCl2的毒性比例，在水样毒性划分时进行相应的转换，回避了剧毒物质的使用，并应用发光细菌(市售产品)达到同样的对水质急性生物毒性进行测定的目的。
本发明通过以下技术方法实现。本发明具体包括以下步骤：
第一步，发光细菌新鲜菌悬液的制备
检测所用发光细菌为明亮发光杆菌T3小种(Photobacteriumphosphoreum T3 spp.，为市售产品，在中科院南京土壤所购得)。检测前对发光细菌进行筛选、斜面培养和摇瓶菌液培养获得初始发光度不低于1.5×106RLU/S的新鲜菌悬液，备用。
第二步，测试样品的处理与稀释
本发明所监测的生物急性毒性不考虑pH的影响，因此需排除pH因素。将测试水样和CK(对照)(氯化钠3g/100mL)pH调整为：水样中的含Cu量高于其他金属以及有机物含量时为4.5，水样中不含Cu同时其它金属含量高于有机物含量时为5.4，水样中有机物含量高于金属含量时为7.0；
测试水样一律采用蒸馏水稀释。定容前，按构成NaCl 3g/100mL浓度投加NaCl。
第三步，发光细菌新鲜菌悬液投加
在20～25℃条件下用微量注射器吸取按第一步制备的发光细菌新鲜菌悬液，将稳定的发光细菌新鲜菌悬液逐一加入各测试管，盖上瓶盖，用手颠倒数次，静置后测定发光度。
第四步，测试样品急性毒性的计算
参比毒物采用ZnSO4，配制参比毒物系列标准溶液后分别置于5mLCK管中，每管中加入第一步制备的发光细菌新鲜菌悬液，充分混匀后进行相对发光度测定。各测试水样的发光强度变化以相对发光度表示，计算公式为：样品管相对发光度＝样品管的发光度(RLU/S)/CK(对照)管的发光度(RLU/S)。
根据不同参比毒物浓度时的相对发光度，以相对发光度为纵轴，参比毒物浓度为横轴作图并进行线性拟合，通过参比毒物浓度与相对发光度之间的相关方程，可计算出相对发光度减少50％时所测样品以ZnSO4浓度表示的EC50值。通过以HgCl2为参照毒物的平行试验可得到HgCl2溶液的毒性为同浓度ZnSO4溶液的12.458倍，以此换算可得测试样品以HgCl2表示的急性毒性。
本发明采用毒性相对较低的ZnSO4代替剧毒物质氯化汞作为毒性参比，通过实验确定ZnSO4与HgCl2的毒性比例，在水样毒性划分时进行相应的转换，回避了剧毒物质的使用，并应用发光细菌达到同样的对水质急性生物毒性进行测定的目的。同时选择ZnSO4作为毒性参照来代替HgCl2不仅降低了检测成本、减弱了毒性、扩大了监测范围，而且具有较好的稳定性。以HgCl2为毒物参比时，发光细菌的测试灵敏度为0.025mg/L；而以ZnSO4为毒物参比时，可明显提高发光细菌的测试灵敏度，小于0.01mg/L。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例采用三种参比毒物：0.00mg/L～2.00mg/L的ZnCl2系列标准溶液；0.00mg/L～2.25mg/L的ZnSO4系列标准溶液和0.5～6mg/L的HgCl2系列标准溶液进行比较实验。整个实施实现过程如下：
1.按以下要求准备实施材料，其中参比毒物采用ZnCl2、ZnSO4和HgCl2三种(这三种化学物质均有市售，但HgCl2属剧毒物质，需公安部门审批并特殊输送)；
测试菌种：明亮发光杆菌T3小种(Photobacterium phosphoreum T3spp.)，中科院南京土壤所可购得的市售产品。
稀释液：3％NaCl，2％NaCl。
单管发光检测仪Tube Luminometer Sirius V3.1；恒温振荡器，培养箱，高温灭菌器；10μL或20μL微量移液器，1mL注射器，容量瓶，三角瓶等。
2.实施方法
2.1发光细菌新鲜菌悬液的制备
(1)筛选菌种：取所购发光细菌菌种涂布培养48h，挑取各种菌落细菌进行镜检，挑选出所需发光细菌的菌落。
(2)斜面菌种培养：测定前取发光细菌于新鲜斜面上接出第一代斜面，20±0.5℃培养24h后立即转接第二代斜面，20±0.5℃培养24h，再接出第三代斜面20±0.5℃培养12h后备用。每次接种量不超过一接种环。
(3)摇瓶菌液培养：取第三代斜面菌种近一环，接种于装有50mL培养液的250mL三角瓶内，20±0.5℃，184rpm/min下培养12～14h备用。
(4)将培养液稀释至每毫升108～109个细胞，初始发光度不低于1.5×106 RLU/S，备用。
2.2样品的处理与稀释
所监测的生物急性毒性不考虑pH的影响，因此需排除pH因素。将测试水样和CK(对照)(氯化钠3g/100mL)pH调整为：水样中的含Cu量高于其他金属以及有机物含量时为4.5，水样中不含Cu同时其它金属含量高于有机物含量时为5.4，水样中有机物含量高于金属含量时为7.0；对于有色样品测定干扰的校正参照GB/T 15441-1995的细则。
样品采用蒸馏水稀释。定容前，按构成NaCl 3g/100ml的浓度投加NaCl。
2.3发光细菌新鲜菌悬液投加
在20～25℃条件下用微量注射器吸取10μL发光细菌新鲜菌悬液，将稳定的发光细菌新鲜菌悬液按样品排列顺序逐一加入各测试管(具标准磨口塞，为制造比色管的玻璃料制作，由专业玻璃仪器厂制造)，盖上瓶盖，用手颠倒数次，静置后采用单管发光检测仪测定发光度。
