CN101129378A - 一种用于促进毛发生长的药物喷雾剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于促进毛发生长的药物喷雾剂，制得该喷雾剂的有效组分及其百分比的原料组成为：米诺地尔、卵磷脂、维生素E、天然精油和乙醇，由上述化合物的全部或部分制备含醇脂质体米诺地尔喷雾剂制剂，通过脂质体包裹很好的解决了米诺地尔的水溶性和药物在水中的溶解和均一性，增强了药物的透皮吸收并将药物送入真皮层提高药效，避免了有副作用的助溶剂使用，减少药物进入全身血液循环***所引起的毒副作用和对皮肤的刺激，并且对皮肤有保护、美容的功效；应用于动物模型显示其较普通制剂更好促进毛发生长的优势；应用于透皮模型显示其较普通制剂更好的促进透皮吸收和更高的高皮肤储存优势。

Description

一种用于促进毛发生长的药物喷雾剂

技术领域

本发明属于医药领域，涉及药物喷雾制剂，特别涉及一种促进毛发生长的药物喷雾剂。

背景技术

脱发是临床常见病和多发病，尽管没有生命威胁，但是对患者社会交往和心理健康影响极大。目前市场上大部分产品是无效的，FDA仅认证了治疗脱发的两种疗法的事实就说明了这一点^[1]。目前毛发组织工程和有毛皮肤组织工程尚未完全成功，仍存在着许多难点。所以针对皮肤美容中棘手的毛发再生，研制开发治疗脱发的高效、特异、副作用小的药物对于治疗脱发具有重要意义。

米诺地尔(minoxidil)米诺地尔^[2]属嘧啶衍生物(2，4-二氨基-3-羟-6-哌啶嘧啶)，又名长压定或敏乐血定，是FDA批准的第一个治疗脱发的外用药物。米诺地尔可以诱导毛发进入生长期，增加毛干的直径。1996年FDA正式批准2％米诺地尔溶液作为治疗脱发的非处方药上市，用于治疗男性和妇女的雄激素引起的脱发。1998年获准上市的5％局部用米诺地尔溶液仍作为非处方药，但仅用于男性脱发，该药商品名是Rogine^[3]。国内外学者^[4~6]通过体内与体外实验均已证实米诺地尔对毛发生长的促进作用明显。具体机制仍不是很清楚，可能与米诺地尔直接促进细胞增殖、开放钾离子通道、增加皮下血流、增加毛***VEGF表达及激活***素内过氧化物酶(PGHS)等因素有关。普通制剂的米诺地尔外用药虽然取得一定效果，但由于皮肤外用药均需经过透皮吸收才可以作用于毛囊，而其透过率较低(皮下吸收量约5％～36％)，人体实验结果和体外培养毛囊的结果仍有一定差距，同时还存在心血管***的不良反应，治疗时间较长(9～12周)，停药6个月后新生毛发又逐渐脱落等一系列的缺点。要提高药效，同时减少不良反应，关键是提高透皮率和皮肤存储量。所以，临床上急需开发一种高效，低毒，靶向毛囊的局部用药。

脂质体(liposome)毛发疾病治疗历来存在着以下两个重要问题：①病变局限于毛发，全身给药后经体内转运、分布和代谢，到达皮肤局部的药物浓度极其有限，而要使局部达到理想治疗浓度，势必引起全身性毒副作用；②有些药物全身给药疗效很好，一旦改用局部给药，由于透皮吸收性能差而对局部病变疗效甚小，甚至无效。故研究一个透皮性能很好的外用药物制剂是解决上述问题的关键。而脂质体制剂本身的特性恰恰迎合了这一需求。脂质体^[7]是由磷脂双层膜构成的中空小球。与其他剂型相比，脂质体可使药物具有较大的皮肤角质层透过量，它本身可生物降解，无毒性，不产生皮肤刺激性，近年来发现脂质体既有促进透皮吸收和保持药物在皮肤高浓度的优点，又有选择性靶向毛囊的优势而备受关注，成为研究的热点。当今国际资本市场投资中最推崇，最关注的是纳米材料技术，而脂质体是纳米领域目前最成熟，最具工业化，商业化的切入点。由于其无毒、高效、应用面广、制备简单、无免疫原性及易实现靶向性等优点而倍受临床医生及各大药厂的广泛关注。药物通过皮肤进入体内的途径主要有以下三种：通过穿透细胞进入、经细胞间隙穿透和经过皮肤附属器官道开口处进入(如毛囊、皮脂腺、汗腺的开口)。其中经细胞间隙途径一度被认为是主要的途径，而毛囊途径则被认为只是作为旁路在起作用。最近的研究有了不同的观点，逐渐强调了第三途径的重要性，特别是毛囊在药物透皮的过程中起着重要的作用^[8]。有研究表明，经过毛囊开口处药物透皮的速度就明显的高于经过皮质层的透皮速度，特别是水溶性的药物^[9]。脂质体作为药物的载体，不但可以促进药物的透皮吸收，还能保持药物在皮肤中高浓度。脂质体促进药物穿透皮肤皮质层的机理可能与水合作用、穿透机制、融合机制、毛囊皮脂腺途径有关。脂质体同时具有亲毛囊特性^[10～12]，有人将脂质体包裹的抗阿霉素的单克隆抗体载入大鼠毛囊，并且防止了阿霉素引起的脱发，为化疗或放疗引起的获得性脱发的治疗和预防提供了新的思路和方法。脂质体载入的高选择性的特点，提示了它在实用、安全毛发疾病治疗方面有着巨大的潜力。

