CN101087805A - Fsh的纯化方法 - Google Patents

Fsh的纯化方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101087805A
CN101087805A CNA2005800375919A CN200580037591A CN101087805A CN 101087805 A CN101087805 A CN 101087805A CN A2005800375919 A CNA2005800375919 A CN A2005800375919A CN 200580037591 A CN200580037591 A CN 200580037591A CN 101087805 A CN101087805 A CN 101087805A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fsh
chromatography
anion
arbitrary
resin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA2005800375919A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101087805B (zh
Inventor
P·瓦拉克斯
P·温格
A·斯坦利
L·德勒格兰吉
L·卡珀尼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ares Trading SA
Original Assignee
Ares Trading SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ares Trading SA filed Critical Ares Trading SA
Publication of CN101087805A publication Critical patent/CN101087805A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101087805B publication Critical patent/CN101087805B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/24—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g. HCG; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Fluid-Pressure Circuits (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Fats And Perfumes (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Manufacturing Of Electric Cables (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)

Abstract

本发明涉及起始材料为未加工的FSH的重组人FSH或FSH变异体的一种纯化方法，其包括以下步骤：1.染料亲和层析；2.疏水作用层析；和3.反相层析。

Description

FSH的纯化方法
技术领域
本发明涉及促卵泡激素(FSH)的纯化领域。
技术背景
促卵泡激素(FSH)是一种属于***类的可注射的蛋白质。FSH用于女性和男性病人的***和生殖紊乱的治疗。
天然状态下，FSH产生于垂体腺。作为药用，FSH可以重组产生(rFSH)，或者可以从绝经后的妇女尿中分离得到(uFSH)。
FSH用于女性病人在辅助生殖技术(ART)中诱导***(OI)和控制性超***(COH)。在一典型的诱导***治疗疗程中，病人在大约6到12天内每天给予FSH或其变异体注射(大约75到300IU FSH/日)。在一种典型的控制性超***治疗疗程中，病人在大约6到12天内每天给予FSH或其变异体注射(大约150-600IU FSH/日)。
FSH也用于诱导***减少的男性病人的***产生。在***分泌不足的性腺机能减退的男性病人中，用150IU FSH每周3次并结合2,500IU hCG每周两次的疗程已经成功地使***数量得以提高[Burgues等人；Subcutaneous self-administration of highlypurified follicle stimulating hormone and human chorionicgonadotrophin for the treatment of male hypogonadotrophichypogonadism. Spanish Collaborative Group on MaleHypogonadotrophic Hypogonadism；Hum.Reprod.；1997，12，980-6]。
因为FSH在治疗生殖紊乱中的重要性，所以最好提供高纯度和高比活性的FSH。FSH治疗需要重复注射。高度纯化的FSH制剂可以皮下给药，病人也可以自己给药，因此大大方便和依从了病人。
Lynch等人所述为一种人垂体FSH的纯化方法[The extraction andpurification of human pituitary follicle-stimulating hormone andluteinising hormone；Acta Endocrinologica，1988，288，12-19]。该方法包括阴离子和阳离子交换层析、免疫亲和提取以及尺寸排阻层析。该方法所得垂体FSH的比活性为4,990(免疫测定)IU/mg，包括16IU/mgLH在内。用干重或于溶液中在280nm的光谱下吸收来测定蛋白质含量(假定A280 1cm时1g/l等于1)。
WO 98/20039(IBSA Institut Biochimique SA)叙述一种人尿FSH纯化方法，原材料为尿提取物，也称为人绝经期***(hMG)。该方法用DEAE型的弱碱性阴离子交换树脂进行离子交换层析，然后在有一蒽醌衍生物作为配体的树脂上进行亲和层析。据称，该方法得到的尿FSH不含LH，其比活性为6,870(免疫测定)IU/mg。假定1mg/ml蛋白质水溶液在277nm时光密度为0.62的情况下，在路径长度为1cm的石英比色管中测定蛋白质含量。
WO 00/63248(Instituto Massone SA)叙述一种人尿中包括的FSH的***纯化方法。该方法包括以下步骤：一强阳离子烃基硫酸型树脂的离子交换层析、一强阴离子树脂的离子交换层析以及疏水作用层析(HIC)。据报道，所得的FSH制剂的比活性为8,400IU/mg(Steelman-Pohley method：Assay of the follicle stimulatinghormone based on the augmentation with human chorionicgonadotrophin； Endocrinology；1953，53，604-616)和每75IU FSH少于1 IU LH生物活性(rat semihal vesicle weight gain method：VanHell H，Matthijsen R&GA Overbeek；Acta Endocrinol，1964，47，409)。用Lowry方法测定蛋白质含量[O.H.Lowry et al.，J.Biol.Chem.，1951，193，265]。
