CN101102791A - 抗血管内皮生长因子受体-1的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供对血管内皮生长因子受体1(VEGFR-1)具有特异性的单克隆抗体。本发明还提供编码可变重链和可变轻链免疫球蛋白分子的核苷酸序列，以及包含可变重链和可变轻链免疫球蛋白分子的氨基酸序列，包括对应于互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的序列。本发明还提供产生和表达抗VEGFR-1抗体的方法，以及通过给予抗VEGFR-1抗体来治疗血管生成相关疾病和减缓肿瘤生长的方法。

Description

抗血管内皮生长因子受体-1的抗体
发明领域
本发明涉及对血管内皮生长因子受体-1(VEGFR-1)具有特异性的抗体和用抗VEGFR-1抗体治疗血管生成相关疾病和肿瘤的方法。
发明背景
血管生成，是指从胚胎及成年生物现有血管形成毛细血管，被视为肿瘤生长、存活和转移的关键因素。一般认为，生长因子及其受体，包括表皮生长因子(EGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-δ(TGF-δ)、酸性和碱性成纤维细胞生长因子(aFGF和bFGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)和血管内皮生长因子(VEGF)，在肿瘤血管生成中发挥重要作用。参见Klagsbrun和D′Amore，Annual Rev.Physiol.，53：217-239(1991)。这些生长因子与它们的细胞表面受体结合诱导受体活化，这启动并更改了信号传导途径，导致细胞增殖和分化。VEGF，一种内皮细胞特异性促***原，由于通过特异性地促进内皮细胞增殖而作为血管生成诱导物发挥作用，因此在这些因子中尤为突出。
VEGF的生物应答是通过它的高亲和性受体介导的，该受体是在以下过程中在内皮细胞上选择性地表达的：胚胎发生(Millauer，Cell，72：835-846(1993))和肿瘤形成。VEGF受体(VEGFR)通常为III类受体型酪氨酸激酶，特征是它们的氨基端胞外受体配体结合结构域上有数个，通常为5个或7个免疫球蛋白样环(Kaipainen等，J.Exp.Med.，178：2077-2088(1993))。其它两个区包括跨膜区和羧基端胞内催化结构域，胞内催化结构域因***长度可变化的亲水性interldnase序列(亦称激酶***域)而分隔开(Terman等，Oncogene，6：1677-1683(1991))。VEGFR包括＞z，s-样酪氨酸激酶受体(flt-1)或VEGFR-1(序列见Shibuya等，Oncogene，5：519-524(1990))、含激酶***域受体/胎肝激酶(KDR/fik-1)或VEGFR-2(记载于1992年2月20日申请的WO92/14248和Terman等，Oncogene，6：1677-1683(1991)，序列见Matthews等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：9026-9030(1991))，虽然其它受体，例如神经毡蛋白-1和神经毡蛋白-2，也可与VEGF结合。另一个酪氨酸激酶受体VEGFR-3(flt-4)，与VEGF同源物VEGF-C和VEGF-D结合，在***发育中更为重要。
VEGFR-1在调节病理性血管生成的重要性在体内实验模型中得到证明。VEGFR-1酪氨酸激酶结构域的缺陷导致肿瘤血管形成减少，这表明VEGFR-1酪氨酸激酶在病理性血管生成中的重要作用(Hiratsuka等，Cancer Research，61：1207-1213(2001))。VEGFR-1酪氨酸激酶结构域也是通过在内皮细胞和巨噬细胞中诱导基质金属蛋白酶-9(MMP-9)，促进肿瘤发病机制和转移所需要的(Hiratsuka等，Cancer Cell，2：289-300(2002))。另外，VEGFR-1显示介导响应PlGF的BM衍生祖细胞的转移和分化(Hattori等，Nature Medicine，8：841-849(2002))。用抗VEGFR-1抗体抑制VEGFR-1，通过防止从肿瘤血管形成中，募集骨髓衍生内皮细胞和单核细胞祖细胞(monocyteprogenitor cell)，使肿瘤血管发生减少(Lyden等，Nature Medicine，7：1194-1201(2001))。用抗VEGFR-1抗体治疗还有效抑制肿瘤病理性血管生成及动物模型视网膜缺血(Lutten等，Nature Medicine，8：831-840(2002))。
除了VEGFR-1在血管生成中的作用外，VEGF及其受体的共表达还常见于血液恶性细胞和某些实体瘤细胞中(Bellamy，CancerResearch，59：728-733(1999)；Ferrer等，Urology，54：567-572(1999)；Price等，Cell Growth Differ.，12：129-135(2001))。VEGF显示出经配体刺激性自分泌环激活下游胞内信号传导途径，直接诱导表达VEGF受体的白血病细胞的增殖、存活和侵袭(Dias等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98：10857-10862(2001)；Gerber等，J.Mol.Med.，81：20-31(2003))。VEGF刺激还通过诱导ERK1/2和PI3/Akt-激酶信号传导途径的活化，引起表达VEGFR-1的乳腺癌细胞的侵袭增强(Price等，CellGrowth Differ.，12：129-135(2001))。
VEGFR-1及其配体还显示在炎性疾病中发挥重要作用。VEGF-B缺陷导致关节炎模型中炎症相关的血管密度降低和滑液炎症减轻(Mould等，Arthritis Rheum.，48：2660-2669(2003))。PlGF还通过介导血管扩张、炎性细胞和单核细胞/巨噬细胞，在控制皮肤炎症中发挥至关重要的作用，还显示出有助于调理动物模型的动脉粥样硬化和类风湿性关节炎(Luttun等，Nature Medicine，8：831-840(2002)；Autiero& Thromb Haemost，1：1356-1370(2003))。用中和抗VEGFR-1抗体治疗，抑制关节炎的炎性关节损坏，减少动脉粥样硬化斑的生长和易损性。抗VEGFR-1抗体的抗炎作用可归因于炎性组织中骨髓衍生的骨髓祖细胞转移到外周血的减少、骨髓细胞的缺损性活化以及表达VEGFR-1的白细胞的分化和浸润削弱。因此，VEGFR-1还可以是治疗炎症相关疾病的治疗靶。
仍然存在对抑制VEGF受体活性药物(例如VEGFR-1特异性的全人单克隆抗体(mAb))的需要。抗VEGFR-1抗体可能是有用的治疗血管生成相关疾病和癌症的新的治疗拮抗剂。
发明简述
在一个实施方案中，本发明提供与VEGFR-1特异性结合的单克隆抗体或其片段，该抗体或其片段包含SEQ ID NO：2的轻链互补决定区-2(CDR2)和SEQ ID NO：3的轻链互补区-3(CDR3)。
在另一个实施方案中，本发明提供与VEGFR-1特异性结合的单克隆抗体或其片段，该抗体或其片段与包含SEQ ID NO：2的轻链互补决定区-2(CDR2)和SEQ ID NO：3的轻链互补区-3(CDR3)的抗体或其片段的氨基酸序列有至少70％同源性。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的多核苷酸，该多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQ IDNO：27。该核苷酸序列编码与VEGFR-1特异性结合的抗体或其片段。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的多核苷酸，该多核苷酸包含编码与VEGFR-1特异性结合的抗体或其片段的核苷酸序列，该核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列有至少70％同源性：SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27。
在另一个实施方案中，本发明提供通过给予治疗有效量的抗体或其片段抑制血管生成或减缓肿瘤生长的方法，该抗体或其片段与VEGFR-1特异性结合，并包含SEQ ID NO：2的轻链互补决定区-2(CDR2)和SEQ ID NO：3的轻链互补区-3(CDR3)。
附图简述
图1是本发明实施方案抗VEGFR-1抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列。
图2是本发明实施方案抗VEGFR-1抗体的轻链可变区和重链可变区的核苷酸序列。
图3是表示基于ELISA的结合试验，测定本发明实施方案抗VEGFR-1抗体与VEGFR-1体外结合活性结果的曲线图。
图4是表示基于ELISA的阻断试验，测定本发明实施方案抗VEGFR-1抗体与P1GF同VEGFR-1体外竞争性结合结果的曲线图。
图5是表示基于ELISA的阻断试验，测定本发明实施方案抗VEGFR-1抗体与VEGF同VEGFR-1体外竞争性结合结果的曲线图。
图6A-D是表示本发明抗VEGFR-1抗体18F1与人VEGFR-1(图6A)、非小鼠VEGFR-1(图6B)、人VEGFR-2(图6C)或小鼠VEGFR-2(图6D)特异性结合结果的曲线图。
图7A-E为流式细胞术分析结果，表示本发明实施方案抗VEGFR-1抗体与表达VEGFR-1的猪主动脉内皮细胞的结合反应性。
图8A-B为流式细胞术分析结果，表示本发明抗VEGFR-1抗体18F1与表达VEGFR-1的猪内皮细胞(图8A)和DU4475人乳腺癌细胞(图8B)的结合反应性。
图9是表示基于细胞的阻断试验，测定本发明抗VEGFR-1抗体18F1与VEGF对内皮细胞的VEGFR-1体外竞争性结合结果的曲线图。
图10为蛋白质印迹分析，证实在猪主动脉内皮VEGFR-1表达细胞中，用本发明抗VEGFR-1抗体18F1处理减少PlGF刺激的VEGFR-1磷酸化。
图11为蛋白质印迹分析，证实在BT474乳腺癌细胞中，用本发明抗VEGFR-1抗体18F1处理抑制PlGF或VEGF刺激的VEGFR-1磷酸化。
图12为蛋白质印迹分析，证实在猪主动脉内皮VEGFR-1表达细胞中，通过本发明实施方案的抗VEGFR-1抗体，抑制P1GF诱导的ERK1/2下游信号的活化。
图13为蛋白质印迹分析，证实在猪主动脉内皮VEGFR-1表达细胞中，通过本发明实施方案的抗VEGFR-1抗体抑制VEGF诱导的ERK1/2下游信号的活化。
图14A-B为蛋白质印迹分析，证实在表达VEGFR-1的猪主动脉内皮细胞中，本发明的抗VEGFR-1抗体18F1抑制PIGF(图14A)或VEGF(图14B)诱导的ERK1/2下游信号的活化。
图15为蛋白质印迹分析，证实在BT474乳腺癌细胞中，本发明的抗VEGFR-1抗体18F1阻断P1GF或VEGF刺激的Akt磷酸化。
图16为剂量反应曲线，表示在用本发明实施方案抗VEGFR-1抗体处理的DU4475乳腺癌细胞中，以剂量反应方式抑制VEGF刺激的细胞增殖。
图17为剂量反应曲线，表示在用本发明实施方案的抗VEGFR-1抗体处理的DU4475乳腺癌细胞中，以剂量反应方式抑制P1GF刺激的细胞增殖。
图18A-B为剂量反应曲线，表示在用本发明抗VEGFR-1抗体18F1处理的DU4475乳腺癌细胞中，以剂量反应方式抑制PIGF(图18A)或VEGF(图18B)刺激的细胞增殖。
图19A和图19B是用本发明实施方案的抗VEGFR-1抗体治疗后，以DU4475乳腺瘤的肿瘤生长对天数作图绘制的曲线图。
图20A-C是用本发明的抗VEGFR-1抗体18F1治疗后，以DU4475(图20A)、MDA-MB-231(图20B)和MDA-MB-435(图20C)乳腺肿瘤的肿瘤生长对天数作图绘制的曲线图。
图21A-B是用本发明的抗人VEGFR-1抗体18F1和抗小鼠VEGFR-1抗体MF1治疗后，以DU4475(图21A)和MDA-MB-231(图21B)乳腺肿瘤的肿瘤生长对天数作图绘制的曲线图。
