CN101057975B

CN101057975B - 一种抗免疫耐受性和免疫缺陷性病毒的鸡尾酒疫苗及其应用

Info

Publication number: CN101057975B
Application number: CN200610165104A
Authority: CN
Inventors: 田波; 张玉霞; 刘长梅; 高福
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2006-12-13
Filing date: 2006-12-13
Publication date: 2012-10-10
Anticipated expiration: 2026-12-13
Also published as: CN101057975A

Abstract

本发明提供一种抗免疫耐受性和免疫缺陷性病毒的鸡尾酒疫苗及其应用。所述鸡尾酒疫苗至少包括两种或两种以上元件以及任选的病毒抗原重组蛋白和可药用赋形剂，所述元件以重组DNA和/或重组病毒的形式存在，所述元件选自(A)中和抗体、受体阻断剂、膜融合抑制剂、细胞因子编码序列，和/或RNA干涉序列；(B)免疫佐剂编码序列；(C)抗原基因、病毒抗原与免疫佐剂融合基因、病毒抗原表位编码序列、多表位融合基因和/或病毒抗原表位-MHC-I SCT基因；(D)囊膜病毒融合蛋白的两个七肽重复序列HR1、HR2和/或其聚合物HR212的编码序列。鸡尾酒疫苗中各抗病毒元件的表达载体包括重组DNA载体、致弱的痘苗病毒载体和/或腺病毒载体。

Description

一种抗免疫耐受性和免疫缺陷性病毒的鸡尾酒疫苗及其应用

技术领域

本发明属于免疫学领域和疫苗研制技术，具体涉及抗免疫耐受性和免疫缺陷性病毒的鸡尾酒疫苗及其应用。

背景技术

1.免疫耐受性病毒及其免疫学基础：免疫耐受性病毒是指可导致机体免疫***反应能力低下的病毒。虽然各个病毒的致病机理不尽相同，但它们都导致以病毒的持续存在、B细胞和T细胞产生抗体和细胞免疫的能力下降或消失为特征的疾病。在引起肝炎的众多病毒中，乙肝病毒(HBV)和丙肝病毒(HCV)是最重要的两个免疫耐受性病毒。

免疫耐受性病毒可有效的逃逸机体免疫，引起免疫耐受，使人体的免疫机制不再对抗原产生免疫应答，使病毒在体内长期存在。HBV是最典型的免疫耐受性病毒，感病母亲所产90％新生儿成为病毒携带者，部分成人HBV患者也会形成乙肝的慢性感染。HBV的持续性感染和抗原的过量表达以及病毒的变异往往导致患者体内持续的病毒复制、胸腺中病毒特异的与免疫调节相关的Th1类细胞被克隆剔除、外周血和肝脏中与病毒清除和感染细胞裂解相关的CTL反应能力下降、消失或者克隆剔除。HBV的持续性感染以及与之相关的肝硬化和肝癌对患者对社会造成了极大的经济和社会压力。

HBV的主要结构抗原包括表面抗原S，(包括糖基化的大抗原S1S2S，中抗原S2S和小抗原S)和核心蛋白C，此外还有聚合酶P和调节蛋白e和x。S和C抗原可以引起中和抗体的产生。核心蛋白C相对保守，它产生的特异的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对病毒清除具有重要意义。对HBV来说，e抗原的大量表达能够使得Th1类细胞受到抑制，表面抗原的大量表达使得免疫***枯竭(exhausted)。

HCV免疫耐受机制与HBV不同，HCV多为低水平感染，不易产生活跃的免疫应答，此外HCV基因极易产生变异，造成免疫逃逸，产生持续性感染和免疫耐受。

HCV多蛋白N末端191个氨基酸为核心蛋白，是病毒核衣壳的主要成分。核心蛋白的N末端富含碱性氨基酸且高度保守。核心蛋白后是病毒的包膜蛋白E1，E2，是高度糖基化的I型跨膜蛋白。在所有HCV蛋白中，E2的保守性最弱，是免疫反应的主要目标。大多数的HCV非结构蛋白(NS2-NS5B)为病毒基因组复制所必需。HCV是一种高度变异的病毒，这种变异使得HCV在感染者体内形成复杂多样的HCV准种群，有可能对机体抗病毒免疫应答产生影响。免疫逃避株的形成则可能与病毒持续感染有关。免疫逃避的两种可能机制：(1)HCV对IFN应答的主动拮抗作用，如HCV NS3/4丝氨酸蛋白酶可以阻断干扰素调节因子3的磷酸化和活性；E2和NS5蛋白能够抑制RNA依赖性蛋白激酶的功能，从而影响IFN的抗病毒效应。(2)HCV蛋白上B淋巴细胞或者T淋巴细胞抗原表位在机体免疫力下发生被动变异，从而逃避适应性免疫应答的攻击。

