CN101103103A - 具有串联转录单位的重组流感病毒载体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于例如在没有辅助病毒的情况下使用含串联转录盒的载体制备流感病毒的组合物，其中所述串联转录盒包含PolI和/或PolII启动子。
Description
相关申请的交叉参考
本申请要求2004年11月19日提交的美国申请序号60/629,665的权益，所述申请的公开内容在此引入作为参考。
政府权利声明
本发明是在美国政府资助下完成的(美国公共卫生服务部国立***反应和感染性疾病研究所(National Institute of Allergy and InfectiousDiseases Public Health Service)资助号AI047446)。美国政府在本发明中可享有一定的权利。
发明背景
流感季节性流行和大流行持续夺走人类生命，并影响全球经济。单在美国，流感每年引致估计50,000例死亡(Thompson等，2003)，而全球大流行可导致数百万例流感相关死亡。一个经典事例就是所谓的‘西班牙流感’，其于1918-1919年在全世界夺走了估计4000-5000万人的生命(Potter，1998)。流感病毒施加的威胁由于近期禽流感病毒传入人群中而被进一步提升。长期以来一直认为禽流感病毒不会直接传播到人类并引起致死结果。但是，这种观念在1997年被改变，当时18名香港居民被H5N1亚型的全禽流感病毒感染，导致6人死亡(Subbarao等，1998；Claas等，1998)。在之后的几年当中，报告了其它几例直接禽传人病例(Peiris等，2004；Fouchier等，2004；Koopsman等，2004)，包括在几个亚洲国家正在发生的高致病性H5N1流感病毒的爆发，至2005年1月26日为止夺走了54名受感染个体中的41条生命(WHO，2004)。人H5N1病毒感染数量的逐渐增加连同高死亡率以及可能的人传人传播一起，使得必须开发针对这些病毒的疫苗。
在美国，两种流感疫苗获颁人用许可：一种灭活疫苗和一种减毒活疫苗病毒。流感病毒疫苗的生产依赖于重配(Gerdil，2003)，其需要用提供血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)节段的循环野生株和A/PR/8/34(PR8)病毒(在鸡胚(egg)中提供高生长特性的减毒人病毒)或提供减毒表型的减毒活病毒共感染细胞。选择期望的“6+2”重配体(即在PR8或减毒活病毒遗传背景中含循环野生株的HA和NA基因节段的那些毒株)耗时且麻烦。而且，需要重配和选择以及某些重配体病毒不能培养至高滴度导致疫苗生产延迟。
对于甲型和乙型流感病毒，高效反向遗传***目前所处状态允许由克隆的cDNA产生这些病毒(Neumann等，1999；Hoffmann等，2002；Fodor等，1999；Hoffmann等，2000)。在一个***(Neumann等，1999)中，8种质粒编码处于RNA聚合酶I(PolI)启动子和终止子序列控制之下的8个流感病毒RNA节段，将这8种质粒连同4种RNA聚合酶II(PolII)驱动的、用于表达3种病毒聚合酶亚单位和核蛋白NP的质粒一起转染入真核细胞中；这4种蛋白是启动病毒复制和转录所必需的。也已开发出替代***(Hoffmann等，2000)，其依赖于8种质粒，在这8种质粒中，病毒cDNA在一个位点侧接RNA聚合酶I启动子，在另一个位点侧接RNA聚合酶II启动子，该***允许由同一模板获得vRNA和mRNA。这些***允许对6+2重配体进行工程化，而不需要重配和筛选步骤。
数量有限的哺乳动物细胞系可用于生产流感病毒疫苗。它们包括Madin-Darby犬肾细胞(MDCK)(Brands等，1999；Palache等，1999；Halperin等，2002)和非洲绿猴肾细胞(Vero)(Kistner等，1998；Kistner等，1999a；Kistner等，1999b；Bruhl等，2000)。这些细胞系不能被高效转染，有时限制了其在反向遗传***中用于流感病毒疫苗生产的用途；但是，在Vero细胞中生产流感病毒已得到证实(Fodor等，1999；Nicolson等，2005)。
因此，需要一种制备流感病毒的改良方法。
发明概述
本发明提供含串联转录单位(转录盒)的分离载体(多核苷酸)，所述串联转录单位包括(i)基于RNA聚合酶I(PolI)的转录盒，和/或(ii)基于RNA聚合酶II(PolII)的转录盒，和/或(iii)基于RNA PolI/II的转录盒，它们在一个或多个载体(例如质粒或其它载体，例如线性核酸传递载体)上。具体地说，本发明提供可用于组合物的质粒，以制备感染性负链分段RNA病毒，所述组合物具有少于8种含病毒基因的质粒，用于病毒生产。例如，本发明的组合物可包含1、2、3、4、5、6或7种具有流感病毒基因的质粒，所述组合物一旦导入到细胞中，就产生感染性流感病毒。因此，在一个实施方案中，为提供病毒生产用质粒数减少的反向遗传***，将达8种用于对应流感病毒RNA合成的RNA聚合酶I转录盒组合在一种质粒上，并将达用于3种流感病毒聚合酶亚单位的3种转录盒组合在一种质粒上。如下文所述，该方法允许在Vero细胞中有效和大量地产生甲型流感病毒。
例如，本发明包括含串联转录盒的载体，例如质粒，所述串联转录盒例如为以下的一种或更多种转录盒：(i)RNA PolI启动子、流感病毒RNA的cDNA(为负义或正义方向)和RNA PolI终止子；(ii)RNA PolII启动子、流感病毒的PB2、PB1、PA和/或NP蛋白的DNA以及聚腺苷酸化信号(RNA PolII转录终止序列)，和/或(iii)RNA PolII启动子、RNA PolI转录终止序列、流感病毒RNA的cDNA(为正义方向)、RNA聚合酶PolI启动子和RNA PolII转录终止序列。在可被有效转染的细胞系中，这些方法在来源于转染细胞的每ml上清液中产生高达108病毒。
转录盒和/或本文所述载体的组合可用于产生减毒活流感疫苗病毒，例如使用所谓的“内部基因”(即PB2、PB1、PA、NP、M和NS)与来源于现有循环病毒的HA和NA基因组合。例如，H5N1病毒不能在鸡胚中培养，所以含这些基因的转录盒对产生H5N1疫苗病毒特别有用。在一个实施方案中，转录盒中的HA是甲型HA。在另一个实施方案中，转录盒中的HA是乙型HA。在再一个实施方案中，使用丙型流感病毒的基因。在一个实施方案中，RNA PolI启动子是人RNA PolI启动子。在一个实施方案中，NA cDNA还包含NB序列。在一个实施方案中，所述组合物还包含含PolI启动子的转录盒，所述PolI启动子有效连接(operably linked)至与PolI转录终止序列相连的流感病毒BM2 cDNA。
在一个实施方案中，通过将全部8种用于产生流感病毒的RNAPolI转录盒组合在一种质粒上，可由5个质粒产生病毒，即1种用于合成全部8种vRNA，4种用于合成聚合酶蛋白和NP蛋白。在另一个实施方案中，通过将4种用于合成聚合酶和NP蛋白的RNA PolII转录盒组合在一种质粒上，可由两个质粒产生病毒，即1种用于合成全部8个vRNA，1种用于合成聚合酶蛋白和NP蛋白。在再一个实施方案中，通过将3种用于合成聚合酶蛋白的RNA PolII转录盒组合在1种质粒上、将用于NP蛋白的1个RNA PolII转录盒组合在1种质粒上以及使用1种用于合成全部8个vRNA的质粒，可由3种质粒产生病毒。在另一个实施方案中，通过将用于产生HA、NA、M和NS vRNA的4种RNA PolI转录盒和用于产生PB2、PB1、PA和NP vRNA和mRNA的4种RNA PolI/II转录盒组合在一种质粒上，可由一种质粒产生流感病毒。
任意合适的启动子或转录终止序列都可用于表达蛋白(例如病毒蛋白、非病毒病原体的蛋白或治疗性蛋白)或vRNA。因此，在一个实施方案中，本发明提供分离和纯化的载体，例如质粒，其表达或编码流感病毒蛋白，或表达或编码流感vRNA，所述流感vRNA既可以是天然vRNA，也可以是重组vRNA。优选地，所述启动子适于在特定宿主细胞中表达，例如禽宿主细胞或哺乳动物宿主细胞，例如犬、猫、马、牛、绵羊或灵长类动物细胞(包括人细胞)，或优选地适于在不止一种宿主中表达。
在一个实施方案中，用于vRNA生产的一种或更多种载体包含启动子，其包括但不限于RNA PolI启动子(例如人RNA PolI启动子)、RNA PolII启动子、RNA PolIII启动子、T7启动子或T3启动子。对于含RNA PolII启动子的vRNA载体，该载体可选地可包含核酶序列(参见PCT/US04/016649，其公开内容在此引入作为参考)。vRNA载体用的优选转录终止序列包括但不限于RNA PolI转录终止序列、RNAPolIII转录终止序列或核酶。质粒或待一起使用的质粒组合中的各个RNA PolII启动子可相同或不同。质粒或待一起使用的质粒组合中的各个RNA PolI启动子可相同或不同。同样，质粒或待一起使用的质粒组合中的各个RNA PolII转录终止序列可相同或不同。此外，质粒或待一起使用的质粒组合中的各个RNA PolI转录终止序列可相同或不同。使用少于12种质粒，例如少于10种质粒，可产生102TCID50/mL、103TCID50/mL、104 TCID50/mL、105TCID50/mL、106TCID50/mL、107TCID50/mL、108 TCID50/mL或以上的滴度。
在一个实施方案中，一个或多个(例如2、3、4、5、6、7或8个)病毒节段的cDNA各自均侧接RNA PolI终止序列和启动子序列，这种转录盒然后侧接RNA PolII启动子和RNA PolII聚腺苷酸化信号(以图4中的NP基因为例)。该方法由同一模板产生vRNA(由RNA PolI合成)和mRNA(由RNA PolII合成)这二者。因此不再需要另外的病毒蛋白合成用质粒，减少了流感病毒生产所必需的转录盒数。在各个vRNA/蛋白编码盒中的RNA PolI启动子和/或RNA PolI转录终止序列和/或RNA PolII启动子和/或RNA PolII终止序列可与任意其它编码盒相同或不同。
在再一个实施方案中，本发明包括以下组合：2种质粒(1种用于产生HA vRNA和NA vRNA，1种用于产生M vRNA和NS vRNA)和1种质粒(含4种用于合成PB2、PB1、PA和NP vRNA和mRNA的RNA PolI/II转录盒)，使得可由3种质粒产生病毒；或者1种用于PB2、PB1、PA、NP、M和NS vRNA的质粒、1种用于HA vRNA的质粒、1种用于NA vRNA的质粒以及1种用于合成聚合酶和NP蛋白的质粒，使得可由4种质粒产生病毒。在另一个实施方案中，本发明包括1种用于产生6种vRNA(例如PB2、PB1、PA、NP、M和NS vRNA)的质粒、1种用于产生两个vRNA(HA和NA vRNA)的质粒和4种各自用于生产PB2、PB1、PA和NP蛋白的质粒，使得可由6种质粒产生病毒。在进一步的实施方案中，本发明包括1种用于产生6个vRNA(例如PB2、PB1、PA、NP、M和NS vRNA)的质粒、1种用于产生两个vRNA(例如HA和NA vRNA)的质粒和1种用于产生PB2、PB1和PA蛋白的质粒以及1种用于生产NP蛋白的质粒，使得可由4种质粒产生病毒。
可用于本发明的组合物和/或方法的其它载体包含目标DNA，例如预防或治疗性蛋白的目标基因或可读框(编码区)，其侧接病毒序列以及可选的PolI启动子和PolI转录终止序列和/或PolII启动子和PolII转录终止序列。目标DNA相对于启动子可为正义方向或负义方向。目标DNA无论是在vRNA生产用载体中还是在蛋白生产用载体中都可编码免疫原性表位，例如可用于癌症治疗或疫苗或基因治疗的表位。在一个实施方案中，目标DNA是全长流感病毒cDNA或流感病毒DNA编码区，例如甲型流感(例如任意甲型流感病毒基因，包括15种HA或9种NA亚型中的任一种)、乙型流感或丙型流感DNA(参见Fields
Virology(Fields等(编辑)，Lippincott-Raven Publ.，Philadelphia，PA(1996))的45和46章，其通过引用具体地结合到本文中)，尽管预期任意来源(例如任意病毒)的基因都可用于本发明的载体和方法。因此，本发明的组合物还可包含一种转录盒，其包含连接至5′流感病毒序列的启动子，所述5′流感病毒序列包含连接至异源目标DNA(即未被发现与流感病毒序列天然连接的DNA或与自然界中所发现不同的谱系中的DNA)的5′流感病毒非编码序列，所述目标DNA连接至3′流感病毒序列，所述3′流感病毒序列包含连接至转录终止序列的3′流感病毒非编码序列。在一个实施方案中，目标DNA有效连接至RNA聚合酶启动子和RNA聚合酶转录终止序列。
在一个实施方案中，目标DNA包含编码病原体的免疫原性多肽或肽或者治疗性多肽或肽的可读框。在一个实施方案中，目标DNA有效连接至PolI启动子和PolI转录终止序列，而在另一个实施方案中，目标DNA有效连接至PolII启动子和PolII转录终止序列。在再一个实施方案中，目标DNA有效连接至PolI启动子和PolI转录终止序列以及PolII启动子和PolII转录终止序列。含目标DNA的转录盒可与至少一种其它转录盒在同一质粒上，或者可与其它转录盒在不同质粒上。当制备病毒时，目标DNA可替代流感病毒可读框或其部分，或者可处于所有流感病毒可读框之外。
本发明还提供一种制备病毒(例如流感病毒)的方法，或提供一种通过将异源目标DNA导入流感病毒载体而传递基因的方法。例如，所述方法包括使细胞与多种本发明的转录盒例如序贯地或同时接触，例如使用其量有效产生感染性流感病毒的本发明组合物。本发明还包括由与所述组合物接触的细胞分离出病毒。因此，本发明还提供分离的病毒以及与本发明的组合物或病毒接触过的宿主细胞。在另一个实施方案中，本发明包括使细胞与一种或更多种载体(或者是vRNA生产载体，或者是蛋白生产载体)接触，之后与其它载体(或者是vRNA生产载体，或者是蛋白生产载体)接触。
本发明的方法允许容易地操作流感病毒之类的负链病毒，例如通过将减毒突变导入到病毒基因组中。此外，因为流感病毒诱导强体液免疫和细胞免疫，所以本发明大大地增强了这些作为疫苗载体的病毒，尤其是考虑到病毒天然变异体的可获得性，所述病毒可序贯使用，允许重复地用于基因治疗。
本文描述的病毒生产方法不需要辅助病毒感染，可用于病毒诱变研究，以及生产疫苗(例如用于AIDS、流感、乙肝、丙肝、鼻病毒、丝状病毒、疟疾、疱疹和***的疫苗)和基因治疗载体(例如用于癌症、AIDS、腺苷脱氨酶缺乏症、肌营养不良、鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症和中枢神经***肿瘤的基因治疗载体)。因此，提供用于药物治疗(例如用于疫苗或基因治疗)的病毒。
本发明还提供一种免疫接种个体以对抗病原体(例如细菌、病毒或寄生物)或恶性肿瘤的方法。该方法包括给予个体一定量的至少一种本发明的分离病毒，其可选地与能有效免疫个体的佐剂组合。该病毒包含含有由病原体或肿瘤特异性多肽所编码的多肽之序列的vRNA。
本发明还提供一种扩大或增加哺乳动物中的内源蛋白质表达的方法，所述哺乳动物患有以所述内源性蛋白质的量下降或缺乏为特征的适应症或疾病。该方法包括给予所述哺乳动物一定量的本发明分离病毒，以有效扩大或增加所述哺乳动物中的该内源蛋白质的量。所述病毒含扩大或增加内源蛋白质量的多肽的vRNA。优选地，所述哺乳动物是人。
附图简述
图1：已建立的反向遗传***的示意图。在RNP转染方法(A)中，用体外合成的vRNA将纯化的NP和聚合酶蛋白质装配到RNP中。用RNP转染细胞，接着进行辅助病毒感染。在RNA聚合酶I方法(B)中，将含有RNA聚合酶I启动子、编码待拯救的vRNA的cDNA以及RNA聚合酶I终止子的质粒转染到细胞中。RNA聚合酶I的胞内转录产生了合成vRNA，该vRNA在用辅助病毒感染时被包装入子代病毒颗粒中。在A)和B)中，由辅助病毒群中选择转染子病毒(即含来源于所克隆cDNA的RNA的那些病毒)。在示于(C)的方法中，将含RNA聚合酶I启动子、8个病毒RNA节段各自的cDNA和RNA聚合酶I终止子的质粒与蛋白表达质粒一起转染入细胞中。尽管可用表达PA、PB1、PB2和NP的质粒产生感染性病毒，但所有其余结构蛋白(以括号表示)的表达增加了依赖于所产生病毒的病毒生产效率。
图2：产生RNA聚合酶I构建物的示意图。通过PCR扩增得自流感病毒的cDNA，用BsmBI消化并克隆到pHH21载体的BsmBI位点中(E.Hoffmann，Ph.D.thesis，Justus，Liebig-University，Giessen，Germany)，该载体含人RNA聚合酶I启动子(P)和小鼠RNA聚合酶I终止子(T)。该终止子序列上游的胸苷核苷酸(*T)代表该流感病毒RNA的3′末端。甲型流感病毒序列用粗体字母表示。
图3：具有多个流感病毒基因的质粒的示意图。A)用于由一个模板转录全部8个流感病毒RNA的pTM-PolI-WSN-All。通过使用限制性内切核酸酶的单一识别位点，将包含人RNA聚合酶I启动子(蓝色，PolI启动子)、编码负义方向的流感病毒节段的cDNA(以不同颜色显示)和小鼠RNA聚合酶I终止子(黑色，PolI终止子)的转录单位组合在一种质粒上。B)用于由1种质粒转录6个和2个流感病毒RNA的pTM-PolI-WSN-PB2-PB1-PA-NP-M-NS和pTM-PolI-WSN-HA-NA。这些质粒和术语的产生同对pTM-PolI-WSN-All的概述一样。C)用于由1种质粒转录PB2、PB1和PA mRNA的pC-PolII-WSN-PB2-PB1-PA。通过使用限制性内切核酸酶的单一识别位点，将包含RNA聚合酶II启动子(深蓝色，PolII启动子)(即鸡β-肌动蛋白启动子)、相应病毒蛋白的编码区(以不同颜色显示)和聚腺苷酸化序列(金色，PolyA)的转录单位组合在一种质粒上。
图4：RNA聚合酶I/II转录单位。NP基因侧接RNA聚合酶I终止子(PolI-Term)和RNA聚合酶I启动子(PolI-Prom)序列。然后将该单位插到RNA聚合酶II启动子(例如CMV启动子(CMV Pr))和聚腺苷酸化信号(例如牛生长激素聚腺苷酸化信号(BGH polyA))之间。
