CN101087533A - 使用经热处理的奶和蛋白水解产物生产奶酪的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了一种方法，用于从奶组合物生产凝乳或奶酪，所述方法由下述步骤构成：加热奶，向经过热处理的奶中加入蛋白水解产物，向经过热处理的奶中加入凝结剂形成凝胶，以及将形成的凝胶加工成奶酪凝乳以及将乳清与凝乳分开。

Description

使用经热处理的奶和蛋白水解产物生产奶酪的方法
发明领域
本发明涉及生产奶酪的方法。
发明背景
在从乳组合物，例如牛奶生产奶酪的传统方法中，凝结是基本的步骤。
凝结可通过酸化和/或加入酶(凝结剂)例如凝乳酶(chymosine)来起始。凝结之后，奶被分离为凝乳和乳清。凝乳再被进一步加工成奶酪。酪蛋白组成凝乳的主要蛋白组分，因为奶酪是较之乳清更有价值的产品，因此人们需要使得被包括进凝乳的蛋白含量最大化。将乳清蛋白包括进凝乳将导致奶酪产率(＝从1L奶酪奶生产的kg奶酪)增加，这是人们想要的。
从多种奶来源进行的奶酪生产方法很久以来已为人们所知，并且针对多种不同类型的奶酪变种，这些方法已被详细描述(见，例如Cheese：Chemistry，Physics and Microbiology，Vol 1&2，1999，Ed.Fox，AspenPublications，Gaithersburg，Maryland；Encyclopedia of Dairy Sciences Vol 1-4，2003，Academic Press，London)。奶酪生产中的关键点是凝结过程，其中，酪蛋白胶束和亚胶束的溶解性降低。酶诱导的凝结被非常常见地使用。酶，例如牛凝乳酶，凝乳酶的微生物等价物，以及来自其它来源的其它酶已被描述过，很多种可以多种商品名获得。它们全部都可用于起始凝结过程。凝结中的第一步是切割κ-酪蛋白中的Phe105-Met106键。这导致κ-酪蛋白C末端部分：糖巨肽(GMP)被除去。GMP的去除导致酪蛋白胶束的联结，即，酪蛋白凝结。酪蛋白凝结导致凝胶形成，特定乳组合物中获得胶凝需要的时间与凝结剂活性直接相关。
加入凝结剂到最初的酪蛋白絮凝出现之间经历的时间被定义为凝结(结块(clotting))时间。奶酪奶中凝胶形成的速度以及凝胶的紧密度密切依赖于加入的酶的质量，钙离子、磷的浓度，温度和pH。最初的凝结之后，凝胶形成，凝胶的一致性随着胶束间键的增加而增加。胶束一起移动，凝结物收缩，由此排出乳清。该现象被已知为脱水收缩，其通过切割凝乳、增加温度以及通过发育乳酸菌增加产生的酸度而加速。
为了微生物安全性，在使用之前对奶酪奶进行热处理。多种热处理被用于奶，例如比杀菌温度稍高一些的热杀菌(thermisation)  (65℃，数秒)、低温巴氏灭菌(72℃，15秒)、高温巴氏灭菌(85℃，20秒)以及超高温(UHT)处理(例如1秒，145℃)。热处理提高奶的保存品质，破坏微生物。此外，对某些乳应用而言，可能需要特定的加热处理以获得想要的终产物特征，例如在酸奶制作中。就奶酪制作目的而言，热处理可能导致奶的性质不良(见，例如Singh & Waungana，Int Dairy J(2001)，11，543-551)。导致奶结块性质不良(例如，凝结时间增加、凝乳紧实速率降低或者凝乳强度降低)的热处理在本文剩余部分中被称为“高热处理”；得到的奶在全文中被称为“经高热的奶”。
高于60℃对奶进行加热时发生的显著变化包括乳清蛋白的变性，变性的乳清蛋白与酪蛋白胶束之间的相互作用，以及可溶钙、镁和磷酸盐转化为凝胶状态。酪蛋白胶束在高温下非常稳定，虽然在剧烈的加热温度下的确会发生zeta势、胶束sizem水合方面的变化以及一些联结-解离反应(Singh & Waungana，lnt Dairy J(2001)11，543-551；以及其中引用的参考文献)。高于65℃对奶进行加热时，乳清蛋白通过它们的肽的解折叠而变性。这些解折叠的蛋白再与酪蛋白胶束发生相互作用，或者简单地自身聚集，参与硫醇-二硫化物交换反应、疏水相互作用和离子连接。离子强度、pH、钙和蛋白质的浓度影响乳清蛋白变性的程度。蛋白热变性还被乳糖和其它糖、多元醇以及蛋白修饰试剂的存在影响。
变性的乳清蛋白已显示出与κ-酪蛋白在酪蛋白胶束表面上联结。主要相互作用被认为存在于β-乳球蛋白和κ-酪蛋白之间，并涉及二硫化物和疏水相互作用(Singh and Fox，J Dairy Res(1987)54，509-521)。变性的乳清蛋白的一部分不与酪蛋白胶束复合，但其与其它乳清蛋白形成聚集物。变性的乳清蛋白与酪蛋白胶束联结的程度显著取决于加热前奶的pH、钙和磷酸盐的水平、奶固体浓度以及加热体系的类型(水浴、间接或直接)。有报道称，间接加热较之使用直接加热(例如，注入蒸汽)的情况，会导致与胶束联结的β-乳球蛋白和α-乳清蛋白比例增加。在小于6.7的pH值加热导致与胶束联结的变性乳清蛋白数量增加，而更高的pH值下，乳清蛋白/κ-酪蛋白复合物从胶束表面解离(Singh & Waunanga，Int Dairy J(2001)11，543-551)。
热处理导致奶中的多种变化。最明显的变化是乳清蛋白的部分或完全变性。变性程度取决于热处理和奶中的条件，例如，pH以及添加剂(例如碳水化合物)的存在。对奶的热处理导致含有α-乳清蛋白和β-乳球蛋白的乳清蛋白聚集物的形成(Singh & Waungana，lnt Dairy J(2001)，11，543-551；Vasbinder，Casein-whey protein interactions in heated milk，Thesis，ISBN90-393-3194-4)。在70-100℃的温度范围酪蛋白胶束部分并不显著受影响。也存在于酪蛋白胶束中的磷酸钙在热处理时沉淀，冷却后其仅缓慢复溶。对奶的热处理还导致变性乳清蛋白与酪蛋白胶束之间的相互作用。该相互作用可以是共价的，其通过例如β-乳球蛋白和κ-酪蛋白之间的二硫键形成实现，这些相互作用使得酪蛋白胶束稳定。经热处理的奶的最终组成取决于奶pH和应用的温度。通过最终的奶组合物来测定经加热的奶的性质。
经高热的奶显示出不良的结块情况(Singh & Waunanga，Int Dairy J(2001)11，543-551)。结块时间增加，形成较弱较细的凝乳，较之正常情况其保留有更多的水。文献中对于结块时间增加的成因尚有争论。一种通常被接受的解释是κ-酪蛋白GMP的部分已与β-乳球蛋白发生了相互作用，这导致对凝结酶的位阻，从而抑制了κ-酪蛋白切割(见，例如Singhet al(1998)J Dairy Res.55，2005)。较弱的凝乳的现象有多种方式的解释。关于较弱的凝乳的一种解释是κ-酪蛋白被不充分地切割(见：Walstra& Jennes，(1984)Dairy Chemistry and Physics，John Wiley and sons Inc，USA)。另一种解释是热诱导的磷酸钙沉淀起作用(见，例如Schreibcr(2001)Int.Dairy J.11，553)。第三种解释是乳清-蛋白在热处理期间变性，与酪蛋白胶束联结，由此干扰了酪蛋白胶束-胶束相互作用(Vasbinder，Casein-whey protein interactions in heated milk，Thesis，ISBN 90-393-3194-4)。尚不清楚这些解释中哪种才是最相关的。
已知，热处理对于皱胃酶(rennet)凝结的不利影响可在一定程度上被克服，这通过a)将pH降低至大约6.2，b)将奶酸化至低于5.5，接着中和至6.6，或c)加入氯化钙来实现(Lucey et al(1993)Cheese yield andfactors affecting its control，special issue 9402 pp 448-456，International DairyFederaton)。但是，这些手段并非满意的解决方案，因为无法恢复原始的凝乳强度和结块时间。此外，在pH调节的情况下，需要对奶酪奶进行额外的操作。
