CN101081373A

CN101081373A - 一种阳离子交换晶胶层析介质及其制备方法

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Publication number: CN101081373A
Application number: CNA2007100698189A
Authority: CN
Inventors: 贠军贤; 姚克俭; 沈绍传
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2007-06-29
Filing date: 2007-06-29
Publication date: 2007-12-05
Anticipated expiration: 2027-06-29
Also published as: CN100574883C

Abstract

本发明公开了一种新型阳离子交换超大孔连续床晶胶(cryogel)层析分离介质及其制备方法。所述的阳离子交换晶胶介质内有羧基型功能基团，晶胶介质孔径为5～400μm，孔隙率50～98％。制备时，将晶胶聚合物单体和交联剂的水溶液，加入催化剂后置于冷却***中进行结晶致孔和聚合反应，后升温使冰晶融化形成超大孔隙，得到晶胶基质；再将可与晶胶基质发生接枝反应的带有羧基的单体在30～90℃及催化剂的作用下，固载在晶胶基质内即得阳离子交换晶胶介质。所述的晶胶介质连通性好、分离性能良好、吸附容量大；可方便地再生，重复使用可达20次以上。

Description

一种阳离子交换晶胶层析介质及其制备方法

(一)技术领域

本发明属于生物分离与医药技术领域，涉及一种阳离子交换型超大孔连续床晶胶(Cryogel)层析分离介质及其制备方法。

(二)背景技术

超大孔连续床晶胶层析分离方法(Supermacroporous CryogelChromatography，简称晶胶层析)，是2002年出现的一种新型生物层析分离技术，可在高流速下实现从复杂微生物发酵液、培养液、裂解液等原料液中直接提取和分离目标物。离子交换晶胶是晶胶层析中经常使用的介质，在生物大分子的吸附和层析分离方面十分有效，对目标生物大分子的吸附容量较大，洗脱方便。因此，在生物大分子和药物分子的分离纯化领域得到了广泛应用。

以羧基(-COO-)为功能基团的晶胶是阳离子交换晶胶介质中的一种。现有文献资料中(Savina等，Polymer 46，9596-9603，2005)曾用丙烯酸为接枝聚合单体，以聚丙烯酰胺基晶胶基质为介质骨架，通过接枝聚合，得到了一种阳离子交换晶胶介质，其阳离子交换功能基团为但事先需将基质进行干燥处理，然后进行接枝反应，所得介质的吸附容量需提高。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一种新的带有羧基型功能基团的阳离子交换型超大孔连续床晶胶分离介质。

本发明所述阳离子交换超大孔连续床晶胶介质(cryogel)孔径为5～400μm，孔隙率50～98％，所述的晶胶介质带有如下羧基型阳离子交换功能基团：

其中所述的功能基团是由晶胶基质与可和晶胶基质发生接枝反应的带有羧基的单体反应形成聚合物中带有的基团。

所述的晶胶介质有较小的等板高度和较大的吸附容量，当流速在0.1～10cm/min时，晶胶床柱等板高度小于0.2cm，吸附容量大于10mg溶菌酶/g晶胶介质。

本发明提供了一种所述阳离子交换型超大孔连续床晶胶介质的制备方法，包括如下步骤：

(1)将床层骨架聚合物单体和交联剂制备成总质量百分比浓度2～14％的水溶液，加入催化剂A后将反应液置于冷却***中结晶并进行聚合反应，后升温使晶体形成超大孔隙，得到所述的超大孔连续床晶胶基质；所述的床层骨架聚合物单体为含有氨基或酰胺基的可聚合单体；所述的A催化剂为下列之一：过硫酸铵和四甲基乙二胺任意比例的混合物、三乙醇胺；所述的聚合物单体：交联剂：催化剂A的投料质量比为1∶0.01～0.5∶0.001～0.1。

(2)将可与晶胶基质发生接枝反应的带有羧基的单体在催化剂B的作用下，通过接枝反应固载在晶胶介质基质内，即得到所述的阳离子交换晶胶介质，所述的催化剂B是高价Cu离子的溶液。