图22是在VEGF-A和VEGF-B存在下，用抗人VEGFR-1抗体18F1处理后结肠癌细胞集落数的柱状图。
图23A是在VEGF-A和VEGF-B存在下，用抗人VEGFR-1抗体18F1处理后迁移肿瘤细胞数的柱状图。
图23B是在VEGF-A和VEGF-B存在下，用抗人VEGFR-1抗体18F1处理后染色迁移细胞的显微照片。
图24A是在VEGF-A或VEGF-B存在下，用抗人VEGFR-1抗体18F1处理后穿过MATRIGELTM层迁移的肿瘤细胞数的柱状图。
图24B是在VEGF-A和VEGF-B存在下，用抗人VEGFR-1抗体18F1处理后染色迁移细胞的显微照片。
图25是用抗VEGFR-1抗体18F1、6F9和15F11治疗后，以DU4475(图25A)和MDA-MB-435(图25B)乳腺肿瘤的肿瘤生长对天数作图绘制的曲线图。
图26是用规定剂量的抗人VEGFR-1抗体18F1治疗后，以HT-29(图26A)、DLD-1(图26B)和GEO(图26C)结肠癌细胞的生长对天数作图绘制的曲线图。
图27是用抗人VEGFR-1抗体18F1治疗后MDS-MB-231异种移植肿瘤的显微照片。
图28是在MDA-MB-231(图28A)和DU4475(图28B)异种移植物中，用规定剂量的抗人抗VEGFR-1抗体18F1、抗小鼠抗VEGFR-1抗体MF1或者两者治疗后，以肿瘤生长对天数作图绘制的曲线图。
图29是在MDS-MB-231异种移植物中，用与环磷酰胺联用的抗人抗VEGFR-1抗体18F1和抗小鼠抗VEGFR-1抗体MF1治疗后，以肿瘤生长对天数作图绘制的曲线图。
图30A和图30B是在MDA-MB-231异种移植物中，用与5-FU/LV或多柔比星联用的抗人抗VEGFR-1抗体18F1和抗小鼠抗VEGFR-1抗体MF1治疗后，以肿瘤生长对天数作图绘制的曲线图。
图31是在VEGF-A(图31A)或P1GF(图31B)存在下，用去铁胺处理后，以肿瘤细胞总数对不同量的18F1抗体浓度作图绘制的柱状图。
图32A、图32B和图32C是表示抗人抗VEGFR-1抗体18F1和抗小鼠抗VEGFR-1抗体MF1特异性的曲线图。
发明详述
在一个实施方案中，本发明提供与VEGFR-1特异性结合的单克隆抗体及其片段(该抗体及其片段本文亦称“抗VEGFR-1抗体”，除非另有说明)。本发明的抗VEGFR-1抗体包含SEQ ID NO：2的轻链互补决定区-2(CDR2)和SEQ ID NO：3的轻链互补区-3(CDR3)。或者优选本发明的抗VEGFR-1抗体包含具有以下序列的轻链互补区-1(CDR1)：RASQSX1SSSYLA，其中X1为V或G(SEQ ID NO：1或4)。或者优选本发明的抗VEGFR-1抗体包含具有以下序列的重链CDR1：GFX2FSSYGMH，其中X2为T或A(SEQ ID NO：5或11)。或者优选本发明的抗VEGFR-1抗体包含具有以下序列的重链CDR2：VIWX3DGSNKYYADSVX4G，其中X3为Y或F，X4为K或R(SEQ ID NO：6、9或12)。或者还优选本发明的抗VEGFR-1抗体包含具有以下序列的重链CDR3：DHX5GSGX6HX7YX8YYGX9DV，其中X5为F或Y；X6为A或V；X7为Y、S或H；X8为Y或F；X9为M或L(SEQ ID NO：7、8、10、13)。优选的抗VEGFR-1抗体(亦称克隆“6F9”、“13G12”、“15F11”和“18F1”(或“MC-18F1”))的CDR氨基酸序列见下表1。
表1-抗VEGFR-1抗体的CDR序列
克隆 CDR1 CDR2 CDR3
轻链
6F9 RASQSGSSSYLA(SEQ ID NO：1) GASSRAT(SEQ ID NO：2) QQYGSSPLT(SEQ ID NO：3)
13G12 RASQSGSSSYLA(SEQ ID NO：1) GASSRAT(SEQ ID NO：2) QQYGSSPLT(SEQ ID NO：3)
15F11 RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO：4) GASSRAT(SEQ ID NO：2) QQYGSSPLT(SEQ ID NO：3)
18F1 RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO：4) GASSRAT(SEQ ID NO：2) QQYGSSPLT(SEQ ID NO：3)
重链
6F9 GFTFSSYGMH(SEQ ID NO：5) VIWYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO：6) DHFGSGAHYYYYYGMDV(SEQ ID NO：7)
13G12 GFTFSSYGMH(SEQ ID NO：5) VIWYDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO：6) DHYGSGAHYYYYYGMDV(SEQ ID NO：8)
15F11 GFTFSSYGMH(SEQ ID NO：5) VIWFDGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO：9) DHYGSGAHSYYYYGLDV(SEQ ID NO：10)
18F1 GFAFS SYGMH(SEQ ID NO：11) VIWYDGSNKYYADSVRG(SEQ ID NO：12) DHYGSGVHHYFYYGLDV(SEQ ID NO：13)
在另一个实施方案中，本发明的抗VEGFR-1抗体具有SEQ IDNO：14、15或16的轻链可变区(VL)和/或SEQ ID NO：17、18、19或20的重链可变区(VH)。优选的本发明抗VEGFR-1抗体的轻链和重链可变区的氨基酸序列见下表2。
表2-抗VEGFR-1抗体的可变区序列(下划线部分表示CDR)
克隆 轻链
6F9 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC RASOSGSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY GASS RATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC OOYGSSPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPSEQ ID NO：14
13G12 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC RASOSGSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY GASS RATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC QOYGSSPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPSEQ ID NO：14
15F11 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC RASOSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY GASS RATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC OOYGSSPLTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPSEQ ID NO：15
18F1 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC RASOSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY GASS RATGIPDRFSGSGSGTDFTLISRLEPEDFAVYYCQ OYGSSPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPSEQ ID NO：16
克隆 重链
6F9 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVA VI WYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYHCTR DHFG SGAHYYYYYGMDVWGQGTTVTVSSSEQ ID NO：17
13G12 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVA VI WYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSRNILYLQIVNSLRAEDTAVYYCA RDHY GSGAHYYYYYGMDMWGQGTTVTVSSSEQ ID NO：18
15F11 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVA VI WFDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA RDHYG SGAHSYYYYGLDVWGQGTSVTVSSSEQ ID NO：19
18F1 QAQVVESGGGVVQSGRSLRLSCAAS GFAFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVA VI WYDGSNKYYADSVRGRFTISRDNSENTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR DHYGSGVHHYFYYGLDVWGQGTTVTVSSSEQ ID NO：20
在一个优选的实施方案中，本发明的抗VEGFR-1抗体为人抗体。
本发明的抗VEGFR-1抗体包括与VEGFR-1特异性结合的完整抗体和抗体片段。本发明抗体类型的非限制性实例包括天然存在的抗体；单链抗体；多价单链抗体例如双链抗体(diabody)和三链抗体(tribody)；单价片段例如Fab(抗原结合片段)、二价片段例如(FaV)2；Fv(可变片段(fragment variable))片段或其衍生物例如单链Fv(scFv)片段和与VEGFR-1特异性结合的单域抗体(single domain antibody)。
天然存在的抗体通常具有两条相同的重链和两条相同的轻链，每条轻链通过链间二硫键与重链共价连接，多个二硫键进一步使两条重链相互连接。每条链都可折叠成大小(110-125个氨基酸)和结构相似但功能不同的结构域。轻链可包含一个VL区和一个恒定区(CL)。重链也可包含一个VH区和/或根据抗体类别或同种型包含3个或4个恒定区(CH1、CH2、CH3和CH4)。人的同种型有IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，对于IgA和IgG还再分为亚类或亚型(IgA1-2和IgG1-4)。
单链抗体缺少从它们所衍生而来的完整抗体的某些或全部恒定区。用于产生单链抗体的肽接头可以是精选的柔性肽以确保形成合适的三维折叠的VL区和VH区。一般而言，VL或VH序列的羧基端可以通过这种肽接头与互补的VH或VL序列的氨基端共价连接。接头一般为10-50个氨基酸残基，优选10-30个氨基酸残基，更优选12-30个氨基酸残基，最优选15-25个氨基酸残基。该连接肽的实例包括(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3(SEQ ID NO：28)。
多个单链抗体，每一单链都具有通过第一个肽接头共价连接的一个VH区和一个VL区，可以与至少一个或多个肽接头共价连接而形成多价单链抗体，它可以是单特异性或多特异性的。多价单链抗体的每条链都包括可变轻链片段和可变重链片段，且通过肽接头与至少一条其它链相连接。