使用经高热的奶用于奶酪制作的可能性将是人们希望的。一方面，热处理增加了奶的保质期，允许更长的运输和储存时间。另一方面，其导致奶酪产率的显著增加。已报道了多达10％或更多的增加。但是，阻止使用经高热的奶的因素是增加的结块时间和增加的凝乳脆弱性(weakness)(较之正常情况保留有更多水的较细的凝乳)。奶酪凝固的挤压期间增加的奶酪凝乳损失与凝乳脆弱性相关。解决经高热奶在奶酪生产中的缺陷是工业需要及人们所期望的。
发明内容
我们吃惊地发现，在奶酪制作工艺中，向经加热的奶中加入蛋白水解产、肽或肽的混合物使得奶结块时间的增加减少或消失。此外，加入蛋白水解产、肽或肽的混合物使得通常出现于这类情况中的增加的凝乳脆弱性减少或消失。本发明涉及从奶组合物生产凝乳或奶酪的方法，所述方法包括如下步骤：
加热奶，
向经过热处理的奶中加入蛋白水解产物，和/或肽和/或肽的混合物
向经过热处理的奶中加入凝结剂形成凝胶，以及
将形成的凝胶加工成奶酪凝乳以及将乳清与凝乳分离。
因此，本发明生产奶酪的方法，所述方法包括在升高的温度下对奶酪奶处理足够的时间，优选地，以导致凝结步骤期间奶结块行为不良，向经过热处理的奶中加入蛋白水解产物和/或肽和/或肽的混合物，向经过热处理的奶中加入凝结剂形成凝胶，将形成的凝胶加工成奶酪凝乳以及将乳清与凝乳分离。根据本发明，获得下述凝乳，其包含水解产物，并且其优选具有20mm或更少(对应于10分钟或更少)的结块时间(r)，更优选地，18mm或更少(对应于9分钟或更少)，以及优选地，100mm或更小的凝乳强度(k20)，更优选地，90mm或更小。结块时间按照实施例2的方法来测量。本发明还描述了水解产物和/或肽和/或肽的混合物用于在其中使用经热处理的奶的奶酪制作工艺中减少结块时间的用途，以及水解产物用于在其中使用经热处理的奶的奶酪制作工艺中增加凝乳的凝乳强度的用途。
优选地，肽包含2至5个氨基酸。肽混合物包含至少一种包含2至5个氨基酸的肽。水解产物包含至少一种包含2至5个氨基酸的肽。有利地，肽的氨基酸中的至少一种为Glu或Asp残基，或者肽包含Lys-Lys残基，或者肽是二肽Lys-Lys。
本文中，术语“乳组合物”和“奶”都将使用。本文中奶被看作乳组合物的例子。
本发明的另一方面涉及生产奶酪的方法，其包括1)通过热处理处理奶酪奶，2)向冷却的奶酪奶中加入蛋白水解产物和/或肽和/或肽的混合物，以及3)从所述乳组合物生产奶酪。
本发明的另一方面涉及通过本发明的方法生产的奶酪。
发明详述
奶酪
本发明中，术语“奶酪”指任何类型的奶酪，例如天然奶酪、奶酪类似物和经加工奶酪。奶酪可通过本领域已知的任何合适的方法获得，例如通过用皱胃酶对乳组合物进行的酶促凝结，或者通过用食品级酸或乳酸细菌生长产生的酸对乳组合物进行酸凝结来获得。在一种实施方式中，通过本发明的方法生产的奶酪是皱胃酶凝乳奶酪。乳组合物可经历传统的奶酪制作工艺。
经加工的奶酪优选从天然奶酪或奶酪类似物产生，这通过对奶酪进行蒸煮(cooking)和例如用乳化盐(例如磷酸盐和柠檬酸盐)乳化来实现。该方法还可包括加入香料/调味料。
术语“奶酪类似物”指奶酪样产品，其含有脂肪(例如，奶脂肪(例如奶油))作为其组成的一部分，并且，其还含有非奶成分，例如植物油作为其组成的一部分。
通过本发明的方法生产的奶酪包含奶酪的所有变种，例如软质奶酪、半硬奶酪和硬奶酪。在奶酪生产中，乳组合物的凝结优选通过皱胃酶或通过单独酸化来进行，分别产生皱胃酶凝乳和酸凝乳奶酪。新鲜的酸凝乳奶酪指下述奶酪变种，它们是通过酸化或酸和热的组合对奶、奶油或乳清加以凝结来生产的，一旦生产出来即可被消费，而无须完全成熟。新鲜的酸凝乳奶酪通常与皱胃酶凝乳奶酪变种(例如金文必奶酪(Camembert)、车打奶酪(Cheddar)、埃曼塔奶酪(Emmenthal))(凝结通常在6.4-6.6的pH值由皱胃酶的作用进行)的不同之处在于，凝结通常发生于酪蛋白等电点附近，即，例如pH4.6，或者使用升高的温度时，在更高的值，例如，在茅屋奶酪(Ricotta)的情况中，pH典型地为大约6.0，温度典型地为大约80℃。在本发明的一种优选实施方式中，奶酪属于皱胃酶凝乳奶酪一类。
马祖里拉奶酪(Mozzarella)是所谓拉丝饼状奶酪(pasta filata)或可延展凝乳奶酪，通常通过在热水中对新鲜凝乳进行独特的塑化和捏炼处理使其与众不同，这赋予加工完成的奶酪以特征性的纤维状结构和熔融及延展性质。在一种实施方式中，本发明还包括用于拉丝饼状奶酪的热延展处理，例如，用于生产马祖里拉奶酪。
乳组合物
根据本发明的乳组合物可以是包含奶成分的任何组合物。奶成分可以是奶的任何成分，例如奶脂肪、奶蛋白、酪蛋白、乳清蛋白和乳糖。奶的级分(fraction)可以是奶的任何级分，例如脱脂奶、奶油奶(buttermilk)、乳清、奶油、奶粉、全脂奶粉、脱脂奶粉。在本发明的一种优选的实施方式中，乳组合物包含奶、脱脂奶、奶油奶、全脂奶、乳清、奶油或其任何组合。在一种更为优选的实施方式中，乳组合物由奶，例如脱脂奶，全脂奶，奶油或其任何组合构成。
在本发明的其它一些实施方式中，乳组合物全部或部分地从经干燥的奶级分制备，例如，从全脂奶粉、脱脂奶粉、酪蛋白、酪蛋白酸盐、总奶蛋白或奶油奶粉(buttermilk powder)或其任何组合来制备。
根据本发明，乳组合物包含牛奶或一种或多种牛奶的级分。牛奶的级分可来自任何品种的母牛(Bos Taurus(Bos taurus taurus)、Bos indicus(Bosindicus taurus))以及它们的杂交品种。在一种实施方式中，乳组合物包含来自两种或多种母牛品种的牛奶和/或牛奶级分。乳组合物还包含来自用于奶酪制备的其它哺乳动物的奶，例如从山羊、水牛或骆驼获得的奶。
通常，将按照本发明用经热处理的奶来制造奶酪。此外，还可用下述的奶，其含有至少20wt％，优选至少30wt％，更优选至少50wt％以及最优选至少70wt％的经热处理奶，奶的剩余部分并没有按照本发明的手段经过热处理。
用于生产奶酪的乳组合物可被标准化为想要的组合物，这通过除去任何原始奶组分的全部或部分和/或通过向其中加入额外含量的此类组分来实现。这可以通过，例如，在到达乳品厂时将奶分离为奶油和奶来进行。因此，可按照传统方式，通过对奶进行分级分离，以及将级分重新组合，以获得想要的乳组合物的最终组成，来制备乳组合物。分离可在连续离心机上进行，这能产生具有非常低脂肪含量(即＜0.5％)的脱脂奶级分以及具有例如＞35％脂肪的奶油。乳组合物可通过将奶油和脱脂奶混合来制备。在另一种实施方式中，可通过使用超滤对蛋白质和/或酪蛋白含量加以标准化。乳组合物可具有已发现对于将由本发明的方法生产的奶酪来说合适的任何总脂肪含量。
在本发明的一种实施方式中，向乳组合物中加入钙。钙可在奶酪制作之前或期间的任何合适的步骤加入乳组合物，例如，在加入起始培养物之前、与其同时或之后加入。在一种优选的实施方式中，钙在热处理之前和之后都加入。钙可以以任何合适的形式加入。在一种优选的实施方式中，钙作为钙盐加入，例如，作为CaCl2加入。可向乳组合物中加入任何合适量的钙。加入的钙的浓度将通常在0.1-5.0mM的范围内，例如，1至3mM的范围内。如果CaCl2加入到乳组合物中，其量将通常在每100升乳组合物1-50g的范围内，例如每1000升乳组合物5-30g的范围内，优选地，每100升乳组合物10-20g的范围内。
可通过传统步骤降低脱脂奶的细菌数。在本发明的一种实施方式中，可在奶酪生产之前对乳组合物进行均质工艺，例如在对丹麦蓝奶酪的生产中。
热处理
人们公知：在商业加工操作期间对奶的热处理导致奶成分的大量物理化学变化。变化的类型和这些变化的程度取决于处理的温度、热处理的时间以及奶的组成，例如其pH、蛋白质和脂肪浓度以及阳离子(例如钙和镁)的存在。一些时候，参数的不同组合可能导致同样或相似的最终结果。例如，高温短时热处理可能具有与较低温度下较长时间热处理相似的效果。本领域专家已知将如何改变实验参数以针对不同加工途径获得相似的最终效果，或者知道将如何建立此类途径。
