BRPI0517973B1 - Métodos para purificar o fsh recombinante - Google Patents
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Abstract
método para purificar o fsh. a presente invenção refere-se a um método para purificar o fsh recombinante humano ou uma variante de fsh, partindo do fsh bruto, compreendendo as seguintes etapas: 1.cromatografia de afinidade por corante; 2.cromatografia de interação hidrofóbica; e 3.cromatografla de fase reversa.
Description
(54) Título: MÉTODOS PARA PURIFICAR O FSH RECOMBINANTE (51) Int.CI.: C07K 14/59; A61K 38/04 (30) Prioridade Unionista: 09/11/2004 EP 04 105639.1, 17/11/2004 US 60/628,717 (73) Titular(es): ARES TRADING S.A.
(72) Inventor(es): PASCAL VALAX; PIERRE WENGER; ANNE STANLEY; LYDIA DELEGRANCE; LUCIANO CAPPONI
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODOS PARA PURIFICAR O FSH RECOMBINANTE.
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se ao campo da purificação de 5 hormônio folículo-estimulante (FSH).
Antecedentes da Invenção
O hormônio folículo-estimulante (FSH) é uma proteína injetável que cai na classe das gonadotrofinas. FSH é usado no tratamento da infertilidade e distúrbios reprodutivos tanto em pacientes masculinos como femininos.
Na natureza, o FSH é produzido pela glândula pituitária. Para uso farmacêutico, o FSH pode ser produzido recombinantemente (FSHr) ou ele pode ser isolado da urina de mulheres pós-menopausa (FSHu).
FSH é usado em pacientes femininas na indução da ovulação 15 (OI) e na hiperestimulação ovariana controlada (COH) para tecnologias reprodutivas assistidas (ART). Em um regime de tratamento típico para a indução da ovulação, um paciente é administrado injeções diárias de FSH ou um variante (cerca de 75 a 300 UI de FSH/dia) por um período de cerca de 6 até cerca de 12 dias. Em um regime de tratamento típico para a hiperestimulação ovariana controlada, um paciente é administrado injeções diárias de FSH ou um variante (cerca de 150 - 600 UI de FSH/dia) por um período de cerca de 6 até cerca de 12 dias.
O FSH também é usado para induzir a espermatogênese em homens que sofrem de oligospermia. Um regime usando 150 UI de FSH 3 vezes por semana juntamente com 2.500 de UI de hCG duas vezes por semana foi bem sucedido ao alcançar uma melhora na contagem de esperma em homens que sofrem de hipogonadismo hipogonadotrófico [Burges et al.; Subcutaneous self-administration of highly purified follicle stimulating hormone and human chorionic gonadotrophin for the treatment of male hypogonadotrophic hypogonadism. Spanish Collaborative Group on Male Hypogonadotrophic Hypogonadism; Hum. Reprod.; 1997, 12, 980 - 6].
Devido à importância do FSH no tratamento de distúrbios de ferPetição 870170076555, de 09/10/2017, pág. 5/14 tilidade, o fornecimento de FSH de alta pureza e alta atividade específica é desejável. O tratamento do FSH requer injeções repetidas. Preparações de FSH altamente purificado podem ser administradas subcutaneamente, permitindo a auto-administração pelo paciente, aumentando dessa forma a conveniência e aceitação do paciente.
Lynch et al. [The extraction and purification of human pituitary follicle-stimulating hormone and luteinising hormone; Acta Endocrinologica, 1998, 288, 12 - 19] descreve um método para purificar o FSH pituitário humano. O método envolve a cromatografia de troca aniônica e catiônica, extração por imunoafinidade e cromatografia de exclusão por tamanho. O método é dito resultar no FSH pituitário com uma atividade específica de 4.990 UI (imunoensaio)/mg, com 16 Ul/mg de LH. O conteúdo de proteína foi determinado ou por peso seco ou em solução pela absorção a 280 nm (assumindo que A280i cm para 1 g/L é igual a 1).
WO 98/20039 (IBSA Institut Biochimique SA) descreve um processo para a purificação do FSH urinário humano partindo de extratos urinários chamados de gonadotrofinas da menopausa humana (hMG). O processo usa cromatografia de troca iônica em resinas de troca aniônica fracamente básicas do tipo DEAE seguido por cromatografia de afinidade em resina com um derivado da antraquinona como um ligante. Considera-se que o processo produza FSH urinária livre a partir de LH e com uma atividade específica de 6.870 UI (imunoensaio)/mg. O conteúdo de proteína foi determinado assumindo que uma solução de água de 1 mg/mL de proteína tem uma densidade ótica de 0,62 a 277 nm, em cubetas de quartzo com um caminho ótico de 1 cm.
WO 00/63248 (Instituto Massone SA) descreve um processo para a purificação de gonadotrofinas, incluindo FSH, a partir da urina humana. O processo envolve as seguintes etapas: cromatografia de troca iônica com uma resina catiônica forte do tipo sulfopropila, cromatografia de troca iônica com uma resina aniônica forte e cromatografia de interação hidrofóbica (HIC). Uma preparação FSH com uma atividade específica de 8.400 Ul/mg (método de Steelman-Pohley: Assay of the follicle stimulating hormone base don the augmentation with human choríonic gonadotrophin; Endocrinology; 1953, 53, 604 - 616) e menos de 1 UI LH (método de ganho de peso da vesícula seminal de rato: Van Hell H, Matthijsen R & GA Overbeek; Acta Endocrinol, 1964, 47, 409) de atividade biológica por 75 UI de FSH é obtido de maneira reportada. O conteúdo de proteína foi efetuado pelo método de Lowry [O. H. Lowry et at., J. Biol. Chem., 1951,193, 265].
US 5.990.288 (Musick et al.) descreve um método para purificar FSH a partir de amostras biológicas, tais como as glândulas pituitárias humanas ou urina pós-menopausa humana. O processo usa cromatografia de troca de cátions em Fractogel EMD SO3-650 M, seguido por cromatografia de afinidade de corante em uma resina Mimetic Orange 1, seguido por uma etapa de cromatografia de interação hidrofóbica em uma resina Bakerbond Wide Pore Hl-Propyl. O processo é dito resultar no FSH da pituitária humana com uma atividade específica de 7.066 UI (imunoensaio)/mg e menos de 1 UI (imunoensaio)/mg de LH, e um FSH urinário com uma atividade específica de 6.298 UI (imunoensaio)/mg e menos de 3 UI (imunoensaio)/mg de LH. O conteúdo de proteína foi determinado por absorção a 280 nm (assumindo que A28°i cm para 1 g/L é igual a 1).
Chiba et al. [Isolation and partial characterization of LH, FSH and TSH from canine pituitary gland; Endocrinol. J. 1997, 44, 205 - 218] descreve uma técnica para purificar as gonadotrofinas pituitárias caninas, incluindo FSH, usando cromatografia por afinidade de concanvalina (Con) A, cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) e cromatografia de íon metálico imobilizado com Cu++. O FSH resultante é reportado como tendo uma atividade específica de 2,17 Ul/g de proteína usando um ensaio de radiorreceptor para
FSH para medir a atividade biológica e o kit de ensaio de proteína BioRad (BioRad Laboratories CA EUA) para determinar o conteúdo de proteína.
