CN101104078B - 多肽及蛋白药物的聚乙二醇偶合物 - Google Patents

多肽及蛋白药物的聚乙二醇偶合物 Download PDF

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Abstract

本发明的目的是提供聚乙二醇通过氨基酸或寡肽的连接子与胸腺五肽、胸腺素α1、干扰素(IFN)或白介素等多肽或蛋白类药物的连接形成的偶合物。通过选择适当的连接子可以保持偶合物在血浆中的稳定性；到达靶组织后，连接子可以在细胞类解离，释放活性形式的多肽或蛋白分子，产生药理作用。

Description

多肽及蛋白药物的聚乙二醇偶合物
技术领域
本发明涉及聚乙二醇通过氨基酸或寡肽的连接子与胸腺五肽、胸腺素α1、干扰素(IFN)或白介素等多肽或蛋白类药物的连接形成的偶合物；这种偶合物在体内能够缓慢释放活性多肽分子发挥药理作用。
背景技术
多肽和蛋白类药物如奥曲肽、T-20、胸腺素α1(Tα1)，降钙素，干扰素(IFN)，白介素(IL)等在临床得到越来越广泛的应用。但是，该类药物口服无效，在体内易被酶解失活，生物半衰期短，影响了其药理作用的发挥。
聚乙二醇(PEG)是具有良好的生物兼容性的中性聚合物，具有高度的亲水性，在水溶液中有较大的水动力学体积，并且没有免疫原性。将PEG与多肽和蛋白类药物分子偶联后，能够提高药物在血浆中的稳定性，减少药物的酶解；避免免疫***对药物的识别和清除，降低免疫原性；同时避免药物在肾脏的代谢清楚，从而显著延长多肽或蛋白类药物在体内的半衰期。
目前PEG对多肽或蛋白的化学修饰均是通过PEG的活性衍生物与药物分子中的氨基形成酰胺键或氨基甲酸酯键。由于蛋白或多肽分子中存在多个氨基，因此得到的偶合物是多种交联产物的混合物。而且，由于对活性位点的直接修饰或空间位阻作用，被修饰药物的生物活性损失较大。
发明内容
本发明的目的是提供聚乙二醇通过氨基酸或寡肽的连接子与多肽或蛋白类药物的连接形成的偶合物。通过选择适当的连接子可以保持偶合物在血浆中的稳定性；到达靶组织后，连接子可以在细胞内解离，释放活性形式的多肽或蛋白分子，产生药理作用。
本发明一方面提供式I所示的聚乙二醇衍生物通过氨基酸或寡肽的连接子与多肽或蛋白分子中的氨基连接形成的偶合物：
         CH3O-PEG-OCH2CONH-(AA)n-CONH-P
                    I
本发明另一方面提供式II所示的聚乙二醇衍生物通过氨基酸或寡肽的连接子与多肽或蛋白分子中的氨基连接形成的偶合物：
         CH3O-PEG-OCH2CH2OCONH-(AA)n-CONH-P
                    II
本发明还提供式III所示的聚乙二醇衍生物通过氨基酸或寡肽的连接子与多肽分子中的羧基连接形成的偶合物：
         CH3O-PEG-OCH2CH2-NHCO-(AA)n-NHCO-P
                    III
式I中，PEG代表平均分子量5000-40000的聚乙二醇，AA代表L-氨基酸残基，P代表胸腺五肽、胸腺素α1、干扰素(IFN)或白介素等多肽或蛋白药物；n为1-6的整数。
本发明还提供含有式I、II或III所示的聚乙二醇与多肽或蛋白的偶合物作为活性成分的药物组合物。
本发明最后还提供本发明还提供式I、II或III所示的聚乙二醇与多肽或蛋白的偶合物，以及含有式I、II或III所示的聚乙二醇与多肽或蛋白的偶合物作为活性成分的药物组合物作为药物的用途。
具体实施方式
本发明中聚乙二醇与多肽或蛋白的偶合物的制备可以分为聚乙二醇衍生物的合成及其与多肽或蛋白的交联两个部分。
式I所示的偶合物可以按照如下方法制备：单甲氧基聚乙二醇在叔丁醇钾作用下，与溴乙酸乙酯反应；反应产物经氢氧化钠水解，然后将水解产物酸化，得到羧甲基取代的单甲氧基聚乙二醇衍生物CH3O-PEG-OCH2COOH；通过接肽反应，制备寡肽衍生物CH3O-PEG-OCH2CONH-(AA)n-COOH；CH3O-PEG-OCH2CONH-(AA)n-COOH可以通过接肽反应与多肽的末端氨基连接，形成偶合物CH3O-PEG-OCH2CONH-(AA)N-CONH-P(I)；也可以将CH3O-PEG-OCH2CONH-(AA)n-COOH与N-羟基琥珀酰亚胺反应成活泼酯CH3O-PEG-OCH2CONH-(AA)n-COOSu，后者再与多肽或蛋白分子中的游离氨基连接，形成偶合物CH3O-PEG-OCH2CONH-(AA)n-CONH-P(I)。