两个单链抗体可以结合形成双链抗体，亦称三价二聚体。双链抗体有两条链和两个结合位点，可为单特异性或双特异性。双链抗体的每条链都包括VH区及与其连接的VL区。用短得足以防止同一链的结构域之间发生配对的接头，来连接各结构域，从而促使不同链上的互补结构域配对以重新产生两个抗原结合位点。
三条单链抗体可以结合形成三链抗体，亦称三价三聚体。将VL区或VH区的氨基端与VL区或VH区的羧基端直接融合，也就是说，无任何连接序列，来构建三链抗体。三链抗体具有三个Fv头，它们的多肽以环状、头尾方式排列。一种可能的三链抗体构象是平面的，三个结合位点以相互之间120°的角度位于平面上。三链抗体可为单特异性、双特异性或三特异性。
Fab片段是指由VLCLVHCH1区组成的抗体片段。用木瓜蛋白酶消化产生的片段称为“Fab”，不保留重链铰链区。用胃蛋白酶消化产生的片段既称为“(Fab′)2”，在这种情况下，链间二硫键完好无缺，又称为Fab′，这种情况下不保留二硫键。二价(Fab′)2片段对抗原的亲合力比单价Fab片段的高。
Fv片段是由VL区和VH区组成的抗体部分，构成抗原结合位点。scFv是在一条多肽链上包含VL区和VH区的抗体片段，其中一个区的N端和另一个区的C端通过柔性接头结合在一起，使得两个片段缔合形成功能性抗原结合位点(参见例如美国专利第4,946,778号(Ladner等)，WO 88/09344(Huston等)，这两个文献的内容都通过引用结合到本文中)。通过引用结合到本文的WO 92/01047(McCafferty等)，描述了scFv片段在可溶性重组基因展示包(soluble recombinantgenetic display package)例如噬菌体表面上的展示。
单域抗体具有能够有效结合抗原的单可变区(single variabledomain)。其中结合亲和性和特异性主要归因于总有一个可变区的抗体的实例为本领域所知，参见例如Jeffrey，P.D.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：10310-4(1993)，该文献的内容通过引用结合到本文中，文献中公开了主要通过抗体重链与地高辛结合的抗地高辛抗体。因此，可以确定单抗体域与VEGF受体结合得很好。应该了解的是，为了从包含VH区和VL区的抗体制备单域抗体，CDR区外可能需要某些氨基酸取代以增强结合、表达或可溶性。例如，可能需要修饰氨基酸残基，否则会被埋在VH-VL界面。
本发明的抗VEGFR-1抗体的各个结构域可以是完整的抗体重链或轻链可变区，或者它可以是天然存在结构域的功能性等同物或突变体或衍生物，或者是合成结构域，例如应用记载于诸如WO 93/11236(Griffiths等)中的技术体外构建。例如，有可能使结构域与相应的缺少至少一个氨基酸的抗体可变区结合在一起。重要的特征性特点是各结构域与互补结构域缔合形成抗原结合位点的能力。因此，术语“可变重链/轻链片段”不应理解为排除了对VEGFR-1结合特异性无实质性作用的变异片段。
本文所用“抗VEGFR-1抗体”包括保留了VEGFR-1特异性的本发明抗VEGFR-1抗体的各种修饰。这些修饰包括但不限于与效应分子例如化疗药物(例如顺铂、泰素、多柔比星)或细胞毒素(例如蛋白或非蛋白有机化疗药物)缀合。修饰还包括但不限于与可检出报道部分缀合。还包括延长抗体半寿期(例如聚乙二醇化)的修饰。
蛋白和非蛋白药物可通过本领域已知方法与抗体缀合。缀合方法包括直接键合、通过共价连接的接头键合和配对成分(例如抗生物素蛋白-生物素)特异性结合。例如，这些方法包括记载于Greenfield等，Cancer Research50，6600-6607(1990)中用于多柔比星缀合的方法(该文献的内容通过引用结合到本文中)，以及记载于Arnon等，Adv.Exp.Med.Biol.303，79-90(1991)和Kiseleva等，Mol.Biol.(USSR)25，508-514(1991)中用于铂化合物缀合的方法，这两个文献的内容都通过引用结合到本文中。
本发明的抗VEGFR-1抗体还包括通过直接突变、亲和力成熟法、噬菌体展示或链改组使结合特性得到改进的抗体。可以通过使本发明抗体的任何CDR发生突变，筛选具有所需特性的抗原结合位点，修饰和改进亲和性和特异性(参见例如Yang等，J.Mol.Biol.，254：392-403(1995)，该文献的内容通过引用结合到本文中)。可按本领域技术人员所知的各种方法使CDR发生突变。例如，一种方法是任意排列各个残基或残基的组合，使得在一组不相同的抗原结合位点上，所有20个氨基酸都处于特定的位置。或者通过易错PCR法，在CDR残基范围内诱导突变(参见例如Hawkins等，J.Mol.Biol.，226：889-896(1992)，该文献的内容通过引用结合到本文中)。例如，含有重链和轻链可变区基因的噬菌体展示载体可以在大肠杆菌(E.coli)增变株中繁殖(参见例如Low等，J.Mol.Biol.，250：359-368(1996)，该文献的内容通过引用结合到本文中)。
抗VEGFR-1抗体还包括功能性等同物，该等同物包括氨基酸序列与本发明抗体可变区或超变区的氨基酸序列基本相同的多肽。“基本相同的”氨基酸序列包括当两个序列的氨基酸最佳比对和比较以确定两个序列间氨基酸的精确配对时，一个氨基酸序列与另一个氨基酸序列有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％同一性。“基本相同的”氨基酸序列还包括一个氨基酸序列与另一个氨基酸序列有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％同源性，根据Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85，2444-8(1988)，通过FASTA检索方法确定。
如前所述，本发明的抗VEGFR-1抗体与VEGFR-1特异性结合。这些抗体可以为单特异性或双特异性，只要抗原结合位点对VEGFR-1是特异性的。抗体特异性，是指抗体对特定抗原表位的选择性识别，抗体对VEGFR-1的抗体特异性可以根据亲和力和/或亲合力确定。亲和力，用抗原与抗体的解离平衡常数(Kd)表示，衡量抗原决定簇(表位)与抗体结合位点间的结合强度。亲合力是衡量抗体与其抗原间的结合强度。抗体通常的Kd为10-5-10-11公升/摩尔。一般认为，任何小于10-4公升/摩尔的Kd都表示非特异性结合。Kd值越小，抗原决定簇和抗体结合位点间的结合强度越强。
本发明的抗VEGFR-1抗体与VEGFR-1的胞外区特异性结合，优选通过防止VEGFR-1的配体与受体结合，来中和VEGFR-1的活化。在这些优选的实施方案中，抗体结合VEGFR-1的强度至少与VEGFR-1的天然配体(包括VEGF-A、VEGF-B和PlGF)一样强。
中和VEGFR-1的活化包括减小、抑制、钝化和/或阻断一种或多种与信号转导相关的活性。这些活性包括受体二聚化、VEGFR-1自身磷酸化、VEGFR-1内部胞质酪氨酸激酶结构域的活化及参与调节DNA合成(基因活化)和细胞周期进程或***的多个信号转导途径和反式激活途径的启动。VEGFR-1中和的一个方法是抑制VEGFR-1酪氨酸激酶活性。可以用众所周知的方法，例如测定重组激酶受体自身磷酸化水平和/或天然或合成底物磷酸化的磷酸化试验，测定酪氨酸激酶的抑制。可以在ELISA试验或蛋白质印迹中，用例如对磷酸酪氨酸特异性的抗体检测磷酸化。一些用于酪氨酸激酶活性的试验记载于Panek等，J.Pharmacol.Exp.Them.，283：1433-44(1997)和Batley等，Life Sci，62：143-50(1998)，这两个文献的内容都通过引用作为参考。
另外，可以用蛋白表达的检测方法确定抗体是否中和了VEGFR-1的活化，其中待检测蛋白受VEGFR-1酪氨酸激酶活性调节。这些方法包括检测蛋白表达的免疫组织化学(IHC)、检测基因扩增的荧光原位杂交(FISH)、竞争性放射性配体结合试验、固体基质印迹技术例如RNA印迹法和DNA印迹法、逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)和ELISA。参见例如Grandis等，Cancer，78：1284-92.(1996)；Shimizu等，Japan J.Cancer Res.，85：567-71(1994)；Sauter等，Am.J.Path.，148：1047-53(1996)；Collins，Glia，15：289-96(1995)；Radinsky等，Clin.Cancer Res.，1：19-31(1995)；Petrides等，Cancer Res.，50：3934-39(1990)；Hoffmann等，Anticancer Res.，17：4419-26(1997)；Wikstrand等，CancerRes.，55：3140-48(1995)，所有这些文献的内容都通过引用作为参考。
可以利用体内试验检测VEGFR-1中和。例如通过促细胞***试验，在抑制剂存在或不存在时，用受体配体刺激的细胞系可以观察受体酪氨酸激酶受抑制。例如，用VEGF-A或VEGF-B刺激的HUVEC细胞(ATCC)，可以用来分析VEGFR-1抑制。另一个方法涉及使用例如人肿瘤细胞注入小鼠体内，测试表达VEGF肿瘤细胞生长的抑制。参见例如美国专利第6,365,157号(Rockwell等)，该文献的内容通过引用结合到本文中。
当然，本发明并不受任何具体VEGFR-1中和机制的限制。例如，本发明的抗VEGFR-1抗体可以与VEGFR-1在外部结合，阻断配体与VEGFR-1结合，并阻断随即通过受体相关酪氨酸激酶介导的信号转导，防止VEGFR-1和信号转导级联***中其它下游蛋白的磷酸化。受体-抗体复合物还可被内化和降解，导致受体细胞表面减量调节。基质金属蛋白酶，其功能是肿瘤细胞侵袭和转移，还可以通过本发明的抗VEGFR-1抗体减量调节。
人抗VEGFR-1抗体可得自天然存在的抗体，或者得自从例如人重链和轻链可变区基因构建的Fab或scFv噬菌体展示文库，本发明抗VEGFR-1抗体的CDR序列可以***该人抗VEGFR-1抗体中。
可以通过本领域技术人员熟知的方法，产生人抗VEGFR-1抗体。这些方法包括使用转基因小鼠杂交瘤的方法以及重组DNA的方法。杂交瘤的方法记载于Kohler和Milstein，Nature，256：495-497(1975)和Campbell，Monoclonal Antibody Technology，The Productionand Characterization of Rodent and Human Hybridomas(单克隆抗体技术：啮齿动物及人杂交瘤的产生及表征)；Burdon等主编，LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology(生物化学与分子生物学实验技术)，第13卷，Elsevier Science Publishers，Amsterdam(1985)，所有这些文献的内容都通过引用结合到本文中；重组DNA的方法记载于Huse等，Science，246，1275-1281(1989)，该文献的内容通过引用结合到本文中。
可以通过剪切完整抗体，或者通过表达编码片段的DNA，制备抗体片段。可以通过记载于Lamoyi等，J.Immunol.Methods，56：235-243(1983)和Parham，J.Immunol.131：2895-2902(1983)的方法制备抗体片段，这两个文献的内容都通过引用结合到本文中。这些片段可含有一个或两个Fab片段或F(ab′)2片段。这些片段还可含有抗体单链片段可变区，即scFv、双链抗体或其它抗体片段。PCT申请WO93/21319、欧洲专利申请第239,400号、PCT申请WO 89/09622、欧洲专利申请第338,745号和欧洲专利申请EP 332,424公开了制备这些抗体的方法，所有这些文献的内容都通过引用结合到本文中。
