CN101117344A - 用于分离核酸的过滤装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用包含多个膜的过滤装置从样品中分离核酸的方法。本发明也提供包含多个膜的装置以及适于从样品中分离核酸的试剂盒。本发明也提供与微生物基因组的至少一部分结合的核酸以及使用所述核酸的方法。

Description

用于分离核酸的过滤装置

本申请要求2006年6月29日提交的美国临时申请No.60/817,504和2007年1月18日提交的美国临时申请No.60/881,058的优先权，在此通过引用将其全部内容并入本申请。

技术领域

本发明一般性涉及分子生物学领域。在某些特定的实施方式中，本发明提供了与核酸分离及检测相关的装置、试剂盒和方法。

背景技术

分离核酸常常是大多数分子生物学研究的第一个步骤，所述研究包括PCR、基因克隆、测序、Southern印迹、Northern印迹、核酸酶保护分析、RT-PCR、RNA图谱、体外翻译、体外转录、包括转录/扩增反应和cDNA文库构建。获得适合于分析的高质量的完整核酸因此常常是后继分析的有用的和所需的起点。虽然已经描述了各种用于从样品中分离出核酸的技术(见例如美国专利No.5,075,430、5,234,809、5,155,018、6,274,308、6,277,648、6,958,392、6,953,686、6,310,199、6,992,182、6,475,388、5,075,430；美国专利申请No.20060024701；欧洲专利No.EP0765335；Boom et al.1990，J.Clinical Microbiology 28：495)，但是提供一种快速的、经济的和高产量的从样品中分离出核酸的方法仍然是有益的。如果方法能使得对样品的所需操作最简化、容许使用主要是液体的操作步骤以及可以利用单一装置例如过滤装置实施所述方法，那么该方法也是有用的。在此所述的本发明的某些实施方式提供了这样一种方法。在此所述的本发明的其它实施方式提供了可以用于从样品中分离出核酸的装置和试剂盒。本发明的其它实施方式也提供了对样品中的核酸进行检测。

发明内容

在某些实施方式中，本发明提供了一种从样品中分离出核酸的方法，包括a)将包含多个多孔膜的过滤装置与样品接触，使得样品依次地接触多个多孔膜，所述接触从第一个多孔膜开始，随后至少接触第二个多孔膜；b)裂解第一个多孔膜上的样品，其中第一个多孔膜的标定孔径小于第二个多孔膜的标定孔径；c)给过滤装置施加外力，据此在多个多孔膜中的至少一个多孔膜上分离出核酸。样品可以是细胞样品或者例如包含病毒颗粒的病毒样品。任选地，可以从其中一个多孔膜中洗脱出所分离的核酸。

在其它实施方式中，本发明提供了一种从样品中分离出核酸的方法，包括将包含多个多孔膜的过滤装置与样品接触，使得样品依次地接触多个多孔膜，所述接触从包含聚合物的第一个多孔膜开始，随后至少接触包含硅酸盐的第二个多孔膜，据此在多个多孔膜中的至少一个多孔膜上分离出核酸。聚合物膜可以具有比硅酸盐膜更小的标定孔径。样品可以是细胞样品或病毒样品，每一种或者两种都可以在其中一个膜上、例如在第一个多孔膜上被原位裂解。任选地，可以从其中一个多孔膜上洗脱出所分离的核酸。

在其它实施方式中，本发明提供了一种从样品中分离出核酸的方法，包括将包含多个多孔膜的过滤装置与样品接触，使得样品依次地接触多个多孔膜，所述接触从包含多糖的第一个多孔膜开始，随后至少接触包含硅酸盐的第二个多孔膜，据此在多个多孔膜中的至少一个多孔膜上分离出核酸。多糖膜可以具有比硅酸盐膜更小的标定孔径。样品可以是细胞样品或病毒样品，其中一种或者两种都可以在其中一个膜上、例如在第一个多孔膜上被原位裂解。任选地，可以从其中一个多孔膜上洗脱出所分离的核酸。

仍在其它实施方式中，本发明提供了一种从样品中分离出核酸的方法，包括将包含多个多孔膜的过滤装置与样品接触，使得样品依次地接触多个多孔膜，所述接触从包含包含磺酰基的聚合物的第一个多孔膜开始，随后至少接触包含硅酸盐的第二个多孔膜，据此在多个多孔膜中的至少一个多孔膜上分离出核酸。包含磺酰基的聚合物膜可以具有比硅酸盐膜更小的标定孔径。样品可以是细胞样品或病毒样品，其中一种或者两种都可以在其中一个膜上、例如在第一个多孔膜上被原位裂解。任选地，可以从其中一个多孔膜上洗脱出所分离的核酸。

仍在其它实施方式中，本发明提供了一种从样品中分离出核酸的方法，包括将包含多个多孔膜的过滤装置与样品接触，使得样品依次地接触多个多孔膜，所述接触从包含包含磺酰基的聚合物的第一个多孔膜开始，随后至少接触包含多糖的第二个多孔膜，据此在多个多孔膜中的至少一个多孔膜上分离出核酸。包含磺酰基的聚合物膜可以具有比多糖膜更小的标定孔径。样品可以是细胞样品或病毒样品，其中一种或者两种都可以在其中一个膜上、例如在第一个多孔膜上被原位裂解。任选地，可以从其中一个多孔膜上洗脱出所分离的核酸。

在一些实施方式中，本发明提供了一种从样品中分离出RNA的方法，包括将包含多个多孔膜的过滤装置与样品接触，使得样品首先接触包含混合纤维素酯的膜，随后接触包含玻璃纤维的膜，其中混合纤维素酯膜的标定孔径比玻璃纤维膜的标定孔径更小，任选地从装置中洗脱出RNA，据此从样品中分离出RNA。样品可以是细胞样品或病毒样品，其中一种或者两种都可以在其中一个膜上、例如第一个多孔膜上被原位裂解。

在一些实施方式中，本发明提供了一种从样品中分离出DNA的方法，包括将包含多个多孔膜的过滤装置与样品接触，使得样品首先接触包含包含磺酰基的聚合物的膜，随后接触包含玻璃纤维的膜，其中包含磺酰基的聚合物膜的标定孔径比玻璃纤维膜的标定孔径更小，从装置中洗脱出DNA，据此从样品中分离出DNA。在某些实施方式中，在包含磺酰基的聚合物膜上分离到至少一些DNA。在其它实施方式中，在玻璃纤维膜上分离到至少一些DNA。样品可以是细胞样品或病毒样品，每一种或者两种都可以在其中一个膜上、例如第一个多孔膜上被原位裂解。任选地，可以从其中一个多孔膜中洗脱出所分离的DNA。

仍在其它实施方式中，本发明提供了一种从细胞样品中分离出RNA的方法，包括a)将细胞样品与包含聚合物的第一个膜接触；b)给第一个膜施加外力，使得细胞样品被滞留于第一个膜的表面上；c)将保留于第一个膜的表面上的细胞样品与裂解缓冲液接触，使得样品中的细胞裂解；与RNA捕获缓冲液接触，使得从第一个膜中洗脱出样品中的RNA，并且与包含硅酸盐的第二个膜接触；d)给第一个和第二个膜施加外力，使得裂解缓冲液和RNA捕获缓冲液流过c)的第一个和第二个膜；e)任选地将d)的第一个和/或第二个膜与一种或多种洗涤缓冲液接触；f)任选地给e)的第一个和/或第二个膜施加外力，使得洗涤缓冲液流过第一个和/或第二个膜；g)加入无RNase水，使得从硅酸盐膜中洗脱出至少一些RNA，据此从样品中分离出RNA。在一些实施方式中，裂解缓冲液可以是与RNA捕获缓冲液相同的缓冲液，使得样品包含的细胞被裂解。

仍在其它实施方式中，本发明提供了一种从样品中分离出DNA的方法，包括a)将细胞样品与多个膜接触，其中第一个膜包含聚合物，在样品与第一个膜接触随后，以至少一个附加的膜与样品接触，其中所述至少一个附加的膜包含硅酸盐；b)给聚合物膜施加外力，使得样品被保留于聚合物膜的表面上；c)将保留于聚合物膜表面上的样品与裂解缓冲液接触，使得含有DNA的样品裂解；d)给第一个和第二个膜中的至少一个施加外力，使得裂解缓冲液至少流过c)的第一个和第二个膜；e)任选地将d)的第一个和/或第二个膜与一种或多种洗涤缓冲液接触；O任选地给e)的至少第二个膜施加外力，使得洗涤缓冲液至少流过第二个膜；g)向多个膜中加入无核酸酶的水，使得从至少一个膜中洗脱出至少一些DNA，据此从样品中分离出DNA。

在某些其它的实施方式中，本发明提供了适合于从样品中分离出核酸的过滤装置，其包含依次设置的多个多孔膜，使得施加于过滤装置的样品与第一个多孔膜接触，随后至少接触第二个多孔膜，其中第一个多孔膜的标定孔径小于第二个多孔膜的标定孔径。

在另外的实施方式中，本发明提供了适合于从样品中分离出核酸的过滤装置，其包含依次设置的多个多孔膜，使得施加于过滤装置的样品与包含聚合物的第一个多孔膜接触，随后至少接触包含硅酸盐的第二个多孔膜。聚合物膜可以具有比硅酸盐膜更小的标定孔径。

仍在其它的实施方式中，本发明提供了适合于从样品中分离出核酸的过滤装置，其包含依次设置的多个多孔膜，使得施加于过滤装置的样品与包含包含磺酰基的聚合物的第一个多孔膜接触，随后至少接触包含硅酸盐的第二个多孔膜。包含磺酰基的聚合物膜可以具有比硅酸盐膜更小的标定孔径。