WO 88/10270 (Instituto di Ricerca Cesare Serono SPA) descreve um método para purificar a FSH humana da urina. O processo envolve a imunocromatografia com anticorpos monoclonais imobilizados específicos para o FSH ligados à Sepharose 4B pela divinilsulfona, seguido por HPLC de fase reversa. O FSH resultante é livre de LH e outras proteínas urinárias e tem uma atividade específica de 6.200 Ul/mg de pó liofilizado (método de Steelman-Pohley). A preparação foi a primeira preparação de FSH a ser adequada para a administração subcutânea, devido à sua pureza.
Uma necessidade persistente permanece para novos métodos para purificar
FSH e variantes de FSH. Particularmente, existe uma necessidade por métodos de purificação que evitam o uso de etapas de cromatografia de imunoafinidade de custo intensivo.
Sumário da Invenção
É um objetivo da presente invenção fornecer um novo método para purificar o FSH recombinante ou uma variante de FSH recombinante.
Em um primeiro aspecto, a invenção fornece um método para purificar o FSH humano recombinante ou uma variante de FSH partindo de um líquido contendo o FSH bruto, compreendendo as seguintes etapas:
(1) cromatografia de afinidade por corante;
(2) cromatografia de interação hidrofóbica; e (3) cromatografia de fase reversa;
o qual pode ser realilzado em qualquer ordem.
Breve Descrição dos Desenhos
Figura 1 ilustra a presente invenção, isto é, um processo de purificação 20 compreendendo as etapas de:
• cromatografia de afinidade por corante;
• cromatografia de interação hidrofóbica; e • cromatografia de fase reversa;
Figura 2 mostra um diagrama de uma modalidade específica da presente 25 invenção, isto é, um processo para a purificação compreendendo as etapas de:
• ultrafiltração/diafiltração • cromatografia de troca aniônica, • cromatografia de afinidade por corante, · cromatografia de interação hidrofóbica, • cromatografia de fase reversa, • cromatografia de troca aniônica, • nanofiltração,ultrafiltração/diafiltração;
Abreviações
As seguintes abreviações são usadas na descrição da invenção: DF: diafiltração
FSH: hormônio folículo estimulante: r-FSH: FSH recombinante; hFSH: FSH humano; r-hFSH: FSH humano recombinante;
BV: volume de leito
DEAE: dietilaminoetila;
ELISA: imunoensaio ligado a enzima;
DAC: cromatografia de afinidade por corante;
IMAC: cromatografia de afinidade por íon metálico imobilizado;
OD: densidade ótica;
HIC: cromatografia de interação hidrofóbica;
HPLC: cromatografia líquida de alta performance IRMA: ensaio imunorradiométrico;
KD ou kD: quilodalton;
HCP: proteína de célula hospedeira, proteínas que se originam da célula hospedeira usada para a expressão de FSH;
ICP: em controles de processo;
IEF: focagem isoelétrica;
PES: polietersulfona;
RP-HPLC: cromatografia líquida de alta performance de fase reversa;
Q FF: troca aniônica em Q Sepharose FF;
TA: temperatura ambiente;
WFI: água para injeção;
Descrição Detalhada da Invenção
A invenção fornece um método para purificar o FSH humano recombinante ou uma variante do FSH recombinante partindo de um líquido contendo o FSH bruto, compreendendo as etapas:
(1) cromatografia de afinidade por corante;
Λ7 (2) cromatografia de interação hidrofóbica; e (3) cromatografia de fase reversa; o qual pode ser executado em qualquer ordem.
O método de purificação da invenção produz um bolo de FSH 5 recombinante de alta pureza, o qual pode, a seguir, ser formulado para o medicamento final, por exemplo, Gonal-F (Serono). Ele tem a vantagem de produzir um alto grau de pureza sem usar cromatografia de imunoaflnidade. O FSH bruto, o qual forma o material de partida para a purificação de acordo com a presente invenção, consiste em coletas de cultura de células conten10 do FSH recombinante.
Em uma modalidade preferida, um antioxidante ou um aminoácido ou dipeptídeo livre com efeito antioxidante e retirador é incluído em algum ou todas as etapas do método de purificação de acordo com a presente invenção. Mais precisamente, o antioxidante está presente em qualquer um dos tampões usados para purificar e/ou concentrar e/ou filtrar o r-hFSH. O antioxidante previne a oxidação do FSH durante o processamento. Um antioxidante preferido é a L-metionina. Preferivelmente, a L-metionina é usada em uma concentração de ou cerca de 10 -100 nM. Outros exemplos de um antioxidante incluem t-butil-4-metoxifenol, 2,6-bis(1,1-dimetiletil)-4-metilfenol;
bimetabissulfito de potássio ou sódio, bissulfito de sódio. Exemplos de aminoácidos e dipeptídeos livres com efeito antioxidante e retirador são a histidina, taurina, glicina, alanina, carnosina, anserina, 1-metilistidina ou suas combinações.
Tipicamente, o material de partida é primeiramente clarificado e, a seguir, e opcionalmente concentrado (por exemplo, pelo uso de ultrafiltração) e/ou trocado com tampão (por exemplo, através de uma etapa de diafiltração) antes de começar a ser capturado na primeira etapa cromatográfico.
Nas etapas de cromatografia, resinas baseadas em polímero e baseadas em agarose podem ser usadas. Também é possível usar croma30 tografia de membrana, na qual a resina é substituída com uma membrana funcionalizada.
As 3 etapas de purificação da presente invenção (isto é, croma7
J2<2 tcgrafia de afinidade de corante, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de fase reversa) estão a seguir descritos em mais detalhes.
A etapa da cromatografia de afinidade de corante (1)
O método da invenção envolve uma etapa de cromatografia de afinidade de corante (1). Em uma modalidade preferida, a etapa de cromatografia de afinidade por corante é executado usando uma resina tendo como ligante imobilizado um composto corante o qual é bem conhecido de uma pessoa versada na técnica, isto é, Cibacron Blue F3G-A. O termo imobilizado é bem entendido por uma pessoa versada na técnica e significa que o ligante é derivado no sentido de que ele está quimicamente ligado à resina. Uma resina particularmente preferida é a Blue Sepharose FF (obtenível da Amersham Biosciences Inc.). As características técnicas da Blue Sepharose FF são as seguintes:
| Especificações Técnicas | |
| Ligante | Cibacron Blue F3G-A |
| Método dè acoplamento do ligante | Acoplamento de triazina |
| Capacidade de ligação | = 18 mg de albumina de soro humano/mL de gel drenado |
| Matriz | Agarose aitamente ligada de forma cruzada, 6% |
| Limite de exclusão (Mr) | 4x106 |
| Faixa de tamanho de partícula | 45 -165 pm |
| Taxa de fluxo linear* | «750 cm/h |
| Densidade do ligante | « 7 pmol de Cibacron Blue/mL de meio |
| Estabilidade do pH | 4-12 (longo prazo), 3-13 (curto prazo) |
| Estabilidade química | 40 °C por 7 dias em : etanol 70%, cloridrato de guanidina 6 M, uréia 8 M |
É entendido que o método pode ser efetuado com resinas alter15 nadas, com características similares. Exemplos de resinas alternativas incluem: Toyopearl AF-blue-HC-650M (Tosoh Bioscience), Toyopearl SuperButyl
550, Toyopearl Phenyl 650, Blue Cellthru BigBead (Sterogene), SwelIGel Blue (Pierce), Cibachrome blue 3GA-agarose 100 (Sigma), Affi-Gel Blue (BioRad), cartuchos de Econo-Pac blue (Bio-Rad), Blue Sepharose HP (Amersham), Cibacron Blue 3GA (Sigma).