图5：含4种用于合成PB2、PB1、PA和NP vRNA和mRNA的RNA聚合酶I/II转录单位以及4种用于合成HA、NA、M和NS vRNA的RNA聚合酶I转录单位的质粒。PII：RNA聚合酶II启动子(阴影框)，pA：聚腺苷酸化信号(空心框)；P：RNA聚合酶I启动子(大黑框)，T：RNA聚合酶I终止子(小黑框)。
发明详述
定义
本文所用的术语“分离的和/或纯化的”指在体外制备、分离和/或纯化核酸分子，例如本发明的质粒或本发明的病毒，使其不与体内物质相结合，或者基本上由体外物质中纯化出来。分离的病毒制备物一般通过体外培养和繁殖获得，并基本上不含其它感染因子。本文所用的“基本上不含”指对特定感染因子来说，低于用针对该感染因子的标准检测方法的检测水平。“重组体”病毒是例如使用重组DNA技术体外操作以向病毒基因组导入变化的病毒或者人工产生的病毒。本文所用的术语“重组核酸”或“重组DNA序列或节段”指一种核酸(例如DNA)，该核酸来源于或分离自其某来源，随后可在体外发生化学变化，使得其序列不是天然序列，或者其序列相当于天然序列，但此序列的定位与其在天然基因组中应处位置不同。“来源”于某来源的DNA的实例应是被鉴定为有用片段的DNA序列，该序列然后可用化学方法合成为基本纯的形式。“分离”自某来源的此DNA的实例应是通过化学方法(如使用限制性内切核酸酶)从所述来源中切下或取出的有用DNA序列，这样其可通过基因工程方法作进一步处理(如扩增)而用于本发明。
本文所用的“高度可转染细胞”是这样的细胞：在这种细胞中例如根据转染细胞中的蛋白表达检测，单个质粒的转染效率达约95％，和/或其中用起过5种具有流感病毒基因的质粒转染，用于非减毒流感病毒的病毒生产，至转染后2天时产生至少约106TCID50/mL的病毒滴度，或者用于减毒病毒生产，产生约102 TCID50/mL的病毒滴度。代表性的高度可转染细胞包括但不限于293T细胞。相反，本文所用的“感染效率降低的细胞”是这样的细胞：在这种细胞中单个质粒的转染效率低于约50％，和/或用超过5个具有流感病毒基因的质粒转染，用于非减毒流感病毒的病毒生产，至感染后2天时产生低于约3×105TCID50/mL的病毒滴度。代表性的感染效率降低的细胞包括但不限于Vero细胞和MDCK细胞。
负义RNA病毒
负义RNA病毒分为7个科(弹状病毒科(Rhabdoviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、玻那病毒科(Bornaviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)和沙粒病毒科(Arenaviridae))，其中包括常见的人类病原体(例如呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus)、流感病毒(influenzavirus)、麻疹病毒(measles virus)和埃博拉病毒(Ebola virus))以及对家禽业和养牛业具有重要经济影响的动物病毒(例如新城疫病毒(Newcastledisease virus)和牛瘟病毒(Rinderpest virus))。前4科的特征在于不分段基因组，而后3科分别具有包含6-8个、3个或2个负义RNA段的基因组。负义RNA病毒的共同特征是其RNA基因组的负极性；即病毒RNA(vRNA)与mRNA互补，因此自身没有感染性。为了启动病毒转录和复制，vRNA必须通过病毒聚合酶复合体和核蛋白分别转录成正义mRNA或cRNA；对于甲型流感病毒，病毒聚合酶复合体由3种聚合酶蛋白PB2、PB1和PA组成。在病毒复制期间，cRNA作为新vRNA分子的合成模板。对于所有负链RNA病毒来说，vRNA和cRNA 5′端和3′端的非编码区对病毒基因组的转录和复制都是至关重要的。与细胞或病毒的mRNA转录物不同，cRNA和vRNA在5′末端都没有被加帽，在绝对的3′末端(very 3′end)也都没有聚腺苷酸化。
从生物化学方面和/或在病毒感染背景下，已经阐明了许多病毒蛋白的基本功能。然而，反向遗传***使我们对负链分段和不分段RNA病毒在其病毒复制和致病性方面的了解以及对开发减毒活病毒疫苗的了解急剧增加。反向遗传学作为用于分子病毒学的术语，定义为产生具有来自克隆cDNA的基因组的病毒(有关综述参见Neumann等，2002)。
流感病毒
甲型流感病毒具有8条单链负义病毒RNA(vRNA)的基因组，总共编码10-11种蛋白。流感病毒生命周期起始于血凝素(HA)与宿主细胞表面含唾液酸受体的结合，其后是受体介导的胞吞作用。晚期内体的低pH触发HA构象变化，因而暴露出HA2亚基的N端(所谓的融合肽)。融合肽促使病毒和胞内体膜融合，基质蛋白(M1)和RNP复合体释放到细胞质内。RNP由将vRNA壳体化的核蛋白(NP)以及由PA、PB1和PB2蛋白所形成的病毒聚合酶复合体组成。RNP转运到细胞核中，在此发生转录和复制。RNA聚合酶复合体催化3个不同反应：合成具有5′帽和3′多聚腺苷酸结构的mRNA、合成全长互补RNA(cRNA)以及使用cDNA为模板合成基因组vRNA。随后，新合成的vRNA、NP和聚合酶蛋白装配成RNP，从核中输出，转运到质膜，在此发生子代病毒颗粒的出芽。神经氨酸酶(NA)蛋白除去唾液酸寡糖中的唾液酸，由此从细胞表面释放出新装配的病毒体，并阻止病毒颗粒的自我聚集，因而在感染后期起至关重要的作用。尽管病毒装配涉及蛋白-蛋白相互作用和蛋白-vRNA相互作用，但是这些相互作用的性质很大程度上还是未知的。
尽管乙型和丙型流感病毒在结构和功能上均类似于甲型流感病毒，但还是有一些差异。例如，乙型流感病毒的M节段通过串联顺反子的终止-重起始模式编码两种蛋白M1和BM2，NA节段由双顺反子mRNA编码NA和NB蛋白。丙型流感病毒具有7个vRNA节段，依靠剪接过的转录物产生M1蛋白；未剪接过的mRNA的产物被蛋白酶剪切，产生CM2蛋白。另外，丙型流感病毒编码HA-酯酶，而不是单个的HA和NA蛋白。
索戈托病毒属(Thogotovirus)
索戈托病毒属(THOV)代表正粘病毒科的一个新属。它们由蜱传播，并己在驯养动物中(包括骆驼、山羊和牛)发现。因此，THOV能在蜱和脊椎动物细胞中复制。THOV基因组包含6个单链负义RNA节段。由3个最大节段编码的蛋白质显示出与流感病毒聚合酶蛋白质PB2、PB1和PA有显著同源性。节段5编码一种与流感病毒NP有关的蛋白质。节段4编码的THOV糖蛋白与流感病毒HA或NA均不同源，但是它显示出与杆状病毒糖蛋白有序列相似性。一般认为最小节段编码基质蛋白，与任一种流感病毒蛋白质都不象。与流感病毒相似，vRNA的3′和5′端都是启动子活性所需要的，此活性分别位于该vRNA的3′和5′端的末端14个和15个核苷酸上。
THOV的mRNA合成由宿主细胞衍生的帽结构启动。然而，与流感病毒相反，只有该帽结构(没有额外核苷酸)才被从细胞mRNA中切下(Albo等，1996；Leahy等，1997；Weber等，1996)。体外切割测定揭示，vRNA的5′和3′末端都是核酸内切酶活性所需要的(Leahy等，1998)，但是如流感病毒已显示的一样(Hagen等，1994)，加入模型cRNA启动子并不刺激核酸内切酶活性(Leahy等，1998)。已提出了THOV的‘钩’结构(Leahy等，1997；Weber等，1997)，这与对流感病毒提出的螺旋状结构相类似。然而，这种‘钩’结构仅存在于THOVvRNA启动子中。cRNA启动子序列不允许cRNA 5′端的2和9位之间以及3和8位之间形成碱基对。允许在这些核苷酸之间碱基配对的3位或8位替换刺激核酸内切酶活性，这是对所提出的‘钩’结构的强力支持证据(Leahy等，1998)。而且，该结构对THOV生命周期的调控可能是至关重要的；形成该‘钩’结构的vRNA启动子可刺激PB2核酸内切酶活性，因而允许转录。相反，cRNA启动子不能形成‘钩’结构，因此不能刺激核酸内切酶活性，因而不能引起复制。
布尼亚病毒科
布尼亚病毒科包括若干种在人中引起出血热或脑炎热(如裂谷热、汉坦病毒、La Crosse和Crimean-Congo出血热)的病毒。球状有包膜的病毒粒含有3个单链负义RNA节段(综述于Elliott，1997)。最大的节段(L)编码病毒RNA聚合酶蛋白(L蛋白)，而M节段编码G1和G2两种病毒糖蛋白以及一个非结构性蛋白质(NSm)。最小节段(S)编码核壳蛋白质(N)和第二种非结构性蛋白质(NSs)。病毒的复制和转录发生在细胞质中，新装配的病毒粒通过高尔基体膜出芽。
Bridgen和Elliott(1996)已建立了一种反向遗传***，从克隆的cDNA完整地产生感染性布尼安威拉病毒(Bunyamwera vinus)。他们采用了首先由Schnell等(1994)描述的用于狂犬病毒的策略：在表达病毒聚合酶和核蛋白的细胞中进行编码正义反基因组RNA(而不是负义基因组RNA)的cDNA的胞内转录。Bridgen和Elliott(1996)用表达T7聚合酶的牛痘病毒感染HeLaT4+细胞，然后用表达S、M和L节段所编码蛋白质的质粒转染这些细胞。接着他们用3种编码侧接T7聚合酶启动子和丁型肝炎病毒核酶的全长反基因组cDNA的质粒转染这些细胞。为了相对于牛痘病毒颗粒数增加布尼亚病毒颗粒数，该作者使用了蚊子细胞，在该细胞中布尼安威拉病毒复制而牛痘病毒不复制。此方案不仅能用于基因工程改造布尼亚病毒，还可以产生用不同的布尼亚病毒科毒株共感染细胞不易获得的重配体病毒。
为研究转录与复制所需要的布尼亚病毒启动子元件和病毒蛋白质，Dunn等(1995)以负义方向将CAT基因克隆在布尼安威拉S RNA节段5′和3′非翻译区之间。用表达L和S节段所编码蛋白质的构建物转染细胞，然后用在体外转录的RNA转染，产生CAT活性。布尼亚病毒S节段在重叠读框中编码两种蛋白质-N和NSs。为确定这两种蛋白质是否都是转录和复制所需要的，测试了仅表达N或NSs的构建物的CAT活性。N蛋白与L蛋白一起表达产生CAT活性，而用NSs表达构建物没有检测到CAT活性。因此，L蛋白和N蛋白足以满足布尼亚病毒样RNA的转录和复制。
同流感病毒一样，布尼亚病毒RNA的末端序列是互补的且高度保守的。因此猜测这些序列元件限定了布尼亚病毒启动子，并且对启动子活性至关重要。在该病毒RNA 3′末端缺失5个核苷酸极大地降低了CAT表达(Dunn等，1995)。相反，在5′末端加入2个核苷酸，或者在3′末端加入11个或35个核苷酸，并不消除CAT表达(Dunn等，1995)。因此，与流感病毒聚合酶复合体一样，布尼亚病毒聚合酶蛋白明显可在内部启动转录和/或复制。
本发明的重组流感病毒载体
使用本文所述载体明显降低了产生分段病毒(例如流感病毒)所需的质粒数，增加了可被高效转染的细胞系中的流感病毒的拯救效率，允许产生被严重减毒的病毒，和/或允许在不能以高效率被转染的细胞系(包括用于人疫苗生产的细胞系(例如Vero细胞))中产生流感病毒。因此，使用本发明载体降低了病毒产生的变量数，使流感病毒产生更一致，并减轻了提供有关质粒历史、纯度和毒性的必要文件证明的负担。这些优势允许快速产生疫苗病毒，尤其是对大流行而言。而且，本文公开的本发明并不限于流感病毒，而是可适用于任意其它的反义RNA病毒，例如副粘病毒科(Paramyxoviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)或布尼亚病毒科(Bunyaviridae)。
本发明提供至少一种以下的分离和/或纯化载体或包含一种或更多种载体和或两种或更多种转录盒的组合物：一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PA cDNA(例如全长流感病毒PA cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB1 cDNA(例如全长流感病毒PB1 cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB2 cDNA(例如全长流感病毒PB2 cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒HA cDNA(例如全长流感病毒HA cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NP cDNA(例如全长流感病毒NP cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NA cDNA(例如全长流感病毒NA cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒M cDNA(例如全长流感病毒M cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NS cDNA(例如全长流感病毒NS cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PA的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB1的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB2的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NP的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有各自均有效连接至流感病毒PA的DNA节段(例如全长流感病毒PA cDNA)的PolI启动子和PolI转录终止序列以及PolII启动子和PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有各自均有效连接至流感病毒PB1的DNA节段(例如全长流感病毒PB1 cDNA)的PolI启动子和PolI转录终止序列以及PolII启动子和PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有各自均有效连接至流感病毒PB2的DNA节段(例如全长流感病毒PB2 cDNA)的PolI启动子和PolI转录终止序列以及PolII启动子和PolII转录终止序列；和/或一种转录盒，其含有各自均有效连接至流感病毒NP的DNA节段(例如全长流感病毒NPcDNA)的PolI启动子和PolI转录终止序列以及PolII启动子和PolII转录终止序列。
本发明的载体可包含选自以下的两种或更多种转录盒：一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PA cDNA(例如全长流感病毒PAcDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB1 cDNA(例如全长流感病毒PB1cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB2 cDNA(例如全长流感病毒PB2cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒HA cDNA(例如全长流感病毒HAcDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NP cDNA(例如全长流感病毒NPcDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NA cDNA(例如全长流感病毒NAcDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒M cDNA(例如全长流感病毒McDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NS cDNA(例如全长流感病毒NScDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PA的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB1的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB2的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列；和/或一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NP的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列。
在一个实施方案中，本发明的载体包含选自以下的两种或更多种转录盒：一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PA的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB1的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB2的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列；和一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NP的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列。
在另一个实施方案中，本发明的载体包含选自以下的至少两种转录盒：一种转录盒，其含有效连接至流感病毒HA cDNA(例如全长流感病毒HA cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NA cDNA(例如全长流感病毒NA cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒M cDNA(例如全长流感病毒M cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；和/或一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NS cDNA(例如全长流感病毒NS cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列。