根据本发明，在升高的温度下对乳组合物加热一段时间，该时间优选足以导致凝结步骤中奶凝结不良。经热处理的奶指在至少75℃的温度被处理了至少1秒的奶，优选处理至少1分钟，更优选至少10分钟。热处理可在至少75℃温度进行，优选至少80℃。在一种实施方式中，热处理在75℃至145℃之间的温度进行，在一种优选的实施方式中，热处理在75℃至120℃之间的温度进行，在一种更优选的实施方式中，热处理在75℃至100℃之间的温度进行，在一种进一步更优选的实施方式中，热处理在80℃至90℃之间的温度进行。热处理的持续时间可以是适于获得不良的奶结块行为的任何时间。在一种实施方式中，热处理持续时间为1秒至30分钟之前。在一种实施方式中，热处理在75℃至90℃进行5秒至30分钟，在另一种实施方式中，热处理在80℃至90℃进行2秒至30分钟，在还一种实施方式中，热处理在80℃至145℃进行1秒至20分钟。热处理可以用本领域已知的任何方法来进行，例如在板式热交换器中、通过在槽或容器中对奶进行分批加热或通过蒸汽注入来进行。对乳清蛋白的热处理(单独进行，或在混合物中或在奶中进行)是公知的现象，其已在文献中有所描述(例如，Mulvihill & Donovan(1987)Ir.J.Food Sci.Techn.11，43-75)。可通过测定等电点pH范围或用NaCl饱和时的溶解度损失，来定量测量乳清蛋白的变性。乳清蛋白变性的另一种表现是侧链基团反应活性增加，尤其是β-乳球蛋白的巯基(Mulvihill & Donovan(1987)Ir.J.Food Sci.Techn.11，43-75及其中引用的参考文献)。在奶酪制作之前对奶进行巴氏灭菌导致非常有限的乳清蛋白变性，少于20％，以及更优选地，少于10％的变性。当热处理更为严酷时，变性程度将增加，如文献中所述(例如，Law & Leaver(1997)J Agric Food Chem 45，4255-4261；Law &Leaver(2000)J Agric Food Chem 48，672-679)。与巴氏灭菌相反，高热处理将导致高得多的乳清变性程度，为至少30％，或者至少40％，或者至少50％，或者至少60％，或者至少70％，或者甚至至少80％。
热处理的效果对加热时间和精确温度非常敏感。加热时间的略微变化导致经加热奶性质的变化。在工业环境中，加热过程被很好地控制和标准化。实验室过程更难于控制，例如加热时间的小量变化就可能导致经加热奶性质的略微改变。这导致各批经加热的奶之间10-20％的结果差异，这取决于被测量的性质。
蛋白水解产物
蛋白水解产物指对蛋白质水解形成的产物(或简言之，蛋白水解产物或经水解蛋白)，或该蛋白水解产物的级分，例如含有可溶肽的级分，或者蛋白水解产物和蛋白水解产物级分的混合物。
蛋白水解产物可通过将蛋白来源与单种蛋白酶或蛋白酶的组合一起温育来制备。此类蛋白酶可以是任何类型的蛋白酶，其包括但不限于内切蛋白酶、氨基肽酶、羧基肽酶或二氨基肽酶以及三氨基肽酶。不用酶生产或者部分酶促生产的水解产物也是本发明的一部分，例如，可使用酸，或者酸处理与酶处理的组合来生产水解产物。
蛋白来源理论上可以是任何蛋白来源。优选的来源是乳清蛋白、酪蛋白或其混合物，更优选地，乳清蛋白。根据本发明的包含乳清蛋白的组合物可以是包含乳清蛋白，例如奶、奶油和奶酪乳清的任何组合物。可以使用来自任何奶酪来源(包括车打奶酪、瑞士奶酪、马祖里拉奶酪等)的乳清。包含乳清蛋白的组合物可以是包含乳清蛋白的任何水溶液。乳清蛋白可通过本领域已知的任何方法获得。乳清蛋白制剂可以以多种形式通过商业途径获得，例如乳清蛋白浓缩物(WPC)和乳清蛋白分离物(WPI)。此类可通过商业途径获得的制剂的例子是BiPro(来自Davisco，USA)和Lacprodan MFGM-10或Lacprodan Alpha-10(来自ArIa Foods，Denmark)。用于水解的合适的蛋白底物还包括全脂奶、脱脂奶、酸酪蛋白、皱胃酶酪蛋白、酸乳清产品或者奶酪乳清产品。此外，植物性底物，例如小麦谷蛋白，碾磨过的大麦以及从例如大豆、水稻或玉米获得的蛋白级分是合适的底物。可通过商业途径获得的小麦谷蛋白的合适例子是SWP-500(Tate & Lyle，Belgium)。此外，经过脱酰胺的谷蛋白的水解产物也可有利地用于本发明的方法。
蛋白水解产物可以通过将蛋白底物与一种蛋白水解酶或蛋白水解酶的组合接触来制备。优选地，使用至少一种内切蛋白酶，更优选地，至少两种或多种内切蛋白酶。特别适合的是广谱内切蛋白酶，例如Alcalase和Collupuline。广谱内切蛋白酶表示具有至少三个偏好切割位点的内切蛋白酶。例子是木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胰蛋白酶、碱性丝氨酸蛋白酶(例如esperase)。此外，还可使用复合酶混合物，尤其是含内切蛋白酶的混合物，例如从Aspergillus orzae或Aspergillus niger获得的制剂。在使用超过一种蛋白酶的情况下，这些蛋白酶可同时加入到蛋白底物中。或者，蛋白酶可按照预订顺序加入到蛋白质中。可选地，在加入下一个蛋白酶之前对在水解过程中较早时候使用的一种或多种蛋白酶进行失活。此类失活可通过多种方式获得，对方法的选择取决于必须被失活的蛋白酶。失活处理包括但不限于热处理和pH改变。或者，可使用可通过商业途径获得的水解产物。
蛋白底物的水解程度(DH)是重要的参数。关于蛋白水解产物可获得的DH取决于大量参数，其包括但不限于：对特定蛋白酶的选择，允许水解进行的时间，反应条件(pH、温度、盐浓度等)以及在通过蛋白酶水解之前对蛋白底物的预先处理。适于根据本发明的方法的水解产物DH可在5-60的范围内，优选地，10-45，更优选地，15-40。水解产物可含有游离氨基酸。用于测定DH的方法是本领域技术人员已知的，例如，Dambmann，C.Improved method for determining food protein degree ofhydrolysis Journal of Food Science 2001，66，642-646描述的OPA方法。
可以以多种方式、方法对水解产物进一步加工，所述方式、方法包括但不限于：喷雾干燥、超滤、冷冻干燥、真空干燥。干燥后，干物质可被磨碎和/或过筛，以获得特定颗粒大小范围的级分。可向水解产物中加入化合物，以协助干燥，或者以影响经干燥水解产物的最终特征，例如，其形成团块(lump)的趋势或者其可湿性(wettability)。
肽
“肽”或“寡肽”在本文中被定义为通过肽键相连的至少两个氨基酸的链。术语“肽”或“寡肽”被认为是同义的(如通常所认识的那样)，按照上下文需要，每个术语可互换使用。“多肽”在本文中被定义包含超过30个氨基酸残基的链。本文中所有(寡)肽和多肽结构式或序列都是按照通常实践中那样，从氨基末端到羧基末端的方向从左到右书写的。
由2至5个氨基酸构成的肽是优选的。有利地，在本发明的方法中使用在pH6.5时具有净的负电荷的肽。该净的负电荷由一个或多个带负电荷氨基酸侧链的存在所介导。此外，因为例如糖基化和/或磷酸化而带负电荷的氨基酸，也非常有用于本发明的方法。优选地，肽的至少一个氨基酸是Glu(谷氨酸)或Asp(天冬氨酸)。
包含Lys(赖氨酸)、Arg(精氨酸)或His(组氨酸)的肽是较为不合适的。但是，含有Lys-Lys残基的肽在本发明的方法中令人吃惊地展示出了良好的结果。尤其是二肽Lys-Lys被有利地使用。在使用肽的混合物的情况下，优选地，肽的至少20mol％包含Glu和/或Asp。
肽的氨基酸序列优选存在于奶蛋白中，优选地，酪蛋白中。因此可通过水解酪蛋白形成肽来生产肽。还可以合成生产肽。
此外，可使用肽的混合物或者水解产物和一种或多种肽的混合物。
通常，本发明的方法中，奶中存在至少0.3mM以及优选地，至少0.6mM的肽。优选地，本发明的方法中，奶中存在至少0.3mM以及优选地，至少0.6mM的由2至5个氨基酸构成的肽。在加入超过一种肽的情况下，奶中肽的总和将通常为至少0.3mM，优选地，存在至少0.6mM的肽。此外，以至少0.3mM肽，优选地，至少0.3mM由2至5各氨基酸构成的肽的量向奶中加入水解产物是优选的。
蛋白水解酶