以下是发明人给出的参考文献：

[1]George Cotsarelis and Sarah E.Millar.Towards a molecularunderstanding of hair loss and its treatment[J].TRENDS in Molecular Medicine，2001，7(7)：293～301。

[2]Lucky AW，Piacquadio DJ，Ditre CM，A randomized，placebo-controlledtrial of 5％ and 2％ topical minoxidil solutions in the reatment of femalepattern hair loss.J Am Acad Dermatol.2004 Apr；50(4)：541～553。

[3]薛瑛，屠军波，杨壮群，促毛发生长药物研究进展[J].中国美容医学杂志，2004.13(5)：620～622。

[4]杨壮群，屠军波，姚天华等.NGF与***对离体培养的人头皮毛囊影响的实验研究[J].中华整形外科，2004，20(1)：48～50.

[5]Namazi MR，Handjani F.An immunologic mechanism for thetherapeutic efficacy of minoxidil in alopecia areata.J Drugs Dermatol.2004Mar-Apr；3(2)：129～130。

[6]Nippon.Hair growth effect of minoxidil[J].Yakurigaku Zasshi，2002，119(3)：167～174。

[7]陈涛，王九成，傅经国等，脂质体药物制剂的研究现状和前景[J]。世界最新医学，2003，(2)4：721～728。

[8]Lademann J，Otberg N，Richter H，et al.Follicular penetration.An important pathway for topicaily applied substances[J].Hautarzt，2003，54 (4)：321～323。

[9]Ogiso T，Shiraki T，Okajima K，et al.Transfollicular drugdelivery：penetration of drugs through human scalp skin and comparison ofpenetration between scalp and abdominal skins in vitro[J].J Drug Target，2002，10(5)：369～378。

[10]Ciotti SN，Weiner N.Follicular liposomal delivery systems[J]..JLiposome Res，2002，12(1-2)：143～148。

[11]屠军波，王九成，杨壮群等，脂质体透皮吸收与靶向毛囊的研究进展[J].中华整形外科杂志，2005.21(3)：221～223。

[12]Hoffman RM.Gene and stem cell therapy of the hair follicle.MethodsMol Biol.2004：289：437～448。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种用于促进毛发生长的药物喷雾剂，该喷雾剂旨在利用脂质体递药技术、抗氧化剂、皮肤保护剂和多元复合透皮吸收促透剂的互补作用，增加药物的溶解性和对皮肤角质层的通透性，起到促进透皮吸收、靶向毛囊、促进毛发生长、保护皮肤的作用。

实现本发明所采取的技术方案是，

用于促进毛发生长的药物喷雾剂，其有效组分有：

1)作为药物的米诺地尔，用量为0.5％～20％(重量比)；

2)作为脂质体包材、透皮吸收促透剂和皮肤保护剂的卵磷脂，用量为50％～80％(重量比)；

3)作为抗氧化剂、抗氧化剂和皮肤保护的维生素E，用量为0～0.4％(摩尔比)

4)作为透皮吸收促透剂的氮酮，用量为0～0.2％(摩尔比)；

5)作为透皮吸收促透剂乙醇，用量为10～40％(重量比)；

6)作为脂质体包材和透皮吸收促透剂的天然精油，用量为0～10％(摩尔比)；

所说的作为脂质体包材、透皮吸收促透剂和皮肤保护剂的卵磷脂可以是：蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、人工合成卵磷脂、鞘磷脂中的一种或几种。

所说的作为脂质体包材和透皮吸收促透剂的天然精油可以是：薄荷油、桉叶油、玫瑰油、松木油、丁香油、麝香草油、熏衣草油、木香油、柠檬油、留兰香油、香柠檬油、檀香油的一种或几种。

本发明通过脂质体包裹很好的解决了药物的水溶性，增强药物的透皮吸收并将药物送入真皮层提高局部药物的浓度，显著得提高了药效，增强了药物作用时间；同时避免了有副作用的传统助溶剂的使用，可以减少药物以及助溶剂进入全身血液循环***，此外磷脂脂质体不仅减少了对皮肤的刺激，还对皮肤有很好的保护作用。

附图说明

图1是本发明的制备工艺流程图；

图2是激光散射法检测含醇脂质体粒径分布图；

图3是含醇脂质体为单室或多室的中空薄层泡囊(TEM200，000x)；

图4是荧光显微镜下PE-Rhodamine含醇脂质体透皮情况(10x)；

图5是荧光显微镜下钙黄绿素水溶液透皮情况(10×)；

图6是荧光显微镜下钙黄绿素含醇脂质体透皮情况(10×)；

图7钙黄绿素空白CSLM(20×)；

图8是PE-Rhodamine空白CSLM(20×)；

图9是钙黄绿素水溶液透皮情况CSLM(20×)；

图10是钙黄绿素含醇脂质体透皮情况CSLM(20×)；

图11是PE-Rhodamine含醇脂质体透皮情况CSLM(20×)；

图12A，B，C是1.4％脂质体米诺地尔组用药第1，10，18天的照片

图12D是用药18天的1.4％脂质体米诺地尔组皮肤(HE×200)；

图13A，B，C是1.4％普通米诺地尔组用药第1，10，18天的照片；

图13D是用药18天的1.4％普通米诺地尔组皮肤(HE×200)；

图14A，B，C是空白对照组涂药第1，10，18天的照片；

图14D是用药18天的空白对照组皮肤(HE×200)；

图15是用药18天时VEGF在1.4％含醇脂质体米诺地尔组的毛囊皮脂腺中的表达(SP×400)