本发明还包括具有至少两种选自以下的转录盒的载体：一种转录盒，其含有各自均有效连接至流感病毒PA的DNA节段(例如全长流感病毒PA cDNA)的PolI启动子和PolI转录终止序列以及PolII启动子和PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有各自均有效连接至流感病毒PB1的DNA节段(例如全长流感病毒PB1 cDNA)的PolI启动子和PolI转录终止序列以及PolII启动子和PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有各自均有效连接至流感病毒PB2的DNA节段(例如全长流感病毒PB2 cDNA)的PolI启动子和PolI转录终止序列以及PolII启动子和PolII转录终止序列；和/或一种转录盒，其含有各自均有效连接至流感病毒NP的DNA节段(例如全长流感病毒NP cDNA)的PolI启动子和PolI转录终止序列以及PolII启动子和PolII转录终止序列。
本发明还提供含选自以下的两种或更多种转录盒的载体：一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PA cDNA(例如全长流感病毒PAcDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB1 cDNA(例如全长流感病毒PB1cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB2 cDNA(例如全长流感病毒PB2cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒HEF cDNA(例如全长流感病毒HEFcDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NP cDNA(例如全长流感病毒NPcDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒M cDNA(例如全长流感病毒McDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；和/或一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NS cDNA(例如全长流感病毒NS cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列。
本发明还提供含选自以下的两种或更多种转录盒的载体：一种转录盒，其含有效连接至流感病毒M cDNA(例如全长流感病毒McDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NS cDNA(例如全长流感病毒NScDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；和一种转录盒，其含有效连接至流感病毒HEF cDNA(例如全长流感病毒HEF cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列。
在一个实施方案中，本发明提供一种分离和/或纯化的载体，其包含一种或更多种转录盒，所述转录盒包括：一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PA cDNA(例如全长流感病毒PA cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB1 cDNA(例如全长流感病毒PB1 cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB2 cDNA(例如全长流感病毒PB2 cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒HEF cDNA(例如全长流感病毒HEF cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NP cDNA(例如全长流感病毒NP cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒M cDNA(例如全长流感病毒M cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NS cDNA(例如全长流感病毒NS cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PA的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB1的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB2的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NP的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有各自均有效连接至流感病毒PA的DNA节段(例如全长流感病毒PA cDNA)的PolI启动子和PolI转录终止序列以及PolII启动子和PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有各自均有效连接至流感病毒PB1的DNA节段(例如全长流感病毒PB1 cDNA)的PolI启动子和PolI转录终止序列以及PolII启动子和PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有各自均有效连接至流感病毒PB2的DNA节段(例如全长流感病毒PB2 cDNA)的PolI启动子和PolI转录终止序列以及PolII启动子和PolII转录终止序列；和/或一种转录盒，其含有各自均有效连接至流感病毒NP的DNA节段(例如全长流感病毒NPcDNA)的PolI启动子和PolI转录终止序列以及PolII启动子和PolII转录终止序列。
本发明的示例性组合物
本发明提供一种组合物，所述组合物包含至少一种质粒，所述质粒包含两种或更多种vRNA生产用转录盒，所述转录盒选自：一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PA cDNA(例如全长流感病毒PAcDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB1 cDNA(例如全长流感病毒PB1cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB2 cDNA(例如全长流感病毒PB2cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒HA cDNA(例如全长流感病毒HAcDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NP cDNA(例如全长流感病毒NPcDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NA cDNA(例如全长流感病毒NAcDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒M cDNA(例如全长流感病毒McDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；和/或一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NS cDNA(例如全长流感病毒NS cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；以及所述组合物包含至少一种质粒，所述质粒包含一种或更多种mRNA生产用转录盒，所述转录盒选自：一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PA的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB1的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB2的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列；和/或一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NP的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列。在一个实施方案中，每个PolI启动子都是相同的。在一个实施方案中，每个PolII启动子都是相同的。在一个实施方案中，每个PolI转录终止子序列都是相同的。在一个实施方案中，每个PolII转录终止子序列都是相同的。
在一个实施方案中，至少一种vRNA生产用质粒包含流感病毒PA、流感病毒PB1、流感病毒PB2、流感病毒HA、流感病毒NP、流感病毒NA、流感病毒M和流感病毒NS节段的转录盒。在一个实施方案中，至少一种mRNA生产用质粒包含两种或更多种用于流感病毒PA、流感病毒PB1、流感病毒PB2或流感病毒NP的转录盒，例如至少一种mRNA生产用质粒包含流感病毒PA、流感病毒PB1、流感病毒PB2和流感病毒NP的转录盒。在一个实施方案中，至少一种mRNA生产用质粒包含3种转录盒，其中所述组合物还包含第三种mRNA生产用质粒，其具有有效连接至流感病毒基因的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列，其中在第三种质粒中的DNA编码区属于不在所述含3种转录盒的质粒上的流感病毒基因，例如，至少一种mRNA生产用质粒包含流感病毒PA、流感病毒PB1、流感病毒PB2的转录盒，第三种质粒包含流感病毒NP的转录盒。在另一个实施方案中，至少一种vRNA生产用质粒包含流感病毒PA、流感病毒PB1、流感病毒PB2、流感病毒NP、流感病毒M和流感病毒NS的转录盒。本发明还包括一种vRNA生产用质粒，其包含：一种转录盒，其含有效连接至流感病毒HA cDNA(例如全长流感病毒HA cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；和一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NA cDNA(例如全长流感病毒NA cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列，例如，至少一种mRNA生产用质粒包含流感病毒PA、流感病毒PB1、流感病毒PB2和流感病毒NP的转录盒。在另一个实施方案中，至少一种mRNA生产用质粒包含其中3种转录盒，其中所述组合物还包含第三种mRNA生产用质粒，其具有有效连接至流感病毒基因的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列，其中在第三种质粒中的DNA编码区属于不在含所述3种转录盒的质粒上的流感病毒基因，例如，至少一种mRNA生产用质粒包含流感病毒PA、流感病毒PB1、流感病毒PB2的转录盒，第三种质粒包含流感病毒NP的转录盒。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含一种质粒，该质粒包含：一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PA cDNA(例如全长流感病毒PA cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB1 cDNA(例如全长流感病毒PB1 cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB2 cDNA(例如全长流感病毒PB2 cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒HA cDNA(例如全长流感病毒HA cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NP cDNA(例如全长流感病毒NP cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NA cDNA(例如全长流感病毒NA cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒M cDNA(例如全长流感病毒M cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；和一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NS cDNA(例如全长流感病毒NS cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列。在一个实施方案中，转录盒中的HA是甲型HA。在另一个实施方案中，转录盒中的HA是乙型HA。在一个实施方案中，RNA聚合酶I启动子是人RNA聚合酶I启动子。在一个实施方案中，转录盒中的NA节段是乙型NA节段，即乙型流感病毒NA和NB蛋白这二者的节段。在一个实施方案中，所述组合物还包含一种转录盒，其含有有效连接至流感病毒M cDNA(例如M1和BM2这二者的cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列。
本发明还提供一种含质粒的组合物，所述质粒包含两种或更多种选自以下的转录盒：一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PA的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB1的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB2的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列；和/或一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NP的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列。
在另一个实施方案中，本发明提供一种含质粒的组合物，所述质粒包含一种或更多种选自以下的转录盒：一种转录盒，其含有效连接至流感病毒HA cDNA(例如全长流感病毒HA cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NA cDNA(例如全长流感病毒NA cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒M cDNA(例如全长流感病毒M cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；和一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NS cDNA(例如全长流感病毒NS cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；以及所述质粒包含一种或更多种选自以下的转录盒：一种转录盒，其含有各自均有效连接至流感病毒PA cDNA(例如全长流感病毒PA cDNA)的PolI启动子和PolI转录终止序列以及PolII启动子和PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有各自均有效连接至流感病毒PB1 cDNA(例如全长流感病毒PB1 cDNA)的PolI启动子和PolI转录终止序列以及PolII启动子和PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有各自均有效连接至流感病毒PB2 cDNA(例如全长流感病毒PB2 cDNA)的PolI启动子和PolI转录终止序列以及PolII启动子和PolII转录终止序列；和一种转录盒，其含有各自均有效连接至流感病毒NP cDNA(例如全长流感病毒NP cDNA)的PolI启动子和PolI转录终止序列以及PolII启动子和PolII转录终止序列。在一个实施方案中，转录盒中的HA为甲型HA。在另一个实施方案中，转录盒中的HA为乙型HA。在一个实施方案中，RNA PolI启动子是人RNA PolI启动子。在一个实施方案中，转录盒中的NA cDNA是乙型NA cDNA，即具有NA和NB的cDNA。在一个实施方案中，组合物还包含一种转录盒，该转录盒含有有效连接至流感病毒M cDNA(例如具有M1和BM2的cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列。
本发明还提供一种含质粒的组合物，该质粒包含：一种转录盒，其含有各自均有效连接至流感病毒PA(例如全长流感病毒PA)的cDNA的PolI启动子和PolI转录终止序列以及PolII启动子和PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有各自均有效连接至流感病毒PB1cDNA(例如全长流感病毒PB1 cDNA)的PolI启动子和PolI转录终止序列以及PolII启动子和PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有各自均有效连接至流感病毒PB2 cDNA(例如全长流感病毒PB2cDNA)的PolI启动子和PolI转录终止序列以及PolII启动子和PolII转录终止序列；和一种转录盒，其含有各自均有效连接至流感病毒NP cDNA(例如全长流感病毒NP cDNA)的PolI启动子和PolI转录终止序列以及PolII启动子和PolII转录终止序列。