在另一个实施方案中，本发明提供编码本发明抗VEGFR-1抗体的多核苷酸。这些多核苷酸编码SEQ ID NO：2的轻链CDR2、SEQ IDNO：3的轻链CDR3和优选表1所列的其它一种或多种CDR。表3表示优选的抗VEGFR-1抗体的核酸序列。
表3-抗VEGFR-1抗体的核苷酸序列
克隆 轻链
6F9 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCCTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGGTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGSEQ ID NO：21
13G12 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCCTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGGTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGSEQ ID NO：21
15F11 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCTCTCACCTTCGG CCAAGGGACACGACTGGAGATTAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGSEQ ID NO：22
18F1 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTTCCGSEQ ID NO：23
克隆 重链
6F9 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATCACTGTACGAGAGATCACTTTGGTTCGGGGGCTCACTACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCASEQ ID NO：24
13G12 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCACTATGGTTCGGGGGCTCACTACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCASEQ ID NO：25
15F11 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTTTGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCACTATGGTTCGGGGGCTCACTCCTACTACTACTACGGTTTGGACGTTTGGGGCCAAGGGACCTCGGTCACCGTCTCCTCASEQ ID NO：26
  18F1 CAGGCGCAGGTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGTCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCGCCTTCAGTAGCTACGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCGAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCTGTGTATTACTGTGCCAGAGATCACTATGGTTCGGGGGTGCACCACTATTTCTACTACGGTCTGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCASEQ ID NO：27
除基本衍生或完全衍生自相应的人抗体区CDR以外，可以通过重组编码人恒定区和可变区的DNA，以及重组编码衍生自人的CDR(SEQ ID NO：1-4轻链可变区CDR和SEQ ID NO：5-13重链可变区CDR)的DNA，制备编码人抗体的DNA。
编码本发明抗VEGFR-1抗体的多核苷酸包括与本发明多核苷酸的核酸序列基本相同的核酸序列的多核苷酸。本文“基本相同的”核酸序列定义为当两个序列最佳比对(带有合适核苷酸的***或缺失)和比较以确定两个序列间核苷酸的精确配对时，一个序列与另一个核酸序列有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％同一性。
编码抗体片段DNA的合适来源包括任何细胞，例如表达全长抗体的杂交瘤细胞和脾细胞。可以使用片段本身作为抗体等同物，或者按上述方法重组成为等同物。可以通过已知方法，例如记载于上述所列已公开专利部分中发明名称为“抗体功能性等同物(FunctionalEquivalents of Antibody)”和/或其它标准重组DNA技术(例如下述方法)的方法，进行这一部分所述的DNA缺失和重组。正如本领域所知，另一个DNA来源是从噬菌体展示文库产生的单链抗体。
另外，本发明提供含有与表达序列、启动子序列和增强子序列操作性连接的上述多核苷酸序列的表达载体。已经开发出在原核***(例如细菌)和真核***(包括但不限于酵母和哺乳动物细胞培养***)中用于有效合成抗体多肽的各种表达载体。本发明的载体可包含染色体节段、非染色体节段和合成的DNA序列。
可以使用任何合适的表达载体。例如，原核克隆载体包括得自大肠杆菌的质粒，例如colEl、pCRl、pBR322、pMB9、pUC，pKSM和RP4。原核载体还包括噬菌体DNA的衍生物，例如M13和其它丝状单链DNA噬菌体。酵母用载体的一个实例为2μ质粒。用于在哺乳动物细胞中表达的合适载体包括众所周知的SV-40衍生物、腺病毒衍生的DNA序列、反转录病毒衍生的DNA序列和衍生自功能性哺乳动物载体(例如上述载体)与功能性质粒和噬菌体DNA组合的穿梭载体。
另外的真核表达载体为本领域所知(例如PJ.Southern和P.Berg，J.Mol.Appl.Genet.，1：327-341(1982)；Subramani等，Mol.Cell.Biol.，1：854-864(1981)；Kaufinann和Sharp，“Amplification And Expression ofSequences Cotransfected with a Modular Dihydrofolate ReductaseComplementary DNA Gene(用模块式二氢叶酸还原酶互补DNA基因共转染的序列扩增与表达)”J.Mol.Biol.，159：601-621(1982)；Kaufinann和Sharp，Mol.Cell.Biol.，159：601-664(1982)；Scahill等，“Expression And Characterization Of The Product Of A Human ImmuneInterferon DNA Gene In Chinese Hamster Ovary Cells(人免疫干扰素DNA基因在中国仓鼠卵巢细胞中的表达与表征)”Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA，80：4654-4659(1983)；Urlaub和Chasin，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA，77：4216-4220，(1980)，所有这些文献的内容都通过引用结合到本文中)。
用于本发明的表达载体含有至少一个表达控制序列，其与要表达的DNA序列或片段操作性连接。为了控制和调节克隆DNA序列的表达，将控制序列***载体中。有用的表达控制序列的实例为lac***、trp***、tac***、trc***、噬菌体λ主要的操纵基因和启动子区、fd外壳蛋白控制区、酵母糖酵解启动子例如3-磷酸甘油酸激酶启动子、酵母酸性磷酸酶启动子例如Pho5、酵母α-交配因子的启动子、从多瘤病毒、腺病毒、反转录病毒和猿猴病毒获得的启动子例如早期启动子和晚期启动子或SV40，以及已知的控制原核细胞或真核细胞和它们的病毒或病毒组合基因表达的其它序列。
本发明还提供含有前述表达载体的重组宿主细胞。本发明的抗VEGFR-1抗体可以在除杂交瘤以外的细胞系中表达。包含编码本发明多肽序列的核酸，可以用于转化合适的哺乳动物宿主细胞。
根据高表达水平、目标蛋白的组成型表达和宿主蛋白最小污染，选择特别优选的细胞系。可得到的用作表达宿主的哺乳动物细胞系是本领域众所周知的，包括许多无限增殖化细胞系，例如但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(Baby Hamster Kidney(BHK))细胞和许多其它细胞系。合适的其它真核细胞包括酵母和其它真菌。有用的原核宿主包括例如大肠杆菌(E.coli)(例如大肠杆菌SG-936、大肠杆菌HB101、大肠杆菌W3110、大肠杆菌X1776、大肠杆菌X2282、大肠杆菌DHI和大肠杆菌MRCl)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和链霉菌属(Streptomyces)。
可以使用现有的这些重组宿主细胞，通过在允许抗体表达的条件下培养细胞，并从宿主细胞和宿主细胞周围的培养基中纯化抗体，以产生抗体。通过在编码抗体目标基因的5′端，***信号或分泌前导肽编码序列(参见Shokri等，(2003)Appl.Microbiol.Biotechnol.，60(6)：654-664，Nielsen等，Prot.Eng.，10：1-6(1997)；von Heinje等，Nucl.AcidsRes.，14：4683-4690(1986)，所有这些文献的内容都通过引用结合到本文中)，促进重组宿主细胞已表达抗体的分泌。可以从原核序列或真核序列获得这些分泌前导肽元件。因此，适宜使用分泌前导肽，即与多肽N-端连接以引导多肽从宿主细胞的细胞溶胶中转移并分泌到培养基中的氨基酸。
本发明的抗VEGFR-1抗体可与其它氨基酸残基融合。例如，这些氨基酸残基可以是肽标记以促进分离。还包括用于抗体归巢特异性器官或组织的其它氨基酸残基。
在另一个实施方案中，本发明提供通过给予有需要的哺乳动物治疗有效量的本发明抗VEGFR-1抗体，治疗医学病症的方法。治疗有效量是指有效产生所需治疗效果(例如抑制酪氨酸激酶活性)的量。
在一个优选的实施方案中，本发明提供通过给予有需要的哺乳动物治疗有效量的本发明的抗VEGFR-1抗体，减缓肿瘤生长或抑制血管生成的方法。虽然无意受具体机制的束缚，但是可以用本发明方法治疗的疾病包括例如肿瘤生长或病理性血管生成是通过VEGFR旁分泌和/或自分泌环刺激的疾病。
对于减缓肿瘤生长，这些肿瘤包括原发性肿瘤和转移性肿瘤以及难治性肿瘤。难治性肿瘤包括对其它治疗形式无反应或抵抗的肿瘤，其它治疗例如仅用化疗药物、仅用抗体、仅用放射性药物或它们的组合的治疗。难治性肿瘤还包括用这些药物治疗后似乎受到抑制，但在治疗停止后达5年，有时达10年或更长又再复发的肿瘤。
本发明的抗VEGFR-1抗体用于治疗表达VEGFR-1的肿瘤。这些肿瘤对存在于它们环境中的VEGF有独特的敏感性，且可进一步产生自分泌刺激环中的VEGF并受自分泌刺激环中的VEGF刺激。因此，该方法有效地用于治疗实体瘤或不形成血管或者基本不形成血管的非实体瘤。
因此，可以治疗的实体瘤的实例包括乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、神经胶质瘤和淋巴瘤。这些肿瘤的一些实例包括表皮样瘤、鳞状瘤例如头颈部肿瘤、结肠直肠肿瘤、***肿瘤、乳腺肿瘤、肺肿瘤包括小细胞和非小细胞肺肿瘤、胰腺肿瘤、甲状腺肿瘤、卵巢肿瘤和肝肿瘤。其它实例包括卡波西肉瘤(Kaposi′s sarcoma)、CNS肿瘤(CNS neoplasm)、成神经细胞瘤、毛细血管成血管细胞瘤、脑膜瘤和脑转移瘤、黑素瘤、胃肠癌、胃肠肉瘤、肾癌、肾肉瘤、横纹肌肉瘤、成胶质细胞瘤(优选多形性成胶质细胞瘤)和平滑肌肉瘤。本发明的抗VEGFR-1抗体对之有效的血管化皮肤癌的实例包括鳞状细胞癌、基底细胞癌和通过抑制恶性角化细胞(例如人恶性角化细胞)生长可以治疗的皮肤癌。