图16是用药18天时VEGF在空白对照组的毛囊皮脂腺中的表达(SP×400)。

以下结合附图和发明人依本发明的技术方案所完成的实施例对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

1.本发明的处方、制备工艺、工艺流程

1.1、本发明的处方

1)、最佳处方

名称	分子量	摩尔比(％)	用量(g)
				卵磷脂	760		4.0
米诺地尔	209.25		1.0
				氮酮	281.48		0.002
维生素E	472		0.006
				薄荷油			0.06

2)、辅料在处方中的作用

配料名称	配料处方作用
		卵磷脂米诺地尔	脂质体包材，透皮吸收促透剂，皮肤保护剂促毛发生长药物
氮酮	透皮吸收促透剂
		维生素E	抗氧化剂，皮肤保护剂
薄荷油	香料，透皮吸收促透剂，抗菌作用

1.2制备工艺

整个脂质体生产过程在氮气保护下进行。

1.取处方量卵磷脂，米诺地尔，氮酮，V_E和薄荷油等药物加入20ml～40ml无水乙醇(乙醇的用量应控制为制成的脂质体药液体积的10％～40％)，加热搅拌使之完全溶解。

2.将乙醇药物溶液缓慢的加入用剪切机高速搅拌(3000r/min)的80ml～60ml纯净水中，在氮气保护的条件下继续搅拌30min，即得多相脂质体药物溶液。

3.多相脂质体药物溶液经高压挤压器均质7～8次，压力为3-6MPa，得到粒径范围在150nm～250nm的大单室单相脂质体药物溶液。最终产品应该是均匀的乳状溶液，没有沉淀，分层现象。

4.该产品装瓶后应在2℃～15℃和避光条件下贮藏。

1.3工艺流程(参见图1的本发明的制备工艺流程图)

1)首先将各种处方用药和辅料准备好；

2)加入乙醇并加热(40±2℃)，搅拌15min；

3)收集上述乙醇药物溶液；

4)然后将上述乙醇药物溶液加入去离子水并经剪切机搅拌30min，得到多相脂质体药液；

5)将上述多相脂质体药液用挤压器均质7～8次，即得到大单室单相脂质体药液。

2.1实施例

实施例第一部分：促毛发生长药物处方用量范围

本发明对所列化学合成促毛发生长药物在处方中的用量范围进行了验证。在本发明的工艺和条件下，脂质体处方除了卵磷脂用量依米诺地尔的用量相应调整外其他组分和用量基本保持固定不变，由于米诺地尔的溶解性问题，化学合成药物米诺地尔的用量在0.5％-20％含量范围内的任一用量都保证可以制成稳定的最终产品。虽然原则上米诺地尔含量在0.5％以下可以制成稳定的脂质体药液，但是其药液浓度达不到有效促毛发生长浓度，已无药用意义，故不在实施例中加以考察。

实施例1：药物脂质体产品中含1.5％米诺地尔

药物脂质体处方：

名称	分子量	摩尔比(％)	投料量(g)
				卵磷脂	760		4.0
米诺地尔	209.25		1.5

将处方量卵磷脂，米诺地尔加入40ml乙醇，加热至45℃搅拌使之完全溶解。而后将乙醇药物溶液缓慢的加入用剪切机高速搅拌(3000r/min)的60ml纯净水中，在氮气保护的条件下继续搅拌30min，即得多相脂质体药物溶液。多相脂质体药物溶液经高压挤压器均质7次，压力为4Mpa～6MPa，均质过程注意温度不得超过60℃，得到粒径200nm±50nm的大单室单相脂质体药物溶液。稀释后的最终产品为均匀的乳状溶液，没有沉淀，分层现象。产品灌装后在2℃～15℃和避光条件下贮藏。

实施例2：药物脂质体产品中含0.5％米诺地尔

药物脂质体处方：

名称	分子量	摩尔比(％)	投料量(g)
				卵磷脂	760	80	8.36
米诺地尔	209.25	20	0.5

取处方量卵磷脂，米诺地尔，加入24ml乙醇，加热搅拌至完全溶解。将乙醇药物溶液缓慢的加入用剪切机高速搅拌(3000r/min)的76ml纯净水中，在氮气保护的条件下继续搅拌35min，即得多相脂质体药物溶液。多相脂质体药物溶液经高压挤压器均质6次，压力为4-6MPa，均质过程注意温度不得超过60℃，得到粒径为200nm±35nm的大单室单相脂质体药物溶液。最终产品为均匀的乳状溶液，没有沉淀、分层现象。产品灌装后在2℃～15℃和避光条件下贮藏。