上述步骤(2)中所述的带有羧基的单体使用时先配成浓度为0.001～5mol/L的溶液，所述的带有羧基的单体溶液的用量为所述的晶胶介质基质体积的0.5～10倍。

进一步，所述的带有羧基的单体可与基质发生接枝反应，可选有烯键和羧基的单体，优选下列之一或两种任意比例的组合：衣康酸、衣康酸盐。所述的烯键(C＝C)可与晶胶介质基质中的酰胺键(-CONH₂-)在催化剂B的作用下进行接枝反应，从而将功能基团固载于晶胶基质内。

所述步骤(2)中催化剂B可为0.001～0.5mol/L的高价Cu离子的溶液，所述的高价Cu离子的溶液的体积用量为所述的晶胶基质体积的0.5倍以上。

步骤(2)中接枝反应的温度在30～90℃，优选40～60℃；反应时间0.5～24小时，优选1～5小时。

所述的床层骨架聚合物单体为含有氨基或酰胺基的可聚合单体，可为下列一种或两种或两种以上任意比例的混合物：丙烯酰胺(AAm)、N，N-二甲基丙烯酰胺(DMAAm)、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)，更优选丙烯酰胺(AAm)或N，N-二甲基丙烯酰胺(DMAAm)。

所述的交联剂为下列之一： N，N′-亚甲基双丙烯酰胺(MBAAm)、N，N′-双烯丙酰基乙二胺，优选为N，N′-亚甲基双丙烯酰胺(MBAAm)。

所述的催化剂A要针对不同的聚合物单体进行选择，常为相应聚合反应的引发剂或是加速剂，针对本发明所具体使用的床层骨架聚合物单体和交联剂，A催化剂可为下列之一：过硫酸铵和四甲基乙二胺任意比例的混合物、三乙醇胺；优选为过硫酸铵(APS)和四甲基乙二胺(TEMED)的混合物。

所述的步骤(1)中反应液在冷却***中-60～0℃条件下冷却结晶。

进一步，所述的步骤(1)中反应液冷却结晶***的温度变化历程为：

(A)降温：由0℃下降到-30～-10℃；

(B)恒温：恒温5～24小时；

(C)升温：升温至室温，在室温下使晶体形成超大孔隙，得到所述的超大孔连续床晶胶基质。

更进一步，降温过程可以分步进行，可先降到一个比较高的温度，恒温一段时间后再降温到降低的温度，逐步进行，直到降到设定的温度。

用本发明提供的方法制备的晶胶介质，具有如下特性：

1)晶胶介质的物理性能：孔隙率50～98％，孔径范围5～400μm，连通性好。以水为例，当水流速在0.1～10cm/min范围内，介质的结构基本不变。

2)晶胶介质的吸附分离性能：流速在0.1～10cm/min范围内，晶胶床柱等板高度小于0.2cm，分离性能良好，以溶菌酶为例，吸附容量大于10mg溶菌酶/g介质。

3)晶胶介质的寿命：可方便地再生，重复使用次数达20次以上。

本发明所述的阳离子交换型晶胶介质及其制备具有如下优点：

1)晶胶介质传质阻力小，连通性好，可在高流速范围内操作；

2)对生物大分子的吸附容量较大，分离效率高，洗脱容易，再生方便；

3)应用领域广阔：允许微生物细胞或细胞碎片顺利通过，可在高流速下从含有微生物细胞、细胞碎片等的发酵液、培养液、裂解液等复杂料液***中直接分离目标物，适于基因工程下游目标物、常规发酵物、生化药物等的大规模分离提取和纯化。

4)单体材料易得，接枝反应中不需要对晶胶基质预先干燥，接枝反应条件温和易行，制备工艺简单，成本低，规模化生产十分容易。

(四)具体实施方式：

以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此：

实施例1

将2.25g DMAEMA和AAm(质量比0.5∶1)单体，0.0225g交联剂MBAAm溶于14ml去离子水中，搅拌均匀后，迅速加入10.5mgTEMED和12mg APS，将所得混合液装入内径16mm、长100mm的玻璃层析柱内，密封后，在可程序控温的恒温冷却***中，进行冷却结晶致孔。温度变化历程为：