非实体瘤的实例包括白血病、多发性骨髓瘤和淋巴瘤。白血病的一些实例包括急性髓细胞白血病(AML)、慢性髓细胞白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、红细胞白血病或单核细胞白血病。淋巴瘤的一些实例包括霍金奇淋巴瘤(Hodgkin′s lymphoma)和非霍金奇淋巴瘤。
对于抑制血管生成，本发明的抗VEGFR-1抗体有效地用于治疗患血管化肿瘤或血管化赘生物或以过度血管生成为特征的血管原性疾病的患者。这些肿瘤和赘生物包括例如恶性肿瘤和赘生物例如胚细胞瘤、癌或肉瘤和高度血管化肿瘤和赘生物。可以用本发明方法治疗的癌包括例如脑癌、泌尿生殖道癌、淋巴***癌、胃癌、肾癌、结肠癌、喉癌和肺癌和骨癌。非限制性实例还包括表皮样瘤、鳞状瘤例如头颈部肿瘤、结肠直肠肿瘤、***肿瘤、乳腺肿瘤、肺肿瘤(包括肺腺癌和小细胞和非小细胞肺肿瘤)、胰腺肿瘤、甲状腺肿瘤、卵巢肿瘤和肝肿瘤。该方法还用于治疗血管化皮肤癌，包括鳞状细胞癌、基底细胞癌和通过抑制恶性角化细胞(例如人恶性角化细胞)生长可以治疗的皮肤癌。其它可以治疗的癌包括卡波西肉瘤、CNS肿瘤(成神经细胞瘤、毛细血管成血管细胞瘤、脑膜瘤和脑转移瘤)、黑素瘤、胃肠癌、胃肠肉瘤、肾癌、肾肉瘤、横纹肌肉瘤、成胶质细胞瘤(包括多形性成胶质细胞瘤)和平滑肌肉瘤。
以过度血管生成(涉及例如炎症)和/或血管形成为特征的病理性血管原性疾病的非限制性实例包括动脉粥样硬化、类风湿性关节炎(RA)、新生血管性青光眼、增殖性视网膜病包括增殖性糖尿病性视网膜病、黄斑变性、血管瘤、血管纤维瘤和牛皮癣。非瘤形成血管原性疾病的其它非限制性实例是早产儿视网膜病(晶状体后纤维组织形成)、角膜移植排斥、胰岛素依赖型糖尿病、多发性硬化、重症肌无力、节段性回肠炎(Crohn′s disease)、自身免疫性肾炎、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、急性胰腺炎、同种移植排斥、变应性炎症、接触性皮炎和迟发型超敏反应、炎性肠病、败血症性休克、骨质疏松症、骨关节炎、神经元炎症诱发的认知缺陷、Osier-Weber综合征、再狭窄和真菌感染、寄生虫感染和病毒感染，包括巨细胞病毒感染。
本领域技术人员熟练掌握了鉴定通过本发明的抗VEGFR-1抗体可治疗的医学病症的知识和技术。例如，患临床上明显瘤形成或血管原性疾病或者有发展成临床上明显症状风险的人个体，适于给予本发明的VEGF受体抗体。例如，通过应用临床试验、身体检查和医疗史/家族史，本领域的临床医生很易确定个体是否适于这种治疗。
可将本发明的抗VEGFR-1抗体给予患肿瘤或血管生成相关病理病症的患者进行治疗性治疗，其用量足以防止、抑制或减缓肿瘤进程或病理病症。进程包括例如生长、侵袭、转移和/或肿瘤或病理病症的复发。使用的有效量将取决于疾病的严重程度和患者本身免疫***的一般状况。给药方案将随疾病状态和患者情况而变化，通常范围为单次推注剂量或连续输注至每天多次用药(例如每4-6小时)，或者按治疗医师及患者情况确定。然而，值得注意的是，本发明没有限制任何具体剂量。
在另一个实施方案中，本发明提供给予与一种或多种其它药物联用的本发明抗VEGFR-1抗体治疗医学病症的方法。例如，本发明的一个实施方案提供本发明的抗VEGFR-1抗体与抗肿瘤药或抗血管生成药一起给予来治疗医学病症的方法。抗VEGFR-1抗体可与一种或多种抗肿瘤药或抗血管生成药化学连接或生物合成连接。
可以使用任何合适的抗肿瘤药物，例如化疗药物或放射性药物。化疗药物的实例包括但不限于顺铂、多柔比星、环磷酰胺、紫杉醇、伊立替康(CPT-Il)、托泊替康或它们的组合。当抗肿瘤药物为放射性药物时，放射源可以是外部(外部束放射治疗(external beam radiationtherapy-EBRT))或内部(近距离放射治疗-BT)的，以给予接受治疗的患者。
此外，本发明的抗VEGFR-1抗体可以与中和参与肿瘤生长或血管生成的其它受体的抗体一起给予。该受体的一个实例是VEGFR-2/KDR。在一个实施方案中，本发明抗VEGR-I抗体与特异性结合VEGFR-2的受体拮抗剂联用。特别优选的是抗原结合蛋白，该蛋白与VEGFR-2胞外结构域结合，阻断VEGFR-2与其任何一种配体例如VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D或VEGF-E结合。
该受体的另一个实例是EGFR。在本发明的一个实施方案中，抗VEGFR-1抗体与EGFR拮抗剂联用。EGFR拮抗剂可以是与EGFR或EGFR配体结合并抑制EGFR与其配体结合的抗体。EGFR的配体包括例如EGF、TGF-ce双调蛋白、肝素结合EGF(HB-EGF)和betarecullulin。一般认为，EGF和TGF-α是导致EGFR介导的刺激的主要内源性配体，尽管TGF-α显示在促进血管生成方面更为有效。应该了解的是，EGFR拮抗剂可在外部与EGFR胞外部分结合，这可抑制或不抑制配体的结合，或在内部与酪氨酸激酶结构域结合。与EGFR结合的EGFR拮抗剂的实例包括但不限于生物分子例如EGFR特异性抗体(及其功能性等同物)及小分子例如直接作用于EGFR胞质结构域的合成激酶抑制剂。
参与肿瘤发生的生长因子受体的其它实例是血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、***受体(IGFR)、神经生长因子受体(NGFR)和成纤维细胞生长因子受体(FGFR)。
在另一个选择性实施方案中，本发明提供通过给予与一种或多种合适的佐剂联用的本发明抗VEGFR-1抗体，治疗医学病症的方法，佐剂例如细胞因子(例如IL-10和IL-13)或其它免疫刺激物。参见例如Larrivee等，出处同上。
在联合治疗中，可以在开始用另一种药物治疗前、治疗中或治疗后以及它们的任一组合，也就是说，在开始抗肿瘤药治疗前和治疗中、治疗前和治疗后、治疗中和治疗后、或者治疗前、治疗中和治疗后，给予抗VEGFR-1抗体。例如，可以在开始放射治疗前1天和前30天之间、优选前3天和前20天之间、更优选前5天和前12天之间，给予本发明的抗VEGFR-1抗体。然而，本发明不限制任何具体的给药方案。所给予的其它药物的剂量取决于多种因素，例如包括药物类型、待治疗医学病症的类型和严重程度和给药途径。然而，本发明不限制任何具体的剂量。
任何合适的方法或途径都可用于给予本发明的抗VEGFR-1抗体，任选与抗肿瘤药和/或其它受体拮抗剂共同给予。例如，给药途径包括口服、静脉内、腹膜内、皮下或肌内给予。然而，应该强调的是，本发明不限制任何具体的给药方法或途径。
值得注意的是，可作为缀合物给予本发明的抗VEGFR-1抗体，该缀合物与受体特异性结合，配体-毒素内化后，释放毒性致死负载。
应该了解的是，当为了预防或治疗目的用于哺乳动物时，将以另外包含药学上可接受的载体的组合物形式，给予本发明的抗VEGFR-1抗体。例如，合适的药学上可接受的载体包括一种或多种下列成分：水、盐水，磷酸缓冲盐溶液、葡萄糖、甘油、乙醇等以及它们的组合。药学上可接受的载体还可包含微量辅助物质，例如延长保存期限或提高结合蛋白有效性的湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂。还可以制备本领域众所周知的注射用组合物，以便在给予哺乳动物后提供速释、缓释或迟释的活性成分。
虽然本发明的人抗体特别用于给予人，但是它们还可给予其它哺乳动物。本文所用术语“哺乳动物”包括但不限于人、实验动物、家养宠物和农用动物。
本发明还可以包括用于抑制肿瘤生长和/或血管生成的试剂盒，试剂盒中包含治疗有效量的本发明抗VEGFR-1抗体。试剂盒还可含有任何合适的拮抗剂，例如另外的参与肿瘤发生或血管生成的生长因子受体(例如上述的VEGFR-2/FKDR、EGFR、PDGFR、IGFR、NGFR、FGFR等)的拮抗剂。或者本发明的试剂盒可包含抗肿瘤药，或者本发明的试剂盒可含有任何合适的拮抗剂，另外还可包含抗肿瘤药。已在本发明内容中描述了合适的抗肿瘤药的实例。本发明的试剂盒可另外包含佐剂，上面已描述了佐剂的实例。
在另一个实施方案中，本发明提供用本发明的抗VEGFR-1抗体进行体内或体外研究或诊断的方法。在这些方法中，抗VEGFR-1抗体可与靶或报道部分连接。
实施例
下面的实施例不包括常规方法的详细说明，常规方法例如用于载体和质粒构建、编码多肽的基因***这些载体和质粒或者质粒导入宿主细胞的方法。这些方法为本领域普通技术人员所熟知，并记载于许多出版物中，包括Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆实验室手册)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，该文献的内容通过引用结合到本文中。
材料
AU试剂和化学试剂购自Sigma(St.Louis，MO)，除非另有说明。按照本领域技术人员已知的方法(Tessler，J.Biol.Chem.，269：12456-12461(1994)，该文献的内容通过引用结合到本文中)，使人VEGF165和可溶性重组人VEGFR-1碱性磷酸酶(rhuVEGFR-1 AP)蛋白在稳定转染的细胞中表达，并从细胞培养上清液中纯化。PlGF和可溶性重组VEGFR-1 Fc(rhuVEGFR-1 Fc)蛋白购自(R&D Systems Inc.Minneapolis，MN)。细胞培养皿和试验板购自BD Biosciences，Bedford，MA。
细胞系
人乳腺癌细胞系DU4475、MDA-MB-231、MDA-MB-435和小鼠骨髓瘤细胞系P3-X63-Ag8.653和NSO得自美国典型培养物保藏中心(American Type Tissue Culture Collection(Manassas，VA))。P3-X63-Ag8.653 Bcl/2转染细胞系按前述方法自行制备(Ray S，Diamond B.Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：5548-51，1994)。肿瘤细胞保存在含有10％FCS(Hyclone，Logan，UT)的  RPMIl640培养基(Invitrogen/LifeTechnologies，Inc.，Rockville，MD)中。猪主动脉内皮VEGFR-1表达细胞系由Uppsala大学L.Claesson-Welsh博士提供，在含有10％FCS(Hyclone，Logan，UT)的F12培养基(Invitrogen/Life Technologies，Inc.，Rockville，MD)中进行培养。所有细胞都在37℃潮湿、5％CO2气氛下保存。
实施例1： 抗VEGFR-1抗体的产生
通过标准杂交瘤技术(Harlow和Lane主编，Antibodies：ALaboratory Manual(抗体实验室手册)，Cold Spring Harbor，211-213(1998)，该文献的内容通过引用结合到本文中)，用产生人免疫球蛋白γ重链和κ轻链的KM转基因小鼠(Medarex，San Jose，Calif)，产生人抗VEGFR-1单克隆抗体(本文亦称“抗VEGFR-1抗体”)。用含有VEGFR-1结晶片段(Fc)的完全弗氏佐剂皮下(s.c.)免疫KM小鼠。融合前，动物用含有相同VEGFR-1蛋白的不完全弗氏佐剂腹膜内(i.p.)加强免疫三次。让动物休息一个月，然后用含有25微克VEGFR-1蛋白的磷酸缓冲溶液(PBS)腹膜内进行最后的加强免疫。四天后，从免疫小鼠内收获脾细胞，用聚乙二醇(PEG，分子量1450KD)与P3-X63-Ag8.653 Bcl-2转染浆细胞瘤细胞融合。融合后，使细胞重悬于补充了10％胎牛血清(FBS)的HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)培养基中，以200微升/孔的密度加入96孔板中，以建立杂交瘤细胞。融合后第6天，吸出100微升原培养基，再加入100微升新鲜培养基。
实施例2A： 得自实施例1的抗VEGFR-1抗体能结合VEGFR-1并 抑制VEGFR-1与其配体结合