在另外的实施方式中，本发明提供了适合于从样品中分离出核酸的过滤装置，其包含依次设置的多个多孔膜，使得施加于过滤装置的样品与包含多糖的第一个多孔膜接触，随后至少接触包含硅酸盐的第二个多孔膜。多糖物膜可以具有比硅酸盐膜更小的标定孔径。

在其它的实施方式中，本发明提供了适合于从样品中分离出核酸的过滤装置，其包含依次设置的多个多孔膜，使得施加于过滤装置的样品与包含包含磺酰基的聚合物的第一个多孔膜接触，随后至少接触包含多糖的第二个多孔膜。包含磺酰基的聚合物膜可以具有比多糖膜更小的标定孔径。

在其它的实施方式中，本发明提供了适合于从样品中分离出RNA的过滤装置，其包含依次设置的多个多孔膜，使得施加于过滤装置的样品与包含混合乙酸纤维素的第一个多孔膜接触，随后至少接触包含玻璃纤维的第二个多孔膜，其中第一个多孔膜的标定孔径可以小于第二个多孔膜的标定孔径。

在其它的实施方式中，本发明提供了适合于从样品中分离出DNA的过滤装置，其包含依次设置的多个多孔膜，使得施加于过滤装置的样品与包含包含磺酰基的聚合物的第一个多孔膜接触，随后至少接触包含玻璃纤维的第二个多孔膜，其中第一个多孔膜的标定孔径可以小于第二个多孔膜的标定孔径。

在其它的实施方式中，本发明提供了适合于从样品中分离出DNA的过滤装置，其包含依次设置的多个多孔膜，使得施加于过滤装置的样品与包含包含磺酰基的聚合物的第一个多孔膜接触，随后接触包含包含磺酰基的聚合物的第二个多孔膜，随后至少接触包含玻璃纤维的第三个多孔膜，其中第一个多孔膜的标定孔径小于玻璃纤维膜的标定孔径。

在其它实施方式中，本发明提供了一种用于从样品中分离出核酸的试剂盒，包括a)适合于从样品中分离出核酸的过滤装置，其包含依次设置的多个多孔膜，使得施加于过滤装置的样品与第一个多孔膜接触，随后至少接触第二个多孔膜，其中第一个多孔膜的标定孔径可以小于第二个多孔膜的标定孔径；和b)至少一个容器。

在其它实施方式中，本发明提供了一种用于从样品中分离出核酸的试剂盒，包括a)适合于从样品中分离出核酸的过滤装置，其包含依次设置的多个多孔膜，使得施加于过滤装置的样品与包括聚合物的第一个多孔膜接触，随后至少接触包括硅酸盐的第二个多孔膜；和b)至少一个容器。聚合物膜可以具有比硅酸盐膜更小的标定孔径。

在其它实施方式中，本发明提供了一种用于从样品中分离出核酸的试剂盒，包括a)适合于从样品中分离出核酸的过滤装置，其包含依次设置的多个多孔膜，使得施加于过滤装置的样品与包括多糖的第一个多孔膜接触，随后至少接触包括硅酸盐的第二个多孔膜；和b)至少一个容器。多糖膜可以具有比硅酸盐膜更小的标定孔径。

在另外的实施方式中，本发明提供了一种用于从样品中分离出核酸的试剂盒，包括a)适合于从样品中分离出核酸的过滤装置，其包含依次设置的多个多孔膜，使得施加于过滤装置的样品与包含包含磺酰基的聚合物的第一个多孔膜接触，随后至少接触包括硅酸盐的第二个多孔膜；和b)至少一个容器。包含磺酰基的聚合物膜可以具有比硅酸盐膜更小的标定孔径。

在其它的实施方式中，本发明提供了一种用于从样品中分离出核酸的试剂盒，包括a)适合于从样品中分离出核酸的过滤装置，其包含依次设置的多个多孔膜，使得施加于过滤装置的样品与包含包含磺酰基的聚合物的第一个多孔膜接触，随后至少接触包括多糖的第二个多孔膜；和b)至少一个容器。包含磺酰基的聚合物膜可以具有比多糖膜更小的标定孔径。

仍在另外的实施方式中，本发明提供了一种用于从样品中分离出核酸的自动化***，包括a)适合于从样品中分离出核酸的过滤装置；b)泵；c)程序逻辑控制器(PLC)；d)至少一个适合于容纳样品的容器；e)任选地，一个或多个适合于容纳一种或多种试剂或缓冲液的容器；f)任选地，一个或多个适合于接收来自过滤装置的过滤液、来自过滤装置的洗脱液和/或来自过滤装置的废液的接收器；g)多个夹闭阀；h)管路和i)任选地，将来自管路的一种或多种液体加送至过滤装置中的注射器筒。

在另外的实施方式中，本发明提供了一种或多种适合于检测样品中的微生物的寡核苷酸。微生物可以包括支原体、病毒等等。

仍在另外的实施方式中，本发明提供了一种检测样品中的微生物的方法，包括a)将样品与特异地结合于靶核酸的一种或多种寡核苷酸接触，所述靶核酸包括微生物基因组的至少一部分；b)扩增靶核酸，据此检测样品中的微生物。任选地，靶核酸可以与特异地结合于至少一部分靶核酸的寡核苷酸探针接触，据此检测样品中的微生物。

附图说明

图1a和1b显示了本发明的过滤装置的一个实例，它是由微分隔装置(micropartition)组成的。

图2显示了本发明的过滤装置的一个实例。

图3a和3b显示了本发明的适合于接收多个样品或大体积样品的多孔格式的过滤装置的实例。

图4显示了本发明的适合于接收多个样品或大体积样品的多孔格式的过滤装置的另一个实例。

图5显示了本发明的单样品形式的过滤装置。

图6a显示了本发明的封闭形式的过滤装置：有通气口的和没有通气口的。

图6b显示了本发明的叠放形式的过滤装置。

图7显示了具有封闭的、有通气口形式的本发明的过滤装置的可控的、自动化的***。

图8是显示与用RNAeasy柱(Qiagen，Valencia，CA)分离到的rRNA相比较的，用本发明的方法所分离到的rRNA的琼脂糖凝胶的照片。

图9是显示来自样品的RNA的相对纯度的图。

具体实施方式

分离核酸的方法

在一些实施方式中，本发明提供了从样品中分离出靶核酸的方法，这是一种快速、容易实施并且只需要最小的样品处理次数的方法。本发明所提供的优点是可以接收粗制细胞输入物例如原核或真核细胞，并输出选择性的生物分子输出物。粗制细胞输入可以只包括在过滤装置所含的多个膜中的其中一个膜表面上例如原位裂解细胞样品。可以加工裂解物，以便用在此所述的方法分离核酸，而不必例如通过离心澄清裂解物。裂解物因此可以包含靶核酸以及细胞碎片、培养基和培养基添加剂。

在具体的实施方式中，本发明提供了一种在玻璃纤维膜上分离出RNA的方法，其中玻璃纤维膜是包含多个膜的过滤装置的一部分。在其它实施方式中，本发明提供了一种在聚合物膜例如包含磺酰基的聚合物膜上分离DNA的方法，其中聚合物膜是包含多个膜的过滤装置的一部分。

当靶核酸是RNA时，本发明提供了一种分离RNA的方法，所述方法不需要使用DNA酶，或者说需要比先前所述方法例如Qiagen柱(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)所需的DNA酶更少的DNA酶，这样就节省了时间和试剂费用。通常在多孔膜上将分离到变性状态的核酸，因此有助于进一步的加工处理，例如PCR包括RT-PCR、转录介导扩增(TMA)。靶核酸的分离可以被用于多种下游分析应用，包括例如鉴定感兴趣的致病性或非致病性生物体例如细菌。

在特定实施方式中，本发明提供了一种从由整个细胞例如原核或真核细胞组成的样品中分离出核酸的方法。可以将细胞与第一个膜接触，裂解细胞，可以在第二个或随后的膜上分离到靶核酸。或者，既可以在第一个也可以在第二个膜上分离到靶核酸。样品可以被施加于由多个膜组成的过滤装置，使得样品依次地与多个膜中的每个膜都接触。因此，样品可以与第一个膜接触，随后至少接触第二个膜。在一些实施方式中，样品可以与三个或更多个膜接触。

在样品与装置中的第一个膜接触之后，可以给装置施加外力，使得样品(例如靶核酸或者至少靶核酸的一部分)被保留于第一个膜的表面上，但是含有样品的溶液或液体例如培养基可以流过过滤装置。在一些实施方式中，可以通过重力或者通过例如经装置底部的通气口而附加于过滤装置的真空装置提供力。当外力是真空时，真空可以提供20-800毫巴的压力差。在其它实施方式中，可以通过正压提供力，所述正压被施加到过滤装置的顶部，例如当装置具有圆筒(cylinder)时，所述正压是通过活塞或组件运动提供，或者是通过注射器的外力。仍在其它实施方式中，力可以是通过将装置放置于离心机中所被施加的离心力。可以施加范围从1xg到15,000xg的离心力。仍在其它实施方式中，可以通过抽吸例如从第一个膜的上面去除溶剂，或者在容许样品沉降之后通过简单倾倒就可以去除溶剂。

本发明可以包括在样品与过滤装置所含的多个多孔膜的第一个膜接触之后，样品可以与不同的缓冲液接触。因此，在样品接触过滤装置所含的第一个膜以及任选地已经给过滤装置施加上面所述的力之后，样品可以与第一个缓冲液接触。当样品包含细胞和/或病毒颗粒时，第一个缓冲液可以是裂解缓冲液。可以使用本领域已知的任何裂解缓冲液。裂解缓冲液通常包括缓冲盐、去污剂和酶例如蛋白酶。酶例如可以是蛋白酶K或溶菌酶。在一个实施方式中，裂解缓冲液可以由50mM Tris-HCl(pH8.0)、100mM EDTA、2％Triton X-100构成。