US 5,990,288(Musick等人)叙述一种生物样品中的FSH的纯化方法，如人垂体腺或人绝经后的尿。该方法采用在Fractogel EMDSO3-650M上的阳离子交换层析，然后在Mimetic orange 1树脂上的染料亲和层析，最后在Bakerbond Wide Pore HI-Propyl树脂上的疏水作用层析。据称，该方法所得人垂体FSH的比活性为7,066 IU(免疫测定)/mg和LH少于1 IU(免疫测定)/mg，以及尿FSH的比活性为6,298IU(免疫测定)/mg和LH少于3 IU(免疫测定)/mg。蛋白质含量用吸收光谱法在280nm测定(假定A280 1cm时1g/l等于1)。
Chiba等人[Isolation and partial characterisation of LH，FSHand TSH from canine pituitary gland；Endocrinol.J.，1997，44，205-218]叙述一种包括FSH的犬垂体***纯化技术，该纯化技术采用伴刀豆球蛋白(Con)A亲和层析、疏水作用层析(HIC)和Cu++固定金属离子层析。据报道，用FSH放射性受体测定方法测定生物活性和用BioRad蛋白质试剂盒(BioRad Laboratories CA USA)测定蛋白质含量，所得到的FSH的比活性为2.17IU/g蛋白质。
WO 88/10270(Instituto di Ricerca Cesare Serono SPA)叙述一种人尿中的FSH的纯化方法。该方法包括免疫层析，采用以双乙烯砜与Sepharose 4B结合的FSH-特异的固定单克隆抗体，然后进行反相HPLC。所得到的FSH不含LH和其他尿蛋白，并比活性为6,200 IU/mg(冻干粉末)(Steelman-Pohley方法)。该制剂为首次的FSH制剂，因其高纯度，而适合皮下注射。
因此需要开发新的FSH或FSH变异体的纯化方法。具体地说，需要避免使用成本高的免疫亲和层析步骤的纯化方法。
发明简述
本发明的目的是提供一种重组FSH或重组FSH变异体纯化新方法。
本发明首先提供了一种起始材料为含有未加工FSH的液体的重组人FSH或FSH变异体的纯化方法，其包括以下步骤：
(1)染料亲和层析；
(2)疏水作用层析，和；
(3)反相层析；
可以以任何顺序进行。
附图简述
图1所示为本发明，也就是包括以下步骤的纯化方法：
●染料亲和层析，
●疏水作用层析，
●反相层析，
图2所示为本发明的一特定实施例，也就是包括以下步骤的纯化方法流程图：
●超滤/渗滤，
●阴离子交换层析，
●染料亲和层析，
●疏水作用层析，
●反相层析，
●阴离子交换层析，
●纳米过滤，
●超滤/渗滤；
缩写：
本发明的描述中采用以下缩写：
DF：渗滤
FSH：促卵泡激素；
r-FSH：重组促卵泡激素；
hFSH：人促卵泡激素；
r-hFSH：重组人促卵泡激素
BV：柱床体积
DEAE：二乙基氨基乙基
ELISA：酶联免疫测定
DAC：染料亲和层析
IMAC：固定金属离子层析
OD：光密度
HIC：疏水作用层析
HPLC：高效液相层析
IRMA：免疫放射测定
KD或kD：千道尔顿
HCP：宿主细胞蛋白，用于表达FSH的宿主细胞蛋白
IPC：过程控制中
IEF：等电聚焦
PES：聚醚砜
RP-HPLC：反相高效液相层析
Q FF：在Q琼脂糖凝胶FF上的阴离子交换
RT：室温
UF：超滤
WFI：注射用水
发明详述
本发明提供了一种起始材料为含有未加工FSH的液体的重组人FSH或FSH变异体的纯化方法，所述的方法包括以下步骤：
(1)染料亲和层析；
(2)疏水作用层析；和
(3)反相层析；
以上步骤可按任何顺序进行。
本发明的纯化方法可以得到高纯度的重组FSH料，其可配制成最后的药物，如Gonal-F(Serono)。它有不用免疫亲和层析得到高纯度的产物的优点。作为本发明，纯化的起始材料未加工的FSH在于含有重组FSH的细胞培养的收获物。
在一较佳实施例，在根据本发明的纯化方法的一些或全部步骤中包括抗氧化剂或游离氨基酸或具有抗氧化和净化作用的二肽。更精确地说，抗氧化剂存在于用于纯化和/或浓缩和/或过滤rhFSH的任何缓冲液中。抗氧化剂防止过程中FSH氧化。较佳的抗氧化剂是L-蛋氨酸。所用的L-蛋氨酸浓度较佳为或大约10-100mM。抗氧化剂的其他例子包括t-丁基-4-甲氧基-酚、2，6-二(1，1-二甲基乙基)-4-甲基酚；双偏亚硫酸氢钾或钠、重亚硫酸钠。游离氨基酸和有抗氧化和净化作用的二肽的例子是组氨酸、氨基乙磺酸、甘氨酸、丙氨酸、肌肽、鹅肌肽、1-甲基组氨酸或其组合物。
通常首先净化起始材料，然后并选择地在第一层析步骤收集之前浓缩(如，用超滤)和/或缓冲液交换(如，通过一渗滤步骤)。
在层析步骤中，可用聚合物基和琼脂糖基的树脂。也可以用膜层析，其中树脂用功能化膜取代。
本发明的3个纯化步骤(也就是染料亲和层析、疏水作用层析和反相层析)在下文中详细描述。
染料亲和层析步骤(1)
本发明的方法包括染料亲和层析步骤(1)。在一较佳实施例，用具有本领域技术人员公知的染料化合物作为固定化配体的树脂进行染料亲和层析，即汽巴龙蓝F3G-A。术语“固定化”为本领域技术人员所理解，其意为在与树脂作化学连接的意义上衍生该配体。特别优选的树脂是蓝琼脂糖凝胶FF(Amersham Biosciences Inc.)。蓝琼脂糖凝胶FF的技术特征如下：
技术规格
配体 汽巴龙蓝F3G-A
配体连接方法 三嗪连接
连接容量 ＝18mg人血清白蛋白/ml沥干凝胶
基质 高度交联琼脂糖，6％
排阻限(Mr) 4×106
颗粒范围 45-165μm
线性流速* ≈750cm/h
配体密度 ≈7μmol汽巴龙蓝/ml基质
pH稳定性 4-12(长期)，3-13(短期)
化学稳定性 在70％乙醇，1,6M盐酸胍，8M尿素中40℃ 7天
可理解为，该方法也可以用有相似特性的其他树脂。其他树脂包括：Toyopearl AF-blue-hc-650m(Tosoh Bioscience)、Toyopearl SuperButyl550、Toyopearl Phenyl 650、Blue Cellthru BigBead(Sterogene)、SwellGel Blue(Pierce)、汽巴克罗姆蓝3GA-琼脂糖凝胶100(Sigma)、Affi-Gel Blue(BioRad)、Econo-Pac blue cartridges(Bio-Rad)、蓝琼脂糖凝胶HP(Amersham)、汽巴龙蓝3GA(Sigma)。
染料亲和层析的洗脱步骤较佳用磷酸盐缓冲液，特别优选磷酸钠。洗脱液的pH值较佳为大约6.0至11.5，更佳为大约6.5至8，特别优选大约7.0。另外的适当维持pH值为7.0的缓冲液包括如下：MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、ACES、BES、MOPS、TES、HEPES。染料亲和层析的洗脱缓冲液较佳含有一种盐增加传导性，较佳是NaCl。
在一特别优选实施例，在染料亲和层析步骤(平衡、洗涤和洗脱)中接触产物的缓冲液含有抗氧化剂，如L-蛋氨酸。抗氧化剂的其他例子包括t-丁基-甲氧基苯酚、2，6-二(1，1-二甲基乙基)-4-甲基苯酚；双偏亚硫酸氢钾或钠、重亚硫酸钠。
疏水作用层析步骤(2)
所述的方法也包括疏水作用层析(2)。在一较佳实施例中，疏水作用层析用如Toyopearl丁基650M的树脂进行(来自Tosoh Biosep公司)。
可以理解的是，步骤(2)也可以用其他有相似特性的树脂进行。可选择的树脂是：快速苯基琼脂糖凝胶6(low sub)；快速苯基琼脂糖凝胶6(high sub)；快速丁基琼脂糖凝胶4；快速辛基琼脂糖凝胶4；高效苯基琼脂糖凝胶；SOURCE 15ETH；SOURCE 15ISO；SOURCE 15PHE，这些树脂都来自Amersham Biosciences(800)526-3593；(参见www.amershambiosciences.com)。其他树脂还有：Hydrocell C3或C4；Hydrocell Phenyl，来自BioChrom Labs公司(812)234-2558；(参见www.biochrom.com)。
在传导性高的缓冲液中达到HIC树脂的结合，传导性高是通过添加盐获得(例如NaCl、(NH4)2SO4或Na2SO4)。在疏水作用层析步骤中的洗脱较佳降低流动相的传导性(降低盐的浓度)，缓冲液pH值大约在6至8，较佳大约在6.5至7.5，最好大约在7。特别优选的***包括pH值大约为7的磷酸钠缓冲液，以及硫酸铵。其他缓冲液在上文中提及。