蛋白质可被看作由通过肽键相连的氨基酸构建材料块构成的杂聚物。蛋白质中的重复单元是具有氨基和羧基的中央alphs碳原子。除甘氨酸外，所谓的氨基酸侧链取代剩下的两个alpha碳氢原子中的一个。氨基酸侧链使得中央alpha碳不对称。通常，在蛋白质中发现氨基酸的L-对映异构体。下述术语描述了多种类型的聚合氨基酸。“肽”是具有确定的序列的氨基酸残基短链。虽然对于残基数量并没有真正的上限，但该术语通常表示下述的链，其性质主要取决于其氨基酸组成，并且没有固定的三维构象。术语“多肽”通常用于更长的链，通常具有确定的序列和长度，理论上，具有适合折叠为三维结构的合适长度。“蛋白质/蛋白”用于表示天然存在并且展示出确定的三维结构的多肽。蛋白质主要功能是催化化学反应得情况下，其通常被称为“酶”。蛋白酶是催化(多)肽和蛋白中肽键水解的酶。
在生理条件下，蛋白酶催化肽键的水解。International Union ofBiochemistry and Molecular Biology(1984)已推荐使用术语“肽酶”，用于肽键水解酶的亚组(亚类E.C.3.4.)。术语“蛋白酶”和“肽水解酶”同义于“肽酶”，也可用于本文中。“蛋白酶”包含两类酶：内切肽酶和外切肽酶，前者在蛋白中内部的点切割肽键，后者从N或C末端顺序除去氨基酸。“蛋白酶”用作为“内切肽酶”的同义词。肽键可出现于二肽、三肽、四肽、肽、多肽或蛋白的情况中。通常，天然肽和多肽的氨基酸组成包含20种不同的氨基酸，其展示出L-构型(除了甘氨酸之外，其不具有手性中心)。但是，蛋白酶的蛋白水解活性并不限于仅含20种天然氨基酸的肽。所谓非天然氨基酸之间的肽键，以及经修饰的氨基酸或氨基酸类似物之间的肽键也可被切割。一些蛋白酶在某些位置接受氨基酸的D-对映异构体。通常，蛋白酶显著的立体选择性使它们非常有用于手性拆分方法。很多蛋白酶展示出令人感兴趣的副活性，例如，脂酶活性、硫羟酯酶(thiol esterase)活性以及(去)酰胺酶活性。这些副活性通常不限于仅用于氨基酸，其可能非常有用于精细化工领域的生物转化。
真核微生物蛋白酶已由North(1982)综述过。最近，Suarez Rendueles和Wolf(1988)已对S.cerevisiae蛋白酶及其功能进行了综述。
除对键的水解切割之外，蛋白酶还可用于键的形成。这方面，键不仅包括肽和酰胺键，其还包括酯键。蛋白酶是催化特定键的切割还是形成首先取决于反应的热力学。酶，例如蛋白酶不会影响到反应的平衡。平衡取决于反应发生的特定条件。在生理条件下，反应的热力学是对肽水解有利的，这是因为两性离子产物具有热力学上非常稳定的结构。通过应用物理-化学原理影响平衡，或者通过对反应物及产物的浓度或性质加以操纵，或者通过利用酶反应的动力学参数，可能将蛋白酶应用于合成肽键的目的。水可混溶有机溶剂的加入降低了羧基组分离子化的程度，由此增加了反应可用的底物浓度。导致产品沉淀的两相***、水模拟物、反胶束、无水介质或经修饰的氨基和羧基通常用于提高产率。当可获得具有正确性质的蛋白酶时，将蛋白酶用于合成提供了很多好处。因为蛋白酶是立体选择性以及区域选择性的，因此通常不需要保护反应物上的敏感基团，并且不需要对反应物进行光学纯化。鉴于酶促合成的条件是温和的，可防止易发生变化的反应物或产物的外消旋和分解。除了氨基酸之间的键之外，还可通过正确选择的蛋白酶，将具有伯氨基、硫醇基或羧基的其它化合物连接起来。此外，还可通过某些蛋白酶合成酯、硫羟酯和酰胺。蛋白酶已显示在对单糖、二糖和三糖，核苷和核黄素的酰化中展示出区域选择性。与某些时候苛刻的反应条件下的稳定性相关的问题可通过正确的配制来避免。胶囊化和固定化不仅能使酶稳定，其还允许从反应介质中容易地回收和分离。广泛交联、用醛处理或用某些聚合物(例如葡聚糖、聚乙二醇、聚亚胺)覆盖表面可大大延长生物催化剂的寿命。
受限的蛋白水解的选择性看起来更直接涉及蛋白酶-底物相互作用。可从仅识别特异性氨基酸靶序列的蛋白水解酶获得特异性。另一方面，这还可能是某些条件下(例如pH、离子强度或二级修饰)“加工位点”选择性暴露的结果，这允许其它时候是非特异性的蛋白酶催化高度特异性的事件。通过受限的蛋白水解对液泡酶原的活化给出了后一类情况的例子。
已知有四大类蛋白酶，这是通过它们活性位点中主要的官能团命名的：“丝氨酸”、“硫醇”或“半胱氨酸”、“天冬氨酸”或“羧基”以及“金属”蛋白酶。关于蛋白酶的这些大类、小类以及未分类蛋白酶的详细现有综述可在Methods in Enzymology part 244 and 248(A.J.Barrett ed，1994 and 1995)中找到。
除蛋白酶的催化机制之外，水解蛋白酶的另一重要方面是蛋白酶的特异性。蛋白酶的特异性表示蛋白酶可能水解何种底物。二十种天然氨基酸提供了制成肽的大量可能性。用二十种氨基酸，人们已可制成400种二肽以及800种不同的三肽等。随着肽更长，可能性的数量将变得近乎无限。某些蛋白酶仅在非常特异的位置水解特定序列。蛋白酶与肽底物的相互作用可涉及肽底物上的一至十个氨基酸残基。使用大的蛋白底物时，底物中有甚至更多残基与蛋白酶相互作用。但是，这可能包括被结合切割活性位点之外的残基与蛋白酶较少特异性的相互作用。通常，特异性识别被限制到线性的肽，其在蛋白酶活性位点结合。
描述底物与蛋白酶相互作用的命名法已在1967年由Schechter和Berger(Biochem.Biophys.Res.Com.，1967，27，157-162)引入，现在其被广泛用于文献中。在该***中，考虑多肽底物的氨基酸残基与活性位点中所谓“亚位点”的结合。约定俗成地，蛋白酶上这些亚位点被称为S(针对亚位点)，相应的氨基酸残基被称为P(针对肽)。易断开的键的N末端侧的氨基酸残基被编号为P3、P2、P1，C末端的那些残基被编号为P1’、P2’、P3’。P1或P1’残基是定位于易断开的键旁边的氨基酸残基。切割位点周围的底物残基可被编号直到P8。蛋白酶上与底物结合残基互补的相应亚位点被编号为S3、S2、S1、S1’、S2’、S3’等等。肽结合位点中亚位点的偏好决定了蛋白酶在特定的点切割某些特定氨基酸序列的偏好。底物氨基酸序列应当与亚位点展示出的偏好一致。针对某底物的特异性明显取决于针对该底物的结合亲和性，以及易断开的键随后被水解的速度。因此，蛋白酶对某底物的特异性通常由其kcat/Km比例表示，这作为特异性常数更为已知。在该特异性常数中，kcat代表周转(turn-over)速率，而Km是解离常数。
除了催化和结合涉及的氨基酸残基外，蛋白酶含有很多其它基本的氨基酸残基。一些残基在折叠中是关键的，一些残基保持蛋白酶的整体三位构造，一些残基可能涉及对蛋白水解活性的调控，一些残基可能将蛋白酶靶向特定位置。很多蛋白酶在活性位点外含有一个或多个针对金属离子的结合位点。这些金属离子通常在结构稳定方面发挥作用。此外，分泌的真核微生物蛋白酶可被广泛糖基化。可发生N-和O-连接的糖基化。糖基化可协助蛋白折叠，可增加溶解度，防止聚集，以及使得成熟蛋白原样稳定。此外，糖基化程度可能影响分泌以及蛋白质的水结合。
理论上，较大蛋白的模块(modular)组织是自然界的普通现象(general theme)。特别地，在较大的多模块架构(framework)中，典型的蛋白水解模块显示出平均100至400个氨基酸的大小。这对应于分泌进培养基的大多数球形蛋白水解酶的平均大小。如上文所讨论的，多肽模块是能作为独立个体折叠及发挥功能的多肽片段。用于此类模块的另一术语是结构域。但是，结构域较之模块用于更广泛的语境中。本文中使用的术语结构域通常指多肽链的一部分，其在三维结构中描述典型的折叠拓扑学。在蛋白质中，结构域以可变的程度发生相互作用，但不如结构域中的结构元件那样强烈。其它术语，例如亚结构域以及折叠单元也用于文献中。同样观察到，共有特定功能的很多蛋白可能共有相同的结构域。此类结构域可从一级结构来识别，所述一级结构可能展示出对于特定结构域来说典型的某些序列图案。典型例子是单核苷酸结合折叠、纤维素结合结构域、螺旋-转角-螺旋DNA结合基元、锌指、EF手(EF hands)、膜锚(membrane anchor)。模块指被预期能自主折叠及发挥功能的那些结构域。本领域技术人员知道如何在一级结构中鉴定特定结构域，这通过将常用计算机软件应用于所述结构和来自其它生物或物种的同源序列来实现。