在裂解之后，样品可以与沉淀剂接触，使得至少一部分样品所含的核酸沉淀到第一个多孔膜的表面上。沉淀剂可以包含胍盐(例如盐酸胍、硫氰酸胍)和醇例如乙醇。在一些实施方式中，沉淀剂包括终浓度范围从25％到50％的醇。样品可以与沉淀剂孵育足够长的时间，使得至少一些核酸沉淀到了第一个膜的表面上。在一些实施方式中，孵育时间的范围是从1到10分钟、1到5分钟、30秒到3分钟、30秒到20分钟、30秒到1个小时或1个小时或更长。利用上面所述的用于从样品中去除溶剂的技术例如施加外力可以从样品中去除沉淀剂和裂解缓冲液。

当靶分析物是RNA时，可以添加RNA捕获缓冲液，这容许靶核酸通过第一个膜并被吸附或沉淀到第二个膜上，使得从样品中分离出靶核酸。合适的RNA捕获缓冲液的实例包括4M盐酸胍、50mM Tris-HCl(pH 8.0)、100mM EDTA、2％Triton X-100、50％乙醇。可以用1％十二烷基硫酸钠作为2％Triton X-100的替代物。另一种RNA捕获缓冲液可以由4M盐酸胍、50mM Tris-HCl(pH 8.0)、100mM EDTA、5％乙酸乙酯和50％乙醇组成。

在任何步骤之间都可以给滞留于装置中的样品施加一种或多种洗涤缓冲液，所述步骤包括a)样品与过滤装置接触；b)沉淀；c)洗脱靶分子。例如在去除了沉淀剂和裂解缓冲液之后，样品可以与洗涤缓冲液接触，以便去除裂解和酶降解所生成的不需要的物质。可以使用本领域已知的任何洗涤缓冲液例如磷酸缓冲盐(PBS)和至少50％的乙醇、甲醇、或异丙醇或10mM Tris-EDTA(pH 8.0)或4M盐酸胍。利用上面所述的用于从样品中去除溶剂的任何方法都可以去除洗涤缓冲液。

可以洗脱下膜上的分离的靶核酸或者滞留于膜上的分离的靶核酸进行进一步的分析。当需要洗脱靶核酸时，可以用洗脱缓冲液自第一个膜或第二个膜收集靶核酸。或者，洗脱缓冲液可以从第一个膜或第二个膜上洗脱下物质例如不需要的核酸，使得在第一个膜或第二个膜上留下靶核酸。可以根据所分离的核酸类型选择洗脱缓冲液。例如，当核酸是RNA时，洗脱缓冲液可以是无RNA酶的水，其可以被用于从第二个膜或者当第一个膜和第二个膜彼此相互接触或者叠放时从第一个和第二个膜洗脱出靶RNA。其它合适的洗脱缓冲液可以包括tris-乙二胺四乙酸(tris-ethylenediaminetetraacetic acid，TE)缓冲液和10mM Tris-HCl(pH8.0)。

在特定实施方式中，当过滤装置包含两个以上膜时，可以从第一个或第二个膜、或者从第三个膜之上的第一个和第二个膜上洗脱下靶核酸。第三个膜可以包含捕获探针例如靶核酸的特异性结合伴侣，由于靶核酸和靶探针之间的特异的化学相互作用可以使得靶核酸被优先地保留于第三个膜上。捕获探针可以与靶核酸共价地或非共价地相互作用。相互作用可以包含电荷-电荷相互作用、氢键、疏水性相互作用、范德华力和偶极子-偶极子相互作用。捕获探针的实例包括与相关的具体核酸序列互补的寡核苷酸、以及肽、蛋白和结合核酸的小分子。例如，能特异地结合16s RNA的抗生素例如伊短菌素可以与膜结合。捕获探针的另一个实例可以包括适合于捕获polyA RNA例如mRNA的寡dT探针。用已知的配体例如抗生物素蛋白或链霉抗生物素或中性抗生物素蛋白(neutravidin)可以对膜进行衍生化。可以给膜添加生物素化的捕获探针，以便赋予对靶核酸序列的特异性。

在具体的实施方式中，本发明提供了一种从细胞样品中分离出核酸的方法(例如总细胞RNA包括23s和16s rRNA、细胞DNA、支原体DNA或RNA、病毒DNA或RNA)，包括将多孔板的一个或多个孔与样品接触，其中多孔板的一个或多个孔是由多个膜组成的，所述膜是例如聚合物膜例如混合纤维素膜、硅酸盐膜或滤器例如玻璃纤维滤器或玻璃纤维膜。样品可以首先与聚合物膜接触，随后与硅酸盐膜接触。样品所接触的第一个膜可以具有比样品所接触的随后的膜例如第二个膜的标定孔径更小的标定孔径。可以按叠放构型排列膜。可以给多孔板施加真空并废弃样品的过滤液，使得细胞样品被分离于第一个膜上。细胞样品可以与裂解缓冲液例如包含一种或多种裂解酶例如溶菌酶的缓冲液接触。样品可以与一种或多种沉淀剂例如胍盐和乙醇接触。可以容许样品孵育合适长的时间。可以给多孔板施加真空，可以废弃过滤液。可以给多孔板施加一种或多种洗涤溶液例如PBS和50％或更高浓度的乙醇，以便洗涤掉任何试剂或非靶物质。可以施加真空并废弃过滤液。可以提供第二个多孔板即收集板，用于接收靶核酸。第二个多孔板可以由与接收样品的多孔板相同数目的孔组成，其大小被设计成彼此紧密吻合，例如通过多孔板下的互锁或按扣在一起的交接部或边缘，使得多孔板的每个孔都对准并对应于第二个多孔板的每个孔。

样品可以与洗脱缓冲液例如无RNA酶的水、TE缓冲液接触，以便将靶核酸从多孔板上洗脱到收集板内。或者，任何低离子强度溶液(0-50mM)(pH 6.0-8.0)都合适于从装置中洗脱出靶核酸例如RNA。

自动化***

在特定实施方式中，本发明提供了用于从样品中分离出核酸的自动化***。因此，任一步骤或者所有步骤都可以被自动化，包括给过滤装置加样、裂解样品、洗涤样品、洗脱样品、自动化***可以包含被设计程序以实施在此所述方法的每个步骤的计算机例如个人计算机。本发明也包括以多联(multiplex)模式处理多个样品。

图7显示了自动化装置的一个实例。在另外的实施方式中，本发明提供了用于从样品中分离出核酸的自动化***，包括a)适合于从样品中分离出核酸的过滤装置(74)；b)泵(75)；c)程序逻辑控制器(PLC)(76)；d)至少一个适合于容纳样品的容器(71)；e)任选地，一个或多个适合于容纳一种或多种试剂或缓冲液的容器(71)；f)任选地，一个或多个适合于接收来自过滤装置的过滤液、来自过滤装置的洗脱液和/或来自过滤装置的废液的接收器(77)；g)多个夹闭阀(72)；h)管路(73)和i)任选地，位于注射器桶容器(79)中的注射器筒，其被用于经管路给过滤装置(74)添加一种或多种液体。提供止回阀(78)，以便容许给过滤装置添加和/或去除液体。

因此，可以设置本发明的自动化***，使得包括试剂缓冲液、样品等的液体从不与任何活动部分例如泵的活动部分接触。通过使用夹闭阀可以实现这一点，其不需要与流经***的液体接触。本***所用的管路和过滤装置可以适合于单次使用，因此可以是一次性的。一次性管路和夹闭阀的组合提供了只需很少维护例如在运行期间进行清洗的***。此外，因为管路和过滤装置只用一次，因此消除了或最小化了样品污染的危险。当样品包含核酸以及对核酸的下游检测依赖于扩增方案例如PCR或TMA时，这是特别有用的。虽然扩增方案提供了出众的敏感性，但是这也显著地增加了扩增污染核酸而非靶核酸的危险。在此所述的自动化***最小化或消除了这种危险，且当与更为传统的由可重复使用的(通常是金属的)部分组成的色谱***(其中流经***的液体与泵的活动部分相接触)相比较时，提供了用于进行核酸分离的廉价***。

适用于自动化***的过滤装置可以是在此所述的本发明的任一实施方式中的过滤装置。可以设置***，使得1)管路提供了样品和过滤装置之间的液体连通；2)管路提供了过滤装置和一个或多个任选的容器中的每一个容器之间的连通；3)泵可以提供a)能够驱动样品或缓冲液或试剂从容器到过滤装置和/或流过过滤装置的外力和/或b)能够从膜表面例如包括过滤装置的膜的第一个表面上去除任何液体例如试剂、缓冲液、样品的外力。第一个表面可以是首先接触液体的表面，例如依次设置的多个膜中的顶层表面。

在一些实施方式中，PLC可以控制***所执行的步骤的次序和时间。因此，PLC可以控制一个或多个夹闭阀什么时候开放和/或关闭。同样，PLC可以控制给一个或多个容器和/或过滤装置所施加的外力的施加持续时间和时机。***也可以包含泵例如能够从一个或多个容器中抽出给定体积的液体并使得过滤装置和液体接触的注射泵。泵也可以被程序化，使得可以确定并控制从一个容器中获得的和/或与过滤装置接触的液体的体积，可以确定并控制从容器和/或过滤装置中抽出的和/或施加的液体的速率。在另一个实施方式中，PLC可以控制***所执行的步骤的时机和持续时间以及从容器或膜表面获得的液体的体积、液体流经***的流速、和/或从容器和/或过滤装置中抽出和/或施加液体的速率。