在一特别优选实施例，HIC的步骤(2)(平衡、洗涤、洗脱)中接触产物的缓冲液包括抗氧化剂，如L-蛋氨酸，其他抗氧化剂在上文中提及。反相层析步骤(3)
本发明的方法也包括反相层析步骤(RPC)(3)。RPC较佳用如SOURCE 30RPC的树脂进行(来自Amersham Biosciences)。可以理解的是，步骤(3)也可用本领域熟练技术人员公知的有相似特性的其他树脂进行。
层析较佳在弱碱性pH缓冲的流动相进行，例如大约为pH7-8.5，较佳大约为7.5或7.6。在一较佳实施例，缓冲液是醋酸铵。其他适当的pH值大约为7.6的缓冲液包括：BES、MOPS、磷酸盐、TES、HEPES。在这个步骤中用到的缓冲溶液也包括有机调节剂，其浓度在层析步骤(上柱、洗涤、洗脱和再生)的不同相进行调节。在一较佳实施例，有机调节剂是易溶于水的有机溶剂，较佳是醇(如甲醇、乙醇等)。最好是2-丙醇(异丙醇)。
在一特别优选实施例，RPC的步骤(3)(平衡、洗涤、洗脱)中接触产物的缓冲液包括抗氧化剂，如L-蛋氨酸，其他抗氧化剂在上文中提及。可选择的其他纯化步骤0-离子交换层析
除三种主要纯化步骤外—以上略述—本发明还可以包括其他纯化步骤。
在一实施例，本发明的纯化方法包括进行离子交换层析的初步步骤(0)，较佳用强阴离子交换树脂，特别优选季铵树脂，如Q琼脂糖凝胶FF(来自Amersham Biosciences)，其有如下特性：
离子交换类型：强阴离子
总容量(mmol/ml)：0.18-0.25
排阻限(球蛋白)：4×106
颗粒形式：球形，直径45-165μm
颗粒结构：交联琼脂糖，6％
pH操作稳定性：2-12
pH清洗稳定性：1-14
在25℃ 1巴15cm柱床高度，
XK 50/30柱的线性流速：400-700cm/h
另外，所述的离子交换树脂步骤(0)可用如Fractogel EMD TMAEHICAP(来自Merck KGaA，Darmstadt Germany)的树脂，或有如下特性的树脂：
支柱   FractogelEMD TMAE
目录号   1.16887
S-型颗粒大小   20-40μm
层析类型   离子交换层析
功能团   三甲基氨基乙基(Q-型)
单体结构   CH2＝CH-CONH-(CH2)2N+(CH3)3
蛋白结合能力   120mg BSA/ml凝胶
pH稳定性范围   pH2到pH12
pK值   ＞13
洗脱条件   高浓度盐溶液
压力限(柱床：150×10mm)   20巴(压力沿着柱下降)
工作温度   4℃至室温
防腐剂   20％乙醇
即时使用药筒   50-10mm
S-型散装材料   100ml；500ml
线性流速   1.27-6.35cm/min
离子交换层析步骤较佳在弱碱性缓冲液中进行(如，大约7.2到9.0，或大约8.0到9.0，最好大约为8.5)。适合的缓冲液包括，例如，硼酸缓冲液、三乙醇胺/亚氨基二乙酸Tris、醋酸铵、三(羟甲基)甲基甘氨酸、N-二(羟乙基)甘氨酸、TES、HEPES、TAPS。最好是pH值大约为8.5的硼酸钠。通过加入较佳为NaCl的盐以增大流动相的传导性可从离子交换树脂中进行洗脱。在一特别优选的实施例，在离子交换层析(平衡、洗涤、洗脱)中接触产物的缓冲液含有抗氧化剂，较佳是L-蛋氨酸。其他抗氧化剂在上文中提及。
因此在一较佳实施例中，本发明的方法包括如下步骤：
(0)阴离子交换层析，较佳在强阴离子交换树脂上进行，[较佳是季铵树脂，如，Q琼脂糖凝胶FF或Fractogel EMDTMAE]；
(1)染料亲和层析[较佳在蓝琼脂糖凝胶FF上]；
(2)疏水作用层析[较佳在Toyopearl丁基650M上]；
(3)反相层析[较佳在Source 30 RPC上]。
可选择的其他纯化步骤(-1)-超滤/渗滤
在进行离子交换层析(0)之前，可进行超滤步骤，以浓缩未加工的FSH。超滤(或渗滤)较佳用大约为3-10kD，最好是8kD的截止膜。可选择的其他纯化步骤(4)-阴离子交换层析
在另一较佳实施例，本发明的方法还可以包括第二次阴离子交换层析(4)。树脂较佳为Fractogel EMD TMAE HICAP(来自Merck KGaA，Darmstadt Germany)，或有如上文提及的相似特性的树脂。或者第二次阴离子交换层析可在Q琼脂糖凝胶FF或有如上文提及的相似特性的树脂上进行。
阴离子交换层析、染料亲和层析、疏水作用层析(HIC)、反相层析和第二次阴离子交换层析可以以任何顺序进行，尽管较佳先进行阴离子交换层析。剩下染料亲和层析、疏水作用层析(HIC)、RPC和可选择的第二次阴离子交换层析的步骤可以任何顺序进行，尽管较佳以如下顺序进行：
(0)阴离子交换层析，(1)染料亲和层析，(2)疏水作用层析(HIC)，(3)反相层析RPC，和(4)第二次阴离子交换层析。
可选择的其他纯化步骤(5)-超滤/渗滤
在另一较佳实施例，以上层析步骤之后(特别是反相层析步骤之后)，FSH样品经受一浓缩步骤。所述的步骤较佳用超滤结合渗滤得到有所需组合物的散装产物。超滤(或渗滤)较佳用大约为3-10kD，最好是8kD的截止膜。
在一特别优选实施例中，以下步骤以如下顺序进行：
(-1)超滤(较佳选用大约为8kD的截止膜)
(0)阴离子交换层析(较佳为Q琼脂糖凝胶FF柱)；
(1)染料亲和层析(较佳用蓝琼脂糖凝胶FF柱)；
(2)疏水作用层析(HIC)(较佳用丁基650M柱)；
(3)反相层析(RPC)(较佳用Source 30 RPC柱)
(4)阴离子交换层析，强碱性阴离子交换树脂(较佳用TMAEhicap柱)
(5)超滤(较佳用5kD的截止膜)。
可能需要将FSH样品进行纳米过滤，特别是作为病毒清除步骤；也就是说，减少FSH制剂的来自细胞培养中的病毒或类病毒颗粒污染风险。纳米过滤可以在纯化过程中的任何步骤中进行，然而，特别优选在第二次离子交换层析之后，或在反相层析之后或疏水作用层析之后进行纳米过滤。可以进行多于一次的纳米过滤，如进行两次纳米过滤。
在一特别优选实施例中，本发明的方法包括以下步骤：
(-1)超滤(较佳选用大约为8kD的截止膜)
(0)阴离子交换层析(较佳用Q琼脂糖凝胶FF)；
(1)染料亲和层析(较佳用蓝琼脂糖凝胶FF)；
(2)疏水作用层析(HIC)(较佳用丁基650M)；
(3)反相层析(RPC)(较佳用Source 30 RPC)；
(4)阴离子交换层析，强碱性阴离子交换树脂(较佳用TMAEhicap)；
(4’)纳米过滤；
(5)超滤(较佳用5kD的截止膜)。
本发明的优点是纯化方法没有高价免疫亲和层析步骤，提供高纯度高特异生物活性的FSH。还有，本发明的纯化FSH不含因为免疫亲和层析而加入的不需要的杂质(如，从树脂上滤去的免疫球蛋白)。
贮存/冻干法
从如上所述的纯化过程中得到的含有纯化的FSH的液态组合物可以按原来样子冷冻贮存，或者在纯化之后，洗脱物进行冻干(“冷冻-干燥”)，去掉溶剂。  所得到的液体或冻干产品称为“FSH总料”。
FSH配方
本发明的FSH或FSH变异体或根据本发明的方法纯化的FSH或FSH变异体可以制成注射剂，可肌肉注射或皮下注射，较佳皮下注射。FSH配方可以冻干，在这种情况下，在注射之前则要将它溶解在水里作注射。FSH配方也可以是一种液体配方，在这种情况下，不需要任何溶解，可以直接注射。
FSH配方可以是单剂量或多剂量。如果是多剂量，较佳含有抑菌剂，如苯甲醇、间甲酚、百里酚或酚，较佳为苯甲醇或间甲酚。单剂量配方也可以含有一种抑菌剂。
本发明的FSH可以与已知赋形剂和稳定剂一起配制，如蔗糖和甘露醇。也可以含有抗氧化剂，如蛋氨酸。更可以含有一种表面活性剂，如TWEEN(较佳为TWEEN 20)，或者聚醚(较佳为聚醚F68)。
在一个特别优选的多剂量配方里，由本发明的方法所生产的FSH通过溶于水再与蔗糖、磷酸盐缓冲液(pH7)、聚醚F68、蛋氨酸和间甲酚或苯甲醇配制成注射剂。
一特别优选的用于皮下或肌肉注射的重组FSH液体多剂量配方如下：
FSH多剂量液体配方成分
成分# 种类 300 IU FSH  450 IU FSH  900 IU FSH