粒径检测：

将制备完成的含醇脂质体米诺地尔取25μl，加入到25ml容量瓶中，生理盐水稀释定容，取250μl置于小试管中，上机(NICOMP^TM380 PSS-NICOMPsubmicron particle sizer)检测粒径。重复3次取平均值。含醇脂质体粒径分布用激光散射法检测，结果显示平均粒径为194.7nm(见图2)。粒径较均一，大部分脂质体粒径分布在50nm～500nm之间。

8批次样品的激光散射法检测平均粒径为195.25±3nm。

激光散射法检测不同批次1％含醇脂质体粒径

样品	平均粒径(nm)
		1	199.3
2	192.6
		3	200.4
4	193.4
		5	195.7
6	192.8
		7	196.1
8	191.7
		平均	195.25±3

结构检测：

用10mmol/L的醋酸铵，50mmol/L Tris pH7.5溶液悬浮脂质体，样品滴在有支持膜的铜网上，滤纸吸干，再滴醋酸铵，滤纸吸干，自然干燥30min，透射电镜(HITACHI H-600)观察脂质体结构。

取1％的含醇脂质体米诺地尔(4％卵磷脂、40％乙醇)透射电镜下观察，含醇脂质体为单室或多室的中空薄层泡囊，粒径比较均一(见图3)。药物包埋率测定：

1)反相高效液相法：

色谱条件：色谱柱，AlltechC18(150mm×4.6mm，5μm)；流动相，甲醇∶水∶冰醋酸(70∶30∶0.1)加癸烷基磺酸钠0.2g离子对试剂；检测波长254nm；进样量，20μl，流速1ml/min；柱温37.0℃。米诺地尔的保留时间为6min左右。

2)线性试验：

精密称定米诺地尔对照品适量，甲醇(色谱醇)超声溶解，配成浓度为0.001，0.01，0.05，0.25，0.75，1.25mg/ml，分别精密吸取20μl，注入液相色谱仪，测定。以峰面积对浓度的1g值回归，得回归方程为：y＝1.0039x+7.6563 R2＝0.9997，r＝0.99985(n＝8)。试验结果表明，米诺地尔对照品进样量在0.001～1.25mg/ml范围内呈良好的线性关系。

3)精密度实验：

取同一对照品溶液重复进样5次，记录米诺地尔的峰面积值，计算RSD为：0.51％，表明本法精密度良好。

4)稳定性实验：

取同一样品供试液分别于1h，2h，4h，6h，8h进样，记录米诺地尔的峰面积值，计算RSD为：0.75％，表明样品供试液在8h内稳定性良好。

5)药物的包埋率通过超速离心法测定：

在4℃下，含醇脂质体米诺地尔在TL-100超速离心机中以20000rpm离心4h。反相高效液相法检测悬浮药物量和沉淀的药物量。

米诺地尔的包封率通过以下公式计算：

[(T-C)/T]×100％

式中，T是悬浮药物量和沉淀的药物量的和，C是悬浮药量。

在本色谱条件下，磷脂对米诺地尔的测定没有干扰，米诺地尔的峰型良好，符合分析要求。

药物的包封率通过超速离心法以高效液相色谱法检测不同批次含醇脂质体中米诺地尔的包封率平均为为90.4±6.2％。米诺地尔的包封率通过以下公式计算：

[(T-C)/T]×100％。

HPLC法检测不同批次中含醇脂质体中米诺地尔的包封率

样品	包封率(％)
		1	84.5
2	83.6
		3	92.1
4	97.2
		5	98.1
6	96.2
		7	86.4
8	85.1
		平均	90.4±6.2

稳定性测试：

制备样品360天后通过观察性状、重新测定粒径初步判断脂质体稳定性情况。

DLS检测三批次样品不同时间显示制剂的粒径在室温下保持稳定可达1年。液体呈现均匀的乳状，没有沉淀和分层现象。

激光散射法检测不同时间点1％含醇脂质体粒径稳定性nm(

)

制备后检测时间(天)	批次
				1	2	3
	1	-	194±4				195±6
30				-	198±2	199±7
	60	-	201±10				203±13
180				-	201±5	205±9
	360	205±8	-				-

实施例第二部分：脂质体各包材处方用量范围

本发明对所列脂质体各包材的用量范围进行了验证。在本发明的工艺和条件下，保持米诺地尔1％的用量固定不变，同时在保证卵磷脂、油酸、氮酮、维生素E和薄荷油的总量为85摩尔％的前提下，卵磷脂的用量在65摩尔％～80摩尔％，氮酮用量在0～0.1摩尔％，维生素E用量在0.05摩尔％～0.2摩尔％，薄荷油用量在0.05摩尔％～0.3摩尔％的含量范围内的任一用量都可以制成稳定的最终产品。

实施例3：药物脂质体产品中含1％米诺地尔

药物脂质体处方：

名称	分子量	摩尔比(％)	投料量(g)
				卵磷脂	760		4.0
米诺地尔	209.25		1.0
				氮酮	281.48		0.002
维生素E	472		0.006
				薄荷油			0.06