a. VEGFR-1结合和阻断试验
融合后第10-12天，在基于ELISA的结合和阻断试验中，筛选产生抗体及培养上清液中抗体与rhuVEGFR-1蛋白有特异性结合活性的杂交瘤。通过建立单克隆杂交瘤的有限稀释培养物，将阳性杂交瘤亚克隆三次。
具体地讲，将杂交瘤上清液和纯化抗体用含5％FBS和0.05％吐温20(Tween20)的PBS(ELISA缓冲液)稀释，在rhu VEGFR-1 AP或AP包被的96孔微量滴定板中孵育30分钟。各板用ELISA缓冲液洗涤，与山羊抗小鼠IgG-辣根过氧化物酶(HRP)缀合物(BioSourceInternational，Camarillo，CA)一起孵育30分钟。按照生产商的说明书，用TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)底物(Kierkegaard and Perry Lab，Inc.，Gaithersburg，MD)显色。在450纳米(nm)下读取吸光度，定量测定抗体结合活性。为了鉴定产生抗VEGFR-1抗体的杂交瘤，杂交瘤上清液与VEGFR-1 AP一起预孵育1小时。混合物和ELISA缓冲液一起在VEGF或PlGF包被的96孔微量滴定板中孵育1小时。按照生产商的说明书，用AP的PNPP(磷酸对硝基苯酯)底物显色。在405nm下读取吸光度，定量测定VEGFR-1与VEGF或PlGF的结合。在微量滴定板读数仪(Molecular Devices Corp.，Sunnyvale，CA)上读取光密度(OD)值。用GraphPad Prism3软件(GraphPad Software，Inc.，SanDiego，CA)分析抗体的ED50和IC50。
图3表示由杂交瘤产生的经过纯化的命名为“6F9”、“13G12”、“15F11”和“18F1”的抗体的结合活性。这些抗体在基于ELISA的结合试验中，显示出结合活性，ED50为0.1-0.3nM。图4和图5分别表示克隆6F9、13G12、15F11、18F1有效阻断PlGF与VEGFR-1结合(IC50为0.4-0.8nM)及VEGF与VEGFR-1结合(IC50为0.7-0.8nM)。表4概括了抗体的结合和阻断特征。
表4-抗VEGFR-1抗体的结合和阻断特征
  克隆     结合活性(ED50)     阻断活性(IC50)
  6F9     0.1nM     0.86nM：P1GF0.82nM：VEGF
  13G12     0.3nM     0.82nM：P1GF0.70nM：VEGF
  15F11     0.3nM     0.49nM：P1GF0.73nM：VEGF
  18F1     0.1nM     0.55nM：P1GF0.84nM：VEGF
b. 抗VEGFR-1抗体亲和性的测定
根据生产商提供的方法，用BIAcore2000(Pharmacia，Piscataway，NJ)通过表面等离子共振技术(plasmon resonance technology)，测定抗VEGFR-1抗体克隆6F9、13G12、15F11、18F1的亲和性。将低密度的VEGFR-1的重组胞外结构域固定在传感器表面，对抗体进行动力学分析。用生产商提供的BIAevaluation2.1软件测定(K缔合)和解离(K解离)速率。
抗VEGFR-1抗体克隆6F9、13G12、F11和18F1显示出高亲和性，KD值分别为69pM、121pM、70pM和54pM。表5概括了抗体动力学特征。
    表5-人抗VEGFR-1抗体的动力学特征
    克隆     K缔合     K解离     KD
    6F9     1.01e6M     7.38e-5M     69pM
    13G12     0.95e6M     10.9e-5M     121pM
    15F11     1.02e6M     7.16e-5M     70pM
    18F1     0.81e6M     4.27e-5M     54pM
c. 抗VEGFR-1抗体特异性的评价
为了测定抗VEGFR-1单克隆抗体对人VEGFR-1的特异性，用基于ELISA的试验测试纯化抗体18F1。将1μg/ml重组人VEGFR-1Fc、小鼠VEGFR-1 Fc、小鼠VEGFR-2 Fc或人VEGFR-2碱性磷酸酶用PBS包被于96孔微量滴定板中，于4℃过夜。洗涤后，受体包被板用含有5％奶粉(Dry Milk)和0.05％吐温20的PBS封闭。连续稀释的抗人VEGFR-1第一抗体18F1、抗小鼠VEGFR-1第一抗体MF1，抗人VEGFR-2第一抗体ICl1或抗小鼠VEGFR-2第一抗体DC1O1在受体包被板中孵育30分钟。洗涤后，第二抗第一HRP缀合物抗体在板中孵育30分钟。洗板，加底物TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)孵育显色。于450nm读取吸光度OD值，以定量测定抗体的结合活性。运用GraphPad Prism Software对数据进行分析。
图6A-D表示抗人VEGFR-1单克隆抗体18F1的特异性(图6A)，该抗体与小鼠VEGFR-1(图6B)、人VEGFR-2(图6C)和小鼠VEGFR-2(图6D)无交叉反应性。结果表明，抗人VEGFR-1抗体18F1与其相应的受体有严格的结合特异性。
d 蛋白质印迹
汇合猪主动脉内皮VEGFR-1表达(PAE-VEGFR-1)细胞和BT474人乳腺癌细胞在血清耗竭的F12培养基中培养48小时。然后，细胞与浓度范围为0.1-30μg/ml的抗VEGFR-1抗体克隆18F1一起预孵育1小时，再用VEGF或PlGF于37℃刺激5分钟。然后细胞用冰冷的PBS漂洗，在裂解缓冲液(50mM HEPES、150mM NaCl、1％TritonX-100和10％甘油，其中含有1mM苯甲磺酰氟、10μg/ml抑蛋白酶肽、10μg/ml亮抑酶肽和1mM钒酸钠)中裂解。将细胞裂解物进行SDS-PAGE，并转移到Immobilon膜(Millipore Corp.Billerica，MA)上。转移后，印迹与封闭溶液孵育，用抗磷酸酪氨酸抗体(PY20，Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA)探测，之后洗涤。用辣根过氧化物酶-缀合第二抗体，随后用增强化学发光(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)观测蛋白质含量。抗VEGFR-1特异性抗体(OncogeneResearch Products，San Diego，CA)用于VEGFR-1的复印迹(re-blot)。
所有抗VEGFR-1抗体都识别180KD分子的VEGFR-1重组蛋白。
实施例2B： 抗人抗VEGFR-1抗体对人VEGFR-1具有特异性
将人VEGFR-1-Fc、小鼠VEGFR-1-AP(hnClone Systems)或huVEGFR-2-AP(ImClone Systems)(100ng/孔)包被在96条孔(strip-well)板上，用5％牛奶/PBS封闭。按上述用于杂交瘤上清液筛选的方法，对18F1和其它抗人VEGFR-1抗体或大鼠抗小鼠VEGFR-1抗体MF1(ImClone Systems，ref.18)与结合板的VEGFR-1或VEGFR-2的结合进行评价，只是对于18F1，用山羊抗人κ-HRP抗体(BioSourceInternational，Camarillo，CA)检测结合抗体，而对于MF1，则用抗人VEGFR-2抗体IC11或山羊抗大鼠IgG-HRSP抗体(BioSourceInternational)检测结合抗体。
8F1显示与人VEGFR-1(图32A)有特异反应性，但与小鼠VEGFR-1(图32B)和人VEGFR-2(图32C)无交叉反应性。抗小鼠VEGFR-1阻断抗体MF1还证实与小鼠(图32B)但不与人VEGFR-1(图32A)结合具有种间特异性。
实施例3： 在VEGFR-1表达细胞中抗VEGFR-1抗体与天然 VEGFR-1结合
a. 流式细胞术分析
从分会合培养物中收获等分为106的PAE-VEGFR-1细胞，与抗VEGFR-1抗体克隆6F9、13G12、F11和18F1一起在含有1％牛血清白蛋白(BSA)和0.02％叠氮化钠的PBS(染色缓冲液)中冰上孵育1小时。从分会合培养物中收获等分为106的DU4475人乳腺癌细胞，与抗VEGFR-1抗体克隆18F1在含有1％牛血清白蛋白(BSA)和0.02％叠氮化钠的PBS(染色缓冲液)中冰上孵育1小时。用匹配的IgG同种型(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)作为阴性对照。细胞用流动缓冲液洗涤两次，然后与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗人IgG抗体(BioSource International，Camarillo，CA)在染色缓冲液中冰上孵育30分钟。细胞按上述方法洗涤，并在Epics XL流式细胞仪(Beckman-Coulter，Hialeah，FL)中进行分析。根据前向和侧向光散射，从分析中剔除死细胞和碎片。以平均对数荧光乘以阳性群体的百分数计算平均荧光强度单位(mean fluorescent intensity units(MFRJ))。
图7表示克隆6F9、13G12、15F11和18F1与PAE-VEGFR-1表达细胞的结合反应性。图8A和图8B分别表示克隆18F1与PAE-VEGFR-1表达细胞和DU4475人乳腺癌的结合反应性。这些结果表明人抗VEGFR-1抗体与细胞表面表达的天然VEGFR-1结合。
b. 表面VEGFR-1阻断试验
用PAE-VEGFR-1表达细胞在细胞表面进行125I-VEGF与VEGFR-1的结合。细胞在未包被的塑料细胞培养板中生长，发现非特异性结合降低，但却不影响125I-VEGF的特异性结合。汇合细胞在无血清和无生长补充剂的Dulbecco′s Modified Eagle培养基(DMEM)/F-12培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中培养24小时。细胞用冰冷的含有0.025M HEPES和1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的DMEM/F-12培养基漂洗一次。将连续稀释的抗VEGFR-1抗体18F1或冷的VEGF以超过标记的VEGF200倍的摩尔浓度加到板的各孔中，于4℃下孵育1小时。洗涤后，加入浓度为2ng/ml的125I-VEGF，在台式振荡器中于4℃下孵育2小时。细胞用含有1mg/ml BSA和0.25mM CaCl2的PBS洗涤三次，在1％Triton X-100、1mg/ml BSA和0.16％NaN3存在下孵育5分钟，以除去结合的VEGF。用γ计数器对各孔可溶物含量计数。在至少三次独立试验中，按一式三份进行试验，用Prism GraphPad软件3.03分析数据。
图9表示抗VEGFR-1抗体18F1极强的阻断活性，18F1显著地阻止天然VEGFR-1与猪主动脉内皮细胞上的125I-VEGF结合。
实施例4： 抗VEGFR-1抗体在响应VEGF和PlGF时，抑制VEGFR-1 的自身磷酸化及MAPK和Akt的活化
a. VEGFR-1磷酸化试验
VEGFR-1的自身磷酸化是由其配体诱导的，所产生的典型MAPK、胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)和PBK/Atk下游信号传导途径的活化，介导细胞生物应答，例如增殖、移动、存活与分化。用PAE-VEGFR-1转染细胞和BT474乳腺癌细胞，测定抗VEGFR-1抗体抑制VEGFR-1磷酸化和ERK1/2和Akt激酶下游信号活化的能力。