当装置被自动化时，可以执行下面的步骤。在初始设定中，可以在溶液容器中装入所有所需的溶液。可以通过夹闭阀控制容器，容器和与注射器相连的双向阀连通。用注射器泵可以控制注射器的抽入和推出。可以经双滤器(dual filter)注射样品。滤液流到废液池，膜上残余物可以被空气干燥。可以经双滤器注射裂解液。滤液流到废液池。膜上残余物可以被空气干燥。可以经双滤器注射洗脱液。滤液流到收集接收器。膜上残余物可以被空气干燥。可以用凝胶、PCR或TMA对滤液中的核酸进行检测。

过滤装置

本发明可使用各种过滤装置格式。滤器可以是单个手动装置或者它可以是自动化***的一部分。根据样品的性质和靶分析物可以决定出滤器的大小和数目。在一些实施方式中，过滤装置可以由孤立单位例如滤筒组成。滤筒可以包括滤筒壳，例如含有多个膜的中空体以及一个或多个入口和一个或多个出口。入口和出口的大小可以被设计成与标准注射器相适合，或者可以被设计成适应于真空源或正压源。滤筒还可以包括用于收集流出物的滤液杯。滤筒大小可以被设计成适合于离心机。

过滤装置可以由柱组成，其包括在其内依次设置的多个滤器，使得施加于柱顶部的样品可以按特定的次序与柱内的多个多孔膜接触。例如，第一个接触的膜可以具有比随后接触的膜更小的标定孔径。另一个实例是，过滤装置可以包括一个或多个依次设置的注射器筒，其被用于给装置施加压力或真空。

过滤装置可以是多联的，例如由多孔板组成，其中至少一个孔是由过滤装置组成，所述过滤装置包括依次设置的多个膜，使得施加于滤器的样品可以先接触第一个膜，随后再接触一个或多个随后的膜。可以使用在此所述的任一过滤装置来设置多联装置中的至少一个孔，其中第一个膜具有比随后的膜更小的标定孔径。过滤装置可以是多联的，例如由多孔板组成，其中至少一个孔是由过滤装置组成，所述过滤装置包括如在此不同实施方式中所述的多个膜。因此，多孔板中的至少一个孔是由依次设置的多个膜组成的，使得施加于滤器的样品可以先接触第一个膜，随后再接触一个或多个随后的膜，例如第一个膜包含聚合物，以及第二个膜包含硅酸盐。

本发明也预期使用在此所述的过滤装置来设置多孔板中的所有孔。合适的多孔板包含由多个孔组成的板，例如6孔、12孔、48孔、96孔、384孔或更多孔。多孔板可以彼此上下叠放。或者，由单孔板组成的本发明的过滤装置也是可以的。在一些实施方式中，可以提供用于接收流出物和废物的板，例如引流板。引流板可以由单个孔或多个孔组成，取决于具体的分析物和样品来源以及是否需要对流出物进行后续分析。至少其中一个板可以包括一个或多个适合于向过滤装置中递送样品或缓冲液的入口。至少其中一个板可以包括出口，由此促进排出流出物和废物。出口大小可以被设计成适合于与真空源连接。多孔板的大小可以被设计成适合于离心机，以便在样品被加于过滤装置后可促进样品加工处理。

在一个具体的实施方式中，过滤装置可以包含混合纤维素酯膜，例如它的标定孔径为0.45微米，所述膜覆盖于APFF玻璃纤维膜(MilliporeCorp，Billerica，MA)上。如果过滤装置被设置成滤筒时，那么膜可以具有13mm的直径。或者，如果过滤装置被设置成多孔板，膜的大小可以被设计成适合于商业可获得的多孔板。在另一个具体的实施方式中，过滤装置可以包含包含磺酰基的聚合物膜，它的标定孔径为28纳米，覆盖于具有标定孔径为0.7微米的玻璃纤维膜之上。

图1显示了由本发明的组件部分组成的一步式可重复使用的过滤装置的实例。取出样品池盖(1)，向样品池(2)内加入样品，由于重力或者施加于装置的一些外力造成样品流动，并使得样品与多个多孔膜(4)的第一个多孔膜接触。多个多孔膜都可以位于膜支持物(5)之上，所述膜支持物与滤液杯之间有液体连通，所述滤液杯也可作为洗脱下的靶的的接收器。也提供了滤液盖(6)。因为装置可以被拆卸以及多个多孔膜可以被替换，因此它适合于重复使用。

图2显示了一步式不可重复使用的本发明的过滤装置的实例。

图3a显示了本发明的多孔过滤装置的实例。每个孔都包含至少两个彼此上下叠放的膜(30，31)。图3b显示了包含本发明的多孔过滤装置的设备的另一个实例。设备可以包括可拆卸外套(32)，其包含位于外套内的外套垫层(33)。外套(32)连接过滤板(34)，其包含多个孔，其中至少其中一个孔是由两个或多个多孔膜组成的，且其中第一个多孔膜具有比第二个多孔膜更小的标定孔径。可以彼此上下叠放多孔膜。过滤板(34)可以位于收集板(35)之上，所述收集板是由多个孔组成的。收集板的孔可以与过滤板的孔彼此一对一的相对应。收集板可以位于包含多联真空歧管的基座(36)之上。

图4显示了本发明的多孔过滤装置的另一个实例。装置可以包含用于接收样品的漏斗(41)，其与由多个用于接收样品例如大体积样品的孔组成的可拆卸过滤板接触，其中至少一个孔是由一个或多个多孔膜(42)组成的。过滤板可以位于多孔板例如Ziptip(Millipore Corp.，Billerica，MA)(43)之上。Ziptip板的孔可以与过滤板的孔一对一的相互对应。Ziptip可以包含树脂或其他适合于滞留核酸例如RNA的固体支持物。在具体的实施方式中，树脂可以包含聚A、聚U、或聚T琼脂糖。Ziptip板可以位于由多个孔(44)组成的收集板之上。孔可以与Ziptip板的孔一一对应，并且可以含有TMA试剂例如重构的扩增用试剂包括扩增用寡聚物和重构的酶。收集板可以位于包含多个真空歧管的基座(45)之上。

图5显示了本发明的单个样品过滤装置的另一个实例。装置包含接收器(51)例如Microfil或Milliflex(Millipore Corporation，Billerica，MA)，其含有一个或多个适合于保留细胞的多孔膜。接收器可以位于装有适合于滞留靶核酸分析物(53)的核酸捕获树脂的微柱之上。微柱可以与用于将裂解物抽吸通过柱的注射器(53)以液体连通。

图6a显示了密封的封闭式顶罩过滤装置(closed dome filtrationdevice)的实例。封闭式顶罩装置可以用于在无菌条件下加工处理样品。顶罩可以作为一个或多个多孔膜的外壳，还可以包含一个或多个不作为样品或试剂入口的通气口。通气口可以是由任何合适材料构成，其容许空气和其他气体通过，但是不容许特殊物质例如微生物通过。在一个实施方式中，通气口是由可透气的疏水性屏障构成。亲水性屏障也是可以的。在一些实施方式中，通气口可以位于带顶罩的外壳结构的表面上。在另一个实施方式中，通气口可以被设置作为侧臂，伸入到带顶罩的外壳的一部分内，例如与含有一个或多个多孔膜的带顶罩外壳相连通的入口。当样品流过过滤装置时，可以用Luer锁口的塞子封闭通气口。塞子可以由固体材料构成，或者本身可以是通气口，因此可以由膜屏障例如疏水性膜构成。通气口的应用提供了释放压力的手段，并因此避免了对滤器的损害。

图6b显示了单次使用本发明的膜装置的实例，其中装置包含多个叠放的膜性滤筒。装置中的每个滤筒都与下一个邻近的滤筒以液体连通。滤筒可以包含一个或多个多孔膜。如果滤筒包含多个多孔膜，膜可以与滤筒所含的其他多孔膜相同或不同。在一些实施方式中，用加热的聚丙烯可以融合滤筒内的多个膜。例如，第一个滤筒可以包含混合纤维素酯(MCE)膜，叠放在第一个滤筒之下的第二个滤筒可以包含玻璃纤维膜。MCE可以具有比玻璃纤维膜更小的标定孔径。

图7显示了本发明的一个实施方式的具有多个膜通气口的装置的实例。装置可以与注射器经双向真空阀(控制阀组件)相连接。双向真空阀可以与溶液歧管连通。从溶液歧管发出多个与溶液容器(例如样品、裂解物、洗涤液、洗脱液/缓冲液)和空气通气口相连的管路。每个溶液管路都受电控夹闭阀控制。可以依次地引入样品、随后是裂解缓冲液、随后是洗涤液、随后是洗脱缓冲液，以便在装置的第一个多孔膜表面上捕获并裂解细胞，然后从装置的叠放膜上捕获、洗涤并洗脱下核酸。装置的第一个多孔膜可以包含聚合物例如MCE、PES。第二个膜可以包含硅酸盐例如玻璃纤维。聚合物膜的标定孔径要小于硅酸盐膜的标定孔径。图7所示的***是一个如何实现自动化的实例。

膜

使用膜而不使用用于分析物吸附或色谱法的多孔珠的显著优点是两种格式之间的液体流动模式的差异。当例如在填充床中使用多孔珠时，在所施加的迁移流中的分析物弥散到薄膜表面，然后也在珠孔内缓慢弥散。当使用膜时，在所加的迁移流中的分析物快速地移动通过膜，只需要弥散到薄膜表面。利用膜可能比珠能更快地实现对分析物的饱和结合。因为膜是一种侧向远大于纵向的结构，因此在各种驱动力下都可以出现物质转移经过膜。

除了其中大多数迁移都与膜表面垂直的正常流动装置外，也可以将径向流动装置用于分析物吸附和色谱分析。在径向流动装置中，液流流经缠绕于多孔圆筒状玻璃料周围的膜。液流可以是从内向外或者从外向内。