虽然多模块或多结构域蛋白可能作为珠串(string of beads)出现，但已观察到实质上更加复杂的构造的集合。在同一的多肽链上存在多个珠子时，这些珠子通常被称为模块或结构域。当这些珠子并非存在一个或相同的多肽链上，而是通过非共价相互作用形成集合时，术语“亚基”就用于命名这种珠子。亚基可以是通过一种或同样的基因，或者通过不同基因转录的。多模块蛋白可在转录后经历蛋白水解加工，产生多个亚基。个体亚基可能由多个结构域构成。典型地，100-300个氨基酸的较小的球形蛋白通常仅由一个结构域构成。
通常，按照其分子性质或者按照其功能性质来对蛋白酶分类。分子分类基于蛋白酶的一级结构。蛋白的一级结构代表其氨基酸序列，这可以通过对应基因的核苷酸序列获得。对一级结构中相似性的广泛追踪可能令人注意到催化机制和其它性质的相似性，这甚至可能延伸到功能性质。术语“家族”用于描述一组蛋白酶，它们展示出进化关系，这基于它们一级结构的相似性。此类家族的成员被相信是通过分歧进化从相同祖先产生的。在家族内，基于对序列比较更细节的精细提取(refinement)对一级结构进一步的亚分组产生了亚家族。按照蛋白酶三维折叠进行的分类可包含二级结构、三级结构和四级结构。通常，对二级结构的分类限于二级结构元件的内容和总体定向。三级结构中的相似性可导致对超家族或族(clan)的鉴定。超家族或族是被认为具有共同祖先的家族的组，因为它们展示出共同的三维折叠。通常，三级结构比一级结构更为保守。因此，一级结构的相似性并非总是反映相似的功能性质。事实上，功能性质可能高度分歧，产生令人感兴趣的新性质。目前，还没有用四级结构来对多种蛋白酶分类。这可能是由于结构数据库对简单球形蛋白酶的某些偏见导致的。很多要经历活化、调控或者复杂反应级联的蛋白水解***可能由多种结构域或亚基构成。此类蛋白酶***的结构组织中的普遍现象可能导致新的分类类型。
序列信息不存在时，可对蛋白酶进行多种类型的功能性分类。通过参考被催化的反应来对酶分类和命名是酶命名学的常见原理。这种方法还是对酶进行EC编号的基础原理(Enzyme Nomenclature 1992 Academic Press，Orlando)。Enzyme Nomenclature 1992中可鉴定出两种类型的蛋白酶(EC3.4)：外切肽酶的那些(EC 3.4.11-19)以及内切肽酶的那些(EC 3.4.21-24、3.4.99)。内切肽酶在肽链的内部区域切割肽键，远离末端切割。外切蛋白仅从肽链末端切割残基。在游离N末端发挥作用的外切肽酶可释放出单个氨基酸残基、二肽或三肽，其被分别称为氨基肽酶(EC 3.4.11)、二肽肽酶(EC 3.4.14)和三肽肽酶(EC 3.3.14)。在羧基末端起始肽加工，释放出单个氨基酸的蛋白酶被称为羧基肽酶(EC 3.4.16-18)。肽-二肽酶(EC 3.4.15)从羧基末端除去二肽。外切肽酶和内切肽酶存在于同一种酶中的是二肽酶(EC 3.4.13)，其仅特异性地将二肽切为它们氨基酸的两半。omega肽酶(EC 3.4.19)除去被取代、环状或通过异肽键连接的末端残基。
除了蛋白酶对肽链进行切割的位置之外，对于每种类型的蛋白酶来说，基于底物中被偏好的氨基酸残基的性质加以分类也是可行的。通常，人们可将蛋白酶分为宽、中等和窄特异性。一些蛋白酶以它们水解的特定蛋白质或多肽来简单命名，例如，角蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶。窄特异性可能由其分别去除或切割的一种特定的氨基酸或者一条特异的序列命名。当蛋白酶显示出对于P1或P1’位置的一种氨基酸的特别偏好时，该氨基酸的名称可能成为限定词。例如，脯氨酰氨基肽酶从肽的氨基末端移除脯氨酸(脯氨酸是P1残基)。当脯氨酸氨基侧的键被切开时(脯氨酸是P1’残基时)，使用“X-Pro”或“脯氨酸”，例如，脯氨酸羧基肽酶从羧基末端去除脯氨酸。脯氨酰内切肽酶(或者Pro-X)在脯氨酸之后进行切割，而脯氨酸内切蛋白(X-Pro)在脯氨酸之前进行切割。在易断开的肽键之前的氨基酸残基指将羧基贡献给肽键的氨基酸残基。在易断开的肽键之后的氨基酸残基指将氨基贡献给肽键的氨基酸残基。根据传统，氨基酸链从氨基末端(起始)到羧基末端(结尾)，其照此被编号。内切蛋白酶还可显示出对于P1或P1’位特定氨基酸的明显偏好，例如甘氨酰内切蛋白酶、肽-赖氨酸内切蛋白酶、谷氨酰内切肽酶。此外，蛋白酶可展示出对于共有某种类同之处的某组氨基酸的偏好。此类被偏好的氨基酸的组可能包含：疏水氨基酸，仅大体积的疏水氨基酸，小的疏水氨基酸，或者就是小的氨基酸，大的带正电荷氨基酸等等。除了对P1或P1’残基的偏好之外，还可能对蛋白酶上的其它亚位点偏好的残基存在特定偏好或排除(exclusion)。此类多种偏好导致了下述蛋白酶，它们仅对同时满足多种结合要求的那些序列非常特异。一般而言，应当认识到，蛋白酶是相当不加选择的酶。甚至非常特异的蛋白酶仍可切割不符合通常观察到的该蛋白酶偏好的肽。此外，应当认识到，环境条件，例如pH、温度、离子强度、水活性、溶剂的存在、竞争性底物或抑制剂的存在可能影响蛋白酶的偏好。环境条件不仅影响蛋白酶，其还影响蛋白底物被展示给蛋白酶的方式。
可基于其催化机制对蛋白酶进行亚分类。应当理解，对于每种催化机制而言，上文所述的基于特异性的分类将导致针对每种类型的机制的进一步亚分类。已知有四大类蛋白酶，按照其活性位点中主要的官能团对它们加以命名：丝氨酸蛋白酶(EC 3.4.21内切肽酶、EC 3.4.16羧基肽酶)、硫醇或半胱氨酸蛋白酶(EC 3.4.22内切肽酶、EC 3.4.18羧基肽酶)、羧基或天冬氨酸蛋白酶(EC 3.4.23内切肽酶)和金属蛋白酶(EC 3.4.24内切肽酶、EC 3.4.18羧基肽酶)。对于每种催化类型的蛋白酶成员存在特征性的抑制剂。这些小抑制剂不可逆地修饰蛋白酶活性位点的氨基酸残基。例如，丝氨酸蛋白酶被与活性丝氨酸反应的苯甲基磺酰氟(PMSF)和二异丙基氟磷酸酯(DFP)失活，而氯甲基酮衍生物与催化三联体(catalytictriad)的组氨酸发生反应。磷阿米酮(phosphoramidon)和1，10菲罗啉(phenanthroline)典型地抑制金属蛋白酶。培普他丁(pepstatin)造成的抑制通常指向天冬氨酸蛋白酶。E64抑制特异性硫醇蛋白酶。阿码他定(amastatin)和贝他定(bestatin)抑制多种氨基肽酶。甚至在一个催化类中，也能观察到蛋白酶对抑制剂的易感性的相当大的变化。这在一定程度上可能与蛋白酶特异性相关。当结合位点的构造阻止了基于机制的抑制剂接近催化位点时，此类蛋白酶就避免了被抑制，对基于抑制的这类机制类型的鉴定受到阻碍。例如，胰凝乳蛋白酶抑制(chymostation)是对具有类似胰凝乳蛋白酶特异性的丝氨酸蛋白酶的有效抑制剂，弹性蛋白酶抑制剂(elastatinal)抑制类似丝氨酸蛋白酶的弹性蛋白酶，但其不与胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶发生反应，4氨基PMSF(APMSF)仅抑制具有类似胰蛋白酶特异性的丝氨酸蛋白酶。在对蛋白酶的分类中，对于抑制剂使用的广泛考虑包括Barret and Salvesen，Proteinase Inhibitors，Elsevier Amstardam，1986；Bond and Beynon(eds)，Proteolytic Enzymes，A Practical Approach，IRLPress，Oxford，1989；Methods in Enzymology，eds E.J.Barret，volume 244，1994 and volume 248，1995；E.Shaw，Cysteinyl proteinases and their selectiveinactivation，Adv Enzymol.63：271-347(1990)。
蛋白酶的催化机制及其构象完整性的需求主要确定可利用蛋白酶的条件。找到能在应用条件下执行最佳功能的蛋白酶是一大挑战。通常，蛋白酶必须执行功能的条件并非最优，这仅代表对于特定应用的理想条件和适合蛋白酶的最佳条件之间的折衷。除蛋白酶的特定质性之外，应当认识到，蛋白底物的展现也取决于条件，并且还同样确定了哪些条件对于蛋白水解最为有效。与应用相关的对酶的规范包括，例如，pH依赖性，温度依赖性，对于金属离子、离子强度、盐浓度、溶剂相容性的敏感度或者对它们的依赖性。另一至关重要的因素是蛋白酶的比活性。酶的比活性越高，需要用于特定转化的酶就越少。更少的酶需求暗示了更低的成本以及更低的蛋白污染水平。