 1  rhFSH(μg/药筒) 22.2(305 IU)  33.3(458 IU)  66.7(916 IU)
 2 蔗糖(mg/药筒) 30.0  45.0  90.0
 3 NaH2PO4·H2O(mg/药筒) 0.225  0.337  0.675
 4  Na2HPO4·2H2O(mg/药筒) 0.555  0.832  1.665
  5   聚醚F68(mg/管)   0.050   0.075   0.150
  6   蛋氨酸(mg/管)   0.050   0.075   0.150
  7   间甲酚(mg/管)   1.50   2.25   4.50
  8   pH   7.0   7.0   7.0
  9   WFI   加到0.5ml   加到0.75ml   加到1.5ml
适应症
本发明的FSH适用于需要FSH的各种治疗。特别适用于控制辅助生殖技术中的诱导***、控制性超***和***减少症治疗中的皮下给药。它可以与其他***如LH和hCG一起结合使用，也可以与增加对FSH反应的化合物如克罗米酚，以及芳香酶抑制剂如阿纳托唑、来曲唑、法倔唑和YM-511一起使用。
序列：
SEQ ID NO.1：人糖蛋白α亚单位；
SEQ ID NO.2：hFSHβ亚单位
SEQ ID NO.3：hFSHβ亚单位变异体1
SEQ ID NO.4：hFSHβ亚单位变异体2
SEQ ID NO.5：hFSHβ亚单位变异体3
本文中所用的促卵泡激素，或者FSH是指作为全长成熟蛋白质提出的人FSH(hFSH)。FSH是一个含有人糖蛋白α亚单位和人FSHβ亚单位的二聚体。人糖蛋白α亚单位的蛋白质序列为SEQ ID NO.1，人FSHβ亚单位的蛋白质序列为SEQ ID NO.2。
所用术语“重组”指通过重组DNA技术而产生的FSH制剂(参见例如WO85/01958)。用重组技术表达FSH的方法的一个实施例是，用编码FSHα亚单位和β亚单位的DNA序列转染真核细胞，如在EP 0211894和EP 0487512中所述，不管在一个载体还是在两个载体上均有一亚单位，每个亚单位都有一单个启动子。编码FSH的DNA可以是一个cDNA或其含有内含子。用重组技术生成FSH的方法的另一个实施例是用同源重组技术以有效连接的方式把一异源调节片段***到编码FSH的一个或两个亚单位的内生序列中，如欧洲专利号EP 0505500(Applied ResearchSystems ARS Holding NV)所述。一些WO 99/57263(TranskaryoticTherapies)中所公开的方法也可以考虑，其中一个亚单位异源***细胞，而另一个亚单位经同源重组***一个异源调节片段以激活基因组序列而表达。本发明的方法可以用于纯化以上所述任何一种方法所表达的FSH。
“重组细胞”的表达指经***一个异源DNA而产生的细胞，包括以上所提到的任何一种遗传操作方法。
FSH较佳由含有编码人糖蛋白α亚单位和FSHβ亚单位的一个或多个载体的DNA转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中重组产生。编码α亚单位和β亚单位的DNA可以在相同的或不同的载体中出现。
“FSH变异体”的表达指包含一些在氨基酸序列、糖基化模式或在亚单位之间的连接与人FSH不同但呈现FSH活性的分子。例子包括CTP-FSH，即一种长效的经修饰的重组FSH，其由野生型α亚单位和杂交β亚单位构成，其中hCG的羧基末端肽在FSHβ亚单位的C末端融合，如LaPolt等人；Endocrinology；1992，131，2514-2520；或Klein等人；Development and characterization of a long-acting recombinanthFSH agonist；Human Reprod.2003，18，50-56]所述。还包括单链CTP-FSH，一种单链分子，其由如下序列(从N末端到C末端)构成：
    βFSH     βhCG-CTP(113-145)     αFSH
其中βFSH表示FSHβ亚单位，βhCG CTP(113-145)表示hCG羧基末端肽，αFSH表示FSHα亚单位，如Klein等人所述[Pharmacokinetics and pharmacodynamics of single-chainrecombinant human follicle-stimulating hormone containing thehuman chorionic gonadotrophin carboxyterminal peptide in therhesusmonkey；Fertility & Sterility；2002，77，1248-1255]。FSH变异体的其他实施例包括具有在α亚单位和/或β亚单位中所引入的糖基化位点的FSH分子，如在WO 01/58493(Maxygen)中所示，以及亚单位之间有S-S键的FSH分子，如在WO 98/58957中所示。FSH变异体的其他实施例包括含有FSH序列和hCG或LH序列的嵌合分子，如在WO91/16922和WO 92/22568中所述的那些。
这里所指的FSH变异体也包括短于SEQ ID NO.2的全长成熟蛋白质的β亚单位的羧基末端缺失。在SEQ IDS NO.3、4和5中有人FSHβ亚单位的羧基末端缺失。可以理解为β链的羧基末端变异体与一个已知的α亚单位形成二聚体，由此形成一个FSH变异异源二聚体。
在一个优选实施例中，在含血清或不含血清的培养基中，FSH在CHO细胞中重组产生。
在一个优选实施例中，根据本发明的方法产生的纯化的FSH适用于皮下给药，病人可以自身给药。
“未加工的重组FSH”的表达指在采取任何层析步骤之前表达FSH的重组细胞中的细胞培养上清液。该表达包括了上清液未加工的形式(从细胞中分离)，也包括浓缩的和/或过滤的和/或超滤的上清液。
与FSH活性相关的术语“生物活性”是指一种FSH制剂引起与FSH相关的生物反应的能力，如在Steelman-Pohley测定中得到的卵巢重量[Assay of the follicle stimulating hormone based on theaugmentation with human chorionic gonadotrophin；Endocrinology；1953，53，604-616]，或者女性病人的卵泡生长。女性病人的卵泡生长可以通过超声波估算，如，根据在刺激后第8天平均直径大约有16mm的卵泡数量。生物活性可经一种对于FSH可接受的标准来估算。
可以测定在FSH制剂中LH的含量，如，用LH特定的免疫测定法，如Delfia hLH Spec(Wallac Oy，Turku，Finland)。
关于FSH的“比活性”术语指以IU表示的制剂的生物活性除以蛋白质重量，IU根据公认的FSH的生物测定法如Steeelman Pohley生物测定法测出，蛋白质重量根据一种总蛋白含量的测定法来测定，如Lowry测定法[O.H.Lowry，N.J.Rosebrough，A.L.Farr and R.J.Randall(1951)J.Biol.Chem.193：265；Hartree E.E.(1972).Anal.Biochem.48：422；J.R.Dulley and P.A.Grieve(1975)Anal.Biochem.64：136]，Bradford测定法[Bradford，M.M.(1976)Anal.Biochem.72，248]，或者在280nm的吸收值测定。
本发明的FSH的比活性较佳为大于或大约8000IU/mg，更佳为大于或大约9000IU/mg，再佳为大于或大约10000IU/mg，最佳为大于或大约14000IU/mg，其中生物活性用Steelman-Pohley测定法测定，而蛋白质含量用SE-HPLC测定。
在纯化过程的各个阶段可以分析FSH样品的纯度，例如，用以下列出的技术：
r-hFSH定量/游离α亚单位/纯度/氧化形式：RP-HPLC