2.免疫缺陷性病毒及其免疫学基础：免疫缺陷病毒的典型代表是人免疫缺陷病毒(HIV)。HIV通过感染CD4T细胞，导致CD4⁺T淋巴细胞数量不断下降。另外，HIV感染还引起B-细胞功能失调和NK细胞的细胞毒功能下降，使具有免疫功能的树突状细胞(DC)的数量在血液中和组织中的分布和数量改变。HIV感染还可引起中枢神经***以及胃肠道等器官产生病变。由于免疫功能下降，患者并发各种癌症和传染病的可能性大增，并最终导致获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。

HIV的结构基因包括gag(P55、P17、P24)、Pol和env。Pol基因编码聚合酶前体蛋白(P34)，经切割形成蛋白酶、整合酶、逆转录酶、核糖核酸酶H，均为病毒增殖所必需。env基因编码约863个氨基酸的前体蛋白，经糖基化形成gp160，gp120和gp41。gp120含有中和抗原决定簇，已证明HIV中和抗原表位在gp120V3环上，V3环区是囊膜蛋白的重要功能区，在病毒与细胞融合中起重要作用。gp120与跨膜蛋白gp41以非共价键相连。gp41参与靶细胞融合，促使病毒侵染细胞。实验表明gp41亦有较强抗原性，能诱导产生抗体反应。HIV的调控基因至少包括Tat、Rev、Nef、Vif、Vpu、Vpr。HIV的免疫治疗应该建立阻断病毒持续侵染CD4⁺T细胞的机制，抑制感染细胞内部HIV的持续复制并产生中和抗体和CTL反应。

3.免疫耐受性病毒和免疫缺陷性病毒疫苗的研究进展

(1)HBV疫苗研究进展：HBV的预防性表面抗原疫苗得到了广泛的应用并在很大程度上降低了HBV的感染，但此种疫苗却不能治疗HBV的慢性感染。传统治疗HBV感染的方法包括α-IFN以及化学药物，它们在控制病毒的复制方面具有重要的作用，但是却不能有效地清除病毒(Seeger and Mason 2000)。单一策略的DNA疫苗虽然因为能够诱发细胞和体液免疫而受到重视，但是DNA疫苗在小动物实验中的结果却不能在大动物身上实现(Payette et al.2006；Zhao et al.2006)。随着对HBV以及其诱发疾病研究的深入，已经有部分的临床实验采用化学药物和蛋白疫苗结合的综合性疗法，虽取得了一定的成果(Yang，Lee et al.2006)，但传统药物在克服病毒变异造成的免疫逃逸、降低病毒复制和恢复机体的CTL反应能力方面还没有乐观的报道。至今尚无被批准的HBV治疗性疫苗问世。

(2)HCV疫苗研究进展：HCV引起的丙型肝炎，其感染的慢性化率高达60-80％，并导致肝硬化和肝癌。HCV主要通过输血传染，血液的严格检查可控制HCV新感染的发生率，根据上述情况，HCV的疫苗研究主要是针对治疗性疫苗的研究。由于HCV基因高度可变，又缺乏合适的细胞培养***和小动物模型，有效的重组疫苗研发受到阻碍.尽管如此，基因疫苗，多肽和蛋白质疫苗，基于DC细胞的疫苗和类病毒颗粒疫苗等研究都被广泛关注(Manns et al.2001)。丙型肝炎的实验疫苗起步时，不外乎传统意义上的疫苗策略，即寻找特异的抗原成分，来免疫宿主以期获得中和性或保护性抗体。在研究中，以重组E1/E2蛋白免疫猩猩能诱导高滴度抗膜蛋白(anti-envelope)抗体产生但只能保护动物免受低价病毒侵害(Foms et al，1998；Zhou et al.2000；Lee et al 1998)。基因疫苗于1992年首先报道，近来发展迅速，该技术将编码抗原的DNA直接注射到宿主肌肉或皮内，能诱导特异性体液免疫以及更广谱的细胞免疫应答，HCV全基因组序列的测序使得HCV基因疫苗的研究逐步深入(Jiao et al.2004)，但重组DNA疫苗的应用同样受到载体特征的限制。HCV疫苗面临的挑战，仍然是病毒蛋白的高变性，尤其是包膜蛋白的变异更为主要，而与HCV相关的LDL蛋白又使得大部分病毒颗粒具有不可中和性，成为疫苗研究的挑战。由于HCV中和抗体的弱保护活性、病毒的高度变异性以及机体免疫功能的破坏，单一策略的疫苗研究思路在HCV的免疫治疗中不能产生重要的治疗作用(Inchauspe et al.2003)。HCV临床研究的现状迫切需要人们确立一种按照病毒侵染过程和肌体免疫反应为特征的综合性治疗策略。