pH是确定应用中蛋白酶表现的重要参数。因此，pH依赖性是对蛋白酶加以分组的重要参数。鉴定出的大组是酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和强碱性蛋白酶。最优pH仅在一定程度上与蛋白水解机制匹配，例如，天冬氨酸蛋白酶通常在酸性pH下最优，金属蛋白酶和硫醇蛋白酶通常在大约中性至略碱性下最优，丝氨酸肽酶主要在碱性和强碱性区域具有活性。对于每类而言，例外都是已知的。除此之外，***的总体水活性也有着重要作用。蛋白酶的pH最优值被定义为：在特定环境，特定条件下，蛋白酶对于其大部分底物展示出最佳水解的pH范围。该范围可以较窄，例如1个pH单位，也可以相当宽，3-4个pH单位。通常，pH最优值还取决于蛋白底物的性质。周转速率以及特异性可作为pH的函数变化。对于特定效果而言，可能需要使用远离其pH最优值的蛋白酶，因为要避免生产较不被希望获得的肽。较不被希望获得的肽可能例如是非常短的肽或者导致苦味的肽。此外，更窄的特异性可能是选择偏离对于周转速率来说最优条件的条件的理由。取决于pH，特异性可能较窄，例如，仅在一个特定位置或在一个特定氨基酸之前或之后切割肽链，或者更宽，例如在多个位置或者在更多种不同类型的氨基酸之前或之后对链进行切割。事实上，pH依赖性可能是在应用中调节蛋白水解活性的重要工具。加工期间pH发生改变的情况下，无须进行进一步处理以使蛋白酶失活，蛋白水解就可能自发停止。在一些情况下，蛋白水解自身可能是pH改变的驱动者。
在需要低温的应用中，可强调在低温至中等温度下的高内在活性来选择蛋白酶。因为在此类条件下，失活是相对较慢的，在这些条件下，活性可能会在很大程度上决定产量。在仅在短时期内需要蛋白酶活性的过程中，蛋白酶的稳定性可被用作为开关，以关掉蛋白酶的活性。在此类情况下，可能优先考虑更易变的而非具有非常高的热稳定性的蛋白酶。
可能在对合适的蛋白酶的选择中发挥作用的其它环境参数可以是其对盐的敏感度。与金属离子(这在多种天然物质中经常发现有低浓度的)的相容性可能对于某些应用很关键。特别是用金属蛋白酶时，某些离子可能代替催化金属离子，使得活性降低或者甚至完全消失。在一些应用中，必须故意加入金属离子，以防止与蛋白酶协作的金属离子流失。人们公知，出于对酶稳定性和寿命的考虑，必须提供钙离子，以防止结合蛋白质的钙的解离。
对于蛋白酶的生物学性质和进化的综合评述在van den Hombergh：Thesis Landbouwuniversiteit Wageningen：An analysis of the proteolytic systemin Aspergillus in order to improve protein production ISBN 90-5485-545-2中发表，其通过引用被并入本文。
蛋白水解产物及对经高热的奶的奶结块行为的影响
在下述实施例中，用多种蛋白酶来消化乳清蛋白，并针对它们改善经高热奶不良结块行为以形成奶酪的能力对得到的水解产物加以测试。数据显示，一些水解产物能显著改善结块行为，而另一些没有或几乎没有作用。实施例用作阐述目的。本申请中描述的方法允许鉴定出与实施例描述的有效蛋白水解产物具有相同或相似效果的其它蛋白水解产物。此类水解产物可由乳清蛋白制备，但或者可从来自下述来源的其它蛋白材料来制备，所述来源例如但不限于牛奶、大豆、小麦、玉米、豌豆、马铃薯和蛋。实施例描述了特定的蛋白酶，这用于阐述方法，并非限制用另外的蛋白酶来制备具有想要的性质的蛋白水解产物。水解产物的想要的性质是降低经高热奶的结块时间以及增加得到的凝乳的强度。
Formagraph
Formagraph是设计来记录奶酪奶的凝结性质的仪器。其作为工具比较皱胃酶溶液的用途已被描述(MacMahon & Brown，J Dairy Sci(1982)65，1639-1642)。Formagraph测量允许在奶酪制作期间测定三个参数，细节由McMahon & Brown所述。它们是r：奶凝结时间，这是开始形成凝胶所需要的时间；k20：凝乳紧实时间，这是从开始形成凝胶到达到20mm的宽度所需要的时间，以及a30：凝乳紧实度，这是加入酶之后30分钟图(graph)的宽度。k20相当于足以切割奶酪凝乳的凝乳紧实度。下述实施例中使用Formagraph 11700型(Foss Electric，Benelux)，用87％甘油作为阻尼(damper)液体。r和k20时间以记录纸上测量的mm表示。1mm距离对应于30秒的时间。
实施例1 乳清蛋白水解
将乳清蛋白(Bipro，来自Davisco)溶解于水(10％w/w)中，使用HCl或NaOH调节至适当的pH。根据使用的蛋白酶来选择pH。用蛋白酶在60℃对蛋白溶液处理4小时，其间没有pH控制。基于蛋白质每种蛋白酶加5％v/w(例如，每100g蛋白质，5mL蛋白酶溶液)。使用两种蛋白酶的情况下，两种都基于蛋白质加5％w/v。在这两种情况下，加入第一种蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶(Alcalase)或木瓜蛋白酶(Collupuline))并且在60℃温育2.5小时之后，加入PSE作为第二种蛋白酶，接着再进行1.5小时温育。随后通过热处理(85℃，10分钟)来使蛋白酶失活。然后使用NaOH或HCl将pH调节至5.0。通过离心分离可溶和不可溶的蛋白质物质，对上清液进行真空干燥(4小时，60℃)。经干燥的蛋白被磨为细粉，用于后续实验。在一些情况下，省略离心步骤，对水解产物整体真空干燥，并磨为细粉。
表1中描述的蛋白酶被用于在指定的pH值下，使用描述过的程序来水解乳清蛋白。
  蛋白酶     从何处获得     水解的起始pH
  Alcalase 2.4L     Novozymes     6.5
  Protease SP446     Novozymes     6.5
  Fromase L2000     DSM     5.5
  PSEa     5.0
  Collupuline液体     DSM     5.0
  Collupuline液体+PSE     DSM     5.0
  Alcalase+PSE     Novozymes     6.5
表1：从Apergillus niger的培养液获得PSE，作为用于乳清蛋白水解的蛋白酶。A：PSE＝脯氨酸特异性内切蛋白酶液体，其含有10U/ml的蛋白酶。按照WO 02/45525所述从Aspergillus niger的培养液中获得PSE，单位见WO 02/45524所述。
实施例2 乳清蛋白水解产物对于经高热的奶凝结的影响
通过在轻柔搅拌下将11克奶粉(Nilac，NIZO food research)溶解于100克蒸馏水中来制备低热脱脂奶。在80℃对这种奶进行10分钟加热，冷却至31℃。未经热处理的奶被用作为参考。将奶样品转移至Formagraph。加入乳清蛋白水解产物(10％，基于蛋白质：每100g奶蛋白，10克乳清蛋白水解产物)，通过加入凝结剂(每ml 0.08 IMCU，Maxiren，来自DSM)来起始奶凝结。测定结块时间(r)和凝乳强度(k20)。对于多种水解产物的结果示于表2中。
用于乳清水解的蛋白酶   r(mm)   k20(mm)
无蛋白酶，未加热的奶，未加乳清蛋白   15   38
无蛋白酶，经高热的奶，未加乳清蛋白   25   140
AlcalaseTM(枯草杆菌蛋白酶)   15   75
Protease SP446   26   125
Fromase L2000   20   125
PSE   24   125
CollupulineTM(木瓜蛋白酶)   10   80
Collupuline+PSE   15   88
Alcalase+PSE   18   100
表2：乳清蛋白水解产物对于经高热的奶的结块时间和凝乳强度的影响。在对照中，没有加入乳清蛋白水解产物。1mm对应于30秒。