A eluição na etapa de cromatografia de afinidade de corante imobilizado deveria preferivelmente ser executado usando um tampão de fosfato, particularmente preferido fosfato de sódio. O pH do eluente deveria preferivelmente ser de ou cerca de 6,0 até ou cerca de 11,5, mais preferivelmente de ou cerca de 6,5 até ou cerca de 8, particularmente preferivel10 mente de ou cerca de 7,0. Tampões alternados apropriados para manter um pH de 7,0 incluem os seguintes: MÊS, Bis-Tris, ADA, PIPES, ACES, BES, MOPS, TES, HEPES. O tampão de eluição para a etapa de cromatografia de afinidade de corante deveria preferivelmente conter um sal para aumentar a condutividade, preferivelmente NaCl.
Em uma modalidade particularmente preferida, os tampões contendo produto para a etapa de cromatografia de afinidade de corante (equilíbrio, lavagem e eluição) contêm um antioxidante, tal como L-metionina. Outros exemplos de um antioxidante incluem t-butil-4-metoxifenol, 2,6-bis(1,1dimetüetil)-4-metilfenol; bimetabissulfito de sódio ou potássio, bissulfito de sódio.
A etapa de cromatografia de interação hidrofóbica (2)
O método também envolve uma etapa de cromatografia de interação hidrofóbica (2). Em uma modalidade preferida, a cromatografia de interação hidrofóbica é realizada como uma resina, tal como Toyopearl Butyl
25_650M (obtenível da Tosoh Biosep Inc.).
Está entendido que a etapa (2) pode ser efetuado usando resinas alternativas, com características similares. Resinas alternativas que podem ser usadas são as seguintes: Phenyl Sepharose 6 de fluxo rápido (baixo sub); Phenyl Sepharose 6 de fluxo rápido (alta sub); Butyl Sepharose 4 de fluxo rá30 pido; Octyl Sepharose 4 de fluxo rápido; Phenyl Sepharose de alta performance; SOURCE 15ETH; SOURCE 15ISO; SOURCE 15PHE, todos da Amersham Biosciences (800) 526-3593; (ver www.amershambiosciences.com).
Ainda outras resinas são: Hydrocel) C3 ou C4; Hydroceli Phenyl da BioChrom Labs Inc. (812) 234-2558; (vide www.biochrom.com).
A ligação na resina HIC é alcançada em um tampão com uma alta condutividade, obtido através da adição de sal (NaCl, (NH4)2SO4 ou
Na2SO4, por exemplo). A eluição na etapa da cromatografia de interação hidrofóbica é preferivelmente executado pela redução da condutividade da fase móvel (reduzindo a concentração de sal) usando um tampão com um pH em ou cerca de 6 até ou cerca de 8, mais preferivelmente de ou de cerca de 6,5 até ou cerca de 7,5, mais preferivelmente de ou cerca de 7). Um sis10 tema particularmente preferido contém fosfato de sódio para tamponamento, preferivelmente em um pH de ou cerca de 7, e sulfato de amônio. Tampões alternativos são mencionados acima.
Em uma modalidade particularmente preferida, os tampões contendo produto para a etapa (2) de HIC (equilíbrio, lavagem, eluição) contêm um antioxidante, tal como L-metionina. Antioxidantes alternativos são mencionados acima.
A etapa de cromatografia de fase reversa (3)
O método da invenção também compreende uma etapa de cromatografia de fase reversa (RPC) (3). A RPC é preferivelmente executada usando uma resina, tal como SOURCE 30 RPC (obtenível da Amersham Biosciences). É entendido que a etapa (3) pode ser efetuado usando resinas alternativas as quais são bem conhecidas por uma pessoa versada na técnica e o qual tem características similares.
A cromatografia é preferivelmente executada usando um tampão de fase móvel em pH levemente alcalino, por exemplo em ou cerca de pH 7 8,5, mais preferivelmente em ou cerca de 7,5 ou 7,6. Em uma modalidade preferida, as espécies tamponantes são acetato de amônio. Tampões alternados adequados para um pH de ou de cerca de 7,6 incluem: BES, MOPS, fosfato, TES, HEPES. As soluções tampões usadas para essa etapa tam30 bém podem conter um modificador orgânico, a concentração do qual é modulada para diferentes fases da etapa cromatográfica (carregamento, lavagem, eluição e regeneração). Em uma modalidade preferida, o modificador orgânico é um solvente orgânico miscível em água, preferivelmente um álcool (tal como metanol, etanol, etc.), mais preferivelmente 2-propanol (isopropanol).
Em uma modalidade particularmente preferida, os tampões contendo produto para a etapa de RPC (equilíbrio, lavagem, eluição) contêm um antioxidante, tal como L-metionina. Antioxidantes alternados são mencionados acima.
Etapa de purificação adicional opcional 0 - cromatograf ia de troca iônica
Além das 3 etapas de purificação principais - ressaltados acima a presente invenção pode incluir etapas de purificação adicionais.
Em uma modalidade, o método de purificação da invenção envolve uma etapa preliminar de cromatografia de troca iônica (0) executado preferivelmente com uma resina de troca aniônica forte, particularmente preferivelmente uma resina de amônio quaternário, tal como Q Sepharose FF (obtenível da Amersham Biosciences), com as seguintes características:
Tipo de trocador iônico: Ânion forte
Capacidade total (mmol/mL): 0,18 - 0,25
Limite de exclusão (proteínas globulares): 4x10®
Forma das contas:
Estrutura das contas:
Estabilidade do pH operacional Estabilidade do pH de limpeza: Taxa de fluxo linear a 25 °C 1 bar 15 cm de leito
Esférica, diâmetro de 45-165 pm Agarose de ligação cruzada, 6% 2-12
-14
400 - 700 cm/h
Alternativamente, a etapa de cromatografia de troca iônica (0) pode ser executado usando uma resina, tal como Fractogel EMD TMAE HlCAP (obtenível da Merck KGaA, Darmstadt Alemanha), ou uma resina com características similares, ver abaixo:
| Suporte | Fractogel® EMD TMAE |
| Cat. No. | 1.16887 |
| Tamanho de partícula do tipo-S | 20 - 40 pm |
| Tipo de cromatografia | Cromatografia de troca iônica |
A
| Suporte | Fractogel® EMD TMAE |
| Grupo funcional | Grupo trimetilaminoetila (tipo Q) |
| Estrutura do monômero | CH2=CH-CONH-(CH2)2N + (CH3)3 |
| Capacidade de ligação da proteína | 120 mg de BSA/mL de gel |
| Faixa de estabilidade de pH | pH 2 até pH 12 |
| Valor de pH | > 13 |
| Condições de eluição | Concentrações altas de sal |
| Limite de pressão (leito: 150 x 10 mm) | 20 bar (pressão cai ao longo da coluna) |
| Temperatura de funcionamento | 4 °C até a temperatura ambiente |
| Conservante | Etanol 20% |
| Cartucho pronto para uso | 50-10 mm |
| Material do bolo de tipos S | 100 mL; 500 mL |
| Taxa de fluxo linear | 1,27 - 6,35 cm/min |
A etapa de cromatografia de troca iônica é preferivelmente executado usando um tampão com um pH levemente alcalino (por exemplo, em ou cerca de 7,2 até ou cerca de 9,0, ou em ou cerca de 8,0 até ou cerca de 9,0, mais preferivelmente em ou cerca de 8,5). Tampões adequados inclu5 em, por exemplo, tampão borato, Tris trietanolamina/ácido iminodiacético, acetato de amônio, tricina, bicina, TES, HEPES, TAPS. Mais preferido é o tampão borato, em um pH de ou cerca de 8,5. A eluição da resina de troca iônica é alcançada pelo aumento da condutividade da fase móvel através da adição de sal, preferivelmente NaCl. Em uma modalidade particularmente preferida os tampões contendo produto para a cromatografia de troca iônica -(equilíbrio, lavagem, eluição) contêm um antioxidante, preferivelmente Lmetionina. Antioxidantes alternativos são mencionados acima.