(3)HIV疫苗研究进展：自20世纪80年代初发现艾滋病之后，人们早在1986年即开始尝试HIV的预防和治疗性疫苗。主要的疫苗策略包括HIV的灭活疫苗、减毒活疫苗，这些通过对病毒的处理而获得的疫苗虽可持续产生抗体和CTL免疫反应，并可保护试验成年恒河猴降低SIV感染，但这些猴子最终还是发展成艾滋病(Baba T W et al.，1999)，因此人们对灭活或减毒活疫苗在人体中的应用持保守态度。对HIV重组亚单位疫苗的研究也没有获得可应用的成果，如美国首次进入临床实验的HIV膜蛋白gp160抗原疫苗，虽然gp120能结合到CD4细胞上并在一定程度上阻断HIV的入侵，但由于HIV具有其它途径与细胞表面的病毒受体结合，此种亚单位疫苗应用人体后既不能诱发CTL也不能产生中和抗体，在美国和泰国进行的III期临床实验已失败告终(Dennis R B et al.，2004)。HIV病毒样颗粒疫苗是应用部分HIV DNA感染后产生的病毒蛋白组装成颗粒样结构的一种疫苗。由于它在灵长类动物中具有很强的免疫原性而受到重视。我国肖瑶等(肖瑶等，2000)研制的Gag和Gag V3基因的病毒样颗粒在小鼠模型上可诱导体液免疫和一定程度的细胞免疫，但未见在灵长类动物上的实验结果。重组DNA疫苗是把HIV外源基因***活的病毒载体，通过病毒使外源基因在宿主细胞中表达，由此产生更广的宿主免疫应答。这些载体增加了疫苗安全性而不减弱其免疫活性(Bruyn Get al.，2004)。为进一步增加疫苗的安全性，研制减毒痘苗病毒载体已有进展(Qing F，et al.，2005)。DNA疫苗用含HIV基因的质粒免疫动物，可诱导特异性抗体产生，同时还观察到特异性T淋巴细胞的CTL应答。质粒DNA疫苗在恒河猴能诱导SIV特异性CTL，这种疫苗诱导的免疫能促进第二次CTL应答的产生，并能控制随后的致病性SIV感染后的病毒复制(Egan M A，et al.，2000)。采用质粒DNA免疫原作为HIV候选疫苗的人体早期实验研究已在进行中。但HIV疫苗的面临巨大挑战，迄今全球艾滋病疫苗进行了广泛的临床前实验研究，以及近百次的艾滋病疫苗I期临床实验，少数疫苗已完成或正在进行II期临床实验。但目前尚无在临床实验中显示能提供确切保护作用的疫苗，已完成的两个艾滋病疫苗III期临床实验均宣告失败。

根据上述研究结果以及国内外对免疫耐受性和免疫缺陷性病毒疫苗尚未取得突破性进展，并面临严峻的社会需求和技术性挑战的现状，我们及时提出一种新的疫苗研制策略，即：鸡尾酒式抗免疫耐受和免疫缺陷性病毒研制新策略，其要点是根据病毒感染的特征和机体的应答特征，将多种抗病毒元件结合在一个疫苗中。构建的鸡尾酒疫苗经证实比单一组份的疫苗有更大的免疫活性，并可在多个层面上抑制病毒的感染、复制以及造成的免疫损伤。正像艾滋病药物治疗中的鸡尾酒用药方式那样取得了良好的疗效。在本专利所公开的发明中，我们按照病毒侵染细胞的过程和造成的机体免疫反应的特点，设计了针对病毒不同侵染阶段的包含多个抗病毒元件的重组DNA、痘苗病毒和/或腺病毒。由它们的不同组合所构建的鸡尾酒疫苗可以在病毒入侵的第一阶段进行阻断；针对病毒变异的特征设计的RNA干扰序列和序列库可有效抑制病毒核酸复制和变异的机率；使用热休克蛋白gp96作为免疫佐剂能增强免疫活性并活化抗病毒的天然免疫和适应性免疫能力；从病毒抗原的多个变异序列中的保守序列设计具有广泛交叉反应活性的重组疫苗；采用重组DNA载体免疫和病毒载体免疫的方式能最有效的发挥抗病毒免疫作用。这种鸡尾酒疫苗具有单一成份的疫苗及其改进型所不具备的整体优势，是一种全新的制备疫苗的策略。