本发明所用的膜可以包含本领域已知的任何多孔材料。合适的多孔材料实例包括但不限于聚醚砜、聚酰胺例如琼脂糖、纤维素、多糖、聚四氟乙烯、聚砜、聚酯、聚氟乙烯、聚丙烯、碳氟化合物例如聚(四氟乙烯-共-全氟(烷基乙烯醚))(poly(tetrafluoroethylene-co-perfluoro(alkyl vinylether)))、聚碳酸酯、聚乙烯、玻璃、聚碳酸酯、陶瓷、尼龙、金属和碳基材料例如石墨纤维和碳纳米管。

在具体的实施方式中，第一个膜可以包含混合纤维素，例如混合纤维素酯膜(MCE)或包含磺酰基的聚合物例如聚醚砜(PES)。第二个膜可以包含玻璃或玻璃纤维。在一些实施方式中，可以用适合于滞留核酸例如RNA的树脂取代第二个膜。如果需要包含捕获探针的任选的第三个膜，第三个膜可以包含尼龙。

本领域人员要明白，根据疏水性和膜的ζ电位(zeta-potential)可以选出由适用于本发明的材料组成的其他膜。所有与液体接触的微粒的或肉眼可见的材料都要求其表面带有电荷。ζ电位是这种电荷的指标，可以被用于预测并控制胶体悬浮液或乳状液的稳定性。流动电位/流动电流方法可以被用于确定出膜的ζ电位(见例如Lu et a1.，2006，J.Colloid.Interface Sci.299(2)972；Haggard et al.，2005，Langmuir 21(16)：7433；Werner et al.1998，J.Colloid Interface Sci.208(1)：239)。ζ电位是材料的表面静电状态的测定值。如果核酸和材料之间的相互作用主要是由静电相互作用决定的，那么在相同的设定条件下，在所有pH范围内具有相似ζ电位谱的两种材料应当相似地对应于其与核酸相互作用的能力。预计涉及从高盐状态转换到低盐状态的核酸纯化方案将对用于捕获核酸的材料的ζ电位敏感。

本发明的膜可以具有范围从0.01μm到300μm、0.1μm到100μm、0.1μm到50μm、0.1μm到20μm的孔径。在特定实施方式中，其中至少一个膜具有0.45μm的孔径。在具体的实施方式中，至少其中一个膜具有0.2μm的标定孔径。本发明的膜可以具有范围从0.1mm到10mm的厚度。厚度表示从一个外表面到另一个外表面的距离，其对应于当给膜施加力例如重力、真空装置时，样品横跨膜时将经过的距离。膜可以是对称的或不对称的。膜本身可以由一层或多层膜组成。

核酸样品

样品在此表示包含源自任何生物学来源的核酸的材料。生物学来源可以是任何活体事物例如植物、动物、病毒颗粒。生物学来源包含整个生物体或源自生物体的器官或组织。生物学来源可以是单细胞的例如细菌、支原体，或者是多细胞的例如动物或植物，或者是非细胞的例如病毒。细胞来源可以包含真核细胞、原核细胞。真核细胞的实例可以包含源自任何哺乳动物的细胞，例如人、非人灵长类、马、山羊、绵羊、鼠、兔、小鼠、豚鼠。原核细胞的实例包括革兰氏阴性细菌和***例如大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌。样品可以包含整个细胞或其裂解物。样品可以包含天然存在的样品或那些部分或全部人工生成的或加工过的样品。

在此所述方法中的用于分离的靶核酸包含样品中发现的任何核酸，包括DNA、RNA、PNA、LNA和一种以上核酸类型的杂种。核酸可以是双链的、单链的或多链的。当靶是DNA时，DNA可以是质粒DNA、载体DNA、基因组DNA包括线粒体DNA、或上述任何DNA的片段。当靶包含RNA，RNA可以是mRNA、tRNA或rRNA例如16sRNA、23s RNA或其任何组合。核酸可以包含核苷酸类似物例如链终止剂。靶核酸的大小范围可以从2到30个核苷酸或者可以是千碱基或更大的范围。

试剂盒

本发明也提供了可以用于从样品中分离出核酸的试剂盒。试剂盒可以包含本发明的一个或多个过滤装置以及一个或多个容器。试剂盒可以包含一种或多种对照或样品靶核酸或标本，可以任选地包括本发明方法所用的各种缓冲液。例如，试剂盒可以包含适合于裂解病毒颗粒或细胞的裂解缓冲液。试剂盒可以任选地包含用于消除试剂或非特异滞留的或结合的材料的洗涤缓冲液。其他任选的试剂盒试剂包括用于从膜中洗脱出结合的靶核酸的洗脱缓冲液。可以在不同的容器中以溶液的形式提供每种缓冲液。或者，可以以干燥形式或粉末形式提供缓冲液，可以根据使用者所需的用途将其制备成溶液。在这种情况中，可以按包提供缓冲液。对于装置是自动化的以及提供外力例如真空泵方式的情况，试剂盒可以提供动力源。试剂盒也可以包含用于使用装置和/或制备适用于本发明的装置和方法的试剂的说明书。当实施本发明的方法或者当使用本发明的装置时，也可以包括任选的记录并分析所获得的数据的软件。

用于检测微生物的方法和寡核苷酸

在特定实施方式中，本发明提供了适合于检测样品中的微生物的寡核苷酸。寡核苷酸可以包含DNA或RNA，可以特异地结合于至少微生物基因组的一部分。微生物可以时病毒例如微小病毒包括小鼠细小病毒(MVM)或支原体。

特异性结合在此表示含氮碱基配对，例如包含鸟嘌呤的核苷酸将与其互补物即包含胞嘧啶的核苷酸特异性结合。相似地，包含腺嘌呤的核苷酸将与其互补物即包含胸腺嘧啶的核苷酸特异性结合。在中等严格条件下，序列通常可以与其互补物特异性结合。

一个或多个寡核苷酸可以包含短的核酸序列例如DNA序列或RNA序列，所述序列可以与一种或多种支原体或MVM的基因组中的至少一部分特异性结合。寡核苷酸的长度范围通常是从10个核苷酸到40个核苷酸，从15个核苷酸到35个核苷酸、从20个核苷酸到30个核苷酸。

本发明因此提供了分离的DNA序列，其选自：(a)包含核苷酸序列SEQ ID NO：4、5、6、7、8、9、10、11、和/或12的DNA；(b)能与SEQ ID NO：4、5、6、7、8、9、10、11、和/或12中的任一序列编码的DNA在中等严格条件下杂交的DNA；(c)能与(a)的DNA在高严格条件下杂交的DNA。

在另一个实施方式中，本发明的核酸分子也包括与SEQ ID NO：4、5、6、7、8、9、10、11、和/或12至少80％相同的核苷酸序列。其中核酸分子包含与SEQ ID NO：4、5、6、7、8、9、10、11、和/或12至少90％相同的、至少95％相同的、至少98％相同的、至少99％相同的、或至少99.9％相同的序列的实施方式也是本发明所预期的。相同性百分比可以包括整个序列长度上的相同性，例如可以用一个或多个不同的核苷酸取代一个或多个核苷酸，或者它可以包括一部分序列的截短，或是两者的组合。通过观察和数学计算可以确定出相同性百分比。或者，利用Devereux et al.1984，Nucl.Acids Res.12：387所述的以及从威斯康星大学遗传学计算机组(UWGCG)中得到的GAP计算机程序通过比较序列信息可以确定出两种核酸序列的相同性百分比。GAP程序的优选的缺省参数包括：(1)核苷酸的一元比较矩阵(包括的值对于相同的为1，对于非相同的为0)，和Gribskov and Burgess 1986，Nucl.Acids Res.14：6745的加权比较矩阵，如Schwartz and Dayhoff，eds.1979，Atlas of Protein Sequence andStructure，National Biomedical Research Foundation，pp.353-358所述的那样；(2)每个缺口的补偿值为3.0，每个缺口中的每个标记附加补偿0.10；(3)末端缺口没有补偿。也可以使用序列比较领域技术人员所用的其他程序。

中等严格条件在此包括本领域一般人员依据例如DNA长度可以容易确定出的条件。Sambrook et al.1989，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2d ed.，1：1.101-104，Cold Spring Harbor Laboratory Press设定了基本条件，包括预洗涤溶液(包含50％甲酰胺、6X SSC，42℃；或其他相似的杂交溶液例如Stark溶液、50％甲酰胺，42℃)，以及洗涤条件为60℃、0.5X SSC、0.1％SDS。

高严格条件在此包括一般人员依据例如DNA长度容易确定出的条件。这些条件一般被定义为如上所述的杂交条件，以及用近68℃、0.2XSSC、0.1％SDS洗涤。技术人员要认识到，根据因素例如寡核苷酸长度可以按需调整温度和洗涤溶液盐浓度。

两种寡核苷酸可以作为聚合反应中的引物，例如PCR包括RT-PCR、实时PCR。在PCR中，使用两种引物，其与特异DNA序列杂交，并因此促进聚合酶启动DNA合成。引物与互补的DNA链结合并在相反的方向启动DNA合成。第三个寡核苷酸可以作为用于检测PCR扩增序列的探针，通过与扩增序列中所含的核酸序列中的至少一部分结合。其中至少一个寡核苷酸可以时肽核酸(PNA)。肽核酸是核酸分子，其中用肽骨架取代了通常存在于DNA和RNA内的脱氧核糖或核糖骨架。制备PNA的方法在本领域是已知的(见例如Nielson，2001，CurrentOpinion in Biotechnology 12：16)。