表中数据清楚显示：乳清蛋白水解产物对于结块时间和凝乳强度的影响取决于用于乳清水解的蛋白酶。特别合适的是广谱内切蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶—枯草杆菌蛋白酶(Alcalase)和木瓜蛋白酶(Collupuline)，这两种单独或与PSE组合。它们能将经高热的奶的结块时间降低至未加热的奶的水平，或者甚至更低(对Collupuline而言)。此外，在这些情况下，经高热的奶的凝乳强度显著增加。高度特异性的蛋白酶SP446、FromaseL2000和PSE在所用的条件下不能导致结块时间或凝乳强度的强烈降低，由此表明，所用的水解产物的DH是重要的参数。
实施例3  乳清蛋白水解产物对于经高热的奶的胶凝特征的影响的剂量依 赖性
按照实施例2所述，令经高热的奶结块，其中使用多种剂量的经Collupuline消化的乳清蛋白水解产物。实验条件和对照如实施例2所述。结果展示于表3中。
水解产物的％(基于蛋白质)   r(mm)   k20(mm)
未加热的奶，未加水解产物   15   38
经高热的奶，未加水解产物     25     140
2％     20     115
5％     16     105
10％     10     80
表3：经Collupuline消化的乳清蛋白水解产物对于经高热的奶的奶结块特征的影响的剂量依赖性。1mm对应于30秒。
结果表明，较之没有加水解产物的经高热的奶，乳清蛋白水解产物逐渐增加的剂量导致了改进的r值和k20值。
实施例4 制备微型奶酪的方法
按照Shakeel-Ur-Rehman et al.(Protocol for the manufacture of miniaturecheeses in Lait，78(1998)，607-620)所述来生产微型奶酪。使用经高热(80℃，10分钟)的牛奶。在一些情况下，直接使用经巴氏灭菌的全脂均质奶来代替原始牛奶。将经高热的奶转移至宽口塑料离心瓶(每瓶200mL)，冷却至31℃。随后，将1.8个单位的起始培养物DS 5LT1(DSMGist B.V.，Delft，The Netherlands)加入到离心瓶中每份200ml经巴氏灭菌的奶中，奶成熟20分钟。然后，加入CaCl2(每200mL成熟的奶，132μl的1mol·L-1的溶液)，接着加入蛋白水解产物。最后，加入凝结剂(每ml 0.04 IMCU)。将奶溶液在31℃保持40-50分钟，直到形成凝结物。通过张紧线切割器(cutters of stretched wire)对凝结物进行手工切割，以1cm为间隔切割。复原(healing)进行2分钟，接着轻柔搅拌10分钟。之后，在对凝乳/乳清混合物的持续搅拌下，30分钟将温度逐渐升高至39℃。达到6.2的pH后，在室温，以1,700g对凝乳/乳清离心60分钟。排出乳清，将凝乳保持在36℃水浴中。每15分钟颠倒一次奶酪，直到pH降低至5.2-5.3，然后在室温下于17,000g离心20分钟。生产完成之后对奶酪进行称重。
实施例5 加入二肽对于经高热的奶的胶凝特征的影响
针对它们改善经高热(80℃，10分钟)的奶的奶结块特征的能力，对多种二肽进行了测试。按照实施例1所述，使用向其中加入了1.8mMCaCl2的全脂奶(Campina，The Netherlands)来进行奶结块实验。结果示于表4中。
  二肽     剂量(％w/v)   r(以mm表示)   k20(以mm表示)
无     -   36   180
  Glu     0.15   36   180
  Glu-Glu     0.02   30   130
  Glu-Glu     0.05   29   120
  Glu-Glu     0.10   27   100
  Glu-Glu     0.15   25   95
  Lys-Lys     0.15   27   115
  Leu-Leu     0.15   36   180
  Ala-Ala     0.15   36   180
表4.多种肽对于经高热的奶的结块行为的影响。1mm对应于30秒。
表4中的结果表明，较之没有加入肽的情况，含有在奶的pH(pH6.5-6.7)带负电荷氨基酸侧链的glu-glu肽给出了对r和k20值的最大改善。加入游离谷氨酸没有效果。改善明显是剂量依赖性的，这可从浓度系列推断出来。含有在奶的pH(pH6.5-6.7)带正电荷氨基酸侧链的lys-lys肽也展示出降低的r和k20值，但是改善较之相近浓度下的glu-glu肽要小。不含带电荷侧链的Leu-Leu和Ala-Ala对于r和k20值没有影响。明显地，肽必须含有电荷氨基酸侧链，优选地，带负电荷的氨基酸侧链，以获得结块特征的改善。
实施例6 用经高热的奶组合水解产物或肽对奶酪产率的提高
使用在80℃加热10分钟的全脂牛奶，按照实施例4所述来制备微型奶酪。加入按照实施例7所述制备的GMO水解产物至0.2％(w/v)，以改善结块特征。在一项单独实验中，加入实施例5所述的肽glu-glu至0.5％，代替水解产物。在第一项对照实验中，使用经高热的奶，不加水解产物或肽。在第二项对照实验中，从经巴氏灭菌的全脂奶而非经高热的奶来制备奶酪。在该对照实验中加入与用于经高热的奶同样浓度的水解产物或肽。从经高热的奶制备的奶酪在水解产物或肽的存在下展示出正常的结块行为，获得紧实的微型奶酪。在没有向经高热的奶加入水解产物或肽的对照实验中，结块行为很差，形成了非常脆弱的凝乳，其具有很差的一致性。
较之用巴氏灭菌奶进行的相应对照实验，从添加有水解产物或肽的经高热的奶制备的奶酪显示出了提高的奶酪产率。在GMP水解产物的情况下，获得了基于湿重而言22％；基于干重为7％的产率增加。在加入glu-glu肽的情况下，湿重增加为16％，对应的干重增加为2％。结果显示，向经高热的奶中加入glu-glu肽或GMP-水解产物导致紧实的奶酪凝乳的形成，并且奶酪产率有明显增加。
实施例7 GMP-水解产物对于经高热的奶的胶凝特征的影响
将Lacprodan CGMP-10(Arla Foods，Denmark)溶解于水(10％w/w)中，加热至55℃。用苹果酸将pH调节至pH4.5，加入PSE(4％，基于蛋白质)。溶液保持于55℃，搅拌3小时。然后对液体进行热处理(7秒，130℃)，在10kDa分离点的膜上浓缩，喷雾干燥。水解产物具有12％的DH。使用实施例2描述的程序，针对其改善经高热的奶的奶结块特征的能力，对水解产物进行测试。在该实验中，使用在80℃加热10分钟的全脂奶(Gampina，The Netherlands)，向其中加入1.8mM的CaCl2。结果示于表5中。
  水解产物的％(基于蛋白质) r(以mm表示) k20(以mm表示)
  0.00 36 210
  0.15 25 130
  0.30 21 100
表5.GMP-水解产物对于经高热的奶的奶结块特征的影响的剂量依赖性。1mm对应于30秒。
表5中的数据清楚地展示了水解产物对于经高热的奶的结块性质的正面影响。较之其中没加水解产物的情况，加入水解产物导致r和k20值降低。水解产物的作用明显是剂量依赖性的。
实施例8 谷蛋白水解产物对于经高热的奶的胶凝特征的影响
用Flavourzyme(Novozymes，Denmark获得)或AccellerzymeNP50000(oDSM，The Netherlands)对脱酰胺化的谷蛋白蛋白的(SWP，从Tate and Lyle，Belgium获得)进行消化，主要使用实施例1所述的程序。脱酰胺化的谷蛋白含有高摩尔百分比的谷氨酸残基。在Formagraph实验中，加入CaCl2至1.8mM之后，针对它们改善经高热(80℃，10分钟)的全脂奶的结块特征的潜力对水解产物加以测试。在对照实验中，对经高热的奶不进行添加。结果示于表6中。
DH(％) 剂量(％/w/v) r(以mm表示) k20(以mm表示)
对照 34 215
SWP-Flavourzyme 31 0.30 23 155
SWP-N50000 7 0.30 24 180
表6.加入SWP-水解产物对于经高热的奶的结块性质的影响。1mm对应于30秒。