发明内容

本发明的特征在于联合应用包括免疫佐剂如热休克蛋白gp96或其氨基端片段、抗原抗体中和反应、细胞免疫反应、抗病毒细胞因子、受体阻断剂、膜融合抑制物、以及抑制病毒复制的干扰RNA等策略以研制抗免疫耐受性和免疫缺陷性病毒的疫苗。抗原是指病毒结构基因或与佐剂融合的结构基因、病毒的调节基因、病毒抗原表位或其多表位融合基因、抗原表位-MHC-I单链三聚体(SCT)等。通过联合应用包括与抑制病毒侵染和复制相关的元件、病毒抗原、以及能激活机体天然免疫和适应性免疫相关的元件，达到预防病毒感染，控制病毒复制并恢复机体免疫功能的目的。

在本发明的一个方面，本发明提供了抗免疫耐受病毒和/或囊膜病毒的鸡尾酒疫苗，其包括两种或两种以上元件以及任选的病毒抗原重组蛋白以及任选的可药用赋形剂，所述元件以重组DNA和/或重组病毒形式存在，所述元件选自：(A)中和抗体、受体阻断剂、膜融合抑制剂、细胞因子编码序列，和/或RNA干涉序列；(B)免疫佐剂编码序列；(C)抗原基因、病毒抗原与免疫佐剂融合基因、病毒抗原表位编码序列、多表位融合基因和/或病毒抗原表位-MHC-I SCT基因；(D)囊膜病毒融合蛋白的两个七肽重复序列HR1(SEQ ID NO：17)、HR2(SEQ ID NO：16)和/或其聚合物HR212(SEQ ID NO：18)的编码序列。

具体地，所述抗免疫耐受病毒可以选自，但不限于HBV和HCV；所述抗免疫缺陷病毒可以选自，但不限于HIV；所述病毒抗原重组蛋白可以选自，但不限于以下序列表达的蛋白∶病毒抗原的比对保守序列，主要流行株序列或其部分序列，或病毒抗原与佐剂融合的融合基因序列；所述膜融合抑制剂可以选自，但不限于HIV膜融合的七肽重复序列HR1、HR2或其聚合物；所述细胞因子可以选自，但不限于，细胞因子IFNα(1和2)或γ，TNF(肿瘤坏死因子)α，IL-2；所述RNA干涉序列可以选自，但不限于病毒编码序列或非编码序列；所述免疫佐剂可以是热休克蛋白gp96或其N端序列；所述抗原基因可以选自，但不限于病毒抗原的比对保守序列，主要流行株序列或其部分序列，或病毒抗原与佐剂融合的融合基因序列；所述病毒抗原表位编码序列可以选自，但不限于病毒结构基因或调解基因表位序列；所述多表位融合基因可以选自，但不限于，病毒Th(辅助性T细胞)表位和MHC-I(主要组织相容性抗原I)限制表位与佐剂或/和泛素融合序列；所述病毒抗原表位-MHC-I SCT基因可以选自，但不限于HLA-A2、HLA-A11、HLA-A24、HLA-30与病毒抗原和β2m的融合序列。所述重组DNA可以是重组质粒，所述重细病毒可以是重组腺病毒或重组痘苗病毒；所述质粒可以是真核表达载体。

在本发明的另一个方面，本发明还提供了将本发明的抗免疫耐受病毒和/或囊膜病毒的鸡尾酒疫苗用于制备预防和/或治疗由免疫耐受性病毒和免疫缺陷病毒引起的疾病的药物中的用途。