式II所示的偶合物可以按照如下方法制备：单甲氧基聚乙二醇与光气反应得到单甲氧基聚乙二醇的氯甲酸酯衍生物CH3O-PEG-OCH2CH2OCOCl，再与氨基酸分子中的氨基反应，形成氨基甲酸酯衍生物CH3O-PEG-OCH2CH2OCONH-AA-COOH；后者通过接肽反应，制备寡肽衍生物CH3O-PEG-OCH2CH2OCONH-(AA)n-COOH；CH3O-PEG-OCH2CH2OCONH-(AA)n-COOH可以通过接肽反应与多肽的末端氨基连接，形成偶合物CH3O-PEG-OCH2CH2OCONH-(AA)n-CONH-P(II)；也可以将CH3O-PEG-OCH2CH2OCONH-(AA)n-COOH与N-羟基琥珀酰亚胺反应成活泼酯CH3O-PEG-OCH2CH2OCONH-(AA)n-COOSu，后者再与多肽或蛋白分子中的游离氨基连接，形成偶合物CH3O-PEG-OCH2CH2OCONH-(AA)n-CONH-P(II)。
式III所示的偶合物可以按照如下方法制备：单甲氧基聚乙二醇与对甲苯磺酰氯反应，得到单甲氧基聚乙二醇的对甲苯磺酸酯衍生物CH3O-PEG-OCH2CH2-OTs，再与邻苯二甲酰亚胺钾反应，将反应产物水解得到单甲氧基聚乙二醇的氨基衍生物CH3O-PEG-OCH2CH2-NH2。后者通过接肽反应，制备寡肽衍生物CH3O-PEG-OCH2CH2-NHCO-(AA)n-NH2；最后通过接肽反应与多肽的末端羧基连接，形成偶合物CH3O-PEG-OCH2CH2-NHCO-(AA)n-NHCO-P。
在本发明中使用的下列英文缩写词及其含义如下：TP5，胸腺五肽；PEG，聚乙二醇；Arg，精氨酸；Asp，天冬氨酸；Tyr，酪氨酸；Val，缬氨酸；Fmoc，芴甲氧羰基；DCC，二环己基碳二亚胺；HOBT，1-羟基苯并***；HBTU，2-(1H-1-羟基苯并***)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸；IFN-α2b，α2b干扰素；NMM，N-甲基***啉；rhIL-2，重组人白介素-2；TFA，三氟乙酸；Ts-Cl，对甲苯磺酰氯；RP-HPLC，反相高效液相色谱。
下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，这些实施例不应作为对本发明的范围的限制。
实施例1CH3O-PEG5000-OCH2CONH-Ala-Leu-CONH-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH(I1)的制备
1.1CH3O-PEG5000-OCH2COOH的制备
将单甲氧基聚乙二醇(MW 5000)20.0g(4mmol)加到安装了分水器的圆底烧瓶中，加入甲苯溶解，蒸馏，并不断补充干燥的甲苯，在油浴中加热回流，至无水分蒸出。撤去分水器，加入8mmol的叔丁醇钾，回流反应1小时。然后缓慢加入8mmol的溴乙酸乙酯，回流反应6小时。过滤，将滤液减压蒸干，用CH2Cl2溶解残留物，加无水***沉淀出固体，滤集固体，溶于水中，缓慢加入0.1N的氢氧化钠溶液，至pH达到10，室温搅拌2小时。然后用0.1N的盐酸溶液调节pH至3，用等体积的三氯甲烷提取3次，合并提取液，用无水硫酸钠干燥，过滤，将滤液减压浓缩，加无水***沉淀，滤集固体，得CH3O-PEG5000-OCH2COOH 12.5g。
1.2CH3O-PEG5000-OCH2CONH-Ala-Leu-OSu的制备
将CH3O-PEG5000-OCH2COOH溶于干燥的四氢呋喃中，加入5倍摩尔量L-丙氨酸甲酯，5倍摩尔量的DCC，室温搅拌反应过夜，然后缓慢加入0.1N的氢氧化钠溶液，至pH达到10，室温搅拌2小时。用0.1N的盐酸溶液调节pH至3，减压蒸除四氢呋喃，然后将水溶液用Sephadex-10凝胶柱层析分离，以0.2M碳酸氢氨水溶液洗脱。收集第一峰面积下组分，冰冻干燥，得到CH3O-PEG5000-OCH2CH2-NHCO-Ala-OH。