在特定实施方式中，检测微生物所含的靶核酸序列可能是需要的。因此，可以用可检测物修饰至少其中一个寡核苷酸。合适的可检测物包括染料例如荧光染料、放射性标记例如³²P以及通过结合一个或多个附加的分子可以被检测到的分子。例如，通过添加异羟基洋地黄毒甙元可以修饰寡核苷酸，通过结合一个或多个抗体可以检测出该寡核苷酸。抗体也可以被修饰成包含一个或多个可检测物。可检测物可以被放置于寡核苷酸探针上，或者同样地可检测物可以被放置于一个或多个寡核苷酸上，所述寡核苷酸在扩增反应中作为引物。

如果可检测物是实时PCR所用的荧光染料，也可以用淬灭剂标记寡核苷酸。通常用具有荧光报告子的探针以及位于邻近位置上的淬灭剂实施实时PCR。报告子和淬灭剂的紧密接近性避免其发射荧光，只有在探针降解随后才能看到荧光。这个过程依赖于所涉及聚合酶的5’到3’的核酸外切酶。在DNA解链过程中，探针能与模板DNA的相关区域中的互补序列结合(引物也是如此)。当加热PCR激活聚合酶时，聚合酶开始在结合引物的单链DNA上产生互补链。当聚合继续时，其到达与其互补序列结合的探针处。聚合酶化学性地“覆盖”探针，将其打断成分离的核苷酸，并因此分离荧光报告子和淬灭剂。这就造成了荧光的增加。当PCR进行更多以及更多的荧光报告子与其淬灭剂脱离时，造成了荧光的显著的几何学增加。这就容许准确地确定出最终的和初始的DNA的量。

在具体的实施方式中，本发明提供了一种或多种适用于检测样品中的支原体的寡核苷酸。令人惊讶的，本发明者已经发现多个与多个支原体物种的基因组中的至少一部分特异地结合的寡核苷酸。因此，在特定实施方式中，寡核苷酸与至少12种支原体特异地结合。利用根据本发明的一种或多种寡核苷酸可以检测出的支原体物种包括口腔支原体(M.orale)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)、鸡败血支原体(M.gallisepticum)、肺炎支原体(M.pneumoniae)、滑液支原体(M.synoviae)、发酵支原体(M.fermentans)、莱特瓦支原体(M.laidlwaii)、精氨酸支原体(M.arginini)、人型支原体(M.hominis)、M.pirum、唾液支原体(M.salivarium)、关节炎支原体(M.arthritidis)。

本发明也提供了一种检测样品中的微生物的方法，包括a)从样品中分离出核酸；b)所分离的核酸与本发明的多个寡核苷酸接触；c)扩增出来自样品的分离的核酸中的至少一部分，据此检测出样品中的微生物。方法还可以包括任选的步骤，即将所扩增的核酸与经可检测物标记的寡核苷酸接触。或者，在一些实施方式中，例如如果使用实时PCR，步骤b)可以包括分离的核酸与包括可检测物的至少一种寡核苷酸例如探针接触。

实施例

实施例1：从铜绿假单胞菌中分离出rRNA

将于4ml胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)中生长过夜的铜绿假单胞菌培养物转移到20ml TSB中在35℃达到对数期生长。在600nm处所测定到的光密度为0.888，平板细菌计数得到菌落密度为4.1E08菌落形成单位/毫升(cfu/ml)。将培养物在TSB中稀释100倍(4.1E06cfu/ml)。

给Millipore微分隔装置(图1)(Millipore Corporation，Billerica，MA)安装13mm APFF 0.7微米玻璃纤维(底层膜)和13mm混合纤维素酯(MCE)0.45微米膜(顶层膜)，以取代原提供的YMT膜。只用13mm MCE 0.45微米膜取代原提供的YMT膜安装第二个Millipore微分隔装置。

将包含1ml TSB中的4.1E06cfu铜绿假单胞菌的阳性对照在10,000rpm、4℃下离心10分钟，得到沉淀物。

向微分隔装置中加入1ml铜绿假单胞菌(4.1E08 cfu或4.1E06 cfu)。将填充后的装置在4000rpm、4℃下离心5分钟。废弃过滤液。向微分隔装置中加入鸡卵清溶菌酶的TE溶液(100微升，0.4mg/ml)。与顶层膜在室温下接触10分钟后，加入600微升包含350μl含有25-50％硫氰酸胍(Qiagen RNAeasy Minikit(Qiagen，Inc.，Valencia，CA))的RLT缓冲液和250微升乙醇的溶液，并容许其在顶层膜上停留5分钟。将装置在4000rpm、4℃下离心5分钟。废弃来自具有两个膜的微分隔装置中的过滤液。将来自具有合适顶层膜的微分隔装置中的过滤液加入到QiagenRNAeasy Minikit(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)的Qiagen迷你柱中。阳性对照的细胞沉淀按相似的方式在微试管内进行裂解，然后也被加入到Qiagen RNAeasy Minikit柱(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)中。用700微升包含2.5-10％硫氰酸胍和2.5-10％乙醇的RW1缓冲液(Qiagen RNAeasyMinikit)(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)洗涤微分隔装置和Qiagen柱，在4000rpm、4℃下离心5分钟，然后用来自Qiagen RNAeasy Minikit(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)的500微升RPE缓冲液洗涤两次。废弃所有的过滤液。通过两次顺序加入100微升无RNA酶水进行洗脱。

按照生产商的说明书(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)，将来自两膜装置、与Qiagen柱相连的单膜装置、或单独的Qiagen柱中的洗脱样品加到经Sybersafe E-gel PowerBase^TM预先染色的1.2％琼脂糖的孔中。容许跑胶15分钟。用LAS-3000(Fujifilm Global，Japan)上的UV激发以及蓝光发射可以看到核酸带。结果证实从本发明的双膜过滤装置中分离到的rRNA生成了16s和23sRNA，没有任何明显的基因组DNA污染。相反地，流经Qiagen柱的样品有着明显的可检测到的基因组DNA条带(图8)。在MCE滤膜上裂解以及随后流经Qiagen柱的样品没有明显的基因组DNA污染(数据没有显示)。

实施例2：定量所分离的RNA

用RT-PCR定量出从样品中分离到的经如实施例1上面所述的MCE膜和随后的玻璃膜以及MCE膜和随后的Qiagen柱(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)处理过的RNA。细菌细胞沉淀(也如实施例1上面所述的)作为对照。

购买到下面的23S铜绿假单胞菌的特异引物：

PAF1-23S(TAM)，正向引物CACACGGCGGGTGCTAAC(Sigma-Aldrich，St Louis，MO)(SEQ ID NO：1)

PAR1-23S(TAM)，反向引物CCACAACTTTGGGACCTTAGCT(Sigma-Aldrich，StLouis，MO)(SEQ ID NO：2)

PAP1-23S(TAM)，FAM标记的探针CCGTCGTGAAAAGGGAAACAACCCA(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)(SEQ ID NO：3)。

利用经上面的荧光标签和淬灭剂标记的探针进行实时PCR。PCR产物的产生造成了探针上的标签和淬灭剂的解离，因此生成了荧光信号，结合标准曲线用所述荧光信号可以定量出PCR产物。用已知浓度的铜绿假单胞菌rRNA转录体产生了出现时间(emergence time)(CT)和核酸分子的标准值。阈值周期(CT)表示其中RT-PCR反应的荧光信号超过预定荧光阈值的分周期数目。为了联系rRNA拷贝数目和CT值，首先建立了已知数目的铜绿假单胞菌rRNA和CT值之间的线性关系。然后用该标准曲线确定出从所处理的样品中纯化出的铜绿假单胞菌rRNA的拷贝数目。

使用一步RT-PCR标准混合试剂盒(ABI)。混合正向引物(300nM)和反向引物(10nM)、探针(50nM)、2X RT-PCR混合物、逆转录酶和10微升样品的洗脱RNA，使得最终体积为15微升。在ABI 7000周期仪(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)中进行下面的循环程序：

1.50℃，30:00分钟

2.95℃，10:00分钟

3.95℃，0:15分钟，40个周期

4.62℃，1:00分钟

对样品中的RNA以及阳性和阴性对照(无模板)的定量(有或没有逆转录酶)都重复3次。

利用定量逆转录酶聚合酶链反应(qRT-PCR)(实时PCR)证实了通过在用玻璃纤维捕获之前使用MCE膜所获得的选择性RNA纯化的程度，如图9和表1。通过对每个标本都在存在或不存在逆转录酶时进行PCR建立了每个标本中的DNA对RNA的相对量。在没有逆转录酶时，只扩增基因组DNA。在存在逆转录酶时，随后进行PCR可以扩增DNA和RNA，但是具体靶序列的RNA的初始拷贝数目相对于源自基因组DNA的初始拷贝是明显过量的(≥1000倍)。因此，当逆转录酶被用于核糖体RNA的PCR时，所观察到的扩增信号基本上都是RNA的信号。通过确定出存在或不存在逆转录酶时的靶基因拷贝数目(源自已知初始核酸浓度的标准曲线)的比率，裂解MCE膜上的捕获细胞实现了基因组污染DNA的显著降低。通过关联试验CT值和经已知量的铜绿假单胞菌rRNA定义的标准曲线上的相应的拷贝数目值确定出所扩增的核酸信号的拷贝数目。noRT(无逆转录酶)拷贝数目代表样品中存在的DNA拷贝(或者如果需要的是RNA，就是DNA污染物的水平)的数目。如果对照沉淀物被设定为标准物，那么容易确定出通过使用MCE膜或双膜方法实现的RNA纯化的程度(表1)。三个样品的noRT反应的拷贝数目具有下面的数值：阳性对照(6.63E+07拷贝)、MCE膜然后Qiagen柱(1.42E+06拷贝)、MCR/APFF膜(3.05E+05拷贝)。通过MCE膜处理过的样品表现出明显更少的可回收的DNA，因此提供了更纯的RNA样品。因此，用MCE膜使得相对纯化接近于2个数量级(图9)。