2.4.测试样品急性毒性的计算
参比毒物采用ZnCl2、ZnS04和HgCl2三种，配制参比毒物系列标准溶液后分别置于5mLCK管中，每管中加入步骤2.1中制备的发光细菌新鲜菌悬液，充分混匀后进行相对发光度测定。各标准样品的发光强度变化以相对发光度表示，计算公式为：样品管相对发光度＝样品管的发光度(RLU/S)/CK(对照)管的发光度(RLU/S)。
根据不同参比毒物浓度时的相对发光度，以相对发光度为纵轴，参比毒物浓度为横轴作图并进行线性拟合，通过参比毒物浓度与相对发光度之间的相关方程，可计算出相对发光度减少50％时所测样品的浓度即EC50值。
3.对每个参照毒物所对应的标准样品进行10组平行实验，分别计算出它们的EC50值。对所得结果进行统计学分析，检测结果如表1所示。
表1毒性参照的重复测定结果
  类别/组数   最小值   最大值   平均值   标准偏差   变异系数/％
  ZnCl2的EC50ZnSO4的EC50HgCl2的EC50   0.9681.0320.086   1.2021.210.103   1.10481.14990.0923   0.0650.0540.005   5.884.715.37
结合3个实施例的变异系数分析，ZnSO4最小，为4.71％，数据比较整齐；其次为HgCl2，为5.37％；最大的是ZnCl2，为5.88％。经过10组数据的比较，HgCl2溶液的毒性为同浓度ZnSO4溶液的12.458倍。不难看出，选择ZnSO4作为毒性参照来代替HgCl2不仅降低了实施成本、减弱了毒性、扩大了监测范围，而且具有较好的稳定性。

Claims (7)

1.一种利用发光细菌检测水中急性生物毒性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，发光细菌新鲜菌悬液的制备：检测所用发光细菌为明亮发光杆菌T3小种，检测前对发光细菌进行筛选、斜面培养和摇瓶菌液培养获得初始发光度等于或者大于1.5×106RLU/S的新鲜菌悬液，备用；
第二步，测试样品的处理与稀释：将测试水样和对照pH调整为：水样中的含Cu量高于其他金属以及有机物含量时为4.5，水样中不含Cu同时其它金属含量高于有机物含量时为5.4，水样中有机物含量高于金属含量时为7.0；
第三步，发光细菌新鲜菌悬液投加：取第一步制备的发光细菌新鲜菌悬液，将稳定的发光细菌新鲜菌悬液逐一加入各测试管，盖上瓶盖，用手颠倒数次，静置后测定发光度；
第四步，测试样品急性毒性的计算：采用ZnSO4作为参比毒物，配制参比毒物系列标准溶液后分别置于管中，每管中加入第一步制备的发光细菌新鲜菌悬液，充分混匀后进行相对发光度测定，各测试水样的发光强度变化以相对发光度表示，计算公式为：样品管相对发光度＝样品管的发光度/对照管的发光度。
2.根据权利要求1所述的利用发光细菌检测水中急性生物毒性的方法，其特征是，第一步中，所述发光细菌新鲜菌悬液的制备，具体步骤为：
(1)筛选菌种：取发光细菌菌种涂布培养，挑取各种菌落细菌进行镜检，挑选出所需发光细菌的菌落；
(2)斜面菌种培养：测定前取发光细菌于新鲜斜面上接出第一代斜面，20±0.5℃培养24h后立即转接第二代斜面，20±0.5℃培养24h，再接出第三代斜面20±0.5℃培养12h后备用；
(3)摇瓶菌液培养：取第三代斜面菌种近一环，接种于装有50mL培养液的250mL三角瓶内，20±0.5℃，184rpm/min下培养12～14h备用；
(4)将培养液稀释至每毫升108～109个细胞，初始发光度等于或者大于1.5×106RLU/S，备用。
3.根据权利要求2所述的利用发光细菌检测水中急性生物毒性的方法，其特征是，步骤(1)中，所述培养，其时间为48h。
4.根据权利要求2所述的利用发光细菌检测水中急性生物毒性的方法，其特征是，步骤(2)中，每次接种量等于或者小于一接种环。
5.根据权利要求1所述的利用发光细菌检测水中急性生物毒性的方法，其特征是，第二步中，所述测试样品的处理与稀释，具体为：测试水样采用蒸馏水稀释，定容前，按构成NaCl 3g/100mL浓度投加NaCl。
6.根据权利要求1所述的利用发光细菌检测水中急性生物毒性的方法，其特征是，第三步中，所述取第一步制备的发光细菌新鲜菌悬液，是指：在20～25℃条件下用微量注射器吸取按第一步制备的发光细菌新鲜菌悬液。
7.根据权利要求1所述的利用发光细菌检测水中急性生物毒性的方法，其特征是，第四步中，所述测试样品急性毒性的计算，具体为：根据不同参比毒物浓度时的相对发光度，以相对发光度为纵轴，参比毒物浓度为横轴作图并进行线性拟合，通过参比毒物浓度与相对发光度之间的相关方程，计算出相对发光度减少50％时所测样品以ZnSO4浓度表示的EC50值，通过以HgCl2为参照毒物的平行试验可得到HgCl2溶液的毒性为同浓度ZnSO4溶液的12.458倍，以此换算得测试样品以HgCl2表示的急性毒性。
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