Conseqüentemente, em uma modalidade preferida, o método da invenção compreende as seguintes etapas:
(0) cromatografia de troca aniônica, preferivelmente em uma resina de troca aniônica forte, [preferivelmente uma resina de amônio quaternário, tal como Q Sepharose FF ou Fractogel EMD TMAE];
(1) cromatografia de afinidade de corante [preferivelmente em
Blue Sepharose FF];
(2) cromatografia de interação hidrofóbica [preferivelmente em Toyopearl Butyl 650M];
(3) cromatografia de fase reversa [preferivelmente em Source 30
RPC].
Etapa de purificação adicional opcional (-1) - ultrafiltração/diafiltração
Antes da etapa de cromatografia de troca iônica (0), pode ser desejável efetuar uma etapa de ultrafiltração para concentrar o FSH bruto. A ultrafiltração (ou diafiltração) é preferivelmente executada usando uma membrana com um corte de ou por volta de 3 - 10 kD, mais preferivelmente de ou por volta de 8 kD.
Etapa de purificação adicional opcional (4) - cromatografia de troca aniônica em uma outra modalidade preferida, o método da invenção também compreende uma segunda etapa de cromatografia de troca aniônica (4). Uma resina preferida é Fractogel EMD TMAE HICAP (obtenível da
Merck KGaA, Darmstadt Alemanha), ou uma resina com características similares, conforme mencionado acima. Altemativamente, a segunda etapa da cromatografia de troca aniônica pode ser executada em Q Sepharose FF, ou outra resina com características similares, conforme mencionado acima.
As etapas de cromatografia de troca aniônica, cromatografia de afinidade de corante, cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), cromatografia de fase reversa e a segunda etapa da cromatografia de fase aniônica podem ser executadas em qualquer ordem, embora seja preferida executar uma etapa de cromatografia de troca iônica primeiramente. As etapas rema25 nescentes de cromatografia de afinidade de corante, cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), RPC e a segunda cromatografia de troca aniônica opcional podem ser executados em qualquer ordem, embora seja preferido seguir a ordem mostrada abaixo:
(0) cromatografia de troca aniônica, (1) cromatografia de afinida30 de de corante, (2) cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), (3) cromatografia de fase reversa RPC; e (4) segunda cromatografia de troca aniônica. Etapa de purificação adicional opcional (5) - ultrafiltração/diafiltração
Em uma outra modalidade preferida, depois de qualquer uma das etapas de cromatografia (particularmente depois da etapa de cromatografia de fase reversa), a amostra de FSH é submetida a uma etapa de concentração.
Preferivelmente a etapa é efetuada usando ultrafiltração combinada por diafiltração para obter um bolo com a composição desejada. A ultrafiltração (ou diafiltração) é preferivelmente executada usando uma membrana com um corte de ou cerca de 3 -10 Kd, mais preferivelmente em ou por volta de 5 Kd.
Em uma modalidade particularmente preferida, as seguintes etapas são executadas na ordem apresentada abaixo:
(-1) Ultrafiltração (preferivelmente com uma membrana com um corte de ou cerca de 8 KD, (0) Cromatografia de troca aniônica (preferivelmente usando uma coluna de Q Sepharose FF);
(1) Cromatografia de afinidade de corante (preferivelmente usando uma coluna de blue Sepharose FF);
(2) Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) (preferivelmente usando uma coluna Butyl 650M);
(3) Cromatografia de fase reversa (RPC) (preferivelmente usando uma coluna Source 30 RPC);
(4) Cromatografia de troca aniônica em uma resina de troca ani. ônica fortemente básica (preferivelmente usando uma resina TMAE hicap); e (5) Ultrafiltração (preferivelmente com uma membrana coluna com corte de 5 KD).
Pode ser desejável submeter a amostra de FSH a uma etapa de -nanofiltração,-particularmente uma_etapa_de depuração_de_ vírus, isto é, para__ reduzir o risco de contaminação da preparação de FSH com vírus ou partículas semelhantes a vírus originadas da cultura celular. A nanofiltração pode ser feita em qualquer estágio do processo de purificação, entretanto, é particularmente preferido executar a nanofiltração depois da 2a etapa da cromatografia de troca tônica, ou depois da cromatografia de fase reversa ou depois da cromatografia de interação hidrofóbica. A nanofiltração pode ser efetuada mais de uma vez, por exemplo, ela pode ser efetuada duas vezes.
Em uma modalidade particularmente preferida, o método da invenção compreende as seguintes etapas:
(-1) Ultrafiltração (preferivelmente com uma membrana com um corte de ou cerca de 8 KD, (0) Cromatografia de troca aniônica (preferivelmente com Q Sepharose FF);
(1) Cromatografia de afinidade de corante (preferivelmente com Blue Sepharose FF);
(2) Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) (preferivelmen10 te com Butyl 650M);
(3) Cromatografia de fase reversa (RPC) (preferivelmente usando Source 30 RPC);
(4) Cromatografia de troca aniônica em uma resina de troca aniônica fortemente básica (preferivelmente resina TMAE hicap);
(4’) Nanofiltração, (5) Ultrafiltração (preferivelmente com uma membrana com um corte de 5 KD).
A vantagem da presente invenção é que o método de purificação é desprovido de uma etapa de cromatografia de imunoafinidade de custo intensivo e fornece, de qualquer modo, um alto grau de pureza de FSH e de bioatividade específica. Também o FSH purificado da presente invenção não contém impurezas indesejáveis adicionadas pela cromatografia de imunoafinidade (por exemplo, imunoglobulinas que filtradas da resina).
Estocagem/Liofilização
25_A composição do líquido resultante do processo de purificação, conforme descrito acima, e contendo FSH purificado, pode ser congelada para estocagem tal qual ou, depois da purificação, o eluato pode ser submetido à liofilização (secagem por congelamento”) para remover o solvente. O líquido ou produto liofilizado resultante é nomeado bolo de FSH”.
Formulações de FSH
FSH ou uma variante de FSH da invenção ou purificada de acordo como método da invenção pode ser formulado por injeção, quer seja intramuscular ou subcutânea, preferivelmente subcutânea. A formulação de FSH pode ser seca por congelamento, em qual caso ela é dissolvida em água para injeção exatamente antes da injeção. A formulação de FSH também pode ser uma formulação líquida, em cujo caso ela pode ser injetada diretamente, sem dissolução prévia.