处方量卵磷脂，米诺地尔，氮酮，维生素E，薄荷油加入24ml乙醇，加热搅拌至完全溶解。将乙醇药物溶液缓慢的加入用剪切机高速搅拌(3000r/min)的76ml纯净水中，在氮气保护的条件下继续搅拌35min，即得多相脂质体药物溶液。多相脂质体药物溶液经高压挤压器均质6次，压力为4-6MPa，均质过程注意温度不得超过60℃，得到粒径为200nm±35nm的大单室单相脂质体药物溶液。最终产品为均匀的乳状溶液，没有沉淀、分层现象。产品灌装后在2℃～15℃和避光条件下贮藏。

实施例4：药物脂质体产品中含0.5％米诺地尔：

药物脂质体处方：

名称	分子量	摩尔比(％)	投料量(g)
				卵磷脂	760	80	8.36
米诺地尔	209.25	20	0.5
				氮酮	281.48		0.002
维生素E	472		0.006
				薄荷油			0.06

处方量卵磷脂，米诺地尔，氮酮，维生素E，薄荷油加入40ml乙醇，加热搅拌至完全溶解。将乙醇药物溶液缓慢的加入用剪切机高速搅拌(3000r/min)的60ml纯净水中，在氮气保护的条件下继续搅拌35min，即得多相脂质体药物溶液。多相脂质体药物溶液经高压挤压器均质6次，压力为4-6MPa，均质过程注意温度不得超过60℃，得到粒径为200nm±35nm的大单室单相脂质体药物溶液。最终产品为均匀的乳状溶液，没有沉淀、分层现象。产品灌装后在2℃～15℃和避光条件下贮藏。

实施例第三部分：透皮实验模型检测含醇脂质体米诺地尔的促透效果

实施例5：

回收率试验：

取空白C57BL/6小鼠离体皮肤，匀浆机匀碎后取适量，按不同浓度分别加入定量的米诺地尔甲醇(色谱醇)溶液，超声混合，静置2h，以7000g离心10min，留取上清。提取两次，合并提取液，微孔滤膜滤过，取续滤液检测。

Sample	Added(μg)	Found(μg)	Recovery(％)	Averagerecovery(％)	RSD(％)
							25.24	25.13	99.56
Minoxidi	15.1310.015.261.060.210.020.004	14.589.785.150.990.1980.0190.0038	96.3697.709709193.40940290.950.95	96.15	2.10

样品的经皮渗透测定：

透皮实验操作步骤：取C57BL/6小鼠，处死，剪去背部绒毛，取背部皮肤，刮除皮下脂肪组织，将预处理好的皮肤固定在经皮渗透装置上。先将磁搅拌子放在接受池内，再将制备的离体鼠皮平放在接受池上端，角质层面向上，然后将释放池用夹子固定于接受池上。定量加入1％含醇脂质体米诺地尔和1％普通米诺地尔溶液7ml于释放池内，用注射器通过取样管将生理盐水注入接受池，排净空气，使皮肤另一面与接受液紧密接触，37℃恒温120r/min搅拌。分别于2，4，8，10，12，24h于接受池内取样0.5ml，滤过，取续滤液检测。再补加0.5ml新鲜接受液。24h后取扩散用皮肤，匀浆机匀碎后，加入定量的甲醇(色谱醇)溶液，超声混合，静置2h，以7000g离心10min，留取上清。提取两次，合并提取液，微孔滤膜滤过，取续滤液检测。重复实验5次。

溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，外标法求出相应药物浓度C_i，按累积渗透量公式计算累积渗透量Q(μg/cm²)：

$Q=(C_n\×13+\underset{i=1}{\overset{n-1}{\mathrm{\Σ}}}{C}_i\×0.5)/S$

式中，S为渗透面积(cm²)；C_n为第n个取样点测得的样品浓度(μg/ml)；C_i为第i个取样点测得的样品浓度(μg/ml)。

米诺地尔的累积皮肤透过量(n＝5，

ug/cm.sup.2)

剂型	t/h
								2h	4h	6h	8h	12h	24h	皮肤储存量(24h)
	含醇脂质体米诺地尔	2.55±0.30	8.84±0.73	17.97±0.68	30.62±0.69	44.76±0.90	253.68±1.17								104.69±3.15
普通米诺地尔								0.89±0.17	1.65±0.14	3.50±0.33	5.85±0.32	10.35±0.57	26.70±1.13	34.82±1.19
	P	0.000211	1.15E-05	5.53E-07	1.07E-07	1.58E-07	1.25E-10								3.14E-07

结果提示，用药2h、4h、6h、8h、12h、24h，1.0％含醇脂质体米诺地尔组和1.0％普通米诺地尔组累积皮肤透过量比较(P＜0.01)，统计结果有显著性差异；而1.0％含醇脂质体米诺地尔组和1.0％普通制剂米诺地尔组24h皮肤储存量比较(P＜0.01)，统计结果也有显著性差异。

据以上结果可以得出以下结论：含醇脂质体米诺地尔组较普通制剂米诺地尔组比较，无论累积皮肤透过量还是皮肤储存量，含醇脂质体米诺地尔均显示明显的优势。因此该实验结果表明了研制的含醇脂质体米诺地尔具有促进透皮吸收和皮肤蓄积的特点。