在本发明的又一个方面，本发明提供了用所述药物治疗由免疫耐受性病毒和免疫缺陷病毒引起的疾病的方法。

下面是本发明的具体实施方案。

1.HBV治疗性鸡尾酒疫苗

本发明中公开的HBV治疗性鸡尾酒疫苗是选自以下两种或两种以上元件的组合而构建的重组DNA、腺病毒和/或痘苗病毒以及它们的组合物(1)有效降低HBV-DNA复制的干扰RNA(siRNA)和/或IFN(干扰素)α(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？val＝NM_024013.1，序列号NM_024013；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝protein&val＝11067751，序列号NM_000605)或γ编码序列；(2)佐剂分子gp96或其氨基端片段的编码序列；(3)HBV的结构抗原HBsAg、HBcAg或其与佐剂融合的融合基因、HBV的抗原表位、多表位融合基因以及抗原表位-MHC-I SCT基因。DNA载体、病毒载体具有灵活的***序列可选择性和良好的外源基因表达和修饰能力，此外病毒载体上还具有诱发天然免疫的多种活性元件。用DNA疫苗免疫和病毒疫苗加强的免疫步骤不仅可以有效的实现上述多种元件的表达，免疫所产生的CTL还具有向感染部位迁移的能力。此外用痘苗病毒和腺病毒载体的交叉免疫方式可避免机体对同一种病毒载体再度免疫时所产生的中和作用。

本发明中HBV的治疗性鸡尾酒疫苗包括：

疫苗组合形式一：多载体HBV治疗性鸡尾酒疫苗

由重组DNA、痘苗病毒和腺病毒组成的多载体鸡尾酒疫苗(图1所示)，其中载体一为包含抑制HBV复制的RNA干扰元件的重组腺病毒或包含多个RNA干扰元件的重组腺病毒库。载体二为包含HBV结构基因或HBV抗原表位或结构基因以及表位与佐剂的融合基因以及包含表位序列的SCT基因的重组DNA或重组DNA库。载体三为重组痘苗病毒或重组病毒库，包含IFN基因、HBV的结构基因或结构基因与佐剂gp96或其N片段融合基因、HBV抗原表位或多表位重组体以及与佐剂gp96或其N片段的融合基因、HBV抗原表位的SCT基因。多载体HBV鸡尾酒疫苗还包括重组DNA、痘苗病毒和腺病毒与HBV表面抗原蛋白的彼此分离的组合。

疫苗组合形式二：单载体HBV治疗性鸡尾酒疫苗

其特征为包含以下元件的重组痘苗病毒或重组腺病毒或重组痘苗病毒库或重组腺病毒库(如图7所示)：IFN基因、HBV的结构基因或结构基因与佐剂gp96或其N片段融合基因、HBV抗原表位或多表位重组体以及与佐剂gp96或其N片段的融合基因、HBV抗原表位的SCT基因、调解基因和非编码基因对应的RNA干涉序列。单载体HBV治疗性鸡尾酒疫苗还包括由重组病毒或重组病毒库与HBV表面抗原的彼此分离的组合。

2.HCV治疗性鸡尾酒疫苗

本发明中公开的HCV治疗性鸡尾酒疫苗是选自以下两种或两种以上元件的组合而构建的重组DNA、痘苗病毒和腺病毒以及它们的组合物(1)有效降低HCV复制的干扰RNA(siRNA)和/或IFNα或γ；(2)佐剂分子gp96或其氨基端片段；(3)HCV的结构抗原衣壳蛋白core(SEQ IDNO：58)、E1(SEQ ID NO：69)、E2(SEQ ID NO：70)编码序列(http://hcv.lanl.gov/components/hcv- db/combined_search/query_one.comp？se_id＝17434)或其与佐剂融合的融合基因、HCV抗原表位、多表位融合基因以及抗原表位-MHC-I SCT基因。HCV鸡尾酒疫苗的组合形式与HBV鸡尾酒疫苗相似，分为多载体HCV治疗性鸡尾酒疫苗和单载体HCV治疗性鸡尾酒疫苗。

3.HIV-1预防性鸡尾酒疫苗

本发明中公开的HIV预防性鸡尾酒疫苗是选自以下两种或两种以上元件的组合而构建的重组DNA、痘苗病毒和腺病毒以及它们的组合物：

(1)可阻断病毒与细胞融合的七肽重复序列HR212的编码序列；(2)佐剂分子gp96或其氨基端片段的编码序列；(3)HIV的结构抗原基因env(SEQ ID NO：61)、gag(SEQ ID NO：59)、pol(SEQ ID NO：60)编码序列或其与佐剂融合的融合基因、HIV抗原表位、多表位融合基因以及抗原表位-MHC-I SCT基因。HIV预防性鸡尾酒疫苗的组合形式有如下几种：