将密度5×105/孔的PAE-VEGFR-1和BT474细胞接种到100mm2或150mm2板上，无血清培养基中培养18-48小时。更换培养基后，细胞用抗VEGFR-1抗体克隆6F9、15F11和18F1或同种型对照于37℃处理1小时，然后与50ng/ml VEGF或100ng/ml PlGF一起孵育10分钟。处理后，用裂解缓冲液[20mM HEPES(pH7.4)、10mM MgCl2、2mM MnCl2、0.05％Triton X-100和1mM DTT]分离出细胞总蛋白提取物，与抗VEGFR-1抗体(C-17，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)进行免疫沉淀。用抗磷酸-激酶抗体(PY-20，Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA)检测磷酸化VEGFR-1的蛋白质印迹。蛋白质用生电化学发光***(electrogenerated chemiluminescencesystem(ECL))(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)检测，并用NIH Image(National Institute of Mental Health，Bethesda，MD)通过光密度测定法进行定量。
b. 体外激酶试验
为了评价MAPK和Akt磷酸化，将密度5×105/孔的BT474细胞接种到12孔板中，无血清条件下处理18小时。37℃下，细胞用抗VEGFR-1抗体克隆18F1或同种型对照处理1小时，然后与50ng/mlVEGF或100ng/ml PlGF一起孵育5-10分钟。裂解细胞，分离蛋白质，并进行电印迹。膜与浓度1μg/ml的抗磷酸化p44/p42 MAP激酶(Thr202/Tyr204，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)抗体或抗磷酸化Akt(Ser473，Cell Signaling Technology，Beverly，MA)抗体孵育，之后与第二IgG-HRP(1∶5000)孵育。为了确保装载样品的量相同，将膜剥离并用抗p44/p42抗体(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)或抗Akt抗体(Cell Signaling Technology，Beverly，MA)再次探测。
c. 结果
如图10-14所示，在PAE-VEGFR-1转染细胞和BT474乳腺癌细胞中，通过VEGF和P1GF刺激，诱导VEGFR-1显著的磷酸化和ERK1/2和Akt信号的活化，这提示在乳腺癌细胞和内皮细胞两种细胞中VEGFR-1和受体相关下游激酶信号传导途径的内在活性。分别如图10和图11所示，在PAE-VEGFR-1转染细胞和BT474乳腺癌细胞中，与未处理对照相比，用抗VEGFR-1抗体18F1处理显著减少PlGF或VEGF刺激的VEGFR-1的磷酸化。分别如图12和图13所示，在PAE-VEGFR-1转染细胞中，用抗VEGFR-1抗体15F11和6F9处理，也显著地抑制PlGF和VEGF诱导通过PlGF和VEGF诱导的ERK1/2下游信号的活化。在乳腺癌中，Akt蛋白激酶的活化是介导细胞存活的重要胞内信号活动。分别如图14A和图14B所示，在PAE-VEGFR-1转染细胞中，用抗VEGFR-1抗体18F1处理显著地抑制PlGF或VEGF诱导通过PlGF和VEGF诱导的ERK1/2下游信号的活化。
如图15所示，在BT474乳腺癌细胞中，抗VEGFR-1抗体18F1显著地阻断PlGF刺激的Akt磷酸化。这些结果证实，在乳腺癌细胞和内皮细胞两种细胞中，用抗VEGFR-1抗体处理有效地抑制VEGFR-1和下游信号激酶途径的活化。
实施例5： 抗VEGFR-1抗体阻断乳腺肿瘤细胞的体外生长
肿瘤缺氧与恶性进程加快、侵袭性增强和化疗药物抵抗加强有关。缺氧肿瘤细胞经历通过增量调节包括VEGFR-1在内的各种基因表达，激活存活与增殖信号传导途径的生物应答(Harris AL.Nat RevCancer.2：38-47，2002)。
细胞生长试验
将密度5×103/孔的DU4475癌细胞接种到96孔板中，无血清条件处理18小时，在某些情况下，用100nM去铁胺再处理5小时。在50ng/ml VEGF或200ng/ml PlGF存在下，使细胞与各剂量为3μg/ml、10μg/ml和30μg/ml的抗VEGFR-1抗体克隆6F9、13G12、15F11和18F1孵育48小时，测定抗VEGFR-1抗体对肿瘤细胞生长的抑制作用。然后活细胞用Coulter细胞计数器(Coulter Electronics Ltd.Luton，Beds，England)计数，重复三次。每个实验按一式三份进行。
拟缺氧药物去铁胺预处理的DU4475肿瘤细胞的生长速率，在应答VEGF或PlGF的刺激时增加约2倍。分别如图16和图17所示，用抗VEGFR-1抗体处理，以剂量反应方式有效减少VEGF和P1GF刺激的DU4475乳腺癌细胞的增殖。图18A和图18B各自以抗体克隆18F1的抗体浓度对VEGF和P1GF刺激的DU4475乳腺癌细胞增殖的细胞计数绘制曲线。表6概括了IC50值所表示的抗VEGFR-1抗体对P1GF诱导的DU4475细胞体外生长的抑制。
  表6-PlGF诱导的DU4475细胞体外生长的抑制
  克隆     体外细胞生长
  6F9     IC50：43nM
  13G12     IC50：66nM
  15F11     IC50：44nM
  18F1     IC50：24nM
实施例6A： 抗VEGFR-1抗体抑制乳腺肿瘤异种移植物的生长人乳腺癌异种移植物的治疗
在人异种移植乳腺肿瘤模型中，测试人抗VEGFR-1抗体的抗肿瘤功效。
在无胸腺裸小鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)左胁部位，皮下注射在基质胶(Matrigel)(Collaborative ResearchBiochemicals，Bedford，MA)中混合的2×106DU4475细胞或5×106MDA-MB-231细胞和MDA-MB-435细胞。在DU4475和MDA-MB-231模型中，肿瘤生长至约200mm3大小时，将小鼠随机分组，每组12-16只动物。腹膜内给予动物剂量为0.5mg(MDA-MB-231)或1mg(DU4475)的抗VEGFR-1抗体克隆6F9、15F11或18F1，每周三次。在MDA-MB-435模型中，将肿瘤细胞移植到小鼠***脂垫皮下部位。肿瘤生长达约200mm3大小时，将小鼠随机分组，每组15只动物，腹膜内给予18F1抗体0.5mg/剂，每周三次。给予对照组的小鼠等量的盐水溶液。在实验过程中继续治疗动物。肿瘤用测径器测量，每周两次。运用公式[π/6(w1×w2×w2)]计算肿瘤体积，其中“w1”表示肿瘤最大直径，“w2”表示肿瘤最小直径。
如图19A和19B所示，每周三次，以1mg/剂的剂量***给予抗VEGFR-1抗体6F9、15F11、13G12和18F1，导致DU4475异种移植肿瘤的生长在统计学上呈显著抑制(p＜0.05)。分别如图20A、图20B和图20C所示，每周三次，以0.5mg/剂或1mg/剂的剂量，***给予抗VEGFR-1抗体18F1，导致DU4475、MDA-MB-231、MDA-MB-435异种移植的肿瘤生长在统计学上呈显著抑制(ANOVA p＜0.05)。如图21A和图21B所示，每周两次，以20mg/kg或40mg/kg的剂量，用抑制癌细胞生长的抗人VEGFR-1抗体克隆18F1及抑制肿瘤血管生成的抗小鼠VEGFR-1克隆MF1治疗，在DU4475和MDA-MB-231异种移植模型中，与单用一种抗体治疗相比，更强地抑制肿瘤生长(P＜0.05)。这些结果表明，在异种移植模型中，通过抗VEGFR-1抗体，阻断VEGFR-1直接促进癌细胞生长和调节肿瘤血管形成的体内功能，有效地抑制VEGFR-1阳性乳腺肿瘤的生长。
实施例6B： 抗人抗VEGFR-1抗体阻断乳腺癌细胞的体外生长
将DU4475癌细胞(2×104/孔)接种到24孔板中，无血清条件下处理18小时。然后，用拟缺氧药物去铁胺(Sigma)再处理6小时。将连续稀释的抗人VEGFR-1抗体18F1加入板中，一式三份，在50ng/mlVEGF-A(R&D Systems)或200ng/ml PlGF存在下孵育48小时。用Coulter细胞计数器(Coulter Electronics Ltd.，England)测定各孔的细胞总数(固定和悬浮中的细胞)。
IMC-18F1处理显著地阻断VEGF-A和PlGF刺激的DU4475乳腺癌细胞的增殖(分别见图31A和图31B，估计IC50：30-50nM)。同种型对照抗体对细胞增殖无作用。因此，18F1抑制VEGFR-1配体诱导的对肿瘤细胞增殖/存活的促进作用。
实施例7： 抗VEGFR-1抗体抑制VEGF-A和VEGF-R刺激的结肠 癌细胞的集落形成
将含有10％FBS和1％琼脂糖(Cambrex Corporation，EastRutherford，NJ)的1ml DMEM培养基加入6孔板各孔中。无血清培养基中的HT-29人结肠癌细胞用66nM 18F1或对照IgG处理1小时，之后再用10ng/ml VEGF-A或50ng/ml VEGF-B处理4小时。处理细胞与含有0.5％琼脂糖和合适的抗体和/或配体的1ml10％FBS DMEM混合。将该悬液1ml(含有250个细胞)，接种到各孔1％琼脂糖底层的上部。2天后，加入另含有抗体和/或配体的培养基到各孔以使琼脂糖保持水化。使细胞在37℃下生长14天。然后，用解剖显微镜对直径大于50μm的集落计数。用InStat Statistical软件(V2.03，GraphPadSoftware，San Diego，CA)进行统计分析。
与仅有完全培养基的未处理细胞相比，用VEGF-A或VEGF-B处理的细胞各孔中，集落的数目和大小显著增加。如图22所示，与不存在配体刺激的基础活性相比，18F1处理完全抑制配体诱导的集落形成(p＜0.03)(图22)。因此，对于贴壁和非贴壁两种细胞，18F1具有抑制肿瘤细胞存活与生长的能力。
实施例8： 抗VEGFR-1抗体抑制VEGF-A和VEGF-B诱导的结肠 癌细胞的迁移与侵袭
将HT-29细胞(2.5×104)或SW480细胞(1.5×104)在含有1％FBS的培养基中，与24孔MATRIGELTM(Becton Dickinson Labware，Bedford，MA)包被(HT-29)或未包被(SW480)的膜插头(孔径为8.0μm)上表面的抗VEGFR-1抗体18F1(66nM)一起孵育。将插头***含有10ng/ml VEGF-A(R&D Systems)或50ng/ml VEGF-B(R&D Systems)的下室(lower chambers)中48小时。用棉签除去保留在插头上室中的细胞。迁移到插头内部的细胞用Diff-Quik(Harleco，Gibbstown，NJ)染色，放大100 X对10个随机视野计数。用InStat Statistical软件(V2.03，GraphPad Software，San Diego，CA)进行统计分析。
如图23A和图23B所示，VEGF-A或VEGF-B诱导HT-29细胞穿过未包被膜向配体迁移。如图24A和图24B所示，这些配体还诱导SW480细胞穿过MATRIGELTM包被膜的侵袭。与不存在配体刺激的基础活性相比，18F1完全阻断VEGFR-1配体诱导的迁移和侵袭(p＜0.05，图23和图24)。因此，除了对肿瘤细胞增殖与存活的负面作用外，18F1还提供抑制肿瘤细胞侵袭及紧随其后的转移的方法。
实施例9： 用抗VEGFR-1特异性抗体治疗抑制表达VEGFR-1的人 异种移植肿瘤的体内生长
雌性无胸腺nu/nu小鼠，6-8周龄，在背侧表面皮下注射培养基中含有人肿瘤细胞系、用MATRIGELTM(BD Biosciences)1∶1稀释的悬液，体积为0.4ml。用于异种移植模型中的细胞系(细胞剂量在括号中表示(106细胞/小鼠))是：人结肠癌细胞系DLD-1(5)、GEO(5)和HT-29(5)；人乳腺癌细胞系DU4475(2)、MDA-MB-231(5)、MDA-MB-435(5)和BT474(5)。当肿瘤生长至约200-300mm3时，小鼠按肿瘤大小随机分成治疗组。评价肿瘤生长，约每周两次，肿瘤体积以π/6*(长度*宽度2)计算，其中长度＝最长直径，宽度＝垂直于长度的直径。用测径器测量肿瘤尺寸。根据100*(最终***体积/最初***体积)/(最终对照肿瘤体积/最初对照肿瘤体积)，计算出T/C％。