(A)降温：由0℃下降到-30℃；

(B)恒温：恒温24小时；

(C)升温：升温至室温。

然后，在室温下融化晶体，得到超大孔连续床晶胶介质基质，体积16ml。将基质与160ml浓度0.001mol/L的衣康酸钠单体溶液，在75ml 0.005mol/L Cu³⁺的溶液催化作用下，于30℃下进行接枝聚合反应24h，得到阳离子交换晶胶介质。其孔隙率50％，孔径范围5～80μm；水流速在0.1～10cm/min范围内，介质的结构不变，晶胶床柱内等板高度0.06cm；吸附容量12mg溶菌酶/g介质，以2mol/L NaCl和0.5mol/L NaOH再生，重复使用30次以上。

实施例2

将2.77g DMAAm单体，0.554g交联剂N，N′-双烯丙酰基乙二胺溶于53ml去离子水中，搅拌均匀后，迅速加入14mg三乙醇胺，将所得混合液装入内径26mm、长150mm的玻璃层析柱内，密封后，在可程序控温的恒温冷却***中，进行冷却结晶致孔。温度变化历程为：

(A)降温：由0℃下降到-60℃；

(B)升温：升温至-4℃；

(C)恒温：恒温1小时；

(D)降温：由-4℃重新降温至-15℃；

(E)恒温：恒温18小时；

(F)升温：升温至室温。

然后，在室温下融化晶体，形成超大孔隙，得到超大孔连续床晶胶介质基质，体积56ml。将基质与120ml 2.5mol/L的衣康酸钠和2.5mol/L衣康酸的单体溶液(1∶1)，在150ml 0.1mol/L Cu³⁺的溶液催化作用下，于60℃下进行接枝聚合反应时间5h，得到阳离子交换晶胶介质。其孔隙率86％，孔径范围20～250μm；水流速在0.1～10cm/min范围内，介质的结构不变，晶胶床柱内等板高度0.13cm；吸附容量36mg溶菌酶/g介质，以1mol/L NaCl和0.2mol/L NaOH再生，重复使用25次以上。

实施例3

将0.76gAAm和DMAAm(1∶0.2)单体，0.38g交联剂MBAAm溶于12ml去离子水中，搅拌均匀后，迅速加入40mg TEMED和36mgAPS，将所得混合液装入内径10mm、长100mm的玻璃层析柱内，密封后，在可程序控温的恒温冷却***中，进行冷却结晶致孔。温度变化历程为：

(A)降温：由0℃下降到-22℃；

(B)恒温：恒温8小时；

(C)升温：升温至室温。

然后，在室温下融化晶体，得到超大孔连续床晶胶介质基质，体积13ml。将基质与52ml 0.5mol/L的衣康酸钾单体溶液，在6.51ml0.5mol/L Cu³⁺的溶液催化作用下，于90℃下进行接枝聚合反应时间0.5h，得到阳离子交换晶胶介质。其孔隙率73％，孔径范围5～150μm；水流速在0.1～10cm/min范围内，介质的结构不变，晶胶床柱内等板高度0.08cm；吸附容量52mg溶菌酶/g介质，以2mol/L NaCl和0.5mol/L NaOH再生，重复使用25次以上。

实施例4

将1.2g AAm单体，0.1g交联剂MBAAm溶于63.5ml去离子水中，搅拌均匀后，迅速加入10mg TEMED和14mg APS，将所得混合液装入内径26mm、长150mm的玻璃层析柱内，密封后，在可程序控温的恒温冷却***中，进行冷却结晶致孔。温度变化历程为：

(A)降温：由0℃下降到-10℃；

(B)恒温：恒温18小时；

(C)升温：升温至室温。

然后，在室温下融化晶体，得到超大孔连续床晶胶介质基质，体积64ml。将基质与65ml浓度1.8mol/L的衣康酸单体溶液，在100ml0.3mol/L的Cu³⁺的溶液催化作用下，于45℃下进行接枝聚合反应时间2h，得到阳离子交换晶胶介质。其孔隙率98％，孔径范围50～400μm；水流速在0.1～10cm/min范围内，介质的结构不变，晶胶床柱内等板高度0.197cm；吸附容量111mg溶菌酶/g介质，以1mol/L NaCl和0.5mol/L NaOH再生，可重复使用25次以上。