实施例第四部分：动物实验模型检测含醇脂质体米诺地尔的皮肤蓄积效果

实施例6：

动物实验模型可以用C57BL/6小鼠或其他鼠系建立毛发周期动物模型。

将实验动物饲养在清洁级环境中，选择背部皮肤作为涂药区；首先用石蜡脱毛法使小鼠毛发周期同步化。20天后毛囊同步进入休止期，在小鼠背部用刀片小心剃除背部毛，使小鼠背部光滑，无伤无残毛，剃毛面积约2cm×3cm。随机分为2组，剃毛后直接涂抹，每日2次。分别于用药1，2，4，8，12，24h后按不同区域取0.5*0.8mm.sup.2大小皮肤全层，匀浆机匀碎后，加入定量的甲醇(色普醇)溶液，超声混合，静置2h，以7000g离心10min，留取上清。提取两次，合并提取液，微孔滤膜滤过，取续滤液检测。

结果提示，动物体内实验模型中1.0％含醇脂质体米诺地尔组和1.0％普通制剂米诺地尔组各个时间点皮肤储存量比较(P＜0.01)，统计结果有显著性差异。据以上结果可以得出以下结论动物体内实验模型中，皮肤储存量上含醇脂质体米诺地尔显示明显的优势。因此该实验结果也表明了研制的含醇脂质体米诺地尔具有促进透皮吸收和皮肤蓄积的特点。

实施例第五部分：动物实验模型检测含醇脂质体的荧光蓄积

实施例7：荧光标记的含醇脂质体体内透皮实验

依照上述方法制备含醇脂质体，其中含醇脂质体钙黄绿素制备完成后尚需进行柱分离，凝胶柱除去未被包裹的游离钙黄绿素，以其获得完全包裹于脂质体内的脂质体钙黄绿素制剂；同浓度的钙黄绿素水溶液作对照。而含醇脂质体体系含有PE-Rhodamine的浓度为0.56mg/ml。

透皮模型的皮肤可以用大白鼠、小鼠背部皮肤，也可以人人手术后的废弃皮肤。

将近交系C57BL/6小鼠，雌性，28日龄饲养到44日龄时选择皮色粉红毛发处于休止期的小鼠15只(体重18±0.5g)随机分为3组；小鼠背部用刀片小心剔除背部毛，剃毛后分别直接涂抹PE-Rhodamine标记的含醇脂质体、含醇脂质体钙黄绿素和钙黄绿素水溶液。分别于用药1，2，4，8，12，24h后按不同区域取0.5×0.8mm²大小皮肤全层，放入-25℃的冰冻切片机中，预冷30min，使整个组织块***，观察毛发生长方向，修剪组织块，使切片的方向与毛发生长纵轴方向一致，然后用包埋剂OCT将标本固定于样品盘上，继续冷冻30min后开始切片，修理表面多余的包埋剂和组织块，调整样品与刀的角度，使切片方向与毛发生长纵轴方向一致，切出厚度为50μm的标本，荧光显微镜和激光共聚焦显微镜直接观察，拍照。激发波长为488nm，发射波长为520nm，发射强度和各向异性通过空白标本校正背景荧光和散射效应。

相同实验条件下，脂溶性的荧光标记物PE-Rhodamine可以进入皮肤全层，毛囊附近有高聚集。含醇脂质体钙黄绿素较钙黄绿素水溶液进入皮肤更深、更多，并且更多聚集于毛囊周围。图4，5，6显示，荧光显微镜下观察，24h后含醇脂质体制备的酯溶性荧光标记物PE-Rhodamine在皮肤全层可见较高浓度的聚集，毛囊附近尤为突出。而含醇脂质体制备的水溶性荧光标记物钙黄绿素与未经包裹的裸钙黄绿素水溶液比较，透皮进入皮肤全层的量和深度均显示明显的优势，同样毛囊附近有荧光剂的高聚集。激光共聚焦显微镜下观察，空白校正皮肤标本内未见荧光(见图7，8)。24小时后，钙黄绿素水溶液荧光仅存在于表皮，毛囊口有少许渗入(见图9)。相同实验条件下，钙黄绿素含醇脂质体不仅位于表皮和真皮层，毛囊附近亦有高聚集，在强度和深度上明显优于裸钙黄绿素组(图10)，说明水溶性的钙黄绿素通过包裹可以透皮进入皮肤深层，并且在毛囊周围形成高聚集。脂质体制备的酯溶性荧光标记物PE-Rhodamine在皮肤全层可见较高浓度的聚集，毛囊附近尤为突出(图11)，进一步说明含醇脂质体的磷脂成分亦能透过角质层到达真皮层，并聚集于毛囊周围。

结果显示：动物体内实验模型中，含醇脂质体***可以携带脂溶性和水溶性的药物进入皮肤深层，毛囊蓄积显示毛囊皮脂腺途径可能是含醇脂质体的重要传递途径，靶向毛囊传递突显了脂质体的特点。

实施例第六部分：含醇脂质体米诺地尔对C57BL/6小鼠毛发生长的影响

实施例8：将近交系C57BL/6小鼠，雌性，28日龄饲养到44日龄时选择皮色粉红毛发处于休止期的小鼠60只(体重18±0.5g)随机分为不同组；小鼠背部用刀片小心剔除背部毛，剃毛后直接涂抹不同制剂的米诺地尔；连续观察小鼠皮色变化以及毛发生长情况并进行数码照相；分别在涂药18天和35天时从各组小鼠涂药区取材，固定后制作冰冻切片，光镜下观察毛囊组织学变化，电镜下观察超微结构变化；采用数码照相和图像分析结合的方法，观察各组药物对VEGF表达的影响；实验结束时测量各组涂药区毛发直径。