18F1用0.9％USP盐水(Braun)或磷酸缓冲盐溶液(PBS)稀释，每只小鼠腹膜内给予0.5ml体积。用重复测量方差分析(repeated measuresanalysis of variance(RM ANOVA))，分析治疗对肿瘤生长的作用，p＜0.05视为显著。
如图25所示，腹膜内给予18F1显著(p＜0.05)抑制DU4475(图25A)、MDA-MB-231和MDA-MB-435(图25B)异种移植肿瘤的生长。如图26所示，还观测到18F1单一疗法针对HT-29(图26A)、DLD-1(图26B)和GEO(图26C)结肠癌异种移植有显著的抗肿瘤作用。这些结果表明阻断人VEGFR-1，有效地抑制用表达VEGFR-1的人肿瘤细胞系建立的异种移植肿瘤的生长。
实施例10： 抗人VEGFR-1处理抑制增殖与存活途径的体内信号并 诱导肿瘤细胞凋亡
石蜡包埋的MDA-MB-231异种移植物用免疫组织化学法评价肿瘤细胞增殖、存活与凋亡的标记。增殖与存活的标记包括Ki-67(兔pAb；Lab Vision Corporation，Fremont，CA)、磷酸特异性p44/42 MAPK(Thr202/Tyr204)(兔pAb；Cell Signaling Technology)和磷酸特异性Akt(Ser473)(兔pAb；Cell Signaling Technology)。按试剂盒说明书，对于兔抗体(DAKO Cytomation，Carpenteria，CA)使用EnVision+System，以3，3′-二氨基联苯胺(DAB)为色原。经在Mayer苏木精的短暂对比染色后，使所有切片脱水，透明，用永久封固剂封盖玻片。按照试剂盒说明书，肿瘤细胞凋亡通过TUNEL试验用ApopTag过氧化物酶原位细胞凋亡检测试剂盒(Chemicon，Temecula，CA)进行评价。染色切片用Gelmount(Biomeda，Foster City，CA)封盖玻片。用配置Axiocam数码照相机(Carl Zeiss，Germany)的Axioskop光学显微镜，对阳性免疫染色和TUNEL阳性免疫荧光进行分析并拍照。
如图27所示，用20mg/kg(雌性nu/nu无胸腺小鼠约0.5mg/剂)的18F1，2次/周，治疗14天后，增殖细胞标记(Ki-67)显著减少(研究编号3067-04)。另外，18F1治疗导致在这一时间点上MAPK活化显著减少(图27)。用18F1(0.5mg/剂，M-W-F)治疗1周后，在MDA-MB-231异种移植肿瘤中还检测到通过TUNEL阳性事件测量的细胞凋亡(图27)增加及Akt磷酸化显著减少。
实施例11： 体内阻断人和鼠VEGFR-1导致针对人乳腺癌异种移植 物更好的抗肿瘤活性
18F1与抗小鼠VEGFR-1抗体MF1联用。18F1用0.9％USP盐水(Braun)或磷酸缓冲盐溶液(PBS)稀释，腹膜内给予每只小鼠0.5ml体积。用重复测量方差分析(RM ANOVA)，分析治疗对肿瘤生长的作用，p＜0.05视为显著。如图28所示，在MDA-MB-231(图28A)和DU4475(图28B)异种移植模型中，18F1抑制表达人VEGFR-1的肿瘤，MF1抑制表达内源小鼠VEGFR-1的肿瘤，导致显著的肿瘤生长抑制(p＜0.05)。MF1曾显示通过减少肿瘤血管生成从而抑制肿瘤生长。18F1与MF1联用导致比单一疗法更为显著的肿瘤生长抑制(p＜0.05)。18F1+MF1联合治疗与体重减轻无关。这些数据支持用18F1治疗患者，双重抑制肿瘤血管发生及肿瘤细胞的增殖与存活。
实施例12： 抗VEGFR-1抗体与化疗联用
在MDA-MB-231模型中，18F1+MF1与细胞毒素疗法(5-氟尿嘧啶、亚叶酸和紫杉醇)联用。18F1用0.9％USP盐水(Braun)或磷酸缓冲盐溶液(PBS)稀释。每只小鼠以恒定剂量给予抗体治疗，每只小鼠给予0.5ml体积。所给予的抗体和细胞毒素治疗的剂量与体重成比例，为10μl体积/克体重。5-氟尿嘧啶与亚叶酸(5-FU/LV)分别用USP盐水稀释，并分别给予。紫杉醇或用5％苯甲醇(Sigma)、5％聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL(Sigma))和90％USP盐水制备，或用5％乙醇(Sigma)、5％聚氧乙烯蓖麻油和90％USP盐水制备。将环磷酰胺和多柔比星溶于USP盐水中以备给药。腹膜内给予AU治疗。用重复测量方差分析(RM ANOVA)，分析治疗对肿瘤生长的作用，p＜0.05视为显著。
如图29所示，在MDA-MB-231模型中，在将18F1+MF1加入活性剂量的环磷酰胺治疗中，显著增加抗肿瘤的效果。如图30所示，当以具体剂量水平给予5-FU/LV和多柔比星化疗时，18F1+MF1增加这两种化疗药的抗肿瘤效果。
在DU4475异种移植模型中，当IMC-18F1+MF1与5-FU/LV、多柔比星和紫杉醇联用时，有活性(较低T/C％)增强的趋势，尽管与IMC-18F1+MF1单用，或者与细胞毒药物单一疗法相比，效果未达到统计学显著性。在MDA-MB-231中，对于多柔比星同样如此，虽然与5-FU/LV和紫杉醇联用，但是无活性增强的趋势。缺少相加作用可能是因为5-FU/LV和紫杉醇作为单一疗法在所选择的剂量水平上作用最小。在MDA-MB-435模型中(T/C％＝51)，与IMC-18F1+MF1单用(T/C％＝60)或环磷酰胺单一疗法(T/C％＝65)相比，与环磷酰胺联用也增加活性，尽管这些差异未达到统计学显著性。在相同研究中对于多柔比星和紫杉醇也是如此。与上述MDA-MB-231和MDA-MB-435的数据类似，在DU4475异种移植模型中，BVIC-18F1、MF1和环磷酰胺联用，与仅抗体或细胞毒素治疗相比，显示抗肿瘤活性增强，尽管该趋势未达到统计学上的显著性。
统计分析
运用学生氏检验(Student′s t test)和SigmaStat统计分析包(2.03版；Jandel Scientific，San Rafael，CA)，对肿瘤体积和体外肿瘤细胞生长进行分析。方差p＜0.05视为有统计学显著性。
实施例13： 抗VEGFR-1抗体VH/VL区的克隆和测序
用Fast-Track试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)，从杂交瘤细胞中分离出Poly(A+)mRNA，该杂交瘤细胞产生从VEGFR-1免疫KM小鼠获得的克隆6F9、13G12、15F11和18F1。之后，用Clontech试剂盒通过聚合酶链式反应(PCR)产生随机引物cDNA。引物(正向：5′-ATGGAGTTTGGGCTGAGCTG和反向：3′-TGCCAGGGGGAAGACCGATGG)和(正向：5′-ATG GAA ACC CCAGCG CAG CTT CTC和反向：3′-CGGGAAGATGAAGACAGATG)分别用于与重链可变区和κ轻链可变区结合。用上述引物，通过对由poly(A+)RNA产生的PCR产物直接测序，获得来自杂交瘤的人免疫球蛋白衍生的重链和κ链转录物的序列。用TA克隆试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)，将PCR产物克隆到pCR2.1，两条链用Prism dye-terminator测序试剂盒和ABI3730测序仪(GENEWIZ，NorthBrunswick，NJ)测序。用DNASTAR软件，通过与Kataman抗体序列程序比对，对所有序列进行分析。
上表2表示抗VEGFR-1抗体克隆6F9、13G12、15F11和18F1轻链和重链可变区的氨基酸序列。下划线部分表示CDR1、CDR2和CDR3区的序列。上表3表示克隆6F9、13G12、15F11和18F1编码重链和轻链可变区的cDNA的核苷酸序列。
实施例14： 人IgG1抗VEGFR-1抗体的工程改造与表达
编码抗VEGFR-1抗体克隆6F9、13G12、15F11和18F1重链和轻链可变区的DNA序列，通过PCR克隆到表达载体进行增殖。在载体pEEó.l(Lonza Biologies pic，Slough，Berkshire，UK)中，重链可变区与人免疫球蛋白重链γ恒定区符合读框地融合。将整条人轻链cDNA直接克隆到载体pEE12.1(Lonza Biologies PLC，Slough，Berkshire，UK)上。通过电穿孔，将工程免疫球蛋白表达载体稳定地转染至NSO骨髓瘤细胞中，在谷氨酰胺合成酶选择培养基中进行选择。通过抗Fc和VEGFR-1特异性结合ELISA，筛选用于抗体表达的稳定克隆。将阳性克隆在无血清培养基中扩增，在转瓶(spinner flask)或生物反应器中培养达两周时间，以产生抗体。全长IgG1抗体通过蛋白A亲和层析(Poros A，PerSeptive Biosystems Inc.，Foster City，CA)纯化，并洗脱至中性缓冲盐水溶液中。
上面的说明书和实施例仅用来说明本发明，而不是对本发明的限制。本发明各个公开的方面和实施方案可以独立加以考虑，或者可与本发明的其它方面、实施方案和变动相结合。另外，除非另有说明，否则本发明方法中没有一个步骤受任何具体实施顺序的限制。本领域技术人员可能对已公开的包含本发明精神和实质的实施方案作出修改，这些修改也落入本发明的范围内。此外，所有引用的参考文献都通过引用它们的全文作为参考。

Claims (17)

1.一种与VEGFR-1特异性结合的分离的人单克隆抗体或其片段，所述抗体或其片段包含SEQ ID NO：2的轻链互补决定区-2(CDR2)和SEQ ID NO：3的轻链CDR3。
2.权利要求1的抗体或其片段，所述抗体或其片段还包含具有以下序列的轻链CDR1区：
RASQSX1SSSYLA3
其中X1为V或G。
3.权利要求1的抗体或其片段，所述抗体或其片段还包含具有以下序列的重链CDR1：
GFX2FSSYGMH，
其中X2为T或A。
4.权利要求1的抗体或其片段，所述抗体或其片段还包含具有以下序列的重链CDR2：
VIWX3DGSNKYYADSVX4G，
其中X3为Y或F，X4为K或R。
5.权利要求1的抗体或其片段，所述抗体或其片段还包含具有以下序列的重链CDR3：
DHX5GSGX6HX7YX8YYGX9DV
其中X5为F或Y；X6为A或V；X7为Y、S或H；X8为Y或F；X9为M或L。
6.一种抗体或其片段，所述抗体或其片段包含(i)选自SEQ IDNO：14、15和16的轻链可变区，或(ii)选自SEQ ID NO：17、18、19和20的重链可变区。
7.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码权利要求1的抗体或其片段的核苷酸序列。
8.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27，所述核苷酸序列编码与VEGFR-1特异性结合的抗体或其片段。
9.一种表达载体，所述载体包含与表达序列连接的权利要求7的多核苷酸序列。
10.一种重组宿主细胞，所述细胞包含权利要求9的表达载体。
11.权利要求10的重组宿主细胞或其子代，其中所述细胞表达权利要求7的抗体或其片段。
12.一种产生抗体或其片段的方法，该方法包括在允许权利要求7的抗体或其片段表达的条件下，培养权利要求10的细胞。
13.一种调节哺乳动物VEGFR-1活性的方法，该方法包括给予哺乳动物有效量的权利要求1的抗体或其片段。
14.一种抑制哺乳动物血管生成的方法，该方法包括给予哺乳动物有效量的权利要求1的抗体或其片段。
15.一种减缓哺乳动物肿瘤生长的方法，该方法包括给予哺乳动物有效量的权利要求1的抗体或其片段。
16.权利要求15的方法，其中该方法还包括给予抗肿瘤药物或抗肿瘤治疗。
17.权利要求15的方法，其中所述肿瘤是乳腺肿瘤。
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