明显地，加入两种水解产物都导致了降低的r和k20值，如表6中的数字所示。明显地，具有更高DH的水解产物(SWP-Flavourzyme：DH：31％)给出了最好的改善结果。
实施例9 改善经高热的奶的胶凝性质的肽的鉴定
将按照实施例7所述制备的GMP-水解产物(750mg)悬浮于25ml0.1M乙酸铵(pH5.0)中，并离心(12000rpm，Sorvall，SA600rotor)。在0.22μm Millipore过滤器上对清澈的上清液加以过滤。将体积为3ml的该溶液上样至Hiload 26/60 Superdex，肽为30pg(Pharmacia)，用0.1M乙酸铵(pH5.0)平衡过，以2.5ml/分钟进行色谱分析；在280nm处监测洗脱液。收集10ml的级分，冻干。将冻干的级分重新溶解于原始样品体积中，针对它们改善经高热(80℃，10分钟)的奶的皱胃酶凝乳行为的能力加以测试。按照实施例2所述的程序使经高热的奶凝结，不同之处在于凝结在96孔微滴定板中以200μl的体积进行。所有物质都加入后对奶的pH加以监测，以鉴定出与原始的奶pH可能的偏差。有偏差的情况下，重复实验。加入肽和皱胃酶后，将96孔板在30℃温育2小时，之后将板颠倒，猛烈振荡以除去未结块的奶。结块的奶留在孔中，而未结块的奶或结块不好的奶就从孔中去除了。汇合收集该试验中呈阳性的级分，冻干，用于在用溶剂A(MilliQ水+2％乙腈+0.065％三氟乙酸)平衡过的3ml Resource RPC柱上进行第二次分级分离。样品施加之后，用4倍柱体积的溶液A洗柱(3ml/分钟)，之后运用处于A中的0-50％B线性梯度(B：20％MilliQ，80％乙腈，0.05％TFA)。收集1ml的级分，冻干，重新溶解于其原始体积中。在前文所述的微滴定板方法中，针对它们改善经高热的奶的结块行为的能力，对重新溶解的级分加以测试。对最具有活性的级分进行质谱分析。鉴定出了下述的肽：
肽序列 在奶蛋白中存在于：
Thr-Leu-Glu κ-酪蛋白残基145-147
Glu-Ile-Asn κ-酪蛋白残基158-160αs2酪蛋白残基84-86
Ser-Gly-Glu-Pro κ-酪蛋白残基127-130
Thr-Thr-Glu κ-酪蛋白残基135-137
Thr-Thr-Glu-Ala κ-酪蛋白残基135-138
表7.分级分离之后在GMP水解产物中鉴定出的肽。
鉴定出的肽都来自糖巨肽(GMP)，这是奶酪加工期间通过凝乳酶从奶中酪蛋白胶束释放出的κ-酪蛋白的一部分。鉴于GMP是奶酪乳清的一部分，预期也可从奶酪乳清蛋白制剂生产同样的肽。
为了验证鉴定出的肽导致观察到的影响，对它们进行合成和纯化(Pepscan，Lelystad，The Netherlands)，获得了＞90％纯的制剂。使用上文所述的MTP程序，在经高热的奶的结块中对肽进行测试。使用了若干种肽浓度。结果示于表8中。
肽 应用于奶中的浓度(mM) 紧实凝胶的形成
无 - 否
Thr-Leu-Glu 2.5、1.25、0.62、0.25 是，除了在0.25mM时
Glu-Ile-Asn 2.5、1.25、0.62、0.25 是，除了在0.25mM时
Ser-Gly-Glu-Pro 2.5、1.25、0.62、0.25 是，除了在0.25mM时
Thr-Thr-Glu 2.5、1.25、0.62、0.25 是，除了在0.25mM时
Thr-Thr-Glu-Ala 2.5、1.25、0.62、0.25 是，除了在0.25mM时
表8.合成的肽对于经高热的奶的结块行为的影响
结果清楚地验证了：鉴定出的肽导致经高热的奶的改善的结块行为。0.62mM的浓度足以提供改善，而0.25mM的浓度不足以获得紧实的凝胶。肽全部都具有存在谷氨酸残基的特征，该残基在奶酪制作早期奶的pH(pH6.5-6.9)下向肽提供了净的负电荷。
实施例10 多种合成肽对于经高热的奶的结块行为的影响
实施例9中描述的结果表明，含有带负的净电荷的肽导致了经高热的奶的结块行为的改善。制备了若干种肽用于测试该假设。在实施例9中描述的MTP试验中针对其改善行为对它们加以试验。结果示于表9中。
肽 应用于奶中的浓度(mM) 紧实凝胶的形成
无 - 否
Phe-Leu-Glu-Pro 2.5、1.25、0.62、0.25 是，除了在0.25mM时
Phe-Leu-Gln-Pro 2.5、1.25、0.62、0.25 否
Leu-Pro-Glu 2.5、1.25、0.62、0.25 是，除了在0.25mM时
Leu-Pro-Asp 2.5、1.25、0.62、0.25 是，除了在0.25mM时
Leu-Pro-Ala 2.5、1.25、0.62、0.25 否
Leu-Pro-Cys 2.5、1.25、0.62、0.25 否
表9.多种合成的肽对于经高热的奶的结块行为的影响
结果验证了从实施例9获得的观点：含有负的净电荷的肽能提供改善的结块行为。肽phe-leu-glu-pro和phe-leu-gln-pro仅有一个位置不同：带负电荷的谷氨酸(glu)被非常类似但不带电荷的谷氨酰胺(gln)替换。这种替换导致在经高热的奶的奶结块中的改善作用消失。这清楚地表明，谷氨酸带来的负电荷对于获得经高热的奶的改善的结块行为是很重要的。用其它肽获得的结果对其进行了验证：用不带电荷的氨基酸丙氨酸(ala)或半胱氨酸(cys)代替val-pro-glu中的谷氨酸(glu)，丧失了对奶结块的影响。数据清楚表明，含有谷氨酸或天冬氨酸的小的肽能改善经高热的奶的奶结块行为。这些肽在奶酪制作期间奶的pH(pH6.5-6.9)下全部都是具有负电荷的。显示出对奶结块行为具有正面作用的肽含有含量为25-33mo％的带负电荷氨基酸(glu，asp)，不存在带正电荷的氨基酸(arg、lys、his)。

Claims (14)

1.从奶组合物生产凝乳或奶酪的方法，所述方法包括如下步骤：
加热奶，
向经过热处理的奶中加入蛋白水解产物，和/或肽和/或肽的混合物向所述经过热处理的奶中加入凝结剂形成凝胶，以及
将形成的凝胶加工成奶酪凝乳，以及将乳清与所述凝乳分离。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白水解产物从乳清蛋白、酪蛋白或酪蛋白酸盐或其混合物获得，优选地，从乳清蛋白获得。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，使用具有5至60的DH的蛋白水解产物，优选地，10至45的DH，更优选地，15至40的DH。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述的肽是包含2至5个氨基酸的肽，或者是包含含有2至5个氨基酸的肽的蛋白水解产物或肽的混合物。
5.如权利要求1或4所述的方法，其中，所述的肽在pH 6.5时具有净的负电荷，或者包含Lys-Lys残基。
6.如权利要求1、4或5所述的方法，其中，所述的肽包含Glu或Asp残基，和/或包含至少20mol％的Glu或Asp残基。
7.可从权利要求1至6中任意一项所述的方法获得的凝乳，其包含蛋白水解产物和/或肽和/或肽的混合物，并且其具有20mm(对应于10分钟)或更少的结块时间(r)和/或100mm或更少的凝乳强度(k20)。
8.从权利要求7的凝乳或从权利要求1至6中任意一项所述的方法生产的奶酪。
9.乳制品，其包含权利要求7的凝乳，或权利要求8的奶酪，或者其由权利要求7的凝乳或权利要求8的奶酪制得。
10.水解产物和/或肽和/或肽的混合物用于在其中使用经热处理的奶的奶酪制作工艺中降低结块时间的用途。
11.水解产物和/或肽和/或肽的混合物用于在其中使用经热处理的奶的奶酪制作工艺中增加凝乳强度的用途。
12.水解产物和/或肽和/或肽的混合物用于在其中使用经热处理的奶的奶酪制作工艺中增加奶酪产率的用途。
13.水解产物和/或肽和/或肽的混合物在生产由经热处理的奶制备的奶酪中的用途。
14.水解产物和/或肽和/或肽的混合物在生产由热处理的奶制备的乳制品中的用途。
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