如上所述，FSH是一个杂二聚体糖蛋白，含有一个α亚单位和一个β亚单位。这些亚单位可以解离，这可以通过游离α亚单位在样品中的数量来监测。另外，FSH亚单位可以氧化，氧化的污染物用RP-HPLC定量，游离亚单位用SDS-PAGE估算。
r-hFSH定量：免疫测定
FSH在样品中的含量可以用对FSH有特异性的免疫测定来测量，如，DELFIA FSH免疫测定。
总蛋白：Bradford测定，Lowry测定，280nm的吸收值
任何蛋白制剂中，总蛋白含有可以用如Bradford测定、Lowry测定、280nm的吸收值等技术来测定。
异构重整形式：IEF
如上所述，FSH是一种糖蛋白，有多个在两个亚单位不同位置上结合的低聚糖残基。低聚糖残基可以有不同程度的支链，或有唾液酸残基加帽。唾液酸残基带负电荷(在中性pH值的时候)。不同加帽和有不同等电点(PI)的物种混合物一起导致异种。这可以用基于电荷的分离技术等如电聚焦(IEF)来评估。
宿主细胞蛋白(HCP)
宿主细胞蛋白可用ELISA测定分析。例如，抗体可用一种没有FSH基因的宿主细胞培养的“模拟培养”。
实施例
本发明将通过两个实施例来说明。
图1和图2阐明了所述的两个实施例的相应流程。所得到的纯化的r-hFSH称为“r-hFSH总料”。
实施例1(参见图1)
步骤(1)：在蓝琼脂糖凝胶上进行的染料亲和层析
FSH纯化起始材料从含有重组FSH的细胞培养收集物制备，也就是说，在含血清或在不含血清的培养液中，在CHO细胞重组产生的FSH。染料亲和层析柱(蓝琼脂糖凝胶FF树脂)首先与pH值为8.5的含有L-蛋氨酸的低传导性缓冲液平衡。然后在树脂上直接加入含有FSH的液体。装填之后，未结合树脂的始料用平衡缓冲液冲洗出来。最后FSH用pH值为7.0的含有NaCl和L-蛋氨酸的磷酸钠缓冲液冲洗而洗脱出来。总洗出液直接进入下一步骤。本步骤在2-8℃下进行。
步骤(2)：在Toyopearl丁基650M上进行的疏水作用层析(HIC)
将从步骤(1)的蓝琼脂糖凝胶FF上的洗出液装填到Toyopearl丁基650M柱上，与pH值为7.0的含有硫酸铵和L-蛋氨酸的磷酸钠缓冲液平衡。未结合树脂的物料用平衡缓冲液冲洗出来。FSH用同样的缓冲液(但其中所含硫酸铵的浓度较低)洗脱出来。洗出液直接进入下一步骤。本步骤在室温下进行。
步骤(3)：在Source 30 RPC上的反相层析
HIC洗出液(从步骤(2)而来)首先加入IPA(异丙醇)进行调节。Source30 RPC柱与pH值为7.6的含有L-蛋氨酸和2-丙醇的醋酸铵缓冲液以等同于调节的装填料的浓度一起平衡。将未结合的装填料用平衡缓冲液冲洗出来后，树脂用pH值为7.6的含有L-蛋氨酸和浓度增加的2-丙醇的醋酸铵缓冲液洗涤。FSH最后用继续增加浓度的2-丙醇洗脱出来。总洗出液最后在搅拌下用L-蛋氨酸水溶液稀释。总稀释液进入下一步骤。本步骤在室温下进行。
经过以上步骤，纯化因素-也就是说FSH在纯化样品中的纯度对FSH在起始材料(未加工的FSH)中的纯度比例-大约为40.000。
实施例2(参见图2)
步骤(-1)：浓缩的r-hFSH超滤/渗滤
所有操作都在冷藏条件下(2-8℃)进行。待纯化的形成起始材料的未加工FSH来自含有重组FSH的细胞培养收集物。
净化
未加工r-hFSH通过一0.5μm宽的过滤器过滤(如Pall Profile II过滤器或等同物)。
超滤
净化了的未加工液首先通过10KD的聚醚砜膜进行超滤浓缩。浓缩的保留物然后在至少5倍渗滤体积的硼酸盐缓冲液中进行渗滤，该硼酸盐缓冲液含有L-蛋氨酸作为抗氧化剂，pH值为8.6。测量保留物的传导性和pH值以监测渗滤过程。然后在***排水之前进一步浓缩保留物。最后超滤装置用渗滤缓冲液冲洗，冲洗液与复原的保留物混合。总液进入下一步骤。
过滤
浓缩产物通过0.2μm的聚醚砜过滤膜(或等同物)过滤。
步骤(0)：在Q琼脂糖凝胶FF上的阴离子交换层析
将过滤后的液体加到一强阴离子交换(Q琼脂糖凝胶FF)树脂上，与pH值为8.5的含有L-蛋氨酸的硼酸钠缓冲液平衡。装填后，用平衡缓冲液漂洗层析柱，将所有未结合的装填料冲洗出来。然后用pH值为8.5的含有NaCl(增加传导性)和L-蛋氨酸(作为抗氧化剂)的硼酸钠缓冲液洗脱层析柱。收集的总洗出液进行染料亲和层析。
步骤(1)在蓝琼脂糖凝胶上的染料亲和层析
染料亲和层析柱(蓝琼脂糖凝胶FF树脂)首先与来自Q琼脂糖凝胶FF树脂的洗脱缓冲液平衡。得到的洗出液直接加到树脂上。装填后，未结合的装填料用平衡缓冲液冲洗出来。FSH最后用pH值为7.0的含有NaCl和L-蛋氨酸的硼酸钠冲洗层析柱而洗脱出来。总洗出液直接进入下一步骤。本步骤在2-8℃下进行。
步骤(2)：在Toyopearl丁基650M上进行的疏水作用层析
将蓝琼脂糖凝胶FF上的洗出液装填到Toyopearl丁基650M柱上，与pH值为7.0的含有硫酸铵和L-蛋氨酸的磷酸钠缓冲液平衡。未结合树脂的材料用平衡缓冲液冲洗出来。FSH用同样的缓冲液(但其中硫酸铵的浓度较低)洗脱出来。洗出液直接进入下一步骤。本步骤在室温下进行。
步骤(3)：在Source 30 RPC上的反相层析
HIC洗出液(从步骤(2)而来)首先加入IPA(异丙醇)进行调节。Source30 RPC柱与pH值为7.6的含有L-蛋氨酸和2-丙醇的醋酸铵缓冲液以等同于调节的装填料的浓度一起平衡。将未结合的装填料用平衡缓冲液冲洗出来后，树脂用pH值为7.6的含有L-蛋氨酸和浓度增加的2-丙醇的醋酸铵缓冲液洗涤。FSH最后用浓度进一步增加的2-丙醇洗脱出来。总洗出液最后在搅拌下用L-蛋氨酸水溶液稀释。总稀释液进入下一步骤。本步骤在室温下进行。
步骤(4)：在Fractogel EMD TMAE hicap树脂上的阴离子交换层析
Fractogel EMD TMAE hicap层析柱首先与pH值为8.5的含有L-蛋氨酸的硼酸钠缓冲液平衡。RPC后的材料(来自步骤(3))稀释后装填上柱。将未结合的装填料用平衡缓冲液冲洗出来。FSH从盐浓度以线性增加的柱中洗脱出来。本步骤在2-8℃下进行。
步骤(4’)：纳米过滤
来自Fractogel EMD TMAE hicap步骤(4)的洗出液直接加到一20nm纳米过滤装置，以3巴的氮气压进行纳米过滤。过滤物进入下一步骤。本步骤在2-8℃下进行。
步骤(5)：总料超滤
经过纳米过滤的FSH材料通过一5KD聚醚砜膜进行切向流浓缩。当保留物达到起始体积的一半时，材料通过WFI渗滤进行缓冲液交换。
样品纯度
这些纯化步骤后的FSH样品纯度测定如下：
纯化步骤 纯度
步骤(-1)：超滤/渗滤 19％FSHFSH由RP-HPLC测定总蛋白含量由Bradford Assay测定
步骤(0)：在Q琼脂糖凝胶FF上进行的阴离子交换层析 44％FSHFSH由RP-HPLC测定总蛋白含量由Bradford测定
步骤(1)：在蓝琼脂糖凝胶上进行的染料亲和层析 68％FSHFSH由RP-HPLC测定；总蛋白含量由280nm的吸收光或大约420’000ppm HCP测定；FSH含量由RP-HPLC测定；宿主细胞含量由ELISA测定
步骤(2)：在Toyopearl丁基650M上进行的疏水作用层析 杂质量：3400ppmFSH含量由RP-HPLC测定；宿主细胞含量由ELISA测定
步骤(3)：在Source 30 RPC上的反相层析 杂质量：170ppmFSH含量由RP-HPLC测定；宿主细胞含量由ELISA测定
步骤(4)在Fractogel EMD TMAE hicap树脂上的阴离子交换层析 杂质量：＜80ppmFSH含量由RP-HPLC测定；宿主细胞含量由ELISA测定
样品的生物活性
用Steelman-Pohley卵巢重量增加方法测量纯化的r-hFSH生物活性。可以用生物活性除以用SE-HPLC法测定的FSH含量来计算比活性。如下所示。
最后总料比活性通常在10000到17000IU/mg之间。根据实施例2的方法得到的两个实施例的最后总料FSH的值如表1所示。
表2本发明纯化的r-hFSH总料比活性
 分析   样品1   样品2
 SE-HPLC测定的蛋白浓度(mg/ml)   0.61   0.54
 比活性(生物活性/SE-HPLC)   12’600IU/mg   14’600IU/mg