本发明还包括一种组合物，所述组合物含至少一种vRNA生产用质粒，所述质粒包含两种或更多种选自以下的转录盒：一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PA cDNA(例如全长流感病毒PA cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB1 cDNA(例如全长流感病毒PB1 cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB2 cDNA(例如全长流感病毒PB2 cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒HEF cDNA(例如全长流感病毒HEF cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NP cDNA(例如全长流感病毒NP cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒M cDNA(例如全长流感病毒M cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；和/或一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NS cDNA(例如全长流感病毒NS cDNA)的启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；以及所述组合物含至少一种mRNA生产用质粒，所述质粒包含一种或更多种选自以下的转录盒：一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PA的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB1的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB2的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列；和/或一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NP的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列。
在一个实施方案中，至少一种vRNA生产用质粒包含流感病毒PA、流感病毒PB1、流感病毒PB2、流感病毒HEF、流感病毒NP、流感病毒M和流感病毒NS节段的转录盒。在一个实施方案中，至少一种mRNA生产用质粒包含两种或更多种流感病毒PA、流感病毒PB1、流感病毒PB2或流感病毒NP的转录盒，例如至少一种mRNA生产用质粒包含流感病毒PA、流感病毒PB1、流感病毒PB2和流感病毒NP的转录盒。在一个实施方案中，至少一种mRNA生产用质粒包含其中3种转录盒，其中所述组合物还包含第三种mRNA生产用质粒，该质粒具有有效连接至流感病毒基因的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列，其中在第三种质粒中的DNA编码区属于不在含所述3种转录盒的质粒上的流感病毒基因，例如，至少一种mRNA生产用质粒包含流感病毒PA、流感病毒PB1、流感病毒PB2的转录盒，第三种质粒包含流感病毒NP的转录盒。在一个实施方案中，至少一种vRNA生产用质粒包含流感病毒PA、流感病毒PB1、流感病毒PB2、流感病毒NP、流感病毒M和流感病毒NS节段的转录盒。例如，所述组合物包含vRNA生产用质粒，所述质粒包含一种转录盒，该转录盒含有有效连接至流感病毒HEF cDNA(例如全长流感病毒HEF cDNA)的PolI启动子，该cDNA连接至PolI转录终止序列。
本发明还提供一种含质粒的组合物，所述质粒包含两种或更多种选自以下的转录盒：一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PAcDNA(例如全长流感病毒PA cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB1cDNA(例如全长流感病毒PB1 cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB2cDNA(例如全长流感病毒PB2 cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒HEFcDNA(例如全长流感病毒HEF cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NPcDNA(例如全长流感病毒NP cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒McDNA(例如全长流感病毒M cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；和/或一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NS cDNA(例如全长流感病毒NS cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列。在一个实施方案中，各种vRNA生产用转录盒均在一种质粒上。在一个实施方案中，各种mRNA生产用转录盒均在一种质粒上。在一个实施方案中，各种转录盒均在一种质粒上。在一个实施方案中，RNA PolI启动子是人RNA PolI启动子。
本发明还包括一种含质粒的组合物，所述质粒包含一种或更多种选自以下的转录盒：一种转录盒，其含有效连接至流感病毒HEFcDNA(例如全长流感病毒HEF cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒McDNA(例如全长流感病毒M cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；和一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NScDNA(例如全长流感病毒NS cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；以及所述质粒包含一种或更多种选自以下的转录盒：一种转录盒，其含有各自均有效连接至流感病毒PA cDNA(例如全长流感病毒PA cDNA)的PolI启动子和PolI转录终止序列以及PolII启动子和PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有各自均有效连接至流感病毒PB1 cDNA(例如全长流感病毒PB1 cDNA)的PolI启动子和PolI转录终止序列以及PolII启动子和PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有各自均有效连接至流感病毒PB2 cDNA(例如全长流感病毒PB2 cDNA)的PolI启动子和PolI转录终止序列以及PolII启动子和PolII转录终止序列；和一种转录盒，其含有各自均有效连接至流感病毒NP cDNA(例如全长流感病毒NP cDNA)的PolI启动子和PolI转录终止序列以及PolII启动子和/或PolII转录终止序列。在一个实施方案中，用于vRNA生产的各种转录盒均在一种质粒上。在一个实施方案中，用于mRNA生产的各种转录盒均在一种质粒上。在一个实施方案中，各种转录盒均在一种质粒上。在一个实施方案中，RNA PolI启动子是人RNA PolI启动子。
在一个实施方案中，所述组合物当与可选地为293T细胞或Vero细胞的细胞接触时，产生可检测量的流感病毒，例如至少102至至少103TCID50/mL的滴度。
示例性方法
本发明还提供一种制备流感病毒的方法。该方法包括使细胞与质粒接触，所述质粒包含两种或更多种选自以下的转录盒：一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PA cDNA(例如全长流感病毒PAcDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB1 cDNA(例如全长流感病毒PB1cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB2 cDNA(例如全长流感病毒PB2cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒HA cDNA(例如全长流感病毒HAcDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NP cDNA(例如全长流感病毒NPcDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NA cDNA(例如全长流感病毒NAcDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；和/或一种转录盒，其含有效连接至流感病毒M cDNA(例如全长流感病毒M cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；和/或一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NS cDNA(例如全长流感病毒NS cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；以及使细胞与质粒接触，所述质粒含一种或更多种选自以下的转录盒：一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PA的DNA编码区的PolII启动子；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB1的DNA编码区的PolII启动子；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB2的DNA编码区的PolII启动子；和/或一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NP的DNA编码区的PolII启动子。
在一个实施方案中，制备流感病毒的方法包括使细胞与质粒接触，所述质粒包含：一种转录盒，其含有效连接至流感病毒HA cDNA(例如全长流感病毒HA cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NA cDNA(例如全长流感病毒NA cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒M cDNA(例如全长流感病毒M cDNA)的启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NS cDNA(例如全长流感病毒NS cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；以及可选地包含一种或更多种选自以下的转录盒：一种转录盒，其含有各自均有效连接至流感病毒PA cDNA(例如全长流感病毒PA cDNA)的PolI启动子和PolI转录终止序列以及PolII启动子和PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有各自均有效连接至流感病毒PB1 cDNA(例如全长流感病毒PB1 cDNA)的PolI启动子和PolI转录终止序列以及PolII启动子和PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有各自均有效连接至流感病毒PB2 cDNA(例如全长流感病毒PB2 cDNA)的PolI启动子和PolI转录终止序列以及PolII启动子和PolII转录终止序列；和/或一种转录盒，其含有各自均有效连接至流感病毒NP cDNA(例如全长流感病毒NP cDNA)的PolI启动子和PolI转录终止序列以及PolII启动子和PolII转录终止序列。
在另一个实施方案中，本发明提供一种制备流感病毒的方法，该方法包括使细胞与质粒接触，所述质粒包含两种或更多种选自以下的转录盒：一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PA cDNA(例如全长流感病毒PA cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB1 cDNA(例如全长流感病毒PB1 cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB2 cDNA(例如全长流感病毒PB2 cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒HEF cDNA(例如全长流感病毒HEF cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NP cDNA(例如全长流感病毒NP cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒M cDNA(例如全长流感病毒M cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；和/或一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NS cDNA(例如全长流感病毒NS cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；以及使细胞与这样的质粒接触，所述质粒含一种或更多种选自以下的转录盒：一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PA的DNA编码区的PolII启动子；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB1的DNA编码区的PolII启动子；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB2的DNA编码区的PolII启动子；和/或一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NP的DNA编码区的PolII启动子。
本发明还提供一种制备流感病毒的方法。该方法包括使细胞与质粒接触，所述质粒包含：一种转录盒，其含有效连接至流感病毒HEF cDNA(例如全长流感病毒HEF cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒M cDNA(例如全长流感病毒M cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NScDNA(例如全长流感病毒NS cDNA)的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；并可选地包含一种或更多种选自以下的转录盒：一种转录盒，其含有各自均有效连接至流感病毒PA cDNA(例如全长流感病毒PA cDNA)的PolI启动子和PolI转录终止序列以及PolII启动子和PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有各自均有效连接至流感病毒PB1 cDNA(例如全长流感病毒PB1 cDNA)的PolI启动子和PolI转录终止序列以及PolII启动子和PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有各自均有效连接至流感病毒PB2 cDNA(例如全长流感病毒PB2 cDNA)的PolI启动子和PolI转录终止序列以及PolII启动子和PolII转录终止序列；和/或一种转录盒，其含有各自均有效连接至流感病毒NP cDNA(例如全长流感病毒NP cDNA)的PolI启动子和PolI转录终止序列以及PolII启动子和PolII转录终止序列。
在一个实施方案中，本发明的方法包括使细胞与载体接触，所述载体包含：一种转录盒，其包含连接至5′流感病毒序列的启动子，所述5′流感病毒序列包含5′流感病毒非编码序列和可选的编码序列的邻接部分(参见PCT/US03/04233，其在此引入作为参考)，连接至目标DNA，所述目标DNA连接至3′流感病毒序列，所述3′流感病毒序列包含3′流感病毒非编码序列和可选的编码序列的邻接部分，连接至转录终止序列(参见PCT/US03/04233)。在一个实施方案中，目标DNA为有义方向。在另一个实施方案中，目标DNA为负义方向。目标DNA可包含编码病原体的免疫原性多肽或肽或者治疗性多肽或肽的可读框。目标DNA可有效连接至PolI启动子和PolI转录终止序列，和/或目标DNA可有效连接至PolII启动子和PolII转录终止序列。
可用于本发明的细胞系和流感病毒
根据本发明，任何支持流感病毒有效复制的细胞都可用于本发明，所述细胞包括表达减少或降低水平的一种或多种作为流感病毒受体的唾液酸的突变细胞。由该方法得到的病毒可以制备成重配体病毒。