疫苗组合形式一：含有分泌表达的HR212元件的多载体HIV预防性鸡尾酒疫苗

其特征为包含分泌型表达特征的HR212的重组DNA、腺病毒和痘病毒。其中HR212的特征为由经比对的HIV保守七肽重复序列、HIV主要流行株系的序列以及序列库。

疫苗组合形式二：多载体HIV预防性鸡尾酒疫苗

由重组DNA、痘苗病毒和腺病毒组成的多载体鸡尾酒疫苗，其特征为包含分泌表达的HR212以及HIV的结构抗原env、gag、pol或其与佐剂融合的融合基因、HIV抗原表位、多表位融合基因以及抗原表位-MHC-I SCT基因。其中HR212的特征为由经比对的HIV保守性七肽重复序列或HIV主要流行株系HR212序列及其序列库。

疫苗组合形式三：含有分泌表达的HR212元件的单载体HIV预防性鸡尾酒疫苗

其特征为包含分泌型表达特征的HR212的重组DNA(库)或重组腺病毒(库)或痘病毒(库)。其中HR212的特征为由经比对的HIV保守性七肽重复序列、HIV主要流行株系的HR212序列以及序列库。

疫苗组合形式四：单载体HIV预防性鸡尾酒疫苗

由重组DNA或腺病毒或痘苗病毒组成的单载体鸡尾酒疫苗，其特征为包含分泌表达的HR212以及HIV的结构抗原env、gag、pol或其与佐剂融合的融合的抗原基因、HIV抗原表位、多表位融合基因以及抗原表位-MHC-I SCT基因。其中HR212的特征为由经比对的HIV一致性七肽重复序列、HIV主要流行株系的序列以及序列库。

4.HIV-1治疗性鸡尾酒疫苗

本发明中公开的HIV治疗性鸡尾酒疫苗是选自以下两种或两种以上元件的组合而构建的重组DNA、痘苗病毒和腺病毒以及它们的组合物：(1)可阻断病毒与细胞融合的七肽重复序列聚合物HR212；(2)可有效抑制HIV复制的干扰RNA(siRNA)和/或IFNα或γ(3)佐剂分子gp96或其氨基端片段；(4)HIV的结构抗原env、gag、pol或其与佐剂融合的融合基因、HIV抗原表位、多表位融合基因以及抗原表位-MHC-I SCT基因。HIV鸡尾酒疫苗的组合形式有如下几种。

疫苗组合形式一：多载体HIV治疗性鸡尾酒疫苗

由重组DNA、痘苗病毒和腺病毒组成的多载体鸡尾酒疫苗(图1所示)，其中载体一为腺病毒或腺病毒库，其特征为包含抑制HIV复制的有效的RNA干涉元件和/或分泌表达的HR212的。载体二为重组DNA库，其特征为包含分泌表达的HR212、HIV的结构抗原env、gag、pol或其与佐剂融合的融合基因、HIV抗原表位、多表位融合基因以及抗原表位-MHC-I SCT基因。其中HR212的特征为由经比对的HIV一致性七肽重复序列、HIV主要流行株系的序列以及序列库。

疫苗组合形式二：单载体HIV治疗性鸡尾酒疫苗

由重组DNA或腺病毒或痘苗病毒组成的单载体鸡尾酒疫苗，其特征为包含分泌表达的HR212以及HIV的结构抗原env、gag、pol或其与佐剂融合的融合的抗原基因、HIV抗原表位、多表位融合基因以及抗原表位-MHC-I SCT基因。其中HR212的特征为由经比对的HIV保守性七肽重复序列、HIV主要流行株系的HR212序列以及序列库。

