CN101071105A - 同一比色池测定葡萄糖及1,5-脱水葡萄糖醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了同一比色池测定葡萄糖及1,5-脱水葡萄糖醇的方法,具体为:首先用三羟甲基氨基甲烷和盐酸组成的缓冲溶液处理血清,经由GK和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联***将血清中葡萄糖彻底转化为不与PROD反应的6-磷酸葡萄糖酸内酯,以除去内源性葡萄糖的干扰,同时并测定吸光变化以测定葡萄糖含量;然后加浓度为200mmol/L的N-2-羟乙基哌嗪N′-2-乙烷磺酸溶液,把被测的1,5-脱水葡萄糖醇氧化成1,5-脱水果糖和H2O2,H2O2释放出新生态的氧将与HRP、4-AAP和HTIB反应***作用发生Trinders显色反应后(无色到红色)进行比色测定1,5-脱水葡萄糖醇的含量。本发明在同一比色池对葡萄糖和1,5-脱水葡萄糖醇进行检测,具有灵敏、准确、稳定、特异性等特点,降低了检测成本,为糖尿病的检测与治疗监控提供了新的方法。
Description
技术领域
本发明属于生命科学一临床化学领域,涉及在同一比色池测定葡萄糖及1,5-脱水葡萄糖醇测定1,5-脱水葡萄糖醇。
背景技术
血清中糖醇类物质主要是葡萄糖(Glu)和1,5-脱水葡萄糖醇(1,5-AG)。1,5-AG是呋喃葡萄糖的C1-脱氧形式,主要来源于食物,它存在于人的脑脊液、血清中,在体内形成稳定的贮存池,血清中其含量在多元糖醇类物质中仅次于Glu。糖尿病时随着血糖浓度的升高,肾小管重吸收1,5-AG能力下降导致血清中1,5-AG含量明显下降。研究表明,血清1,5-AG检测作为筛选糖尿病的随机实验比其他评价实验更为灵敏。而1,5-AG的测定方法虽多,如色谱法、全自动连续注射***-酶测定法和微柱酶法,但均需昂贵的专用仪器,操作繁琐,不适合于临床常规检验。1994年Fukumura建立了全酶法[4]测定血清1,5-AG。全酶法是1,5-AG最简便的测定方法,但首先要去除血清内源性Glu的干扰。葡萄糖测定的常规方法是:Glu在葡萄糖氧化酶(GOD)作用下生成葡萄糖酸和过氧化氢(H2O2),后者与酚及4-AAP在过氧化物酶(POD)作用下生成红色醌类化合物,可在500nm处检测,其颜色的深浅与葡萄糖含量成正比。这两种物质在国外是检测糖尿病的常规指标,分开测定成本很高,如酶法测定1,5-AG须去除血清葡萄糖的干扰(而又没有测定葡萄糖着实存在浪费)。
发明内容
为了降低测定葡萄糖、1,5-脱水葡萄糖醇的成本,充分利用全酶法测定1,5-脱水葡萄糖醇的中间环节,本发明提出同一比色池测定葡萄糖及1,5-脱水葡萄糖醇的方法。
技术方案为:同一比色池测定葡萄糖及1,5-脱水葡萄糖醇的方法,步骤如下:首先用三羟甲基氨基甲烷和盐酸组成的缓冲溶液处理血清,经由GK和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联***将血清中葡萄糖彻底转化为不与PROD反应的6-磷酸葡萄糖酸内酯,以除去内源性Glu的干扰,同时并测定吸光变化以测定葡萄糖含量;然后加浓度为200mmol/L的N-2-羟乙基哌嗪N′-2-乙烷磺酸溶液,把被测的1,5-脱水葡萄糖醇氧化成1,5-脱水果糖和H2O2,H2O2释放出新生态的氧将与HRP、4-AAP和HTIB反应***作用发生Trinders显色反应后进行比色测定1,5-脱水葡萄糖醇的含量。
有益效果:本方法将酶促反应的高特异性和的高灵敏性结合起来,建立了一种在同一比色池对葡萄糖和1,5-脱水葡萄糖醇检测的方法。该方法具有灵敏、准确、稳定、特异性等特点,可自动化同时检测葡萄糖和1,5-脱水葡萄糖,降低了检测成本,为糖尿病的检测与治疗监控提供了新的方法。
具体实施方式
材料与方法
1.试剂