1.含醇脂质体米诺地尔对C57BL/6小鼠皮肤刺激性结果

根据皮肤刺激性反应分值标准和皮肤刺激性强度评价标准评判结果如下：

皮肤刺激性反应评分标准

刺激反应情况	分值	刺激反应情况	分值
				红斑：无红斑勉强可见明显可见中度到严重红斑***斑并有焦痂形成	01234	水肿无水肿勉强可见可见(边缘高起周围皮肤)皮肤***约1cm，轮廓清楚水肿***1cm以上	01234

皮肤刺激性强度评分标准

平均值	评价
		0～0.490.5～2.993.0～5.996.0～8.0	无刺激性轻刺激性中刺激性强刺激性

评判结果发现含醇脂质体米诺地尔组及空白脂质体组涂药区皮肤未见明显的红斑、水肿等刺激反应，各组刺激反应积分值小于0.49，表明脂质体制剂对小鼠完整皮肤无明显刺激性。

2.含醇脂质体米诺地尔对C57BL/6小鼠皮肤的影响和组织学上的改变

用药18天时，前2组均处于毛发生长期，皮肤均呈黑色，其中1.4％含醇脂质体米诺地尔组小鼠毛发大多数已长出皮肤(见图12A，B，C)，组织学发现毛囊体积较大，毛***完全被毛球包绕，毛球达皮下组织深层，毛球内有明显的黑素形成，并可见新的毛发和内毛根鞘，大多数处于生长期第VI亚期(见图12D)。

而1.4％米诺地尔组小鼠皮肤大多数变黑，但毛发多未长出皮肤(见图13A，B，C)，组织学可见毛囊向下生长，其末端毛囊上皮细胞(毛球)部分包绕毛***，毛***较为疏松体积较小，黑素产生较少，多处于生长期第III亚期(见图13D)。

大部分空白脂质体和空白对照组小鼠皮肤仍为粉红色(见图14A，B，C)，组织学可见毛囊数目较少，毛干末端呈杵状，毛***缩小，毛囊下端退化，少见黑素生成，毛***上移至立毛肌附着水平，毛囊大多处于典型的休止期状态(见图14D)

各组皮肤皮色平均光密度值(OD)分析结果(

dn＝12)

组别	1.4％含醇脂质体米诺地尔	1.4％米诺地尔	空白脂质体	空白对照组
					OD	0.54±0.11	0.29±0.06	0.16±0.07	0.15±0.05

上表中灰度值分析结果也同时与以上肉眼观测和组织学的毛囊分期基本一致。

3.含醇脂质体米诺地尔对C57BL/6小鼠毛发周期的影响

各组药物对毛发周期的影响(

dn＝12)

组别	用药至皮肤开始变黑的时间(t1)	皮肤开始变黑到开始变灰时间(t2)
			1.4％含醇脂质体米诺地尔	6.0±0.9	15.9±2.2
1.4％米诺地尔	15.3±2.2	14.4±2.3
			空白脂质体	23.8±3.0	12.3±2.4
空白对照组	23.3±2.4	11.9±2.5

原始各组数据经Kolmogorov-Smirnov检验P＞0.05，尚不能认为各组样本来自的总体不服从正态分布，各组数据经Levene检验P＞0.05，采用方差分析，得P＜0.01，进一步进行两两比较，结果如下：

各组用药至皮肤开始变黑的时间(t1)比较结果

	1组&4组	1组&3组	1组&2组	2组&4组	3组&4组
						P值	P＜0.01	P＜0.01	P＜0.01	P＜0.01	P＞0.05

各组皮肤开始变黑到开始变灰时间(t2)比较结果

	1组&4组	1组&3组	1组&2组	2组&4组	3组&4组
						P值	P＜0.01	P＜0.01	P＞0.05	P＜0.05	P＞0.05

从结果可以看出，1.4％含醇脂质体米诺地尔组和1.4％米诺地尔组小鼠皮肤由粉红色变为黑色(从休止期向生长期转变)的时间较空白对照组分别提前了17.3d(P＜0.01)和8.0d(P＜0.01)，并且统计结果有显著性差异；皮肤处于黑色的总时间分别延长4.0d(P＜0.01)和2.5d(P＜0.05)，统计结果有显著性差异。其中1.4％含醇脂质体米诺地尔组同1.4％米诺地尔组相比皮肤由粉红色变为黑色的时间(t1)提前了9.3d，且P＜0.01，有显著性差异。

4.含醇脂质体米诺地尔对C57BL/6小鼠毛发直径的影响

表3-7各组药物对毛发直径的影响(

d)

组别	1.4％含醇脂质体米诺地尔	1.4％米诺地尔	空白脂质体	空白对照组
					毛发直径(μm)	60.31±5.64	54.26±6.09	52.72±6.80	48.98±5.25

原始各组数据经Kolmogorov-Smirnov检验P＞0.05，尚不能认为各组样本来自的总体不服从正态分布，各组数据经Levene检验P＞0.05，采用方差分析，得P＜0.01，进一步进行两两比较，结果如下：