A formulação de FSH pode ser de dose única ou de dose múltipla. Se ela for de dose múltipla, ela deve preferivelmente conter um agente bacteriostático, tal como, por exemplo, álcool benzílico, metacresol, timol ou fenol, preferivelmente álcool benzílico ou metacresol. Formulações de dose única podem também compreender um agente bacteriostático.
O FSH da invenção pode ser formulado com excipientes e estabilizantes conhecidos, por exemplo, sacarose e manitol. Ele também pode compreender um antioxidante, tal como metionina. Ele pode compreender ainda um tensoativo, tal como TWEEN (preferivelmente TWEEN 20) ou Plu15 rônico (preferivelmente Plurônico F68).
Em uma formulação de dose múltipla particularmente preferida, o FSH produzido pelo método da invenção é formulado pela sua dissolução em água para injeção com sacarose, tampão fosfato (pH 7), Plurônico F68, metionina e metacresol ou álcool benzílico.
Uma formulação de dose múltipla líquida particular preferida de
FSH recombinante para injeção subcutânea ou intramuscular é a seguinte:
| Componentes das formulações líquidas de dose múltipla de FSH | ||||
| Componente n° | Descrição | 300 UI FSH | 450 UI FSH | 900 UI FSH |
| 1 | rhFSH | 22,2 (305 UI) | 33,3(458 UI) | 66,7 (916 UI) |
| (pg/cartucho) | ||||
| 2 | Sacarose (pg/cartucho) | 30,0 | 45,0 | 90,0 |
| 3 | NaH2PO4.H2O (mg/cartucho) | 0,225 | 0,337 | 0,675 |
| 4 | Na2HPO4.2H2O (mg/cartucho) | 0,555 | 0,832 | 1,665 |
| Componentes das formulações líquidas de dose múltipla de FSH | ||||
| Componente n° | Descrição | 300 UI FSH | 450 UI FSH | 900 UI FSH |
| 5 | Plurônico F68 (mg/frasco) | 0,050 | 0,075 | 0,150 |
| 6 | Metionina (mg/frasco) | 0,050 | 0,075 | 0,150 |
| 7 | m-cresol (mg/frasco) | 1,50 | 2,25 | 4,50 |
| 8 | pH | 7,0 | 7,0 | 7.0 |
| 9 | WFI | q.s. até 0,5 | q.s. até 0,75 | q.s. até 1,5 |
indicações:
O FSH da invenção é adequado para uso em todos os tratamentos onde o FSH é indicado. Ele é particularmente adequado para a administração subcutânea na indução da ovulação, hiperestimulação ovariana controlada para tecnologias reprodutivas assistidas e no tratamento da oligospermia. Ele pode ser usado juntamente com outras gonadotrofinas, tais como LH e hCG. Ele também pode ser usado com outros compostos os quais aumentam a resposta ao FSH, tal como citrato de clomifeno, inibidores da aromatase, tais como anastrozol, letrozol, fadrozol e YM-511.
Seqüências:
SEQ ID NO: 1: subunidade α da glicoproteína humana;
SEQ ID NÕ: 2: subunidade β do hFSH;
SEQ ID NO: 3: variante 1 da subunidade β do hFSH;
SEQ ID NO: 4: variante 2 da subunidade β do hFSH;
SEQ ID NO: 5: variante 3 da subunidade β do hFSH;
O hormônio folícuto-estimulante, ou FSH, conforme aqui utilizado, se refere ao FSH humano (hFSH) produzido como uma proteína madura de comprimento completo. FSH é um dímero composto da subunidade alfa da glicoproteína humana e da subunidade beta da FSH humana. A seqüência de proteína da subunidade alfa da glicoproteína humana é fornecida na SEQ ID NO: 1, e a seqüência de proteína da subunidade beta da FSH humana é dada na SEQ ID NO: 2. O uso do termo recombinante'' se refere às preparações do FSH que são produzidas através do uso de tecnologia de
DNA recombinante (ver, por exemplo, WO 35/01958). Um exemplo de um método de expressar o FSH usando tecnologia recombinante é pela tra nsfecção de células eucarióticas com seqüências de DNA que codificam uma subunidade alfa e beta do FSH, quer seja fornecida em um vetor ou em dois vetores com cada subunidade com um promotor separado, conforme descrito nas Patentes Européias Nos. EP 0 211 894 e EP 0 487 512. O DNA que codifica o FSH pode ser um DNAc ou ele pode conter íntrons. Outro exemplo do uso da tecnologia recombinante para produzir FSH é pelo uso da recombinação homóloga para inserir um segmento heterólogo regulatório em conexão operativa com as seqüências endógenas que codificam uma ou mais das subunidades do FSH, conforme descrito na Patente Européia no. EP 0
505 500 (Applied Research Systems ARS Holding NV). Também contemplados são os métodos, tais como aqueles revelados na WO 99/57263 (Transkaryotic Therapies), em que uma das subunidades é inserida heterologamente em uma célula, e a outra subunidade é expressa pela ativação das seqüências genômicas pela inserção de um segmento regulatório heterólogo por recombinação homóloga. O método da invenção pode ser usado para purificar FSH expresso usando qualquer um desses métodos e outros métodos.
A expressão célula recombinante se refere a uma célula produzida pela inserção de DNA heterólogo, incluindo qualquer um dos métodos acima mencionados de manipulação genética.
Preferivelmente o FSH é produzido de maneira recombinante em células de ovário de hamster chinês (CHO) transfectadas com um vetor ou_ vetores compreendendo DNA codificando para a subunidade alfa da glicoproteína humana e a subunidade beta do FSH. O DNA que codifica as subunidades alfa e beta podem estar presentes nos mesmos ou em diferentes vetores.
A expressão variante FSH pretende englobar aquelas moléculas que diferem na seqüência de aminoácido, padrão de glicosilação ou em ligação intersubunidade do FSH humano, mas exibindo atividade FSH. E18 xemplos incluem CTP-FSH, um FSH recombinante modificado de longa ação, consistindo na subunidade α do tipo selvagem e uma subunidade β híbrida na qual o peptídeo carbóxi terminal do hCG foi fundido com o Cterminal da subunidade β do FSH, conforme descrito em LaPolt et al‘} Endocrinology; 1992, 131, 2514 - 2520; ou Klein et al.\ Development and characterization of a long-acting recombinant hFSH agonist; Human Reprod. 2003, 18, 50 - 56]; Também incluído está o CTP-FSH de cadeia única, uma molécula de cadeia única, consistindo nas seguintes seqüências (do N-terminal para o C-terminal):
| βρεΗ | βΙιΟβ-ΟΤΡ (113-145) | aFSH |
em que βΡ5Η significa subunidade β do FSH, βΙιΟΘ CTP (113 145) significa o peptídeo carbóxi terminal do hCG e aFSH significa a subunidade α do FSH, conforme descrito por Klein et al. [Pharmacokinetics and pharmacodynamics of singfe-chain recombinant human folíicle-stimulating hormone containing the human choríonic gonadotrophin carboxyterminal peptide in the rhesus monkey; Fertility & Sterílity; 2002, 77, 1248 - 1255]. Outros exemplos de variantes FSH incluem moléculas de FSH com sítios de glicosilação adicionais incorporados na subunidade α e/ou na subunidade β, conforme revelado em WO 01/58493 (Maxygen), e moléculas de FSH com ligações S-S intersubunidades, conforme revelado em WO 98/58957. Outros exemplos das variantes FSH incluem seqüências de moléculas quiméricas a partir do FSH e seqüências a partir do hCG ou do LH, tais como aquelas reveladas na WO 91/16922 e WO 92/22568.