将CH3O-PEG5000-OCH2CH2-NHCO-Ala-OH溶于干燥的四氢呋喃中，加入5倍摩尔量L-亮氨酸甲酯，5倍摩尔量的DCC，室温搅拌反应过夜，然后缓慢加入0.1N的氢氧化钠溶液，至pH达到10，室温搅拌2小时。用0.1N的盐酸溶液调节pH至3，减压蒸除四氢呋喃，然后将水溶液用Sephadex-10凝胶柱层析分离，以0.2M碳酸氢氨水溶液洗脱。收集第一峰面积下组分，冰冻干燥，得到CH3O-PEG5000-OCH2CH2-NHCO-Ala-Leu-OH。
将CH3O-PEG5000-OCH2CH2-NHCO-Ala-Leu-OH溶于干燥的四氢呋喃中，加入5倍摩尔量N-羟基琥珀酰亚胺，1倍摩尔量的DCC，室温搅拌反应过夜，过滤，得到CH3O-PEG5000-OCH2CONH-Ala-Leu-OSu的溶液备用。
1.3CH3O-PEG5000-OCH2CONH-Ala-Leu-CONH-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH(I1)的制备
用100mg Wang树脂(0.05mmol)为固相载体，Fmoc-Arg(Mtr)，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Tyr(tBu)为原料，DCC-HOBT作缩合剂，根据胸酰五肽的氨基酸序列，按标准的Fmoc固相多肽合成方法合成H-Arg(Mtr)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-Wang树脂，加入2倍摩尔量的CH3O-PEG5000-OCH2CONH-Ala-Leu-COOSu(0.1mmol)，反应48小时后，茚三酮法检测为阴性，停止反应，将所得肽树脂洗涤干燥。以间甲酚-TMBS-TFA用为裂解试剂，0℃反应90分钟，滤除树脂，将滤液旋转蒸发除去TFA，加无水***沉淀出固体，滤集固体，溶于水中，冰冻干燥得白色粘稠固体，RP-HPLC纯化得目标产物。
酸水解的氨基酸组成比例分析与理论值相符。
实施例2CH3O-PEG5000-OCH2CONH-Ala-Leu-CONH-Tα1-OH(I2)的制备
用0.05mmol Wang树脂为固相载体，Fmoc-AA-OH(0.2mmol)为原料，DCC-HOBT(0.2mmol)为缩合剂，按照胸腺素α1(Tα1)的氨基酸序列，用标准的Fmoc固相多肽合成方法合成全保护肽链Fmoc-Tα1-Wang树脂。用20％哌啶/DMF脱除Fmoc后，加入0.6mmol的CH3O-PEG5000-OCH2CONH-Ala-Leu-COOSu，反应48小时后，茚三酮法检测为阴性，停止反应，将所得肽树脂洗涤干燥。以5ml间甲酚-TMBS-TFA用为裂解试剂，0℃反应90分钟，滤除树脂，将滤液旋转蒸发除去TFA，加无水***沉淀出固体，滤集固体，溶于水中，冰冻干燥得白色粘稠固体，RP-HPLC纯化得目标产物。
酸水解的氨基酸组成比例分析与理论值相符。
实施例3CH3O-PEG12000-OCH2CONH-Ala-Leu-CONH-IFN-α2b(I3)的制备
参照实施例1.1的方法，用分子量12000的单甲氧基聚乙二醇代替分子量5000的单甲氧基聚乙二醇制备CH3O-PEG12000-OCH2COOH。
参照实施例1.2的方法，用CH3O-PEG12000-OCH2COOH代替CH3O-PEG5000-OCH2COOH制备CH3O-PEG12000-OCH2CONH-Ala-Leu-OSu。
将IFN-α2b溶于pH6.5，100mM的磷酸缓冲液，配成5mg/ml的溶液，滴加3倍摩尔量的CH3O-PEG12000-OCH2CONH-Ala-Leu-COOSu的溶液，4℃搅拌反应3小时。将反应液用pH4.5，10mM醋酸铵缓冲液稀释20倍。取羧甲基琼脂糖离子交换树脂(CM-Sepharose)装柱，离子交换树脂先用5个柱体积的pH4.5，10mM醋酸铵缓冲液预平衡，然后将稀释后的反应液上样，先用pH4.5，10mM醋酸铵缓冲液洗脱，除去未反应的PEG衍生物；再用A液为pH4.5，40mM的醋酸铵缓冲液，A液为含2M氯化钠的pH4.5，40mM的醋酸铵缓冲液梯度洗脱，收集第二峰面积下的组分，即得一分子PEG与一分子IFN-α2b交联的产物CH3O-PEG12000-OCH2CONH-Ala-Leu-CONH-IFN-α2b。
实施4CH3O-PEG12000-OCH2CONH-Ala-Leu-CONH-rhIL-2(I4)的制备