Claims (28)

1.一种重组人FSH或FSH变异体的纯化方法，其特征在于，所述的纯化方法包括使含有FSH的液体经受以下步骤，但顺序可随意：
(1)染料亲和层析；
(2)疏水作用层析；和
(3)反相层析。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中的染料亲和层析采用具有固定化汽巴龙蓝F3G-A的树脂。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中染料亲和层析采用的树脂是蓝琼脂糖凝胶FF。
4.如权利要求1至3中的任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中的染料亲和层析采用pH值为或大约为6.5至11.5的磷酸钠缓冲液作为洗脱液。
5.如权利要求1至4中的任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述的步骤(2)的疏水作用层析(HIC)采用Toyopearl丁基650M或有类似性质的树脂。
6.如权利要求1至5中的任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述的步骤(2)的疏水作用层析(HIC)采用磷酸钠/硫酸铵作为洗脱液。
7.如权利要求1至6所述的任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述的步骤(3)的反相层析采用Source 30 RPC作为树脂。
8.如权利要求1至7中的任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述的步骤(3)的反相层析采用含有2-丙醇的醋酸铵作为洗脱液。
9.如权利要求1至8中的任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述的步骤以如下顺序进行；
(1)染料亲和层析；
(2)疏水作用层析；和
(3)反相层析。
10.如权利要求1至9中的任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括阴离子交换层析步骤(0)。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的阴离子交换层析步骤在步骤(1)、(2)和(3)之前进行。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的步骤以如下顺序进行：
(0)阴离子交换层析；
(1)染料亲和层析；
(2)疏水作用层析；和
(3)反相层析。
13.如权利要求10、11或12所述的方法，其特征在于，所述步骤(0)的阴离子交换层析采用Q琼脂糖凝胶FF树脂或Fractogel EMD TMAEHiCap树脂。
14.如权利要求10至13中的任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述步骤(0)的离子交换层析采用硼酸盐缓冲液作为洗脱液。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述的硼酸液缓冲液pH值为8.5或大约8.5。
16.如权利要求10至15中的任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括阴离子交换层析步骤(4)的第二步骤。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述的阴离子交换层析步骤(4)的第二步骤在步骤(1)、(2)和(3)之后进行。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述的方法步骤以如下顺序进行：
(0)阴离子交换层析；
(1)染料亲和层析；
(2)疏水作用层析；
(3)反相层析；和
(4)阴离子交换层析。
19.如权利要求16至18中的任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述的第二次阴离子交换层析步骤(4)采用Fractogel EMD TMAE HiCap树脂或Q琼脂糖凝胶FF树脂。
20.如权利要求16至19中所述的方法，其特征在于，所述的第二次阴离子交换层析步骤(4)采用硼酸盐缓冲液和增加NaCl浓度梯度。
21.如权利要求16至20中的任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述的方法包括在第二次阴离子交换层析步骤(4)之后的纳米过滤步骤(4’)。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述的方法包括在纳米过滤步骤(4’)之后的超滤步骤(5)。
23.如权利要求1至22中的任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述的任何洗脱液和/或缓冲液均含有抗氧化剂，具体是指L-蛋氨酸。
24.一种人重组FSH的纯化方法，其特征在于，所述的方法包括使FSH经受以下步骤：
(-1)超滤；
(0)在Q琼脂糖凝胶FF上用硼酸盐/NaCl、L-蛋氨酸，pH值8.5或大约为8.5作为洗脱液进行阴离子交换层析；
(1)经洗脱步骤(0)之后，在蓝琼脂糖凝胶FF上进行染料亲和层析步骤，以磷酸盐、NaCl、L-蛋氨酸，pH值为7或大约为7作为洗脱液；
(2)经洗脱步骤(1)之后，在Toyopearl丁基650M上进行疏水作用层析步骤，以磷酸盐、硫酸铵、L-蛋氨酸，pH值为7或大约为7作为洗脱液；
(3)经洗脱步骤(2)之后，在Source 30 RPC上以醋酸铵、L-蛋氨酸、2-丙醇，pH值为7.6或大约为7.6作为洗脱液进行反相层析步骤；
(4)经洗脱步骤(3)之后，在FractogelEMD TMAE hicap树脂上用硼酸盐、L-蛋氨酸、pH值为8.5或大约为8.5，和NaCl进行阴离子交换层析步骤；
(4’)经洗脱步骤(4)之后进行纳米过滤；以及
(5)经步骤(4’)渗透之后进行超滤。
25.一种重组人FSH或FSH的变异体，其特征在于，所述的重组人FSH或FSH的变异体通过权利要求1至24的中的任一权利要求所述的方法得到。
26.一种药物组合物，其特征在于，所述的组合物包括如权利要求25所述的人FSH或FSH变异体以及药学上可接受的赋形剂。
27.如权利要求26的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括如权利要求25所述的FSH、聚醚68、蔗糖、蛋氨酸、间甲酚和一pH值为7.0或大约为7.0的水溶性磷酸盐缓冲液。
28.如权利要求25的重组人FSH或FSH变异体在制备治疗生殖力异常的药物中的应用。
CN2005800375919A 2004-11-09 2005-11-08 Fsh的纯化方法 Active CN101087805B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP04105639 2004-11-09
EP04105639.1 2004-11-09
US62871704P 2004-11-17 2004-11-17
US60/628,717 2004-11-17
PCT/EP2005/055815 WO2006051070A1 (en) 2004-11-09 2005-11-08 Method for purifying fsh