As variantes FSH referidas aqui também incluem as anulações carbóxi terminais da subunidade beta que são menores do que a proteína madura de comprimento total da SEQ ID NO: 2. As anulações carbóxi terminais da subunidade beta humana são fornecidas nas SEQ ID Nos: 3, 4 e 5. É entendido que as variantes carbóxi terminais da cadeia beta formam um complexo com uma subunidade alfa conhecida para formar um heterodímero da variante FSH.
Em uma modalidade preferida, o FSH é produzido recombinantemente nas células CHO, quer em um meio com soro ou em um meio livre de soro.
Em uma modalidade preferida, o FSH purificado produzido de acordo com o método da invenção é adequado para administração subcutânea, permitindo a auto-administração pelo paciente.
A expressão FSH recombinante bruto se refere ao sobrenadante da cultura celular das células recombinantes expressando FSH, antes dele sofrer qualquer etapa cromatográfica. A expressão engloba a forma bruta do sobrendante (conforme isolado a partir das células) assim como o sobrenadante concentrado e/ou filtrado e/ou ultrafiltrado.
O termo atividade biológica em relação à atividade do FSH, se refere à capacidade de uma formulação de FSH eliciar respostas biológicas associadas com o FSH, tal como o ganho de peso ovariano no ensaio de Steelman-Pohley [Assay of the folicule stimulating hormone base don the augmentation with human chorionic gonadotrophin; Endocrinology; 1953, 53,
604 - 616], ou crescimento folicular em uma paciente mulher. O crescimento folicular em uma paciente do sexo feminino pode ser avaliada por ultra-som, por exemplo, em termos da quantidade de folículos com um diâmetro médio de ou de cerca de 16 mm no dia 8 da estimulação. A atividade biológica é avaliada em relação a um padrão aceito de FSH.
O conteúdo de LH em uma preparação de FSH pode ser medido, por exemplo, usando um imunoensaio específico para LH, tal como o Delfia hLH Spec (Wallac Ou, Turku, Finlândia).
O termo atividade específica, em referência ao FSH, significa a atividade biológica em UI da preparação em um ensaio biológico reconheci25 do para o FSH, tai como o bioensaio de Steelman Pohley [dividido pela quantidade de proteína, conforme determinado por um ensaio para conteúdo de proteína total, tal como o ensaio de Lowry [O. H. Lowry, N. J. Rosebrough, A. L. Farr e R. J. Randall (1951) J. Biol. Chem. 193: 265; Hartree E. E. (1972). Anal. Biochem. 48: 422; J. R. Duiley e P. A. Grieve (1975) Anal. Bio30 chem. 64: 1361], o ensaio de Bradford [Bradford, Μ. M. (1976) Anal. Biochem. 72, 248] ou por absorvância a 280 nm.
Preferivelmente, a FSH obtida pela invenção tem uma atividade específica de mais de ou de cerca de 8000 Ul/mg, mais preferivelmente maior do que ou de cerca de 9000 Ul/mg, ainda mais preferivelmente maior do que ou de cerca de 10000 Ul/mg, ainda mais preferivelmente de ou de cerca de 14000 Ul/mg, em que a atividade biológica é medida pelo bioensaio de Steelman-Pohley e o conteúdo de proteína é medido por SE-HPLC.
As amostras de FSH podem ser analisadas em relação à sua pureza em vários estágios do procedimento usando, por exemplo, técnicas tais como aquelas listadas abaixo:
Quantificação do r-hFSH/subunidade alfa livre/pureza/formas oxidadas: RPHPLC
Conforme mencionado acima, FSH é uma glicoproteína heterodimérica, composta de uma subunidade α e de uma subunidade β. Alguma dissociação das subunidades pode ocorrer, e isso pode ser monitorado oIhando a quantidade de subunidade α presente em uma amostra. Além disso, as subunidades FSH podem ficar oxidadas. Os contaminantes oxidados podem ser quantificados usando RP-HPLC, enquanto as subunidades livres podem ser avaliadas usando SDS-PAGE.
Quantificação do r-hFSH: imunoensaio
O conteúdo de FSH em uma amostra pode ser determinado usando um imunoensaio específico para FSH, tal como o imunoensaio DELFIA FSH.
Proteína total: ensaio de Bradford, ensaio de Lowry, absorvância a 280nm
Como com qualquer preparação protéica, o conteúdo de proteína total pode ser determinado usando técnicas tais como o ensaio de Bradford, o ensaio de Lowry ou por absorvância a 280 nm.
Padrão de isoformas: IEF
Conforme mencionado acima, FSH é uma glicoproteína, com múltiplos resíduos de oligossacarídeos ligados em vários lugares em ambas as subunidades. Os resíduos de oligossacarídeos podem ter diferentes graus de ramificação e podem ser cobertos com resíduos de ácido siálico. Resíduos de ácido siálico são negativamente carregados (em pH neutro). As diferenças nas coberturas levam à heterogeneidade, com uma mistura de espécies com diferentes pontos isoelétricos (pl). Isso pede ser avaliado cisando uma técnica que separa baseando na carga, tal como a focagem isoelétrica (IEF).
Proteína da célula hospedeira (HCP)
Proteína da célula hospedeira pode ser analisada usando um ensaio de ELISA. Por exemplo, anticorpos podem ser elevados para uma cultura simulada'1, a qual é uma cultura de células hospedeiras sem gene FSH.
Exemplos
A presente invenção será agora ilustrada através de 2 exemplos.
Os diagramas de fluxo correspondentes ilustrando os referidos 2 exemplos estão apresentados na figura 1 & 2. O r-hFSH purificado resultante é nomeado bolo de r-hFSH”.
Exemplo 1 (conforme figura 1)
Etapa (1): Cromatografia de afinidade de corante em Blue Sepharose
O material de partida FSH para a purificação é preparado a partir de coletas de culturas de células contendo FSH recombinante, isto é, FSH o qual foi produzido recombinantemente em células CHO, quer seja em um meio com soro ou em um meio livre de soro. A coluna de cromatografia de afinidade de corante (resina de Blue Sepharose FF) é primeiramente equilibrada com um tampão de baixa condutividade em um pH de 8,5 contendo Lmetionina. O líquido contendo o FSH é, a seguir, aplicado diretamente à resina. Depois da carga, o material não ligado é retirado por lavagem usando tampão de equilíbrio. O FSH é finalmente eluído por fluxo da coluna com tampão de fosfato de sódio em pH 7,0, contendo NaCl e L-metionina. A reu-_ nião de eluição é diretamente processada para a próxima etapa. A etapa é efetuada a 2 - 8 °C.