将重组人白介素-2(rhIL-2)溶于pH6.5，100mM的磷酸缓冲液，配成2mg/ml的溶液，滴加3倍摩尔量的CH3O-PEG12000-OCH2CONH-Ala-Leu-COOSu的溶液，4℃搅拌反应3小时。将反应液用pH6.0，20mM磷酸缓冲液稀释20倍。取羧甲基琼脂糖离子交换树脂(CM-Sepharose)装柱，离子交换树脂先用5个柱体积的pH6.0，20mM磷酸缓冲液预平衡，然后将稀释后的反应液上样，先用pH6.0，20mM磷酸缓冲液洗脱，除去未反应的PEG衍生物；再用A液为pH7.0，20mM的磷酸缓冲液，B液为含1M氯化钠的pH7.0，20mM的磷酸缓冲液梯度洗脱，收集第二峰面积下的组分，即得一分子PEG与一分子rhIL-2交联的产物CH3O-PEG12000-CH2CONH-Ala-Leu-CONH-rhIL-2。
实施例5CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-CONH-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH(II1)的制备
5.1CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-COOSu的制备
将单甲氧基聚乙二醇(MW 12000)14.4g用20ml甲苯和12ml二氯甲烷的混合溶剂溶解，加入1g(20mmol)无水三乙胺，0.56g三光气，搅拌反应过夜。将反应液减压蒸干，将残留物用干燥的四氢呋喃溶解，加入5倍摩尔量L-丙氨酸和干燥的三乙胺，室温搅拌反应过夜。用0.1N的盐酸溶液调节pH至3，减压蒸除四氢呋喃，然后将水溶液用Sephadex-10凝胶柱层析分离，以0.2M碳酸氢氨水溶液洗脱。收集第一峰面积下组分，冰冻干燥，得到CH3O-PEG12000-CH2CH2OCONH-Ala-OH。
将CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Ala-OH溶于干燥的四氢呋喃中，加入5倍摩尔量L-亮氨酸甲酯，5倍摩尔量的DCC，室温搅拌反应过夜，然后缓慢加入0.1N的氢氧化钠溶液，至pH达到10，室温搅拌2小时。用0.1N的盐酸溶液调节pH至3，减压蒸除四氢呋喃，然后将水溶液用Sephadex-10凝胶柱层析分离，以0.2M碳酸氢氨水溶液洗脱。收集第一峰面积下组分，冰冻干燥，得到CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-OH。
将CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-OH溶于干燥的四氢呋喃中，加入5倍摩尔量N-羟基琥珀酰亚胺，1倍摩尔量的DCC，室温搅拌反应过夜，过滤，得到CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-COOSu的溶液备用。
5.2CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-CONH-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH(II1)的制备
按照实施例1.3的方法合成H-Arg(Mtr)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-Wang树脂，加入2倍摩尔量的CH3O-PEG12000-OCH2CH2-OCONH-Ala-Leu-COOSu(0.1mmol)，反应48小时后，茚三酮法检测为阴性，停止反应，将所得肽树脂洗涤干燥。以5ml间甲酚-TMBS-TFA用为裂解试剂，0℃反应90分钟，滤除树脂，将滤液旋转蒸发除去TFA，加无水***沉淀出固体，滤集固体，溶于水中，冰冻干燥得白色粘稠固体，RP-HPLC纯化得目标产物。
酸水解的氨基酸组成比例分析与理论值相符。
实施例6CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-CONH-Tα1-OH(II2)的制备