Claims

1.一种阳离子交换超大孔连续床晶胶介质(cryogel)，其特征在于所述的晶胶介质孔径为5～400μm，孔隙率50～98％，所述的晶胶介质带有如下羧基型阳离子交换功能基团：

所述的阳离子交换超大孔连续床晶胶介质的制备包括如下步骤：

(1)将床层骨架聚合物单体和交联剂制备成总质量百分比浓度2～14％的水溶液，加入催化剂A后将反应液置于冷却***中结晶并进行聚合反应，后升温使晶体形成超大孔隙，得到所述的超大孔连续床晶胶基质；所述的催化剂A为下列之一：过硫酸铵和四甲基乙二胺任意比例的混合物、三乙醇胺；

(2)将可与晶胶基质发生接枝反应的带有羧基的单体在催化剂B的作用下，通过接枝反应固载在晶胶介质基质内，即得到所述的阳离子交换晶胶介质；所述的催化剂B为高价Cu离子的溶液。

2.一种制备如权利要求1所述的阳离子交换型超大孔连续床晶胶介质的方法，包括如下步骤：

(1)将床层骨架聚合物单体和交联剂制备成总质量百分比浓度2～14％的水溶液，加入催化剂A后将反应液置于冷却***中结晶并进行聚合反应，后升温使晶体形成超大孔隙，得到所述的超大孔连续床晶胶基质；所述的床层骨架聚合物单体为含有氨基或酰胺基的可聚合单体；所述的催化剂A为下列之一：过硫酸铵和四甲基乙二胺任意比例的混合物、三乙醇胺；所述的聚合物单体∶交联剂∶催化剂A的投料质量比为1∶0.01～0.5∶0.001～0.1。

3.如权利要求2所述的阳离子交换型超大孔连续床晶胶介质，其特征在于所述的步骤(2)中带有羧基的单体为下列之一或两种任意比例的组合：衣康酸、衣康酸盐。

4.如权利要求3所述的阳离子交换型超大孔连续床晶胶介质的制备方法，其特征在于所述的步骤(2)中带有羧基的单体先配成水溶液，浓度为0.00 1～5mol/L，所述的带有羧基的单体水溶液的体积用量为所述的晶胶基质体积的0.5～10倍。

5.如权利要求2所述的阳离子交换型超大孔连续床晶胶介质的制备方法，其特征在于所述的步骤(2)中催化剂B为浓度为0.001～0.5mol/L的高价Cu离子的溶液，所述的高价Cu离子的溶液的体积用量为所述的晶胶基质体积的0.5倍以上。

6.如权利要求2所述的步骤(2)中接枝反应的温度在30～90℃，反应时间0.5～24小时。

7.如权利要求2所述的阳离子交换型超大孔连续床晶胶介质的制备方法，其特征在于所述的床层骨架聚合物单体为下列一种或两种或两种以上任意比例的混合物：丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯；

8.如权利要求2所述的阳离子交换型超大孔连续床晶胶介质的制备方法，其特征在于所述的交联剂为下列之一：N，N′-亚甲基双丙烯酰胺、N，N′-双烯丙酰基乙二胺。

9.如权利要求2～8之一所述的阳离子交换型超大孔连续床晶胶介质的制备方法，其特征在于所述的步骤(1)中反应液在冷却***中-60～0℃条件下冷却结晶。

10.如权利要求9所述的阳离子交换型超大孔连续床晶胶介质的制备方法，其特征在于所述的步骤(1)中反应液冷却结晶***的温度变化历程为：(A)降温：由0℃下降到-30～-10℃；(B)恒温：恒温5～24小时；(C)升温：升温至室温，在室温下使晶体形成超大孔隙，得到所述的超大孔连续床晶胶基质。