优选所述细胞是WHO已鉴定或可鉴定的连续细胞系。鉴定这类细胞系的要求包括对至少一个系谱的生长特征、免疫学标记、病毒易感性、致瘤性和储藏条件进行表征，以及通过在动物、鸡胚和细胞培养物中检验进行表征。所述表征用于证实所述细胞没有可检测的外源因子。在一些国家，还需要细胞核学实验。另外，致瘤性优选在与用于疫苗生产的细胞具有相同传代水平的细胞中进行检验。优选通过已显示能得到稳定结果的方法纯化疫苗病毒(参见例如World Health Organization，1982)。
优选建立待用细胞系的完整特征，以便可纳入适于终产物纯度的试验。可用于表征本发明所用细胞的数据包括：(a)有关其来源、建系和传代史的信息；(b)有关其生长和形态学特征的信息；(c)外源因子的检验结果；(d)区别性特征，例如将这些细胞与其它细胞系清楚地区分开来的生物化学、免疫学和细胞遗传学模式；和(e)致瘤性试验结果。优选所用宿主细胞的传代水平或群体倍增尽可能低。
优选所述细胞中生产的病毒在配制疫苗或基因治疗剂之前已高度纯化。一般而言，纯化过程使细胞DNA、其它细胞组分和外源因子被完全除去。也可使用使DNA彻底降解或变性的方法。参见例如Mizrahi，1990。
疫苗
本发明的疫苗可包含免疫原性蛋白，所述蛋白包括任何病原体的糖蛋白，例如来自一种或更多种细菌、病毒、酵母或真菌的免疫原性蛋白。因此，在一个实施方案中，本发明的流感病毒可以是流感病毒或其它病毒病原体的疫苗载体，所述其它病毒病原体包括但不限于：慢病毒如HIV、乙肝病毒、丙肝病毒、疱疹病毒如CMV或HSV或***病毒。
完整病毒体疫苗通过超滤浓缩，然后通过区带离心或色谱进行纯化。其在纯化前或纯化后使用例如***或β-丙内酯进行灭活。
亚单位疫苗包含纯化的糖蛋白。可如下制备所述疫苗：使用经去污剂处理而片段化的病毒悬液，通过例如超速离心纯化表面抗原。因此，亚单位疫苗主要含有HA蛋白，也含有NA。所用的去污剂可以是阳离子去污剂，例如十六烷基三甲基溴化铵(Bachmeyer，1975)；阴离子去污剂，例如脱氧胆酸铵(Laver和Webster，1976；Webster等，1977)；或非离子去污剂，例如商品名为TRITON X100的去污剂。也可以在用蛋白酶如菠萝蛋白酶处理病毒体后分离血凝素，然后通过例如Grand和Skehel(1972)所描述的方法进行纯化。
片段疫苗(split vaccine)包含已经过溶解脂质的试剂处理的病毒体。片段疫苗可如下制备：在搅拌下，用脂质溶剂例如***或氯仿以及去污剂处理如上获得的、灭活或未灭活的纯化病毒水性悬液。病毒包膜脂质的溶解导致病毒颗粒片段化。回收含片段疫苗的水相，片段疫苗主要由血凝素和神经氨酸酶(其原有的脂质环境被去除)以及病毒核心或其降解产物组成。然后，如果之前尚未经过灭活，则将残留的感染性颗粒灭活。
灭活疫苗。可以用已知方法灭活本发明的复制型病毒来提供本发明的灭活流感病毒疫苗，所述方法例如但不限于***或β-丙内酯处理。可用于本发明的灭活疫苗类型可包括全病毒(WV)疫苗或亚病毒颗粒(SV)(片段)疫苗。WV疫苗含有完整的灭活病毒，而SV疫苗含有用溶解含脂质病毒包膜的去污剂破坏、接着化学灭活残余病毒的纯化病毒。
另外，可以使用的疫苗包括含有分离的HA和NA表面蛋白的疫苗，称为表面抗原或亚单位疫苗。一般而言，针对SV和表面抗原(即纯化的HA或NA)疫苗的应答是类似的。一种含有与流行性病毒免疫相关的NA抗原和无关的HA的实验灭活WV疫苗似乎有效性比常规疫苗差(Ogra等，1977)。优选含有两种相关表面抗原的灭活疫苗。
减毒活病毒疫苗。根据已知的方法步骤，减毒活流感病毒疫苗也可用于预防或治疗流感病毒感染。优选按照已知方法(参见例如Murphy，1993)，通过将来自减毒供体病毒的减毒基因转移到分离的或重配的复制型病毒中，一步实现减毒。因为针对甲型流感病毒的抗性是由出现抗HA和NA糖蛋白的免疫应答介导的，所以编码这些表面抗原的基因必须来自循环野生型株。减毒基因来自减毒亲本。在该方法中，赋予减毒的基因优选不编码HA和NA糖蛋白。或者，这些基因不能转移给带有临床病毒分离株表面抗原的重配体。
已评价了许多供体病毒可重复地使流感病毒减毒的能力。作为非限制性实例，A/Ann Arbor(AA)/6/60(H2N2)冷适应(ca)供体病毒可用于减毒疫苗生产(参见例如Edwards，1994；Murphy，1993)。然后，在H2N2抗血清(其抑制带有减毒A/AA/6/60(H2N2)ca供体病毒表面抗原的病毒的复制)存在下，在25℃(对强毒病毒复制是限制性的)选择重配体子代。
已在人类中评价了一大系列的HIN1和H3N2重配体，发现在以下方面是令人满意的：(a)感染性，(b)对血清反应阴性儿童和初次免疫的成人的减毒性，(c)免疫原性，和(d)遗传稳定性。ca重配体的免疫原性与其复制水平相对应。因此，由新野生型病毒获得ca供体病毒的6个可转移基因可重复地使这些病毒减毒，以用于接种易感成人和儿童。
其它减毒突变可以经定点诱变引入流感病毒基因中，以拯救带有这些突变基因的感染性病毒。减毒突变可以引入基因组非编码区以及编码区中。这些减毒突变也可以引入例如PB2聚合酶基因(Subbarao等，1993)或NS基因中。因此，也可以产生带有经定点诱变引入的减毒突变的新供体病毒，此新供体病毒可用于生产减毒活重配体H1N1和H3N2候选疫苗，其方式类似于上述A/AA/6/60 ca供体病毒。
优选所述减毒病毒保留的病毒基因所编码的抗原决定簇与原临床分离株的抗原决定簇基本类似。这是因为减毒疫苗的目的是为了提供与原临床分离毒株基本上相同的抗原性，而同时没有感染性，以至于疫苗在接种哺乳动物中使诱发严重病情的变化最小。
因此，可按照已知方法将所述病毒减毒或灭活、配制并作为疫苗给予，以在动物如哺乳动物中诱导免疫应答。确定这些减毒或灭活疫苗是否保留与临床分离株或由其衍生的高生长株相似的抗原性的方法在本领域众所周知。所述已知方法包括利用抗血清或抗体消除表达供体病毒抗原决定簇的病毒；化学选择(例如金刚烷胺或金刚乙胺)；HA和NA活性和抑制；以及DNA筛选(例如探针杂交或PCR)，以证实减毒病毒中不存在编码所述抗原决定簇的供体基因(例如HA或NA基因)。参见例如Robertson等，1988；Kilboume，1969；Aymard-Henry等，1985；Robertson等，1992。
药物组合物
适于接种或胃肠外或口服给药的本发明药物组合物包含减毒或灭活流感病毒，任选还包含无菌的水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。所述组合物还可包含本领域已知的助剂或赋形剂。参见例如Berkow等，1987；
Avery’s Drug Treatment，1987；Osol，1980。本发明的组合物通常以单剂量(单位剂量)形式存在。
常规疫苗通常含有约0.1-200μg、优选10-15μg血凝素，其来自加入到常规疫苗组合物中的各毒株。构成本发明疫苗组合物主要成分的疫苗可包括甲型、乙型或丙型病毒或其任何组合，例如，这三种型别中的至少两种、不同亚型中的至少两种、同型中的至少两种、相同亚型中的至少两种或者不同分离株或重配体。人甲型流感病毒包括H1N1、H2N2和H3N2亚型。
胃肠外给药的制剂包括无菌的水性或非水性溶液剂、混悬剂和/或乳剂，其可含有本领域已知的助剂或赋形剂。非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)以及注射用有机酯类，例如油酸乙酯。载体或封闭敷料(occlusive dressing)可用于增加皮肤渗透性并增强抗原吸收。口服给药的液体剂型通常可包括含有所述液体剂型的脂质体溶液剂。适于悬浮脂质体的形式包括乳剂、混悬剂、溶液剂、糖浆剂和酏剂，其含有本领域常用的惰性稀释剂，例如纯化水。除了惰性稀释剂外，所述组合物还可包含佐剂、润湿剂、乳化剂和悬浮剂，或者甜味剂、调味剂或芳香剂。参见例如Berkow等，1992；Avery′s，1987；和Osol，1980。
当本发明的组合物用于给予个体时，其还可包含盐、缓冲剂、佐剂或对于提高所述组合物功效所需要的其它物质。对于疫苗来说，可以使用能增强特异性免疫应答的佐剂。通常，佐剂和组合物混合在一起，然后给予免疫***，或者可以分开给予，但是给予待免疫生物体的同一部位。Osol(1980)提供了适用于疫苗组合物的材料的实例。
通过混合至少2株流感病毒株(例如2-50株或其间的任意范围或数值)的复制型流感病毒，可提供疫苗异质性。优选具有现代抗原组成的甲型或乙型流感病毒株。按照本发明，可使用本领域已知技术在单株流感病毒中提供用于疫苗的变异性。
本发明的药物组合物可进一步或另外包含至少一种化疗化合物，例如用于基因治疗的免疫抑制剂、抗炎药或免疫增强剂，以及用于疫苗的化疗剂，其包括但不限于γ球蛋白、金刚烷胺、胍、羟基苯并咪唑、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、缩氨基硫脲类、美替沙腙、利福平、利巴韦林、嘧啶类似物、嘌呤类似物、膦甲酸、膦酰乙酸、阿昔洛韦、二脱氧核苷、蛋白酶抑制剂或更昔洛韦。
所述组合物还可含有可变的、但少量的无内毒素甲醛和防腐剂，其已被发现是安全的，并且在接受所述组合物的生物中不会促成不希望的作用。
药物用途
给予所述组合物(或其激发的抗血清)可用于“预防”或“治疗”目的。当预防性提供时，在出现病原体感染的任何症状之前，提供作为疫苗的本发明组合物。预防性给予所述组合物用于预防或缓解任何其后的感染。当预防性提供时，在出现任何疾病症状之前，提供本发明的基因治疗组合物。预防性给予所述组合物用于预防或缓解一种或更多种与所述疾病有关的症状。
当治疗性提供时，在检测到有实际感染症状时提供减毒或灭活病毒疫苗。治疗性给予所述化合物用于缓解任何实际感染。参见例如Berkow等，1992；和Avery，1987。当治疗性提供时，当检测到疾病症状或指征时，提供基因治疗组合物。治疗性给予所述化合物用于缓解所述疾病症状或指征。
因此，本发明的减毒或灭活疫苗组合物可在感染发作之前(以便预防或减弱预期感染)或实际感染开始之后提供。同样，对于基因治疗，所述组合物可在出现障碍或疾病的任何症状之前或者在检测到一种或更多种症状之后提供。
如果一种组合物的给予可被受体患者耐受，则该组合物被称为“药理学上可接受的”。如果这样的药物的给予量在生理学上是有意义的，则称为该药物以“治疗有效量”给予。如果本发明组合物的存在导致在受体患者生理学上出现可检测的变化，例如增强针对至少一种感染性流感病毒株的初次或继发性体液或细胞免疫应答中的至少一种，则该组合物在生理学上是有意义的。
所提供的“保护性”不必是绝对的，即，如果与对照群体或一组患者相比有统计学显著性改善，则流感感染无须完全被预防或消灭。保护性可限于减轻流感病毒感染症状发作的严重程度或减慢其速度。
药物给予
本发明的组合物可通过或者被动免疫或者主动免疫而赋予针对一种或更多种病原体(例如一种或更多种流感病毒株)的抗性。在主动免疫中，预防性给予宿主(例如哺乳动物)灭活或减毒活疫苗组合物，针对所述给予的宿主免疫应答起对抗感染和/或疾病的保护作用。对于被动免疫，可以回收激发的抗血清，将其给予怀疑具有至少一种流感病毒株引起的感染的接受者。本发明的基因治疗组合物可通过主动免疫产生预防或治疗水平的目标基因产物。
在一个实施方案中，在足以引起免疫应答产生的时间和量的条件下，将所述疫苗提供给雌性哺乳动物(在受孕或分娩时或之前)，所述免疫应答同时用于保护母体和胎儿或新生儿(经穿过胎盘的或母乳中的抗体的被动掺入)。
因此，本发明包括预防或缓解障碍或疾病(例如由至少一种病原体毒株引起的感染)的方法。如果本文所使用疫苗的给予引起疾病的症状或病况全部或部分缓解(即抑制)，或使个体产生针对该疾病的全部或部分免疫力，则认为该疫苗预防或缓解疾病。如本文所使用的，如果基因治疗组合物的给予引起疾病的症状或病况全部或部分缓解(即抑制)，或使个体产生针对该疾病的全部或部分免疫力，则认为该基因治疗组合物预防或缓解疾病。
可通过达到预期目的任何方式，使用如前所述的药物组合物，给予本发明的至少一种灭活或减毒流感病毒或其组合物。
例如，可以通过各种胃肠外途径，例如皮下、静脉内、皮内、肌内、腹膜内、鼻内、口服或经皮途径，给予所述组合物。胃肠外给药可通过快速浓注或者通过长时间逐渐输注的方式进行。使用本发明药物组合物的优选方式是通过肌内或皮下施用。参见例如Berkow等，1992；和Avery，1987。
用于预防、抑制或治疗流感病毒相关病理的典型方案包括给予有效量的本文所述疫苗组合物，可以作为单次治疗给药，或者在1周至约24个月之间的周期(包括1周和24个月)内或者其间的任何范围或数值内，作为加强或增强剂量重复给药。
按照本发明，组合物的“有效量”是指足以达到期望生物学作用的量。人们知道，有效剂量将取决于接受者的年龄、性别、健康状况和体重、同时治疗的种类(如果有的话)、治疗频率和所期望作用的性质。下面提供的有效剂量范围并不是对本发明的限制，而是代表优选的剂量范围。但是，最优选剂量将因各受试者而异，这是本领域技术人员理解且可确定的。参见例如Berkow等，1992；Avery′s，1987；和Ebadi，1985。
用于哺乳动物(例如人)或鸟类成年生物的减毒病毒疫苗剂量可为约103-107噬斑形成单位(PFU)/kg或其间的任意范围或数值。灭活疫苗剂量范围可为约0.1-200μg(例如50μg)血凝素蛋白。但是，依据使用现有疫苗作为出发点通过常规方法进行的测定，所述剂量应当是安全有效量。
每剂复制型病毒疫苗中的免疫活性HA的剂量可标准化，使其含有合适的量，例如1-50μg或其间的任意范围或数值，或者为美国公共卫生服务部(PHS)的推荐量，通常是对于3岁以上儿童每组分15μg，对于不满3岁儿童每组分7.5μg。NA的用量也可以标准化，但是，该糖蛋白在处理器纯化和储藏过程中可能不稳定。每剂0.5ml的疫苗优选含有约10-500亿个病毒颗拉，优选100亿个病毒颗粒。
下面通过以下非限制性实施例进一步描述本发明。
实施例1
甲型或乙型流感病毒基因组是一条分成8节段的负单链(C型仅有7个节段)。其中两种基因对病毒感染以及开发流感疫苗的策略是至关重要的，它们是血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因。HA刺突蛋白结合至含末端N-乙酰神经氨酸(唾液酸)基团的粘蛋白，有助于进入到宿主细胞中。经典的流感疫苗通常通过融合HA和NA基因连同6个得自“无害”母株的其它基因制备。该方法非常耗时，经常在疫苗开发过程中倾向于低滴度。已使用允许人们通过反向遗传产生合成流感病毒的方法制备病毒，例如组装含致病毒株的HA和NA基因以及母株的6个基因的重组病毒。具体地说，将这些克隆基因连同在其它质粒中编码的、复制和转录所必需的蛋白(聚合酶PB2、PB1、PA和NP)一起转染入细胞系中。然后收获减毒活病毒用于疫苗生产。
材料与方法
细胞。将293T人胚肾细胞和非洲绿猴肾(Vero)细胞保持在补加10％FCS的DMEM中。对于所有实验，都使用Vero CCL-81细胞，该细胞先前已用于生产灭活日本脑炎疫苗，并已进行了无致瘤性和外源感染因子筛选(Sugawara等，2002)。Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞保持在含5％NCS的MEM中。所有细胞都保持在37℃、5％CO2下。
质粒的构建。为组合用于合成流感病毒RNA节段的RNA聚合酶I转录盒，用含在病毒基因组中不存在的限制性内切核酸酶识别序列的寡核苷酸通过PCR扩增含人RNA聚合酶I启动子、负义方向的流感病毒cDNA和小鼠RNA聚合酶I终止子的转录盒(Neumann等，2002)。使用pPolI-WSN-PB2、pPolI-WSN-PB1、pPolI-WSN-PA、pPolI-WSN-HA、pPolI-WSN-NP、pPolI-WSN-NA、pPolI-WSN-M、pPolI-WSN-NS(全部描述于Neumann等，2002)作为模板，其包含位于RNA聚合酶I启动子和终止子序列之间的A/WSN/33(H1N1)病毒的对应病毒cDNA。将PCR产物克隆入含对应限制位点的标准载体中，测序，以证实它们没有不希望的突变。所获质粒的功能性经反向遗传证实。
使用具有侧接的单一限制位点的改良pTM1载体(Moss等，1990)逐步组合各个RNA聚合酶I转录盒(该载体在下文更详细地描述)。在各个克隆步骤中，通过反向遗传证实含2-7个RNA聚合酶I转录单位的所获质粒的功能性。最终的质粒pPolI-WSN-All(图3A)包含8个RNA聚合酶I转录盒，用于合成全部8个流感A/WSN/33病毒RNA。该质粒于室温稳定保持在大肠杆菌JM109细胞中；细菌培养物在Terrific Broth培养基中培养约30小时。
使用相同策略分别产生两种质粒(分别为pTM-PolI-WSN-HA-NA和pTM-PolI-WSN-PB2-PB1-PA-NP-M-NS)(图3B)，其分别含HA和NA节段以及其余6个病毒节段(即PB2、PB1、PA、NP、M和NS)的RNA聚合酶I转录盒。
质粒pCAWSPB2、pCAWSPB1和pCAWSPA包含鸡β-肌动蛋白启动子、A/WSN/33 PB2、PB1或PA蛋白的编码序列以及聚腺苷酸化信号。这些RNA聚合酶II转录单位通过PCR或通过***短DNA接头侧接单一限制性内切核酸酶的识别序列。对PCR扩增的转录盒整体测序，之后使用单一限制位点组合这3个RNA聚合酶II转录盒。所获质粒(pC-PolII-WSN-PB2-PB1-PA，图3C)的功能性通过反向遗传验证。
由质粒产生病毒。使用Trans IT-LT1(Mirus，Madison，WI)按照生产商的说明转染293T细胞(1×106)或Vero CCL-81细胞(5×105)。简单地讲，将转染试剂(2μl Trans IT-LT1/μg用于转染293T细胞的DNA；4μ1 Trans IT-LT1/μg用于转染Vero细胞的DNA)稀释在100μlOpti-MEM(GIBCO BRL)中，于室温温育5分钟，并加至预混合的DNA中。对于所有转染实验，使用0.1μg用于合成病毒RNA的各个‘单一单位’质粒(即pPolI-WSN-PB2、pPolI-WSN-PB1、pPolI-WSN-PA、pPolI-WSN-HA、pPolI-WSN-NP、pPolI-WSN-NA、pPolI-WSN-M、pPolI-WSN-NS；描述于Neumann等(1999))、1μg含不止一种RNA聚合酶I转录单位的质粒(即pTM-PolI-WSN-All、pTM-PolI-WSN-HA-NA或pTM-PolI-WSN-PB2-PB1-PA-NP-M-NS)以及1μg各种蛋白表达质粒。在转染后的指定时间，测定MDCK细胞中50％组织培养物感染的剂量(TCID50)。