Etapa (2): Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) em Toyopearl Butvl
650M
O eluato de Blue Sepharose FF da etapa (1) é carregado em uma coluna Toyopearl Butyl 650M equilibrada contra um tampão de fosfato de sódio, pH 7,0, contendo sulfato de amônio e L-metionina. O material não
3^ ligado é retirado por fluxo com tampão de equilíbrio. O FSH é eluído com o mesmo tampão, mas com uma concentração reduzida de sulfato de amônio. O eluato é processado para a próximo etapa. A etapa é efetuada em TA. Etapa (3): Fase reversa na Source 30 RPC
O eluato HIC (da etapa (2)) é primeiramente condicionado pela adição de IPA (isopropanol). Uma coluna Source 30RPC é equilibrada contra um tampão de acetato de amônio, pH 7,6, contendo L-metionina, e 2propanol em uma concentração equivalente àquela do material carregado condicionado. Depois de retirar por fluxo o material não ligado com tampão de equilíbrio, a resina é lavada com tampão de acetato de amônio, pH 7,6, contendo L-metionina, e uma concentração aumentada de 2-propanol. O FSH é finalmente eluído pelo aumento adicional da concentração de 2propanof. A reunião de eluição é finalmente diluída sob agitação, com água contendo L-metionina. A reunião diluída é processada para a próximA etapa. A etapa é efetuada em TA.
Seguindo o procedimento acima, o fator de purificação - isto é, a proporção de pureza de FSH na amostra purificada contra a pureza de FSH no material de partida (FSH bruto) é de cerca de 40.000.
Exemplo 2 (conforme figura 2)
Etapa (-1): Ultrafiltração/diafiltracão do r-hFSH concentrado
Todas as operações foram efetuadas em condições refrigeradas (2-8 °C). O FSH bruto formando o material de partida para a purificação é derivado de coletas de cultura de células contendo FSH recombinante. Clarifica ção r-hFSH bruto foi filtrado através de um filtro de profundidade de
0,5 μιτι (tal como filtros Pall Profile II ou equivalente).
Ultrafiltracão
O produto clarificado foi primeiramente concentrado por ultrafiltração usando uma membrana de polietersulfona de 10 KD. O retentato concentrado foi, a seguir, diafiltrado contra pelo menos 5 diavolumes de tampão borato, pH 8,5 contendo L-metionina como antioxidante. A condutividade e o pH do retentato foram medidos para monitorar o progresso da diafiltração. O retentato foi, a seguir, concentrado ainda antes de fazer o sistema escoar. A unidade de ultrafiltração foi finalmente submetida a fluxo com tampão de diafiltração e o rinsato foi misturado com o retentato recuperado. A reunião progrediu para a próxima etapa.
Filtração
O produto concentrado foi filtrado através de um filtro de polietersulfona de 0,2 pm (ou equivalente).
Etapa (0): Troca aniônica em Q Sepharose FF
O material filtrado foi, a seguir, aplicado em uma resina de troca aniônica forte (Q-Sepharose FF) equilibrada contra tampão borato de sódio, pH 8,5, contendo L-metionina. Depois da carga, a coluna foi rinsada com tampão de equilíbrio para fluir todo o material não ligado. A coluna foi, a seguir, eluída com tampão borato de sódio pH 8,5, contendo NaCl (para aumentar a condutividade) e L-metionina (como um antioxidante). A reunião da eluição coletada foi processada para a cromatografia de afinidade de corante.
Etapa (1): Cromatografia de afinidade de corante em Blue Sepharose
A coluna de cromatografia de afinidade (resina de Blue Sepharose FF) foi primeiramente equilibrada com o tampão de eluição a partir da etapa de Q-Sepharose FF. O eluato de captura foi, a seguir, aplicado diretamente à resina. Depois da carga, o material não-ligado foi retirado por lavagem usando tampão de equilíbrio. O FSH foi finalmente eluído pelo fluxo da coluna com tampão fosfato de sódio em pH 7,0, contendo NaCl e Lmetionina. A reunião de eluição foi diretamente processada para a próxima etapa. A etapa foi efetuada em 2 - 8 °C.
Etapa (2): Cromatografia de interação hidrofóbica em Toyoperl Butyl 650M
O eluato de Blue Sepharose FF foi carregado em uma coluna Toyopearl Butyl 650M equilibrada contra um tampão de fosfato de sódio, pH 7,0, contendo sulfato de amônio e L-metionina. O material não ligado foi retirado por fluxo com tampão de equilíbrio. O FSH foi eluído com o mesmo tampão, mas com uma concentração reduzida de sulfato de amônio. O eluato foi processado para a próxima etapa. A etapa foi efetuada em TA.
Etapa (3): Fase reversa em Source 30 RPC
O eluato HIC (da etapa (2)) foi primeiramente condicionado pela adição de IPA (isopropanol). A coluna Source 30RPC foi equilibrada contra um tampão de acetato de amônio, pH 7,6, contendo L-metionina, e 2propanol em uma concentração equivalente àquela do material carregado condicionado. Depois de retirar por fluxo o material não ligado com tampão de equilíbrio, a resina é lavada com tampão de acetato de amônio, pH 7,6, contendo L-metionina, e uma concentração crescente de 2-propanol. O FSH é finalmente eluído peto aumento adicional da concentração de 2-propanol. A reunião da eluição é finalmente diluída sob agitação, com água contendo L-metionina. A reunião diluída é processada para a próxima etapa. O etapa foi efetuada em TA.
Etapa (4): Cromatografia de troca aniônica em resina Fractogel EMD TMAE hicap
Uma coluna de Fractogel EMD TMAE hicap foi primeiramente equilibrada com tampão borato de sódio, pH 8,5, contendo L-metionina. O material pós-RPC diluído (da etapa (3)) foi carregado na coluna. O material não ligado foi retirado por fluxo usando tampão de equilíbrio. O FSH é eluído da coluna aumentando a concentração salina de uma forma linear. A etapa foi efetuada em 2 - 8 °C.
Etapa (4’): Nanofiltração
O eluato da etapa Fractogel EMD-TMAE (4) foi aplicado diretamente a um dispositivo de nanofiltração de 20 nm em uma pressão de 3 bar sob nitrogênio. O filtrado é processado para a próxima etapa. A operação foi efetuada a 2 - 8°C.
Etapa 5: Ultrafiltracão do bolo
O material FSH nanofiltrado foi concentrado por filtração de fluxo tangencial em uma membrana de polietersulfona de 5 KD. Quando o retentato alcançou metade do volume inicial, o material foi trocado com tampão por diafiltração contra WFI.
A pureza das amostras
A pureza das amostras de FSH depois dos etapas de purificação foi determinada:
| Etapa de purificação | Pureza |
| Etapa (-1): Ultrafiltração/diafiitração | 19% de FSH • FSH determinado por RP-HPLC • Conteúdo de proteína total determinado pelo ensaio de Bradford |
| Etapa (0): Troca aniônica em Q Sepharose FF | 44% de FSH • FSH determinado por RP-HPLC • Conteúdo de proteína total determinado por Bradford |
| Etapa (1) Cromatografia de afinidade de corante em Blue Sepharose | 68% de FSH • FSH determinado por RP-HPLC; • Conteúdo de proteína total determinado por absorvância a 280 nm ou cerca de 420.000 ppm de HCP • Conteúdo de FSH determinado por RP-HPLC; • Conteúdo de proteína da célula hospedeira determinado por ELISA |
| Etapa (2): Cromatografia de interação hidrofóbica em Toyopearl Butyl 650M | Quantidade de impureza: 3400 ppm • Conteúdo de FSH determinado por RP-HPLC; • Conteúdo de proteína da célula hospedeira determinado por ELISA |
| Etapa (3): Fase reversa em Source 30 RPC | Quantidade de impureza: 170 ppm • Conteúdo de FSH determinado por RP-HPLC; • Conteúdo de proteína da célula hospedeira |
| determinado por ELISA | |
| Etapa (4): Cromatografia de troca aniônica em resina Fractogel EMD TMAE hicap | Quantidade de impureza: < 80 ppm • Conteúdo de FSH determinado por RP-HPLC; • Conteúdo de proteína da célula hospedeira determinado por ELISA |
Atividade biológica das amostras
A atividade biológica do r-hFSH purificado foi medida usando o método de ganho de peso ovariano de Steelman-Pohley. A atividade específica foi calculada usando a atividade biológica dividida pelo conteúdo de FSH conforme determinado por um método de SE-HPLC, conforme descrito abaixo.