按照实施例2的方法合成合成全保护肽链Fmoc-Tα1-Wang树脂。用20％哌啶/DMF脱除Fmoc后，加入3倍摩尔量的CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-OSu，反应48小时后，茚三酮法检测为阴性，停止反应，将所得肽树脂洗涤干燥。以5ml间甲酚-TMBS-TFA用为裂解试剂，0℃反应90分钟，滤除树脂，将滤液旋转蒸发除去TFA，加无水***沉淀出固体，滤集固体，溶于水中，冰冻干燥得白色粘稠固体，RP-HPLC纯化得目标产物。
酸水解的氨基酸组成比例分析与理论值相符。
实施例7CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-CONH-IFN-α2b(II3)的制备
将IFN-α2b溶于pH6.5，100mM的磷酸缓冲液，配成5mg/ml的溶液，滴加3倍摩尔量的CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-COOSu的溶液，4℃搅拌反应3小时。将反应液用pH4.5，10mM醋酸铵缓冲液稀释20倍。取羧甲基琼脂糖离子交换树脂(CM-Sepharose)装柱，离子交换树脂先用5个柱体积的pH4.5，10mM醋酸铵缓冲液预平衡，然后将稀释后的反应液上样，先用pH4.5，10mM醋酸铵缓冲液洗脱，除去未反应的PEG衍生物；再用A液为pH4.5，40mM的醋酸铵缓冲液，A液为含2M氯化钠的pH4.5，40mM的醋酸铵缓冲液梯度洗脱，收集第二峰面积下的组分，即得一分子PEG与一分子IFN-α2b交联的产物CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-CONH-IFN-α2b。
实施8CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-CONH-rhIL-2(II4)的制备
将重组人白介素-2(rhIL-2)溶于pH6.5，100mM的磷酸缓冲液，配成2mg/ml的溶液，滴加3倍摩尔量的CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-COOSu的溶液，4℃搅拌反应3小时。将反应液用pH6.0，20mM磷酸缓冲液稀释20倍。取羧甲基琼脂糖离子交换树脂(CM-Sepharose)装柱，离子交换树脂先用5个柱体积的pH6.0，20mM磷酸缓冲液预平衡，然后将稀释后的反应液上样，先用pH6.0，20mM磷酸缓冲液洗脱，除去未反应的PEG衍生物；再用A液为pH7.0，20mM的磷酸缓冲液，B液为含1M氯化钠的pH7.0，20mM的磷酸缓冲液梯度洗脱，收集第二峰面积下的组分，即得一分子PEG与一分子rhIL-2交联的产物CH3O-PEG12000-OCH2CH2OCONH-Ala-Leu-CONH-rhIL-2。
实施例9CH3O-PEG5000-OCH2CH2-NHCO-Ala-Leu-NHCO-Tyr-Val-Asp-Lys-Arg-H(III1)的制备
9.1CH3O-PEG5000-OCH2CH2-NH2的制备
称取CH3O-PEG5000-OCH2CH2OH 10.0g置于250ml反应瓶中，加入50ml CH2Cl2，固体溶解后再加入1.5g三乙胺和1.9g Ts-Cl，室温搅拌反应。TLC监测反应完全后，旋转蒸发除去溶剂，加100ml无水***沉淀出固体，得6.5gCH3O-PEG5000-OCH2CH2OTs。
将6.0g CH3O-PEG5000-OTs溶于10ml DMF，加入2.0g邻苯二甲酰亚胺钾盐，120℃反应4小时。减压蒸去溶剂，将残余物溶于50ml无水乙醇，加入1.5ml水合肼，回流反应4小时。旋转蒸发除去溶剂，将残余物溶于CH2Cl2，用无水***沉淀出固体，再以无水乙醇-***重结晶，得4.2g CH3O-PEG5000-OCH2CH2-NH2。
9.2CH3O-PEG5000-OCH2CH2-NHCO-Ala-Leu-H的制备
将CH3O-PEG5000-OCH2CH2-NH2，溶于水，滴加5倍摩尔量的Fmoc-Ala-OSu的四氢呋喃溶液。加完后，室温搅拌反应过夜。减压蒸去四氢呋喃，用哌啶脱除Fmoc后，用Sephadex-10凝胶柱层析分离，以0.2M碳酸氢氨水溶液洗脱。收集第一峰面积下组分，冰冻干燥，得到CH3O-PEG5000-OCH2CH2-NHCO-Ala-H。