结果
含多种RNA聚合酶I或II转录盒的质粒。为允许由少于8-12种质粒产生流感病毒(Neumann等，1999；Hoffmann等，2000；Fodor等，1999)，将用于病毒RNA(vRNA)合成的RNA聚合酶I转录盒或用于mRNA合成的RNA聚合酶II转录盒组合在一种质粒上。作为示范，使用其病毒产生的参数和效率已充分确立的A/WSN/33(WSN)病毒。简单地讲，将含人RNA聚合酶I启动子、负义方向的流感病毒cDNA和小鼠RNA聚合酶I终止子的RNA聚合酶I转录盒通过PCR扩增、克隆并测序，然后使用单一限制性位点逐步连接。使用改良的pTM1载体(Moss等，1990)作为载体骨架，其稳定支持20kb的埃博拉病毒cDNA(Neumann等，2000)，因此适于***大DNA片段。含8个单独的RNA聚合酶I转录单位的pTM-PolI-WSN-All(图3A；约22.5kb长)的产生不存在大的障碍；但是，需要大肠杆菌JM109细菌在室温生长，以防止该质粒重组。
对于每年的流感病毒疫苗生产，仅有两个病毒RNA节段不需要被替换，即编码血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)表面糖蛋白的节段。为此，产生其中组合了HA和NA节段的转录单位的质粒(pTM-PolI-WSN-HA-NA)(图3B)，而第二种质粒组合了编码内部蛋白质的转录单位(pTM-PolI-WSN-PB2-PBl-PA-NP-M-NS)(图3B)。这两种质粒在37℃于大肠杆菌JM109中扩增的过程中均是稳定的。
为进一步减少病毒产生所需的质粒数，使用允许连接用于vRNA合成的RNA聚合酶I转录单位的相同策略，将WSN PB2、PB1和PA蛋白的3个RNA聚合酶II转录单位组合在一个载体骨架上。所获质粒于37℃在大肠杆菌JM109中是稳定的；其被称做pC-PolII-WSN-PB2-PB1-PA(图3C)。值得注意的是，组合了聚合酶蛋白和NP的RNA聚合酶II转录单位的质粒不能被回收。
在293T细胞中由含多个转录盒的质粒产生病毒。为测试含多个转录盒的质粒的功能性，用pTM-PolI-WSN-All(用于全部8个vRNA的转录)(表1，栏2和3)或pTM-PolI-WSN-HA-NA和pTM-PolI-WSN-PB2-PB1-PA-NP-M-NS(用于2个和6个vRNA的转录)(表1，栏7和8)转染293T细胞。用4种用于表达NP和由不同质粒表达聚合酶亚单位的质粒(表1，栏2和7)共转染细胞，或用2种分别表达NP或表达PB2、PB1和PA的质粒(表1，栏3和8)共转染细胞。成功地由这些质粒产生病毒，表明可组合RNA聚合酶I或RNA聚合酶II转录单位，由此降低人工产生流感病毒所需要的质粒数。在转染后48小时时，病毒产生的效率在2×107至2.7×108TCID50/ml的范围内(表1，栏2、3、7、8：平均值＝1.1×108 TCID50/ml)。这些效率稍微高于(p＝0.17)对照实验所获得的效率，在对照实验中，用8种用于转录病毒vRNA的单独质粒、4种或2种用于合成NP和3种聚合酶亚单位的质粒转染细胞(表1，栏9和10，产生6.3×106至1.3×108TCID50/ml；平均值＝5.5×107TCID50/ml)。
还进行了许多对照实验，包括模拟转染(表1，栏14)、仅用蛋白表达质粒转染细胞(表1、栏11和12)、用8种仅用于vRNA合成的质粒转染细胞(表1，栏13)或分别用合成2个或6个vRNA的质粒转染细胞(表1，分别为栏4或5)。这些对照没有一个产生病毒。但是，在用pTM-PolI-WSN-All(表1，栏1)或者pTM-PolI-WSN-HA-NA和pTM-PolI-PB2-PB1-PA-NP-M-NS的组合(表1，栏6)转染的细胞中始终检测到可测量的病毒滴度。这些质粒设计用于转录负义病毒RNA，预期不合成NP和3种聚合酶蛋白。因此，预期用任一个单独的这些质粒也不会产生病毒(关于可能的解释，参见下文)。
表1：在293T细胞中的病毒产生效率
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | |
| vRNA合成‘8单位’质粒 | + | + | + | |||||||||||
| ‘6单位’质粒 | + | + | + | + | ||||||||||
| ‘2单位’质粒 | + | + | + | + | ||||||||||
| 8×1单位质粒 | + | + | + | |||||||||||
| 蛋白合成pCAWS-PB2 | + | + | + | + | ||||||||||
| pCAWS-PB1 | + | + | + | + | ||||||||||
| pCAWS-PA | + | + | + | + | ||||||||||
| pCAWS-NP | + | + | + | + | + | + | + | + | ||||||
| pC-PolII-WSN-PB2-PB 1-PA | + | + | + | + | ||||||||||
| 总质粒数 | 1 | 5 | 3 | 1 | 1 | 2 | 6 | 4 | 12 | 10 | 4 | 2 | 8 | 0 |
| 实验1.TCID50/ml(48hp.t.) | 3.2×106 | 2×107 | 4.6×107 | 0 | 0 | 3.7×104 | 5.6×107 | 6.3×107 | 6.3×106 | 6.3×106 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 实验2.TCID50/ml(48hp.t.) | 3.7×107 | 2.1×108 | 1.5×108 | 0 | 0 | 1.6×105 | 6.3×107 | 6.3×107 | 6.3×107 | 6.3×107 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 实验3.TCID50/ml(48hp.t.) | 6.3×104 | 2.7×108 | 3.2×107 | 0 | 0 | 3.2×105 | 1.6×108 | 1.3×108 | 6.3×107 | 1.3×108 | 0 | 0 | 0 | 0 |
用指定质粒转染293T细胞。48小时后，通过在MDCK细胞中的噬斑检测测定上清液中的病毒滴度。显示了3个独立实验的结果。‘8单位’质粒：pTM-PolI-WSN-All；‘6单位’质粒：pTM-PolI-WSN-PB2-PB 1-PA-NP-M-NS；‘2单位’质粒：pTM-PolI-WSN-HA-NA；8×1单位质粒：pPolI-WSN-PB2、pPolI-WSN-PB1、pPolI-WSN-PA、pPolI-WSN-HA、pPolI-WSN-NP、pPolI-WSN-NA、pPolI-WSN-M、pPolI-WSN-NS的组合；p.t.：转染后。
在Vero细胞中由含多个转录盒的质粒产生病毒。接着，测试在难以高效转染的Vero细胞中的病毒产生效率。在转染后48小时时，来自12种质粒的病毒产生在两个实验中是可忽略的，在一个实验中很低(表2，栏9)，而在转染后72小时时，在全部3个实验中均检测到病毒。使用仅一种或两种用于合成病毒RNA的质粒提高了转染后72小时时的病毒产生效率，尤其是在与pC-PolII-WSN-PB2-PB1-PA组合时，产生达2.5×106TCID50/ml(表2，栏9对栏3：p＝0.0017；栏9对栏8：p＝0.0063)。与此相一致，和由各自的质粒提供这些蛋白相比，由质粒pC-PolII-WSN-PB2-PB1-PA表达3种聚合酶蛋白导致更有效的病毒产生(表2，对比栏2和栏3(p＝0.0054)，栏7和栏8(p＝0.028)，以及栏9和栏10(p＝0.2))。由仅质粒pTM-PolI-WSN-All(表2，栏1)，或由质粒pTM-PolI-WSN-PB2-PB1-PA-NP-M-NS和pTM-PolI-WSN-HA-NA(表2，栏6)检测到病毒；但是，未一致地观察到病毒产生，且获得的病毒滴度低。这可能是由于Vero细胞的较低转染效率。总之，这些结果表明，含多个RNA聚合酶I或II转录单位的质粒可在于Vero细胞中产生病毒方面高度有效。
表2：在Vero细胞中的病毒产生效率
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | |
| vRNA合成‘8单位’质粒 | + | + | + | |||||||||||
| ‘6单位’质粒 | + | + | + | + | ||||||||||
| ‘2单位’质粒 | + | + | + | + | ||||||||||
| 8×1单位质粒 | + | + | + | |||||||||||
| 蛋白合成pCAWS-PB2 | + | + | + | + | ||||||||||
| pCAWS-PB1 | + | + | + | + | ||||||||||
| DCAWS-PA | + | + | + | + | ||||||||||
| pCAWS-NP | + | + | + | + | + | + | + | + | ||||||
| pC-PolII-WSN-PB2-PB1-PA | + | + | + | + | ||||||||||
| 质粒总数 | 1 | 5 | 3 | 1 | 1 | 2 | 6 | 4 | 12 | 10 | 4 | 2 | 8 | 0 |
| 实验1.TCID50/ml(48hp.t.) | ＜50 | 1.7×104 | 3.7×104 | 0 | 0 | 0 | ＜10 | 3.2×104 | ＜10 | ＜50 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 实验2.TCID50/ml(48hp.t.) | 0 | ＜50 | 3.7×104 | 0 | 0 | 0 | 6.2×102 | 4.4×104 | ＜10 | 1.5×103 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 实验3.TCID50/ml(48hp.t.)． | 0 | 3×102 | 5.1×104 | 0 | 0 | 0 | 1.6×102 | 2×104 | 2×100 | 2.5×103 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 实验1.TCID50/ml(72hp.t.) | 3.2×104 | 6.3×105 | 2.5×106 | 0 | 0 | 0 | 5.3×103 | 3.9×105 | 2.5×103 | 6.3×104 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 实验2.TCID50/ml(72hp.t.) | ＜10 | 3.1×103 | 1.6×106 | 0 | 0 | 0 | 7.6×104 | 6.3×105 | 6.3×103 | 2.1×105 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 实验3.TCID50/ml(72hp.t.) | 50 | 3.2×104 | 2×106 | 0 | 0 | 50 | 2×104 | 5.1×105 | 1.6×105 | 2.5×105 | 0 | 0 | 0 | 0 |
用指定质粒转染VERO细胞。在转染后48小时或72小时时，通过在MDCK细胞中的噬斑检测测定上清液中的病毒滴度。显示了3个独立实验的结果。‘8单位’质粒：pTM-PolI-WSN-All；‘6单位’质粒：pTM-PolI-WSN-PB2-PB1-PA-NP-M-NS；‘2单位’质粒：pTM-PoII-WSN-HA-NA；8×1单位质粒：pPolI-WSN-PB2、pPolI-WSN-PB1、pPolI-WSN-PA、pPolI-WSN-HA、pPolI-WSN-NP、pPolI-WSN-NA、pPolI-WSN-M、pPolI-WSN-NS的组合；p.t.：转染后。
讨论
现在可通过反向遗传实现疫苗病毒的产生。实际上，这是生产针对高致病性禽流感病毒的疫苗株的唯一有效方法。这些病毒对人和含胚卵是致命的(Shortridge等，1998)；因此，例如通过改变其HA切割位点序列减毒(Horimoto等，1994；Subbarao等，2003)对确保在含胚卵中生长至高滴度、同时保护疫苗生产人员对抗与飞沫病毒的接触是至关重要的。对人用来说，疫苗株的生产需要经鉴定没有致瘤性和外源感染因子的细胞系。一种这样的细胞系是Vero细胞系，其目前用于生产狂犬疫苗和脊髓灰质炎疫苗(Montagnon等，1999)。使用‘12质粒’法，Fodor等(1999)报告了在转染后4天时由107Vero细胞产生10-20个噬斑形成单位。Wood和Robertson(2004)通过反向遗传在Vero细胞中产生了H5N1参比疫苗株，但没有报告拯救效率，而基于A/PR/8/34(H1N1)或A/PR/8/34的病毒以＜103pfu/ml的效率在Vero细胞中产生(Ozaki等，2004)。通过组合RNA聚合酶I和/或II转录单位并因此由更少质粒实现病毒拯救，我们能够在转染后第3天时由5×105Vero细胞生产约105-106 TCID50/ml。因此，与‘12质粒’法相比，用这些***在Vero细胞中实现了更有效的病毒产生(表2，对比栏3或8与栏9)。因此，这种显著和高效的反向遗传***对在大流行情况下快速制备疫苗株有益。
流感病毒的产生依赖于聚合酶和NP蛋白的表达。聚合酶亚单位组合在一种质粒上增强了病毒产生的效率。该观察结果可由用于病毒拯救的质粒数下降来解释，或者3种转录单位的组合可能更接近地反映出在感染细胞中观察到的等摩尔比率的聚合酶亚单位。
一般认为，相同启动子和终止子单位组合在一种质粒上引致重组。但是，本文证实，8个RNA聚合酶I或3个RNA聚合酶II启动子和终止子序列可组合在一个载体骨架上。Hoffmann等(2000)表明，RNA聚合酶I和II启动子的组合允许由一个模板合成vRNA和mRNA。因此，人们可设计一种质粒，其含有：4种用于合成PB2、PB1、PA和NP vRNA和mRNA的RNA聚合酶I/II转录单位，以及4种用于合成NA、HA、M和NS vRNA的RNA聚合酶I转录单位。这样的构建物应允许由一种质粒有效产生流感病毒。而且，对于其他人将此策略应用于依赖几个质粒共转染细胞的其它反向遗传***来说，或对于其他人设计由一种质粒同时表达几种蛋白的载体来说，本文描述的在一种质粒上组合多个转录单位的成功可能提供了鼓励。
令人惊讶的是，由单种质粒pTM-PolI-WSN-All观察到病毒产生。该质粒表达流感病毒蛋白提示，由在载体中或在RNA聚合酶I启动子或终止子区中存在的(隐蔽)RNA聚合酶II启动子合成蛋白。为确定RNA聚合酶I启动子序列是否在相反方向具有能潜在地驱动上游转录盒表达蛋白的启动子，我们在报告基因前克隆了一个反向的RNA聚合酶I启动子；但是，由该质粒未检测到可测量水平的报告基因表达(未出示数据)。流感病毒的产生依赖于4种不同蛋白(PB2、PB1、PA和NP)的表达，因此应需要几个通读事件。或者，蛋白表达可由另一种机制产生，例如翻译的内部启动。使用改良的pTM1(Moss等，1990)载体，其含f1单链DNA复制起点、氨苄青霉素抗性基因、多克隆位点和T7 RNA聚合酶转录终止子。已由该改良形式中去除了存在于原pTM1克隆载体中的强T7 RNA聚合酶启动子以及部分EMCV非翻译区和胸苷激酶序列。因此预期由该载体不能对聚合酶和NP蛋白进行蛋白合成。尽管如此，由设计用于仅生产负链RNA的质粒产生流感病毒是令人感兴趣的，值得进一步研究。
总之，在这里，本文描述了一种产生流感病毒的改良***，其允许在Vero细胞中容易且可重复地生产疫苗病毒。在高致病性禽流感病毒爆发的情况下应用该***可能尤其有优势。
实施例2
为改进重组病毒生产，一种方法是将编码全部8个病毒基因的cDNA都克隆入质粒中。因此，可将用于合成8种病毒RNA的转录单位组合在一种质粒上，而不是由8种质粒产生8种病毒RNA；因此，全部8个病毒RNA都仅由1种质粒制备，使得可由较少的质粒拯救病毒。同样，可将用于合成病毒蛋白的转录单位组合在较少质粒上。如果全部8个病毒基因都类似地处于1种质粒中，则用于合成流感病毒所需要的质粒数是5种(1种质粒用于全部病毒基因，4种质粒用于编码PB2、PB1、PA和NP的基因)。或者，人们可将PB2、PB1、PA和NP基因组合入1种质粒中，每个基因均侧接RNA聚合酶II启动子和聚腺苷化信号。而且，全部病毒基因和PB2、PB1、PA和NP都可组合入1种质粒中。其它组合可包括1种具有6个病毒基因(每个基因都具有PolI启动子)的质粒、1种具有3个病毒基因(每个基因都具有PoiII启动子)的质粒以及1种具有2个病毒基因(HA和NA)(每个基因都具有PolI启动子)的质粒。
病毒基因侧接RNA聚合酶I启动子和终止子序列，以形成转录单位(或转录盒)，在某些实施方案中，转录盒随后侧接RNA聚合酶II启动子和终止信号(聚腺苷酸化信号)(图4)。该方法既可获得由RNA聚合酶I合成的基因组负链RNA，又可获得由RNA聚合酶II从相同基因合成的mRNA。
因此，本发明将用于转染的质粒数由12种降低至5种或更少，例如4、3、2或1种，提高了从细胞系拯救病毒的效率，允许产生严重减毒的病毒，允许使用具有低转染效率的细胞系(例如Vero细胞)，允许一致地产生用于疫苗生产的流感病毒，和/或降低了有关质粒历史、纯度和毒性的FDA法规问题。
参考文献
Albo等，
J.Virol.，
70：9013(1996).