表3-8各组毛发直径比较结果

	1组&4组	1组&3组	1组&2组	2组&4组	3组&4组
						P值	P＜0.01	P＜0.01	P＜0.05	P＜0.05	P＞0.05

结果提示，1.4％含醇脂质体米诺地尔组(P＜0.01)、1.4％米诺地尔组(P＜0.05)小鼠的毛发直径大于空白对照组，且统计结果有显著性差异。且1.4％含醇脂质体米诺地尔组小鼠的直径大于1.4％米诺地尔组，统计学结果有显著性差异(P＜0.05)。

米诺地尔组均可诱导小鼠毛囊从休止期向生长期转变，并加速此进程，同时延长了生长期，生长出的毛发直径***，1.4％含醇脂质体米诺地尔组可诱导小鼠的休止期更快得向生长期的转变，并且优于1.4％米诺地尔组，故实验结果表明了脂质体制剂治疗脱发的可行性和潜在的市场前景。

5.含醇脂质体米诺地尔对C57BL/6小鼠VEGF的表达的影响

用药18天时，米诺地尔各组小鼠的毛发多处于生长期毛囊，其中阳性表达部位主要位于毛囊皮脂腺单位中的细胞胞膜和胞浆中，而空白脂质体组和空白对照组多处于典型的休止期毛囊，毛囊皮脂腺单位的阳性着色深浅和面积较前两组少(见图15、图16)；用药35天时，各组多为休止期毛囊，毛囊皮脂腺单位的阳性着色较浅、面积也较少。

原始各组数据经Kolmogorov-Smirnov检验P＞0.05，尚不能认为各组样本来自的总体不服从正态分布，各组数据经Levene检验P＜0.05，进行变量变换后，Kolmogorov-Smirnov检验P＞0.05，Levene检验P＞0.05，采用方差分析，得P＜0.01，进一步进行两两比较，结果如下：

各组皮肤VEGF平均光密度值(IOD)比较结果(18天)

	1组&4组	1组&3组	1组&2组	2组&4组
					P值	P＜0.01	P＜0.01	P＜0.05	P＜0.05

结果提示，用药18天时，1.4％含醇脂质体米诺地尔组(P＜0.01)、和1.4％普通制剂米诺地尔组(P＜0.05)小鼠皮肤VEGF阳性表达的IOD值大于空白对照组，统计结果有显著性差异；而1.4％含醇脂质体米诺地尔组小鼠皮肤VEGF阳性表达的IOD值大于1.4％普通制剂米诺地尔组，统计学结果有显著性差异(P＜0.05)；。

据以上结果课得出以下结论：脂质体制剂对小鼠完整皮肤无明显刺激性。米诺地尔组均可诱导小鼠毛囊从休止期向生长期转变，并加速此进程，同时延长了生长期，生长出的毛发直径***，1.4％含醇脂质体米诺地尔组效果优于1.4％米诺地尔组。含醇脂质体米诺地尔可能通过上调小鼠毛囊的VEGF表达，并促进毛囊周围细胞增殖，从而导致小鼠毛发周期的改变。因此该实验结果表明了含醇脂质体米诺地尔治疗脱发的可行性。

综上所述，本发明的用于促进毛发生长的药物喷雾剂，有以下四大优势：

1.有效促进毛发生长：

制剂内含米诺地尔，可诱导小鼠毛囊从休止期向生长期转变，并加速此进程，同时延长了生长期，生长出的毛发直径***，达到促进毛发生长的作用；

2.透皮性能好，作用持久，减少复发：

脂质体独特的结构以及采用磷脂、簿荷油、月桂氮酮和乙醇组成的天然与合成复合多元促透剂可以达到单一促透剂无法比拟的效果，使该产品具有很强的透皮性，能将药物送达并蓄积于皮肤深层，即使停药后仍能持续发挥药力，有效减少脱发的复发，同时又可减少药物进入血液而引发的全身毒性；

3.酯溶性和水溶性的荧光剂均在毛囊部位形成了高浓度聚集，初步显示了研制的含醇脂质体具有亲毛囊的特性。

4.护肤作用：

脂质体具有生物膜相似结构，作为皮肤局部用药载体避免了对皮肤的刺激，还能起到护肤作用，维生素E的抗氧化剂和皮肤营养作用也对皮肤起到保护作用。

Claims (3)

1.一种用于促进毛发生长的药物喷雾剂，其特征在于制得该喷雾剂的有效组分及其百分比的原料组成为：米诺地尔：0.5％～20％，卵磷脂：50％～80％，维生素E：0～0.4％，氮酮：0～0.2％，天然精油：0～10％，余量为乙醇，上述原料总和为100％。

2.如权利要求1所述的用于促进毛发生长的药物喷雾剂，其特征在于，所说的卵磷脂是：蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、人工合成卵磷脂、鞘磷脂中的一种或几种。

3.如权利要求1所述的用于促进毛发生长的药物喷雾剂，其特征在于，所说的天然精油是：薄荷油、桉叶油、玫瑰油、松木油、丁香油、麝香草油、熏衣草油、木香油、柠檬油、留兰香油、香柠檬油、檀香油的一种或几种。

Images