表1

样品	条件	Q1	Q2	Q3	平均值	Stdav	拷贝	拷贝	拷贝	平均值	与沉淀和Qiagen试剂盒相比基因组DNA的相对分数	相对于对照沉淀，基因组DNA减少的百分数
													41EO6沉淀，然后Qiagen试剂盒(阳性对照)	RT	12.15	12.16	12.11	12.14	0.03	1.78E+10	1.77E+10	1.83E+10	1.79E+10
	NoRT	19.25	19.33	19.28	19.29	0.04	6.81E+07	6.40E+07	6.68E+07	6.63E+07	1.00E+00	0.0
4.1EO6 MCE膜，然后Qiagen拄	RT	12.18	12.25	12.08	12.17	0.08	1.74E+10	1.64E+10	1.87E+10	1.75E+10
														NoRT	24.29	24.1	24.18	24.19	0.10	1.31E+06	1.52E+06	1.43E+06	1.42E+06	2.14E-02	97.9
													41EO6 MCE/APFF膜	RT	13.74	13.61	13.45	13.60	0.15	5.09E+09	5.64E+09	6.42E+06	5.72E+09
	NoRT	26.22	26.22	26.02	26.15	0.12	2.88E+05	2.88E+05	3.39E+05	3.05E+05	4.60E-03	99.5
NTC(无模板对照)	RT	N/A	29.76	N/A	29.76	N/A	ND	1.80E+04	ND	1.80E+04	2.72E-04	100.0

实施例3：分离RNA的多联分析(Multiscreen Analysis)

铜绿假单胞菌细胞(1.83E06cfu)被捕获于***于Millipore多联歧管(Millipore Corporation，Billerica MA)的0.01％蛋白胨预湿的0.45微米MCE 96孔板(Millipore Corporation，Billerica MA)上。然后用300μl0.01％蛋白胨洗涤捕获的细胞。向MCE板(Millipore Corporation，BillericaMA)的下面叠放1.0微米B型玻璃纤维板(Millipore Corporation，BillericaMA)。加入含有100μl来自Qiagen RNAeasy Minikit(Qiagen Inc.，Valencia，CA)的RLT缓冲液的200μl溶液和1000微升乙醇，容许其在顶层板的孔内停留5分钟。在过滤裂解溶液随后，取出并废弃顶层过滤板。用200微升RW1缓冲液(Qiagen，Inc.Valencia，CA)和200微升RPE缓冲液(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)洗涤玻璃纤维板1次。然后用300微升乙醇洗涤过滤板两次，以便干燥孔。向玻璃纤维板下面加入回收收集板(Millipore Corporation，Billerica，MA)。通过每次100微升无RNA酶水的依次洗脱从玻璃纤维板中洗脱出核酸。

为了确定出细菌核糖体RNA的相对纯度，首先用5微升1∶1000稀释的Syber Gold染料(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)和15微升样品洗脱物或60ng 0.5-10Kb RNA梯(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)装填48孔2％澄清琼脂糖E胶(Invitrogen Corporation，Carsbad，CA)。跑胶30分钟。用LAS-3000(Fujifilm Global，Japan)上的UV激发和蓝光发射显示出核酸条带。

利用Millipore多联歧管(Millipore Corporation，Billerica，MA)上的多个过滤板类型进行细胞捕获、裂解、和选择性核酸分离的整个过程。首先通过MCE过滤板上的真空过滤捕获细胞。然后将玻璃纤维板放置于MCE过滤板的下方。用50％基于Qiagen胍的RLT缓冲液(Qiagen，Inc.Valencia，CA)和乙醇进行细胞裂解。经两个板的过滤造成了玻璃纤维板上的RNA滞留。在废弃顶层MCE板后，用Qiagen RW1和RPE缓冲液(Qiagen，Inc.Valencia，CA)洗涤玻璃纤维板。然后用乙醇过滤液干燥板。进行每次100微升水的两次依次洗脱。

结果证实以多联格式获得了没有明显基因组DNA污染的核糖体RNA(16S、23S)。

实施例4：从细胞培养上清液中分离并检测病毒DNA

从感染了小鼠微小病毒的指示细胞系人NB-324K中收集上清液。在8log10 TCID₅₀/ml计算出上清液的病毒滴度。

将两层超滤聚醚砜膜(标定孔径为28纳米)***到密封的带有通气口的有顶罩Millipore装置中(图6a)。第二个密封的带有通气口的有顶罩Millipore装置含有Millipore APFF玻璃纤维膜(0.7微米)。通过luer滑动锁止方式(luer slip to luer lock)的出口对入口连接将装置彼此上下叠放。

向第一个膜装置中加入0.5ml含病毒的细胞培养上清液。将第二个装置串连地放置于第一个装置之后。用注射器加入1ml包含500μl来自Qiagen RNeasy Minikit(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)的包含25-50％硫氰酸胍的RLT缓冲液的溶液，并容许其在顶层膜上停留10分钟。通过利用注射器用空气冲洗装置可以去除过量的液体。用加有1ml包含2.5-10％硫氰酸胍和2.5-10％乙醇的RW1缓冲液(Qiagen RNeasy Minikit)(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)的注射器洗涤串连的密封的带有通气口的有顶罩的装置，然后用带有1ml Qiagen RNeasy Minikit(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)的RPE缓冲液的注射器洗涤装置2次。废弃所有的过滤液。用加有空气的注射器干燥微分隔装置。分离装置，并通过加入500微升无核酸酶水进行每个装置上的洗脱。

用实时PCR定量经微分隔装置和Qiagen缓冲液分离到的DNA。用先前定量过的病毒核酸作为对照。加入正向和反向引物、带有荧光标签和淬灭剂的探针、水、模板和ABI 2X Universal TaqMan PCR MasterMix，使得终体积为20μl。使用下面的特异于MVM的探针和引物：

正向引物(MVMJ02275f1)：GCAAACAGCATGGTGAAAATTG(SEQ ID NO：4)

反向引物(MVMJ02275r)：CCTGAACCAAAGCTTGTTTCATC(SEQ ID NO：5)

探针(MVMJ02275探针1)：TGGACCAGCACCAGAGCGCTACAC(SEQ ID NO：6)

在BioRad Chromo4仪器上进行循环：1)50℃，2:00分钟；2)95℃，10:00分钟；3)95℃，0:15分钟；4)60℃，1:00分钟；5)返回步骤3共39次。

表2

样品	Ct1	Ct2	Ct3	平均值	标准差	cv
							8log10TCID50/ml VR	28.84	28.88		28.86	0.03	0.001
8log10TCID50/ml APFF	17.54	17.57		17.56	0.02	0.001
							8log10TCID50/ml VR	30.24	30.37		30.31	0.09	0.003
8log10TCID50/ml APFF	18.57	20.00		19.29	1.01	0.052
							无模板对照	ND	ND	ND	ND
10^6copies/ul(PCR内对照)	19.65	19.97		19.81	0.23	0.011

如预期的扩增对照标准核酸。从APFF和超滤聚醚砜(UF PES)膜中成功地回收并检测到病毒DNA(如表2中的VR所表示的)。APFF膜比UF PES膜滞留了更多的核酸。

实施例5：从猪鼻支原体中分离并定量rRNA。

将猪鼻支原体的1日培养物生长于50ml含有支原体肉汤培养基的血清中(37℃和7％CO₂)。该培养物的集落浓度为2.4×10⁸cfu/ml。将培养物在0.1％蛋白胨中稀释1000倍。计数中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养物，发现其浓度为1.1×10⁷细胞/ml。

制备含有具有10微米标定孔径的25mm Millipore聚丙烯预滤器(Millipore Corporation，Billerica，MA)以及0.5微米/0.1微米聚醚砜膜(PP10-HVEP)的密封的带有通气口的有顶罩Millipore装置。也制备出含有25mm APFF玻璃纤维的第二个装置。

阳性对照是根据生产商推荐的用于含细菌的溶液样品的方案经Qiagen RNAeasy试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)处理过的1ml 0.1％蛋白胨中的2.4×10⁵猪鼻支原体。

在进样之前，用10ml注射器向每个装置中推入3ml 0.1％蛋白胨。向两个PP10-HVEP装置中加入3ml 0.1％蛋白胨；向两个PP10-HVEP装置中加入3ml其中含有100μl经100倍稀释的猪鼻支原体的0.1％蛋白胨；向两个附加的PP10-HVEP装置中加入3ml其中含有100μl经100倍稀释的猪鼻支原体的CHO细胞上清液。用10ml注射器经装置加入和推入样品。将1ml Qiagen缓冲液RLT+乙醇(1∶1)溶液抽入到10ml注射器内(每个装置)，并加入到装置中，直到在装置的底部开始出现1滴或2滴液体。向每个PP10-HVEP装置中安全地加入APFF装置。容许RLT-乙醇溶液在过滤上室温下停留5分钟，随后从装置中清除掉溶液。分离装置，并进一步地处理带有APFF滤器的装置。用10ml注射器经APFF过滤装置推入1ml Qiagen缓冲液RW1。用10ml注射器经APFF滤器推入1ml Qiagen缓冲液RPE，然后重复1次。然后向APFF过滤装置中加入500微升无核酸酶水，加压通过并收集于试管内。

将经装置处理过的样品在超低温冰箱中冷冻30分钟，然后放置到Savant DNA 120 SpeedVac(system on Medium，Manual Setting)(ThermoElectron Corp.，Waltham，MA)内。在SpeedVac浓缩期间不对样品加热。将干燥材料重悬于50μl无核酸酶水中。