(1)试剂I(RI)三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液(Tris/HCl)内含葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD),辣根过氧化物酶(HRP)。(2)试剂II(RII) N-2-羟乙基哌嗪N′-2-乙烷磺酸溶液(HEPES)内含呋喃糖氧化酶(PROD),抗坏血酸氧化酶(AO),3-羟基-2、4、6-三碘苯甲酸(HTIB,)。(3)标准液50mmol/L的Glu标准液和1mmol/L的1,5-AG标准液。
2.仪器RA1000(Technicon,美国),Hitachi 7080全自动生化分析仪(日立,日本)。
3.方法(1)方法原理首先用RI处理血清,经由GK和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)偶联***将血清中Glu彻底转化为不与PROD反应的6-磷酸葡萄糖酸内酯(6-PGA),以除去内源性Glu的干扰并测定吸光变化以计算Glu含量。加入试剂RII后,1,5-AG被氧化成1,5-脱水果糖和H2O2,后者经HRP、4-AAP和HTIB反应***作用发生Trinders显色反应后进行比色测定,反应式如下:
(2)参数设置上机参数:Glu测定终点法参数,温度37℃,主波长340nm,副波长405nm,RI300μl温5min读吸光度A1,加入样品10μl,反应10min,测定吸光度A2。将主波长调至540nm,副波长700nm,加入RII 150μl,读取吸光度A3,反应5min,读取吸光度A4,空白调零。手工测试参数:除上述基本参数外,样品和试剂量按比例增减。
计算公式:Glu(mmol/L)=(A2-A1)×标准品浓度/(A标2-A标1)。
1,5-AG(μmol/L)=(A4-A3)×标准品浓度/(A标4-A标3)。
讨论:目前在国外尤其是日本,Glu与1,5-AG是诊断与监控糖尿病近期治疗的最重要的指标。国际上推荐的Glu参考方法是HK法,而1,5-AG的测定方法中以微柱酶法和Fukumura的全酶GK和PK-PEP***最为简便和可靠。我们首次用GK和G-6PD偶联***去除内源性Glu并同时测定Glu的浓度,然后在同一比色池中加入含PROD的试剂改变主副波长,引入Trinder反应***以测定1,5-AG的浓度。本方法将酶促反应的高特异性和的高灵敏性结合起来,建立了一种新全酶法对Glu和1,5-AG同时检测的自动化分析方法。本研究结果表明,该方法具有灵敏、准确、稳定、特异性等特点。二种指标的线性范围足以满足临床对糖尿病的筛检及治疗监控要求。
我们对建立的方法进行了方法学评价。Glu在0.2~40mmol/L内线性良好,若高于该值建议稀释后重新测定;1,5-AG的测定范围为2.1~550μmol/L。本方法的精密度与准确度符合RCV的要求。二者批内CV%均在2%以内、批间均3%以内;本法的测定Glu和1,5-AG的平均回收率分别为100.2%和101.7%。由于人类血清/血浆中糖醇类物质主要是Glu和1,5-AG。其它如麦芽糖、乳糖含量极微。常规条件下的高血脂、轻微溶血和高胆红素对Glu和1,5-AG的测定影响甚微。用本法测定Glu和1,5-AG分别与HK法和Lana微柱法相关性甚好。
Claims (1)
1、同一比色池测定葡萄糖及1,5-脱水葡萄糖醇的方法,步骤如下:首先用三羟甲基氨基甲烷和盐酸组成的缓冲溶液处理血清,经由GK和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联***将血清中葡萄糖彻底转化为不与PROD反应的6-磷酸葡萄糖酸内酯,以除去内源性Glu的干扰,同时并测定吸光变化以测定葡萄糖含量;然后加浓度为200mmol/L的N-2-羟乙基哌嗪N′-2-乙烷磺酸溶液,把被测的1,5-脱水葡萄糖醇氧化成1,5-脱水果糖和H2O2,H2O2释放出新生态的氧将与HRP、4-AAP和HTIB反应***作用发生Trinders显色反应后进行比色测定1,5-脱水葡萄糖醇的含量。
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