A atividade específica do bolo final obtido são tipicamente entre 10.000 e 17.000 Ul/mg. Valores exemplares para as 2 amostras de um bolo de FSH final seguindo o método do Exemplo 2 são dados na Tabela 1.
Tabela 2. Atividade específica de rhFSH purificado do bolo da invenção
| Análise | Amostra 1 | Amostra 2 |
| Concentração de proteína por SE-HPLC (mg/mL) | 0,61 | 0,54 |
| Atividade específica (atividade biológica/SE-HPLC) | 12.600 Ul/mg | 14.600 Ul/mg |
Claims (2)
1/2
FIG 1
(1) submeter o eluato da etapa (0) a uma etapa de cromatografia de afinidade de corante em uma resina composta por esferas de agarose
10 reticuladas acopladas com um corante aniônico de antraquinona tal como Blue Sepharose FF, e fosfato, NaCl, L-metionina, em um pH 7 como eluente;
(2) submeter o eluato da etapa (1) a uma etapa de cromatografia de interação hidrofóbica em uma resina composta por esferass de polímero metacrílico hidroxiladas funcionalizadas com um grupo ligate Butil tal como
15 Toyopearl Butyl 650M, com fosfato, sulfato de amônio, L-metionina, em um pH 7 como eluente;
(3) submeter o eluato da etapa (2) a uma etapa de cromatografia de fase reversa em uma resina composta por matriz de poliestireno rígido/divinilbenzeno, monodimensionada tal como Source 30 RPC com
20 acetato de amônio, L-metionina, com 2-propanol em um pH 7,6 como eluente;
(4) submeter o eluato da etapa (3) a uma etapa de cromatografia de troca aniônica em uma resina de troca aniônica forte, como resina Fractogel EMD TMAE hicap, com borato, L-metionina, em um pH 8,5, e
25 NaCl;
(4') submeter o eluato da etapa (4) a uma etapa de nanofiltração; e (5) submeter o permeato do etapa (4') a um etapa de ultrafiltração.
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(-1) ultrafiltração;
5 (0) cromatografia de troca aniônica em uma resina de troca aniônica forte, como Q Sepharose FF com borato/NaCl, L-metionina, pH 8,5 como eluente;
(1) cromatografia de afinidade por corante;
(2) cromatografia de interação hidrofóbica;
(3) cromatografia de fase reversa; e
15 (4) cromatografia de troca aniônica.
19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizado pelo fato de que a segunda etapa da cromatografia de troca aniônica da Etapa (4) é executada usando uma resina de troca aniônica forte, como resina Fractogel EMD TMAE ou resina Q Sepharose
20 FF.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19, caracterizado pelo fato de que a segundo etapa da cromatografia de troca aniônica da Etapa (4) é executada usando tampão borato e um gradiente de concentração crescente de NaCl.
25 21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 20, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de nanofiltração (4') realizada na segunda etapa de cromatografia de troca aniônica (4).
22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de ultrafiltração (5), depois da
30 etapa de nanofiltração (4').
23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 22, caracterizado pelo fato de que qualquer um dos eluentes e/ou
Petição 870170076555, de 09/10/2017, pág. 8/14 tampões pode conter um antioxidante, particularmente L-metionina.
24. Método para purificar o FSH humano recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de submeter o FSH a:
(1) cromatografia de afinidade por corante;
(2) cromatografia de interação hidrofóbica; e a seguir
25 (3) cromatografia de fase reversa;
13. Método, de acordo com a reivindicação 10, 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que a cromatografia de troca aniônica da Etapa (0) é executada com uma resina de troca aniônica forte, como a resina Q Sepharose FF ou a resina Fractogel EMD TMAE.
30 14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de
10 a 13, caracterizado pelo fato de que a cromatografia de troca iônica da
Etapa (0) é executada usando tampão borato como eluente.
Petição 870170076555, de 09/10/2017, pág. 7/14
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o tampão borato está em um pH de 8,5.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 10 a 15, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma segunda
5 etapa de cromatografia de troca aniônica (4).
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a segunda etapa de cromatografia de troca aniônica da Etapa (4) é executada depois das etapas (1), (2) e (3).
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado 10 pelo fato de que as etapas são executadas na ordem:
(0) cromatografia de troca aniônica;
(1) cromatografia de afinidade por corante;
(2) cromatografia de interação hidrofóbica; e a seguir (3) cromatografia de fase reversa;
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de
15 1 a 9, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma etapa de cromatografia de troca aniônica (0).
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a etapa de cromatografia de troca aniônica é executada antes das etapas (1), (2) e (3).
20 12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que as etapas são executadas na ordem:
(0) cromatografia de troca aniônica;
(1) cromatografia de afinidade por corante;
5 (2) cromatografia de interação hidrofóbica; e (3) cromatografia de fase reversa; o qual pode ser executado em qualquer ordem.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cromatografia de afinidade de corante da Etapa (1) é efetuada
10 com uma resina com um corante aniônico de antraquinona imobilizado, como o Cibacron Blue F3G-A.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a resina usada para a cromatografia de afinidade de corante do Etapa (1) é uma resina composta por esferas de agarose reticuladas
15 acopladas com um corante aniônico de antraquinona tal como Blue Sepharose FF.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a cromatografia de afinidade de corante da Etapa (1) é executada usando tampão de fosfato de sódio em um pH de
20 6,5 a 11,5 como eluente.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) da Etapa (2) é executada usando uma resina composta por esferass de polímero metacrílico hidroxiladas funcionalizadas com um grupo ligate
25 Butil tal como Toyopearl Butyl 650M, ou uma resina com características similares.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a cromatografia de interação hidrofóbica da Etapa (2) é executada usando fosfato de sódio/sulfato de amônio como
30 eluente.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a etapa de cromatografia de fase reversa
Petição 870170076555, de 09/10/2017, pág. 6/14 da Etapa (3) é executada usando uma resina composta por matriz de poliestireno rígido/divinilbenzeno, monodimensionada tal como Source 30
RPC.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 5 a 7, caracterizado pelo fato de que a etapa de cromatografia de fase reversa da Etapa (3) é executada usando acetato de amônio com 2-propanol como eluente.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo fato de que as etapas são executadas na seguinte
10 ordem:
1. Método para purificar o FSH recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende a submissão de um líquido contendo FSH a:
2/2
ΤΑ
FIG 2
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