进行实时PCR。用已知浓度的RNA转录物生成出现时间(CT)和核酸分子的标准值。阈值周期(CT)表示其中RT-PCR反应的荧光信号超过预定荧光阈值的分周期数目。为了建立RNA拷贝数目和CT数值的相关性，首先建立了已知数量的猪鼻支原体rRNA和CT值之间的线性相关性。然后用该标准曲线确定出从处理样品中纯化出的猪鼻支原体rRNA的拷贝数。

使用一步RT-PCR标准混合物试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA)。混合正向引物(400nM)和反向引物(400nM)、探针(300nM)(经荧光标签和淬灭剂标记)、2X RT-PCR混合物、逆转录酶和5微升样品的洗脱RNA，使得终体积为25微升。在这个检测终使用如下的引物和探针：

序列组1：

正向引物：AAATGATCCGCCTGAGTAGTATGC(SEQ ID NO：7)

反向引物CATGCTCCACCGCTTGTGC(SEQ ID NO：8)

探针：CGCAAGAGTGAAACTTAAAGGAATTGACGG(SEQ ID NO：9)

序列组2：

正向引物：AAACATCCCGCCTGGGTAGTACAT(SEQ ID NO：10)

反向引物：CAACATGCTCCACCACTTGTG(SEQ ID NO：11)

探针：CGCAAGAATGAAACTTAAACGGAATTGACG(SEQ ID NO：12)

在ABI 7000循环仪中，执行下面的循环程序：

1.50℃，30:00分钟

2.95℃，10:00分钟

3.95℃，0:15分钟，40个循环

4.55℃，1:00分钟

对样品中的RNA以及阳性和阴性对照(无模板)的定量(有或没有逆转录酶)都重复3次。表3显示了结果。

表3

样品名	CT	Std.Dev.CT	数量	平均数量	Std.Dev.Quantity
						Neg#1
Neg#2
		Myco#3	26.27			0.278		6.95E+06		7.25E+06	1.41E+06
26.48	6.02E+06
			25.93	8.78E+06
Myco#4	26.33				1.016		6.69E+06	1.25E+07	9.46E+06
		24.51	2.34E+07
	26.2			7.31E+06
		CHO+Myco#5	24.6			0.233	2.19E+07			2.01E+07	3.06E+06
25.01	1.65E+07
			24.61	2.17E+07
CHO+Myco#6	24.62				0.346		2.16E+07	2.70E+07	6.63E+06
		24.41	2.49E+07
	23.94			3.44E+07
		MycoTube#1	24.48			0.287	2.38E+07			1.92E+07	3.99E+06
24.97	1.70E+07
			24.98	1.69E+07
MycoTube#2	25.72				0.547		1.01E+07	1.37E+07	5.52E+06
		24.73	2.00E+07
	25.63			1.08E+07
		裂解过滤液#1
裂解过滤液#2
		裂解过滤液#3	37.79			-1	2547.83
裂解过滤液#4	39.2				1.376		963.6	2937.72	2783.902
		38.35	1727.67
	36.51			6121.88
		裂解过滤液#5	31.13			0.253	246485.42			223580.92	36721.332
31.58	181225.69
			31.15	243031.64
裂解过滤液#6	30.51				0.547		377207.84	558744.03	214071.602
		29.43	794805.31
	30.09			504218.94
		No RT	35.6			3.695	11470.41			626558.41	546658.382
29.01	1.06E+06
			29.4	811279.56

样品Neg#1和Neg#2是阴性对照，不存在支原体。样品Myco#3和Myco#4是支原体，但是没有CHO细胞，并经膜加工处理。样品CHO+Myco#5和CHO+Myco#6都有支原体和CHO细胞，并经膜加工处理。样品Myco Tube#1和Myco Tube#2有沉淀并在试管内处理过的支原体。

样品裂解过滤液#1、裂解过滤液#2、裂解过滤液#3、裂解过滤液#4、裂解过滤液#5、和裂解过滤液#6分别表示分别向样品Neg#1、Neg#2、Myco#3、Myco#4、CHO+Myco#5、和CHO+Myco#6中加入裂解液后的过滤液。根据生产商说明书，用Qiagen RNAeasyMinikitColumn(Qiagen，Valencia，CA)加工处理过滤液。样品NoRT表示在没有逆转录酶时对样品Myco#3和Myco#4进行的扩增反应，并且作为样品中的DNA污染的指示物。

在说明书和权利要求书中所用的表示整数数量、反应条件等的所有数目都应当理解为在所有情况中都被术语“大约”修饰。因此，除非有相反的说明，本说明书和所附的权利要求书中所设定的参数都是近似的，且可能根据本发明要达到的所需的性能而变化。最低限度地、且无意于限制将等同条款适用于权利要求书的范围，每个数值参数都应当根据有效数字的量和一般的舍入方法进行理解。

在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可以对本发明进行多种修饰和变更，这对于本发明的技术人员是显而易见的。仅仅以实施例的方式提供了在此所述的具体的实施方式，其并不作为任何的限制。本说明书和实施例应该只被认为是举例说明的，下面的权利要求书表明了本发明的真实范围和精神。

序列表

<110>米利波尔公司

<120>用于分离核酸的过滤装置

<130>MCA-762 US

<160>12

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>ARTIFICIAL

<220>

<223>ARTIFICIAL PRIMER

<400>1

cacacggcgg gtgctaac                                    18

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>ARTIFICIAL

<220>

<223>ARTIFICIAL PRIMER

<400>2

ccacaacttt gggaccttag ct                                22

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>ARTIFICIAL

<220>

<223>ARTIFICIAL PRIMER

<400>3

ccgtcgtgaa aagggaaaca accca                             25

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>ARTIFICIAL

<220>

<223>ARTIFICIAL PRIMER

<400>4

gcaaacagca tggtgaaaat tg                                22

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>ARTIFICIAL

<220>

<223>ARTIFICIAL PRIMER

<400>5

cctgaaccaa agcttgtttc atc                                23

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>ARTIFICIAL

<220>

<223>ARTIFICIAL PROBE

<400>6

tggaccagca ccagagcgct acac                      24

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>ARTIFICIAL

<220>

<223>ARTIFICIAL PRIMER

<400>7

aaatgatccg cctgagtagt atgc                       24

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>ARTIFICIAL

<220>

<223>ARTIFICIAL PRIMER

<400>8

catgctccac cgcttgtgc                             19

<210>9

<211>30

<212>DNA

<213>ARTIFICIAL

<220>

<223>ARTIFICIAL PROBE

<400>9

cgcaagagtg aaacttaaag gaattgacgg                 30

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>ARTIFICIAL

<220>

<223>ARTIFICIAL PRIMER

<400>10

aaacatcccg cctgggtagt acat                       24

<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>ARTIFICIAL

<220>

<223>ARTIFICIAL PRIMER

<400>11

caacatgctc caccacttgt g                          21

<210>12

<211>30

<212>DNA

<213>ARTIFICIAL

<220>

<223>ARTIFICIAL PROBE

<400>12

cgcaagaatg aaacttaaac ggaattgacg                 30

Claims (25)

1.一种从样品中分离核酸的方法，包括a)将包含多个多孔膜的过滤装置与样品接触，使得样品依次地接触所述多个多孔膜，所述接触开始于第一个多孔膜，随后接触至少第二个多孔膜，b)裂解第一个多孔膜上的样品，其中第一个多孔膜的标定孔径小于第二个多孔膜的标定孔径，c)给过滤装置施加外力，据此在所述多个多孔膜中的至少一个膜上分离出核酸。

2.权利要求1的方法，还包括将过滤装置与一种或多种缓冲液或洗涤试剂接触。

3.权利要求1的方法，还包括将过滤装置与洗脱缓冲液接触。

4.权利要求1的方法，还包括将样品与第三个多孔膜接触。

5.权利要求4的方法，其中多个多孔膜包含捕获探针。

6.权利要求1的方法，其中第一个多孔膜包含聚合物。

7.权利要求6的方法，其中聚合物选自多糖和聚醚砜。

8.权利要求1的方法，其中第二个膜包含硅酸盐。

9.权利要求8的方法，其中硅酸盐是玻璃纤维。

10.权利要求1的方法，其中样品包含细胞。

11.权利要求1的方法，其中样品包含病毒颗粒。

12.权利要求1的方法，其中样品包含支原体。

13.用于从样品中分离核酸的过滤装置，其包含依次设置的多个多孔膜，使得施加于过滤装置的样品先与包含多糖的第一个多孔膜接触，随后至少与包含硅酸盐的第二个多孔膜接触。

14.权利要求13的过滤装置，其中多糖是纤维素。

15.权利要求14的过滤装置，其中纤维素是混合纤维素酯。

16.权利要求13的过滤装置，其中硅酸盐是玻璃纤维。

17.权利要求13的过滤装置，还包括包含捕获探针的第三个多孔膜。

18.权利要求13的过滤装置，其中第一个膜的标定孔径小于第二个膜的标定孔径。

19.用于从样品中分离核酸的过滤装置，其包含依次设置的多个多孔膜，使得施加于过滤装置的样品先与包含包含磺酰基的聚合物的第一个多孔膜接触，随后至少与包含硅酸盐的第二个多孔膜接触。

20.权利要求19的过滤装置，其中聚合物是聚醚砜。

21.权利要求19的过滤装置，其中硅酸盐是玻璃纤维。

22.权利要求19的过滤装置，还包括包含捕获探针的第三个多孔膜。

23.权利要求19的过滤装置，其中第一个膜的标定孔径小于第二个膜的标定孔径。

24.权利要求1的方法，其中核酸是DNA。

25.权利要求1的方法，其中核酸是RNA。

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