将CH3O-PEG5000-OCH2CH2-NHCO-Ala-H溶于水，滴加5倍摩尔量的Fmoc-Leu-OSu的四氢呋喃溶液。加完后，室温搅拌反应过夜。减压蒸去四氢呋喃，用哌啶脱除Fmoc后，用Sephadex-10凝胶柱层析分离，以0.2M碳酸氢氨水溶液洗脱。收集第一峰面积下组分，冰冻干燥，得到CH3O-PEG5000-OCH2CH2-NHCO-Ala-Leu-H。
9.3CH3O-PEG5000-OCH2CH2-NHCO-Ala-Leu-NHCO-Tyr-Val-Asp-Lys-Arg-H(III1)的制备
以0.1mmol Rink酰胺树脂为固相载体，0.2mmol的Fmoc-AA-OH为原料，HBTU(0.2mmol)-NMM(0.3mmol)为缩合剂，按胸腺五肽的氨基酸序列，按标准的Fmoc固相多肽合成方法合成全保护肽树脂。最后加入0.6mmol的CH3O-PEG5000-OCH2CH2-NHCO-Ala-Leu-H，HBTU(0.2mmol)-NMM(0.3mmol)，反应48小时后，茚三酮法检测为阴性，停止反应，将所得肽树脂洗涤干燥。
以EDT-间甲酚-TFA为裂解试剂，0℃反应90分钟，滤除树脂，将滤液旋转蒸发除去TFA，加无水***沉淀出固体，滤集固体，溶于水中，冰冻干燥得白色粘稠固体，RP-HPLC纯化得目标产物。
酸水解的氨基酸组成比例分析与理论值相符。
实施例10CH3O-PEG12000-OCH2CH2-NHCO-Ala-Leu-NHCO-Tα1-H(III2)的制备
参照实施例9.1的方法，用分子量12000的单甲氧基聚乙二醇代替分子量5000的单甲氧基聚乙二醇制备CH3O-PEG12000-OCH2CH2-NH2。
参照实施例9.2的方法，用CH3O-PEG12000-OCH2CH2-NH2代替CH3O-PEG5000-CH2CH2-NH2制备CH3O-PEG12000-OCH2CH2-NHCO-Ala-Leu-H。
以0.1mmol Rink酰胺树脂为固相载体，0.2mmol Fmoc-AA-OH为原料，HBTU(0.2mmol)-NMM(0.3mmol)为缩合剂，按Tα1的氨基酸序列，用标准的Fmoc固相多肽合成方法合成全保护肽树脂。最后加入0.6mmol的CH3O-PEG12000-OCH2CH2-HCO-Ala-Leu-H(0.2mmol)，HBTU(0.2mmol)-NMM(0.3mmol)，反应48小时后，茚三酮法检测为阴性，停止反应，将所得肽树脂洗涤干燥。
以EDT-间甲酚-TFA为裂解试剂，0℃反应90分钟，滤除树脂，将滤液旋转蒸发除去TFA，加无水***沉淀出固体，滤集固体，溶于水中，冰冻干燥得白色粘稠固体，RP-HPLC纯化得目标产物。
酸水解的氨基酸组成比例分析与理论值相符。
实施例11胸腺五肽及胸腺素α1的PEG偶合物的活性评价
11.1对小鼠脾淋巴细胞的增殖的影响
用3H-TdR掺入法测定目标化合物对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。
取小鼠脾脏，制成脾细胞悬液。裂解红细胞后，洗涤三次；用苔盼兰染色，细胞计数，活细胞在95％以上。用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液将脾细胞浓度调为5×106细胞/ml。于96孔板中加入100μl/孔的细胞悬液；然后加入50μl/孔的样品，对照孔加50μl含10％血清的培养液；最后加入50μl/孔的ConA，，总体积为200μl。
于含5％CO2的37℃培养箱中培养，培养结束前12小时，每孔加入25μl3H-胸腺嘧啶核苷酸(2×104Bq)。继续培养至实验结束，然后将培养板冻存于-20℃冰箱；测定时将冻融的细胞用细胞收集仪收集至玻璃纤维膜上，加入闪烁液后于Beta记数仪上读取掺入细胞DNA的[3H]-胸腺嘧啶核苷量，以cpm值代表细胞增殖的情况。
         表1小鼠脾淋巴细胞的增殖试验结果
Figure G06198649720060713D000111
11.2对T淋巴细胞产生IL-2和IFN-γ的诱导作用
用ELISA法测定目标化合物对T淋巴细胞产生IL-2和IFN-γ的诱导作用。