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101087805A true CN101087805A (zh) 2007-12-12
CN101087805B CN101087805B (zh) 2012-05-23

Family

ID=39560952

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2005800375919A Active CN101087805B (zh) 2004-11-09 2005-11-08 Fsh的纯化方法

Country Status (22)

Country Link
US (1) US7741455B2 (zh)
EP (1) EP1809663B1 (zh)
KR (1) KR101173717B1 (zh)
CN (1) CN101087805B (zh)
AT (1) ATE408624T1 (zh)
AU (1) AU2005303818B2 (zh)
BR (1) BRPI0517973B8 (zh)
CA (1) CA2579131A1 (zh)
CY (1) CY1108602T1 (zh)
DE (1) DE602005009856D1 (zh)
DK (1) DK1809663T3 (zh)
EA (1) EA011673B1 (zh)
ES (1) ES2312037T3 (zh)
HK (1) HK1108704A1 (zh)
HR (1) HRP20080464T3 (zh)
IL (1) IL182716A (zh)
MX (1) MX2007005327A (zh)
NO (1) NO340811B1 (zh)
PL (1) PL1809663T3 (zh)
PT (1) PT1809663E (zh)
SI (1) SI1809663T1 (zh)
WO (1) WO2006051070A1 (zh)

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010133071A1 (zh) * 2009-05-19 2010-11-25 上海天伟生物制药有限公司 一种高纯度尿促***及其制备方法
WO2010145125A1 (zh) * 2009-06-18 2010-12-23 上海天伟生物制药有限公司 一种高纯度绝经期促性腺素及其制备方法和用途
CN102656182A (zh) * 2009-11-24 2012-09-05 葛莱高托普有限公司 纯化糖蛋白的方法
CN103539861A (zh) * 2013-11-01 2014-01-29 广州诺新生物技术有限公司 长效重组人促卵泡激素融合蛋白
CN103539860A (zh) * 2013-11-01 2014-01-29 广州优联康医药科技有限公司 一种长效重组人促卵泡激素融合蛋白
CN103554269A (zh) * 2013-11-01 2014-02-05 广州优联康医药科技有限公司 重组猪促卵泡激素融合蛋白
CN103570820A (zh) * 2012-08-06 2014-02-12 齐鲁制药有限公司 一种重组人促卵泡激素的纯化方法
CN104961821A (zh) * 2014-07-28 2015-10-07 厦门欧瑞捷生物科技有限公司 一种从人尿中提取***的方法
CN105461799A (zh) * 2015-12-31 2016-04-06 哈药集团技术中心 一种重组人促卵泡生成素的纯化方法
CN107698676A (zh) * 2017-11-07 2018-02-16 江西浩然生物医药有限公司 一种高纯度尿促性素的提取制备方法
CN110305903A (zh) * 2019-07-31 2019-10-08 江苏璟泽生物医药有限公司 重组人促卵泡激素及其制备方法
CN110563832A (zh) * 2019-07-31 2019-12-13 江苏璟泽生物医药有限公司 一种高纯度重组促***纯化方法

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7754860B2 (en) * 2003-12-22 2010-07-13 Ares Trading S.A. Method for purifying FSH
LT1917276T (lt) 2005-08-26 2018-05-25 Ares Trading S.A. Glikozilinto interferono beta gavimo būdas
JP5199112B2 (ja) * 2005-12-09 2013-05-15 アレス トレーディング ソシエテ アノニム Ｆｓｈ又はｆｓｈ変異体を精製するための方法
US9091695B2 (en) * 2007-06-01 2015-07-28 Laboratory Corporation Of America Holdings Methods and systems for quantification of peptides and other analytes
US8318457B2 (en) 2007-06-28 2012-11-27 Biogenerix Ag FSH producing cell clone
EP2203474A1 (en) * 2007-10-22 2010-07-07 Merck Serono S.A. Method for purifying fc-fusion proteins
AU2008314689A1 (en) * 2007-10-22 2009-04-30 Merck Serono S.A. Method for purifying an Fc-containing protein
AU2009211331B2 (en) 2008-02-08 2014-07-03 Theramex HQ UK Limited Liquid formulation of FSH
JP2009273427A (ja) 2008-05-16 2009-11-26 Jcr Pharmaceuticals Co Ltd 組換え体ヒトｆｓｈの製造方法
DK2414380T3 (en) 2009-04-01 2015-10-19 Ratiopharm Gmbh Process for the purification of recombinant fsh
CN101519445B (zh) * 2009-04-08 2013-03-27 上海天伟生物制药有限公司 一种高比活尿促***及其制备方法
JP2011172602A (ja) * 2011-06-15 2011-09-08 Jcr Pharmaceuticals Co Ltd 組換え体ヒトｆｓｈの製造方法
EP2968391A1 (en) 2013-03-13 2016-01-20 Moderna Therapeutics, Inc. Long-lived polynucleotide molecules
JP5750471B2 (ja) * 2013-05-22 2015-07-22 Ｊｃｒファーマ株式会社 組換え体ヒトｆｓｈの製造方法
BR112016023680A2 (pt) 2014-04-18 2017-08-15 Cadila Healthcare Ltd ?processo de purificação de gonadotropina?
WO2016116966A1 (en) * 2015-01-22 2016-07-28 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Method for purification of recombinant human alpha-galactosidase a from material containing contaminant host cell proteins
CN113372433B (zh) * 2021-03-12 2022-10-11 上海景泽生物技术有限公司 纯化fsh方法