Avery’s Drug Treatment：Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics，第3版，ADIS Press，Ltd.，Williams和Wilkms，Baltimore，MD(1987).
Aymard-Henry等，
Virology：A Practical Approach，Oxford IRLPress，Oxford，119-150(1985).
Bachmeyer，
Intervirology，5：260(1975).
Berkow等编辑，
The Merck Manual，第16版，Merck & Co.，Rahway，NJ(1992).
Brands等，
Dev.Biol.Stand.，
98：93(1999).
Bridgen等，
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，
93：15400(1996).
Bruhl等，
Vaccine，
19：1149(2000).
Claas等，
Lancet，
351：472(1998).
Dunn等，
Virology，
211：133(1995).
Edwards，
J.Infect.Dis.，
169：68(1994).
Elliott，
Mol.Med.，
3：572(1997).
Enami等，
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，
87：3802(1990).
Fodor等，
J.Virol.，
73：9679(1999).
Fouchier等，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA，
101：1356(2004).
Gerdil，
Vaccine，
21：1776(2003).
Grand和Skehel，
Nature，New Biology，
238：145(1972).
Hagen等，
J.Virol.，
68：1509(1994).
Halperin等，
Vaccine，
20：1240(2002).
Hoffman等，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA，
97：6108(2000).
Hoffman等，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA，
99：11411(2002).
Honda等，
J.Biochem.(Tokyo)，
104：1021(1988).
Horimoto等，
J.Virol.，
68：3120(1994).
Kilboume，
Bull.M2 World Health Org.，
41：653(1969).
Kistner等，
Dev.Biol.Stand.，
98：101(1999).
Kistner等，
Vaccine，
16：960(1998).
Kistner等，
Wein.Klin.Wochenschr.，
111：207(1999).
Koopmans等，
Lancet，
363：587(2004).
Laver和Webster，
Virology，
69：511(1976).
Lawson等，
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，
92：4477(1995).
Leahy等，
J.Virol.，
71：8347(1997).
Leahy等，
J.Virol.，
71：8352(1997).
Leahy等，
J.Virol.，
72：2305(1998).
Mizrahi，(编辑)，
Viral Vaccines，Wiley-Liss，New York，39-67(1990).
Montagnon等，
Dev.Biol.Stand.，
98：137(1999).
Moss等，
Nature，
348：91(1990).
Murphy，
Infect.Dis.Clin.Pract.，
2：174(1993).
Muster等，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA，
88：5177(1991).
Neumann等，
Adv.Virus Res.，
53：265(1999).
Neumann等，
J.Gen.Virol.，
83：2635(2002).
Neumann等，
J.Virol.，
76：406(2002).
Neumann等，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA，
96：9345(1999).
Nicolson等，
Vaccine，
23：2943(2005).
Ogra等，
J.Infect.Dis.，
134：499(1977).
Osol(编辑)，
Remington’s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Co.，Easton，PA 1324-1341(1980).
Ozaki等，
J.Virol.，
78：1851(2004).
Palache等，
Dev.Biol.Stand.，
98：115(1999).
Peiris等，
Lancet，
363：617(2004).
Potter in
Textbook of Influenza，编辑，Nicholson，K.G.，Webster，R.G.和Hey，A.J.；Malden：Blackwell Scientific Publication，3-18页(1998).
Robertson等，
Biologicals，
20：213(1992).
Robertson等，
Giornale di Igiene e Medicina Preventiva，
29：4(1988).
Schnell等，
EMBO J.，
13：4195(1994).
Shortridge等，
Virology，
252：331(1998).
Subbarao等，
J.Virol.，
67：7223(1993).
Subbarao等，
Science，
279：393(1998).
Subbarao等，
Virology，
305：192(2003).
Sugawara等，
Biologicals，
30：303(2002).
Thompson等，
Jama，
289：179(2003).
Weber等，
Arch.Virol.，
142：1029(1997).
Weber等，
J.Virol.，
70：8361(1996).
Weber等，
Arch.Virol，
142：1029(1997).
World Health Organization TSR No.673(1982).
WHO，Cumulative Number of Confirmed Human Cases of AvianInfluenza A(H5N1)since 28 January 2004.
Wood和Robertson，
Nat.Rev.Microbiol.，
2：842(2004).
Yasuda等，
J.Virol.，
68：8141(1994).
所有出版物、专利和专利申请都在此引入作为参考。尽管在上述说明书中已经就某些优选实施方案描述了本发明，而且为了说明目的已给出了大量细节，但是对于本领域技术人员显而易见的是，本发明允许其它的实施方案，并且在不偏离本发明基本原则的情况下，可在相当程度上改变本文描述的某些细节。
Claims (49)
1.组合物，所述组合物包含：
a)至少一种质粒，所述质粒包含两种或更多种vRNA生产用转录盒，所述转录盒选自：一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PAcDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB1 cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB2 cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒HA cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NP cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NA cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒M cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；和/或一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NS cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；和
b)至少一种质粒，所述质粒包含一种或更多种mRNA生产用转录盒，所述转录盒选自：一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PA的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB1的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB2的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列；和/或一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NP的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列，其中所述组合物包含8种用于vRNA的转录盒，其中用所述组合物转染细胞产生至少1×102TCID50/mL的滴度。
2.权利要求1的组合物，所述组合物用于由少于8种质粒生产流感病毒。
3.权利要求1-2中任一项的组合物，其中一种质粒具有8种vRNA生产用转录盒。
4.权利要求3的组合物，其中一种质粒具有1种mRNA生产用转录盒，另一种质粒具有3种mRNA生产用转录盒。
5.权利要求3的组合物，所述组合物具有4种mRNA生产用转录盒。
6.权利要求1-2中任一项的组合物，其中一种质粒具有6种vRNA生产用转录盒，另一种质粒具有2种vRNA生产用转录盒。
7.权利要求6的组合物，其中一种质粒具有1种mRNA生产用转录盒，另一种质粒具有3种mRNA生产用转录盒。
8.权利要求6的组合物，所述组合物具有4种mRNA生产用质粒。
9.权利要求1-2中任一项的组合物，其中一种质粒具有1种mRNA生产用转录盒，另一种质粒具有3种mRNA生产用转录盒。
10.权利要求1的组合物，所述组合物具有4种mRNA生产用质粒。
11.权利要求1-10中任一项的组合物，所述组合物还包含一种转录盒，所述转录盒包含连接至5′流感病毒序列的启动子，所述5′流感病毒序列包含连接至目标DNA的5′流感病毒非编码序列，所述目标DNA连接至3′流感病毒序列，所述3′流感病毒序列包含连接至转录终止序列的3′流感病毒非编码序列。
12.权利要求11的组合物，其中所述含目标DNA的转录盒处于与vRNA生产用转录盒不同的质粒上。
13.权利要求11的组合物，其中所述含目标DNA的转录盒处于与mRNA生产用转录盒不同的质粒上。
14.权利要求11的组合物，其中所述含目标DNA的转录盒处于具有其中一种vRNA生产用转录盒的质粒上。
15.权利要求11的组合物，其中所述含目标DNA的转录盒处于具有其中一种mRNA生产用转录盒的质粒上。
16.组合物，所述组合物包含：
至少一种质粒，所述质粒包含两种或更多种vRNA生产用转录盒，所述转录盒选自：一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PA cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB1 cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB2cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒HA cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NP cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NA cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒M cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；和/或一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NS cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列，其中所述组合物包含至少6种用于vRNA的转录盒，
其中所述组合物包含8种用于vRNA的转录盒，其中用所述组合物转染细胞产生至少1×102 TCID50/mL的滴度。
17.权利要求16的组合物，所述组合物用于由少于8种质粒生产流感病毒。
18.权利要求16-17中任一项的组合物，其中一种质粒具有8种vRNA生产用转录盒。
19.权利要求16-17中任一项的组合物，其中一种质粒具有6种vRNA生产用转录盒，另一种质粒具有2种vRNA生产用转录盒。
20.权利要求19的组合物，所述组合物还包含：一种具有1种mRNA生产用转录盒的质粒，以及另一种具有3种mRNA生产用转录盒的质粒。
21.权利要求19的组合物，所述组合物还包含4种mRNA生产用质粒。
22.权利要求16的组合物，所述组合物还包含：一种具有1种mRNA生产用转录盒的质粒，以及另一种具有3种mRNA生产用转录盒的质粒。
23.权利要求16的组合物，所述组合物还包含4种mRNA生产用质粒。
24.权利要求16-23中任一项的组合物，所述组合物还包含一种转录盒，所述转录盒包含连接至5′流感病毒序列的启动子，所述5′流感病毒序列包含连接至目标DNA的5′流感病毒非编码序列，所述目标DNA连接至3′流感病毒序列，所述3′流感病毒序列包含连接至转录终止序列的3′流感病毒非编码序列。
25.权利要求24的组合物，其中所述含目标DNA的转录盒处于与vRNA生产用转录盒不同的质粒上。
26.权利要求24的组合物，其中所述含目标DNA的转录盒处于具有其中一种vRNA生产用转录盒的质粒上。
27.权利要求1-26中任一项的组合物，其中所述HA是甲型HA。
28.权利要求1-26中任一项的组合物，其中所述HA是乙型HA。
29.制备流感病毒的方法，所述方法包括：使细胞与权利要求1-28中任一项的组合物接触，所述组合物的量有效产生感染性流感病毒。
30.制备流感病毒的方法，所述方法包括使细胞与质粒接触，所述质粒包含两种或更多种vRNA生产用转录盒，所述转录盒选自：一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PA cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB1 cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB2 cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒HA cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NP cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NA cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒McDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；和/或一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NS cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；以及使细胞与质粒接触，所述质粒包含一种或更多种mRNA生产用转录盒，所述转录盒选自：一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PA的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB1的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB2的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列；和/或一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NP的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列，其中所述细胞与8种用于vRNA的转录盒接触，其中所述细胞产生至少1×102 TCID50/mL的滴度。
31.制备流感病毒的方法，所述方法包括使细胞与质粒接触，所述质粒包含vRNA生产用转录盒，所述转录盒包括：一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PA cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB1cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB2 cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒HA cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NP cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NA cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒M cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；和一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NS cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列，其中所述细胞与8种用于vRNA的转录盒接触，其中所述细胞产生至少1×102TCID50/mL的滴度。
32.制备流感病毒的方法，所述方法包括使细胞与两种质粒接触，其中所述两种质粒一起包含：一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PA cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB1 cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB2 cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒HA cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NP cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NAcDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒M cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；和一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NS cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列，其中所述细胞与8种用于vRNA的转录盒接触，其中所述细胞产生至少1×102 TCID50/mL的滴度。
33.权利要求30-32中任一项的方法，其中所述细胞是高度可转染细胞。
34.权利要求30-32中任一项的方法，其中所述细胞是Vero细胞。
35.权利要求30-34中任一项的方法，其中所述HA是甲型HA。
36.权利要求30-34中任一项的方法，其中所述HA是乙型HA。
37.权利要求30-36中任一项的方法，所述方法还包括分离所述病毒。
38.权利要求30-37中任一项的方法，所述方法还包含一种转录盒，所述转录盒包含连接至5′流感病毒序列的启动子，所述5′流感病毒序列包含连接至目标DNA的5′流感病毒非编码序列，所述目标DNA连接至3′流感病毒序列，所述3′流感病毒序列包含连接至转录终止序列的3′流感病毒非编码序列。
39.权利要求38的方法，其中所述目标DNA为正义方向。
40.权利要求38的方法，其中所述目标DNA为负义方向。
41.权利要求38的方法，其中所述目标DNA包含编码病原体的免疫原性多肽或肽或者治疗性多肽或肽的可读框。
42.权利要求30-36和38-41中任一项的方法，所述方法还包括分离所述病毒。
43.细胞，所述细胞已与权利要求1-28中任一项的组合物接触。
44.流感病毒生产用质粒，所述质粒包含：一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PA cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB1 cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB2 cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒HAcDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NP cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NA cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒M cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；和一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NS cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列，其中用所述质粒转染细胞产生至少1×102TCID50/mL的滴度。
45.vRNA生产用质粒，所述质粒包含：一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PA cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB1 cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒PB2 cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NPcDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒M cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；和/或一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NS cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列，其中用所述质粒以及用于HA和NA的vRNA生产的转录盒转染细胞产生至少1×102TCID50/mL的滴度。
46.vRNA生产用质粒，所述质粒包含：一种转录盒，其含有效连接至流感病毒HA cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；和一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NA cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列，其中用所述质粒以及用于PA、PB1、PB2、NP、M和NS的vRNA生产的转录盒转染细胞产生至少1×102 TCID50/mL的滴度。
47.mRNA生产用质粒，所述质粒包含：一种转录盒，其包含有效连接至流感病毒PA的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列；一种转录盒，其包含有效连接至流感病毒PB1的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列；一种转录盒，其包含有效连接至流感病毒PB2的DNA编码区的PolII启动子，所述DNA编码区连接至PolII转录终止序列，其中所述质粒不编码NP。
48.流感病毒生产用质粒，所述质粒包含：一种转录盒，其含有效连接至流感病毒HA cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NA cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒M cDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有效连接至流感病毒NScDNA的PolI启动子，所述cDNA连接至PolI转录终止序列；一种转录盒，其含有各自均有效连接至流感病毒PA的DNA节段的PolI启动子和PolI转录终止序列以及PolII启动子和PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有各自均有效连接至流感病毒PB1的DNA节段的PolI启动子和PolI转录终止序列以及PolII启动子和PolII转录终止序列；一种转录盒，其含有各自均有效连接至编码流感病毒PB2的DNA节段的PolI启动子和PolI转录终止序列以及PolII启动子和PolII转录终止序列；和一种转录盒，其含有各自均有效连接至流感病毒NP的DNA节段的PolI启动子和PolI转录终止序列以及PolII启动子和PolII转录终止序列。
49.制备流感病毒的方法，所述方法包括：使细胞与权利要求44或48的质粒接触，所述质粒的量有效产生感染性流感病毒。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102740880A (zh) * | 2009-05-18 | 2012-10-17 | 万能药生物有限公司 | 基于重组修饰的安卡拉痘苗（mva）病毒的通用流感疫苗 |
| WO2020181837A1 (en) * | 2019-03-13 | 2020-09-17 | Zhejiang Senwei Biopharmaceutical Development Co., Ltd. | Method for rescuing influenza virus and composition therefor |