取活细胞计数95％以上的小鼠脾细胞悬液，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液将脾细胞浓度调为1×107细胞/ml。于48孔板中加入800μl/孔的细胞悬液；然后加入100μl/孔的样品，对照孔加100μl含10％血清的培养液；最后加入100μl/孔的ConA。于含5％CO2的37℃培养箱中培养24小时，离心取上清液。用小鼠IFN-γ和IL-2检测试剂盒测定IFN-γ和IL-2的含量。
        表2对T淋巴细胞产生IL-2和IFN-γ的影响
Figure G06198649720060713D000121
实施例12干扰素的PEG偶合物的抗病毒活性评价
用Wish细胞-VSV病毒***测定干扰素及其PEG偶合物的抗病毒活性。采用细胞致病效应抑制为基础的抑制微量测定法，以能够保护半数细胞免受病毒攻击的待测样品的最大稀释度的倒数为干扰素单位。用国家IFNα标准品校准确定效价(IU)。
表3干扰素及其PEG偶合物的抗病毒活性
  样品   IU/mg
  IFN-α2b   1.58×108
  I3   2.31×108
  II3   2.39×108
实施例13白介素-2的PEG偶合物的活性评价
用重组人白介素-2依赖细胞株/MTT法测定白介素-2及其PEG偶合物的生物学活性，用国家标准品校准确定效价(IU)。以人血清白蛋白为标准蛋白，用Lowry法测定蛋白质含量，计算样品生物活性(IU/ml)与蛋白质含量(mg/ml)的比值，即为比活性。
表4白介素-2及其PEG偶合物的生物活性
  样品   IU/mg
  rhIL-2   0.63×108
  I4   1.42×108
  II4   1.78×108
实施例14体外酶稳定性的测定
在pH 7.8的0.1％的胰蛋白酶溶液，分别加入待测样品，于37℃恒温水浴保温，分别于0、10min、30min、60min、120min及480min取样，按照实施例12、13的方法，测定各样品在不同时间点的生物活性，以0时的活性为100％，计算相对活性。
      表5干扰素、白介素-2及其PEG偶合物的酶稳定性
Figure G06198649720060713D000131

Claims (5)

1.式I所示的聚乙二醇衍生物通过氨基酸或寡肽的连接子与多肽或蛋白分子中的氨基连接形成的偶合物：
CH3O-PEG-OCH2CONH-(AA)n-CONH-P
I
式I中，PEG代表平均分子量5000-40000的聚乙二醇，AA代表L-氨基酸残基，P代表胸腺五肽、胸腺素α1、干扰素(IFN)或白介素；n为1-6的整数。
2.式II所示的聚乙二醇衍生物通过氨基酸或寡肽的连接子与多肽或蛋白分子中的氨基连接形成的偶合物：
CH3O-PEG-OCH2CH2OCONH-(AA)n-CONH-P
II
式II中，PEG代表平均分子量5000-40000的聚乙二醇，AA代表L-氨基酸残基，P代表胸腺五肽、胸腺素α1、干扰素(IFN)或白介素；n为1-6的整数。
3.式III所示的聚乙二醇衍生物通过氨基酸或寡肽的连接子与多肽分子中的羧基连接形成的偶合物：
CH3O-PEG-OCH2CH2-NHCO-(AA)n-NHCO-P
III
式III中，PEG代表平均分子量5000-40000的聚乙二醇，AA代表L-氨基酸残基，P代表胸腺五肽、胸腺素α1、干扰素(IFN)或白介素；n为1-6的整数。
4.含有权利要求1-3中式I、II或III所示的聚乙二醇与多肽或蛋白的偶合物作为活性成分的药物组合物。
5.含有权利要求1-3中式I、II或III所示的聚乙二醇与多肽或蛋白的偶合物作为活性成分的药物组合物在制备抗肿瘤或抗病毒药物中的用途。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CL2008002399A1 (es) 2007-08-16 2009-01-02 Pharmaessentia Corp Conjugado sustancialmente puro que posee una porcion polimerica, una porcion proteica (interferon alfa 2b) y un ligante alifatico de 1 a 10 atomos de carbono, util en el tratamiento de las hepatitis b o c.