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1206302B (it) * 1987-06-26 1989-04-14 Serono Cesare Ist Ricerca Ormone follicolo-stimolante urinario
US5665868A (en) 1990-09-14 1997-09-09 Vittal Mallya Scientific Research Foundation Chromatographic agent and its use for the separation or proteins, polypeptides of metals
SE9201073D0 (sv) * 1992-04-03 1992-04-03 Kabi Pharmacia Ab Protein formulation
CA2223125A1 (en) * 1995-02-17 1996-08-22 Stichting Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid Production of biologically active recombinant bovine follicle stimulating hormone (recbfsh) in the baculovirus expression system
AUPN801296A0 (en) 1996-02-12 1996-03-07 Csl Limited Stabilised growth hormone formulation and method of preparation thereof
US6162905A (en) * 1996-11-07 2000-12-19 Ibsa Institut Biochimique S.A. FSH and LH separation and purification process
IT1287138B1 (it) * 1996-11-07 1998-08-04 Ibsa Inst Biochimique Sa Procedimento per la separazione e purificazione di fsh e lh
US6414123B1 (en) * 1997-10-21 2002-07-02 Vitro Diagnostics, Inc. Method for purifying FSH
US5990288A (en) * 1997-10-21 1999-11-23 Vitro Diagnostics, Inc. Method for purifying FSH
ATE358139T1 (de) * 1999-04-16 2007-04-15 Inst Massone S A Verfahren zur herstelllung von gonadotropin- zusammensetzungen
SK287041B6 (sk) * 2000-02-22 2009-10-07 Laboratoires Serono Sa Spôsob čistenia luteinizačného hormónu - LH zo vzorky, rekombinantný hLH, jeho použitie a farmaceutický prostriedok s jeho obsahom
EP1803730A1 (en) * 2000-04-12 2007-07-04 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
AU784808B2 (en) * 2001-04-02 2006-06-29 Kedrion Melville Inc. Prion and viral clearance process
US7754860B2 (en) * 2003-12-22 2010-07-13 Ares Trading S.A. Method for purifying FSH
US7598356B2 (en) 2004-07-08 2009-10-06 Board of Regents of the University of Nebraska by and on behalf of the University of Nebraska Medical Center Method for purifying a protein of the cystine-knot superfamily

Cited By (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010133071A1 (zh) * 2009-05-19 2010-11-25 上海天伟生物制药有限公司 一种高纯度尿促***及其制备方法
WO2010145125A1 (zh) * 2009-06-18 2010-12-23 上海天伟生物制药有限公司 一种高纯度绝经期促性腺素及其制备方法和用途
CN101928342B (zh) * 2009-06-18 2013-05-08 上海天伟生物制药有限公司 一种高纯度绝经期促性腺素及其制备方法和用途
CN102656182A (zh) * 2009-11-24 2012-09-05 葛莱高托普有限公司 纯化糖蛋白的方法
CN102656182B (zh) * 2009-11-24 2015-03-18 葛莱高托普有限公司 纯化糖蛋白的方法
CN103570820A (zh) * 2012-08-06 2014-02-12 齐鲁制药有限公司 一种重组人促卵泡激素的纯化方法
CN103570820B (zh) * 2012-08-06 2015-11-18 齐鲁制药有限公司 一种重组人促卵泡激素的纯化方法
CN103539861A (zh) * 2013-11-01 2014-01-29 广州诺新生物技术有限公司 长效重组人促卵泡激素融合蛋白
CN103554269A (zh) * 2013-11-01 2014-02-05 广州优联康医药科技有限公司 重组猪促卵泡激素融合蛋白
CN103539860A (zh) * 2013-11-01 2014-01-29 广州优联康医药科技有限公司 一种长效重组人促卵泡激素融合蛋白
CN104961821A (zh) * 2014-07-28 2015-10-07 厦门欧瑞捷生物科技有限公司 一种从人尿中提取***的方法
CN105461799A (zh) * 2015-12-31 2016-04-06 哈药集团技术中心 一种重组人促卵泡生成素的纯化方法
CN107698676A (zh) * 2017-11-07 2018-02-16 江西浩然生物医药有限公司 一种高纯度尿促性素的提取制备方法
CN107698676B (zh) * 2017-11-07 2020-07-14 江西浩然生物医药有限公司 一种高纯度尿促性素的提取制备方法
CN110305903A (zh) * 2019-07-31 2019-10-08 江苏璟泽生物医药有限公司 重组人促卵泡激素及其制备方法
CN110563832A (zh) * 2019-07-31 2019-12-13 江苏璟泽生物医药有限公司 一种高纯度重组促***纯化方法
CN110305903B (zh) * 2019-07-31 2021-10-01 江苏璟泽生物医药有限公司 重组人促卵泡激素及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP1809663B1 (en) 2008-09-17
DK1809663T3 (da) 2008-11-17
ES2312037T3 (es) 2009-02-16
WO2006051070A1 (en) 2006-05-18
KR20070083618A (ko) 2007-08-24
HRP20080464T3 (en) 2008-10-31
PL1809663T3 (pl) 2009-01-30
BRPI0517973B1 (pt) 2018-02-14
IL182716A (en) 2010-12-30
CY1108602T1 (el) 2014-04-09
EA011673B1 (ru) 2009-04-28
BRPI0517973A (pt) 2008-10-21
MX2007005327A (es) 2007-08-02
DE602005009856D1 (de) 2008-10-30
CA2579131A1 (en) 2006-05-18
BRPI0517973B8 (pt) 2021-05-25
EP1809663A1 (en) 2007-07-25
PT1809663E (pt) 2008-10-02
NO340811B1 (no) 2017-06-19
HK1108704A1 (en) 2008-05-16
IL182716A0 (en) 2007-07-24
SI1809663T1 (sl) 2009-02-28
ATE408624T1 (de) 2008-10-15
NO20072863L (no) 2007-06-05
EA200701040A1 (ru) 2007-10-26
US20080070832A1 (en) 2008-03-20
KR101173717B1 (ko) 2012-08-13
AU2005303818A1 (en) 2006-05-18
AU2005303818B2 (en) 2011-06-23
CN101087805B (zh) 2012-05-23
US7741455B2 (en) 2010-06-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101087805B (zh) Fsh的纯化方法
CN100554277C (zh) Fsh的纯化方法
CN102656182B (zh) 纯化糖蛋白的方法
EP1960419B1 (en) Method for purifying fsh or a fsh mutant
US20060079460A1 (en) Purified LH
KR100806911B1 (ko) ｈＣＧ의 정제 방법 및 이 방법에 의해 정제된 재조합ｈＣＧ
JP4933439B2 (ja) Ｆｓｈの精製方法
MXPA06005584A (es) Metodo para purificar hormona estimulante de foliculo

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1108704

Country of ref document: HK

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1108704

Country of ref document: HK