Families Citing this family (38)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8475806B2 (en) * | 2003-05-28 | 2013-07-02 | Wisconsin Alumni Research Foundation | High titer recombinant influenza viruses for vaccines and gene therapy |
| EP1814990A2 (en) | 2004-11-19 | 2007-08-08 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Recombinant influenza vectors with tandem transcription units |
| CA2647985C (en) | 2006-03-31 | 2014-12-30 | Warf-Wisconsin Alumni Research Foundation | High titer recombinant influenza viruses for vaccines |
| EP2152883A4 (en) * | 2007-05-10 | 2010-10-27 | Univ Arizona | RECOMBINANT BACTERIA COMPRISING VECTORS FOR THE EXPRESSION OF NUCLEIC ACID SEQUENCES ENCODING ANTIGENS |
| EP2150616A4 (en) | 2007-05-10 | 2011-07-27 | Univ Arizona | REGULATED ANTIGEN SYNTHESIS AND / OR REGULATED ATTENUATION FOR IMPROVING VACCINATE IMMUNOGENICITY AND / OR SAFETY |
| WO2008156778A2 (en) | 2007-06-18 | 2008-12-24 | Tokiko Watanabe | Influenza m2 protein mutant viruses as live influenza attenuated vaccines |
| EP2045323A1 (en) * | 2007-10-05 | 2009-04-08 | Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag | Linear expression constructs for production of influenza virus particles |
| WO2009046451A1 (en) * | 2007-10-05 | 2009-04-09 | The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University | Recombinant bacterium capable of eliciting a protective immune response against c. perfringens |
| US20110110973A1 (en) * | 2008-02-09 | 2011-05-12 | Sanofi Pasteur Biologics Co. | Influenza B Vaccines |
| WO2010045620A1 (en) | 2008-10-17 | 2010-04-22 | The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University | Recombinant bacterium capable of eliciting an immune response against streptococcus pneumoniae |
| US9163219B2 (en) * | 2009-04-14 | 2015-10-20 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | Single expression vector for generation of a virus with a segmented genome |
| WO2010135563A1 (en) | 2009-05-22 | 2010-11-25 | The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University | Recombinant bacterium and methods of antigen and nucleic acid delivery |
| US9045742B2 (en) * | 2009-05-29 | 2015-06-02 | The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University | Recombinant Edwardsiella bacterium |
| JP5845180B2 (ja) * | 2009-07-30 | 2016-01-20 | モウント シナイ スクール オフ メディシネ | インフルエンザウイルス及びそれらの使用 |
| AU2010277310B2 (en) | 2009-07-31 | 2015-01-15 | Seqirus UK Limited | Reverse genetics systems |
| JP2013507990A (ja) | 2009-10-26 | 2013-03-07 | ダブリュエーアールエフ−ウィスコンシン アラムナイ リサーチ ファウンデーション | ベロ細胞において増強された複製を有する高力価の組換えインフルエンザウイルス |
| GB0919117D0 (en) * | 2009-10-30 | 2009-12-16 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Process |
| US9062297B2 (en) | 2010-01-13 | 2015-06-23 | The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University | Yersinia pestis vaccine |
| US8889121B2 (en) | 2010-01-22 | 2014-11-18 | The Arizona Board Of Regents For An On Behalf Of Arizona State University | Bacterium comprising a regulated rfaH nucleic acid |
| US10130697B2 (en) | 2010-03-23 | 2018-11-20 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Vaccines comprising mutant attenuated influenza viruses |
| WO2011150421A2 (en) | 2010-05-28 | 2011-12-01 | The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University | Recombinant bacterium to decrease tumor growth |
| KR101323582B1 (ko) * | 2011-03-17 | 2013-10-30 | 충북대학교 산학협력단 | Ｖｅｒｏ 세포 유래의 ｐｏｌⅠ 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터 |
| JP2014527799A (ja) | 2011-08-26 | 2014-10-23 | ダブリュエーアールエフ−ウィスコンシン アラムナイ リサーチ ファウンデーション | 変異型ｐｂ２遺伝子セグメントを有する弱毒化生ワクチンとしてのインフルエンザウイルス |
| US9303264B2 (en) | 2012-05-18 | 2016-04-05 | The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University | Photosynthetic microorganisms expressing thermostable lipase |
| US9580718B2 (en) | 2013-06-17 | 2017-02-28 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | Attenuated live bacteria with increased acid resistance and methods of use thereof |
| EP3022296B1 (en) | 2013-07-15 | 2022-12-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | High titer recombinant influenza viruses with enhanced replication in mdck or vero cells or eggs |
| US10053671B2 (en) | 2014-06-20 | 2018-08-21 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Mutations that confer genetic stability to additional genes in influenza viruses |
| US10633422B2 (en) | 2015-06-01 | 2020-04-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Influenza virus replication by inhibiting microRNA lec7C binding to influenza viral cRNA and mRNA |
| US9890363B2 (en) | 2015-07-06 | 2018-02-13 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Influenza virus replication for vaccine development |
| EP3341018A1 (en) | 2015-08-28 | 2018-07-04 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of infectious influenza viruses from virus-like particles |
| US11197925B2 (en) | 2016-02-19 | 2021-12-14 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Influenza B virus replication for vaccine development |
| CA3023143A1 (en) | 2016-06-15 | 2017-12-21 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Influenza virus hemagglutinin proteins and uses thereof |
| CA3058652A1 (en) | 2017-04-07 | 2018-10-11 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Anti-influenza b virus neuraminidase antibodies and uses thereof |
| WO2020167432A2 (en) | 2019-01-23 | 2020-08-20 | Yoshihiro Kawaoka | Mutations that confer genetic stability to additional genes in influenza viruses |
| WO2020163804A1 (en) | 2019-02-08 | 2020-08-13 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Humanized cell line |
| US11390649B2 (en) | 2019-05-01 | 2022-07-19 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Influenza virus replication for vaccine development |
| WO2021041624A2 (en) | 2019-08-27 | 2021-03-04 | Yoshihiro Kawaoka | Recombinant influenza viruses with stabilized ha for replication in eggs |
| US20210221854A1 (en) * | 2020-01-17 | 2021-07-22 | Regents Of The University Of Minnesota | Systems, methods, and cell lines for generating influenza virus or influenza virus proteins |
Family Cites Families (36)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4071618A (en) | 1974-09-03 | 1978-01-31 | Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University | Process for preparing virus disease live vaccines |
| JPS57136528A (en) | 1981-02-09 | 1982-08-23 | Hayashibara Biochem Lab Inc | Preparation of viral vaccine |
| NZ219515A (en) | 1987-02-10 | 1989-09-27 | Wellcome Found | Fusion proteins comprising influenza virus ha and a nonnatural antigenic epitope |
| US5166057A (en) | 1989-08-28 | 1992-11-24 | The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Recombinant negative strand rna virus expression-systems |
| US5854037A (en) | 1989-08-28 | 1998-12-29 | The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines |
| US5840520A (en) | 1989-08-28 | 1998-11-24 | Aviron | Recombinant negative strand RNA virus expression systems |
| US6001634A (en) | 1989-08-28 | 1999-12-14 | Palese; Peter | Recombinant negative strand RNA viruses |
| US5786199A (en) | 1989-08-28 | 1998-07-28 | The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines |
| US5919676A (en) | 1993-06-24 | 1999-07-06 | Advec, Inc. | Adenoviral vector system comprising Cre-loxP recombination |
| ES2210273T5 (es) | 1994-07-18 | 2010-03-29 | Conzelmann, Karl-Klaus, Prof. Dr. | Virus con arn de cadena negativa no segmentado recombinante infeccioso. |
| WO1996010400A1 (en) | 1994-09-30 | 1996-04-11 | The Uab Research Foundation | Gene therapy vectors and vaccines based on non-segmented negatives stranded rna viruses |
| EP0704533A1 (en) | 1994-09-30 | 1996-04-03 | Bayer Ag | An attenuated vaccination virus, a method to make the virus and a pharmaceutical compositions comprising the virus |
| US5716821A (en) | 1994-09-30 | 1998-02-10 | Uab Research Foundation | Prevention and treatment of respiratory tract disease |
| US5994526A (en) | 1996-06-21 | 1999-11-30 | Plant Genetic Systems | Gene expression in plants |
| BR9710363A (pt) | 1996-07-15 | 2000-01-11 | Us Gov Health & Human Serv | "vìrus sincicial respirátorio recombinante infeccioso isolado, partìcula do mesmo, processos para estimular o sistema imunológico de um indivìduo para induzir proteção contra o vìrus sincicial respiratório e para produzir uma partìcula de vìrus sincicial respiratório recombinante, vacina para induzir proteção contra o vìrus sincicial respiratório recombinante composição e ceta de vìrus sincicial respiratório recombinante" |
| US6271011B1 (en) | 1996-10-15 | 2001-08-07 | The University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Pasteurella neuraminidase coding sequences and diagnostic methods |
| AU7471098A (en) | 1997-04-30 | 1998-11-24 | Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York, The | Recombinant influenza viruses expressing tumor-associated antigens as antitum or agents |
| DE69842165D1 (de) | 1997-05-23 | 2011-04-21 | Us Of America As Represented By The Secretary Of The Dept Of Health And Human Services | Herstellung attenuierter parainfluenza-virus impfstoffe aus klonierten nukleotidsequenzen |
| WO1999007839A2 (en) | 1997-08-05 | 1999-02-18 | Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie | Immunoprotective influenza antigen and its use in vaccination |
| US6146642A (en) | 1998-09-14 | 2000-11-14 | Mount Sinai School Of Medicine, Of The City University Of New York | Recombinant new castle disease virus RNA expression systems and vaccines |
| CA2345208C (en) * | 1998-10-07 | 2012-01-17 | Aventis Pasteur Limited | Protective recombinant haemophilus influenzae high molecular weight proteins |
| EP1035209A1 (en) | 1999-03-06 | 2000-09-13 | ARTEMIS Pharmaceuticals GmbH | Stable recombinant influenza viruses free of helper viruses |
| US8715940B2 (en) | 1999-04-06 | 2014-05-06 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method of making recombinant influenza virus |
| ES2533622T3 (es) | 1999-04-06 | 2015-04-13 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Virus de la gripe recombinantes para vacunas y terapia génica |
| US6686168B1 (en) | 1999-11-04 | 2004-02-03 | Zymogenetics, Inc. | Cell surface display of proteins by recombinant host cells |
| ATE488577T1 (de) | 2000-04-14 | 2010-12-15 | Wisconsin Alumni Res Found | Mutiertes ionenkanalprotein enthaltende viren |
| ATE420189T1 (de) | 2000-04-28 | 2009-01-15 | St Jude Childrens Res Hospital | Dna-transfektionssystem zur erzeugung von infektiösen negativsträngigen rna virus |
| US6358733B1 (en) * | 2000-05-19 | 2002-03-19 | Apolife, Inc. | Expression of heterologous multi-domain proteins in yeast |
| US20040241139A1 (en) | 2000-07-20 | 2004-12-02 | Gerd Hobom | Recombinant influenza viruses with bicistronic vRNAs coding for two genes in tandem arrangement |
| EP1201760A1 (en) | 2000-10-30 | 2002-05-02 | ARTEMIS Pharmaceuticals GmbH | Influenza virus vector for human dendritic cells |
| AU2003219745B8 (en) | 2002-02-13 | 2008-10-09 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Signal for packaging of influenza virus vectors |
| US8012736B2 (en) | 2002-04-26 | 2011-09-06 | Medimmune, Llc | Multi plasmid system for the production of influenza virus |
| JP2007525175A (ja) | 2003-04-23 | 2007-09-06 | ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファウンデイション | 突然変異した膜タンパク質をその機能性の一部ウイルス |
| AU2004274860A1 (en) | 2003-05-28 | 2005-03-31 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Recombinant influenza vectors with a polII promoter and ribozymes |
| US8475806B2 (en) * | 2003-05-28 | 2013-07-02 | Wisconsin Alumni Research Foundation | High titer recombinant influenza viruses for vaccines and gene therapy |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102740880A (zh) * | 2009-05-18 | 2012-10-17 | 万能药生物有限公司 | 基于重组修饰的安卡拉痘苗（mva）病毒的通用流感疫苗 |
| WO2020181837A1 (en) * | 2019-03-13 | 2020-09-17 | Zhejiang Senwei Biopharmaceutical Development Co., Ltd. | Method for rescuing influenza virus and composition therefor |
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