CN101870732B (zh) * 2009-04-22 2013-03-20 兰州大学 用固-液相结合法进行单聚乙二醇化胸腺五肽的合成方法
CN102078598B (zh) * 2011-01-06 2012-11-28 河南亚卫动物药业有限公司 一种防治猪病毒性疾病的注射剂及其制备方法
US8440309B2 (en) * 2011-01-31 2013-05-14 Confluent Surgical, Inc. Crosslinked polymers with the crosslinker as therapeutic for sustained release
CN102145178B (zh) * 2011-04-15 2012-09-26 北京凯因科技股份有限公司 Peg化白介素15
CN103030580A (zh) * 2012-12-13 2013-04-10 山东铂源药业有限公司 一种拉帕替尼中间体的制备方法
US9700633B2 (en) 2013-01-28 2017-07-11 Jenkem Technology Co., Ltd., Tianjin Branch Conjugates of water soluble polymer-amino acid oligopeptide-drug, preparation method and use thereof
WO2014114262A1 (zh) * 2013-01-28 2014-07-31 天津键凯科技有限公司 水溶性聚合物-氨基酸寡肽-药物结合物及其制备方法和用途
US11559567B2 (en) 2014-11-06 2023-01-24 Pharmaessentia Corporation Dosage regimen for pegylated interferon
CN107325275A (zh) * 2017-07-07 2017-11-07 湖南华腾制药有限公司 一种1,2‑二肉豆蔻酸甘油酯衍生物的制备方法
CN109589415B (zh) 2017-09-30 2022-02-18 天津键凯科技有限公司 一种聚乙二醇-多肽和蛋白类药物的结合物
CN114668852A (zh) * 2017-09-30 2022-06-28 天津键凯科技有限公司 一种聚乙二醇-多肽和蛋白类药物的结合物
CN111494600A (zh) * 2019-06-24 2020-08-07 南京安吉生物科技有限公司 一种药物组合物及治疗免疫力低下疾病的药物
CN110964117A (zh) * 2019-10-21 2020-04-07 哈尔滨医科大学 聚乙二醇修饰的人胸腺素β4二串体蛋白及其制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1283643A (zh) * 2000-07-05 2001-02-14 天津大学 聚乙二醇支载的紫杉醇或多烯紫杉醇的前药
CN1626549A (zh) * 2003-12-11 2005-06-15 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 胸腺五肽的聚乙二醇化衍生物，含有它们的药物组合物及用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1283643A (zh) * 2000-07-05 2001-02-14 天津大学 聚乙二醇支载的紫杉醇或多烯紫杉醇的前药
CN1626549A (zh) * 2003-12-11 2005-06-15 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 胸腺五肽的聚乙二醇化衍生物，含有它们的药物组合物及用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
姜忠义 等.生物分之化学修饰用聚乙二醇衍生物的合成及应用.《高分子通报》.2002,(第1期),34-40. *
王良友 等.多肽和蛋白质的聚乙二醇化修饰方法.《有机化学》.2003,第23卷(第11期),1320-1323. *
郑宝胜 等.蛋白质的聚乙二醇修饰及其在医药研究中的应用.《生物化学与生物物理进展》.1993,第20卷(第4期),267-269. *

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