附图简述

图1：多载体鸡尾酒疫苗的载体和构建策略。

其中载体I的腺病毒载体携带单个或多个RNA干涉元件，也可以是携带不同RNA干涉元件的腺病毒库，其中A、B表示不同的RNA干涉元件，载体I可以单独或混合的组成多载体疫苗中的一种组分。载体II的DNA载体携带病毒的结构抗原基因或由结构抗原与佐剂融合的融合基因或由表位融合构建的多表位基因或由单表位构建的SCT或其混合物，其中的A代表上述任意元件，载体II可以单独或混合的组成多载体疫苗中的一种组分。载体III包括细胞因子编码序列以及任选的载体II基因，其中A、B、C、D分别表示表示载体III所携带的不同元件，载体III可以单独或混合的组成多载体疫苗中的一种组分。多载体HBV治疗性鸡尾酒疫苗包括任选的单独包装的两种或者三种载体。其中载体I和载体II可以单独与载体III组合构建双载体鸡尾酒疫苗，载体I和载体II也可以与载体III组合构建三载体鸡尾酒疫苗。

图2：携带RAN干涉元件的重组腺病毒载体。

A：细胞内形成的针对HBV的siRNA的DNA模板根据HBV的序列设计出互补的sense和antisense oligos，退火成双链。为方便与SalI/XbaI消化载体pAVU6+27相连，在DNA oligos的5’末端加了SalI，3’端加了XbaI酶切位点，中间灰色部分为转录后预期形成的环结构，为使翻译有效终止，在末端设计了终止信号dT(5)。

B：Northern杂交检测HepG2.2.15细胞中HBV mRNA的水平提取HepG2.2.15细胞的RNA，以HBV DNA为探针进行Northern杂交，并且以GAPDH作为内对照。磷屏分析结果表明，与对照相比，转染了siHBV1(P1)或siHBV2(P2)重组腺病毒的2215细胞中，3.5Kb和2.4Kb/2.1Kb的mRNA水平明显减少。在对照组中，转染了与HBV基因无关的重组病毒U6(mock)或siEGFP(E)的细胞中，其mRNA水平与未转染细胞(C)中的mRNA水平相当，表明对照基因siEGFP不会影响HBVmRNA水平，显示了siRNA作用的特异性。C代表未转染的2215细胞；mock，E，P1，P2分别代表转染了含有U6+27，U6+27-siEGFP，U6+27-siHBV1，U6+27-siHBV2重组腺病毒的2215细胞。

C：ELISA法检测2215细胞中HBsAg和HBeAg的表达水平(与对照相比的百分比)取2215细胞的上清，用ELISA检测试剂盒检测细胞上清中的HBsAg、HBeAg水平。结果显示与对照细胞(C)相比，转染了siHBV1(P1)或siHBV2(P2)重组腺病毒的细胞中HBsAg、HBeAg蛋白水平被明显抑制。转染了siHBV1重组病毒的细胞，其HBsAg下降了90.6±0.5％(P＝0.00226)，HBeAg下降了88.4±0.9％(P＝0.00011)；转染了siHBV2重组质粒的细胞，其HBsAg下降了92.9±0.6％(P＝0.00216)，HBeAg下降了89.7±1.0％(P＝0.0001)，数据显示HBsAg的下降幅度略大于HBeAg。表明此干扰***对HBV基因抑制的效果很好。C代表未转染的2215细胞；mock，E，P1，P2分别代表转染了含有U6+27，U6+27-siEGFP，U6+27-siHBV1，U6+27-siHBV2重组腺病毒的2215细胞。

D：Real time PCR检测HBV DNA含量取2215细胞的上清，对其中的病毒DNA进行real time PCR分析。为定量HBV DNA的拷贝数，同时扩增了已知浓度的并且经过系列稀释的topo-HBV质粒，制作出标准曲线，依据标准曲线和测得的HBV DNA的Ct值计算出HBV DNA的拷贝数。结果表明，含有siHBV1(P1)和siHBV2(P2)的腺病毒感染的细胞，其上清中的HBV DNA水平与对照(14.48±2.15×10⁴copys/mL)相比分别下降了3.7倍(3.91±0.72×10⁴copys/mL；P＝0.00821)和3.3倍(4.41±0.85×10⁴copys/mL；P＝0.00780)。

图3：携带结构抗原的重组DNA载体。

A.融合基因的构建与表达。(A)融合基因构建示意图。基因在pcDNA3的CMV启动子下。在融合基因中引入柔性的连接子“GGSGG”保证各基因的正确表达和维持正常功能。N355^w代指鼠或人的gp96N端的355个氨基酸。(B)免疫印迹杂交分析。构建的克隆经磷酸钙方法转染293T细胞，两天后，收集细胞，细胞裂解物经免疫沉淀后进行检测。HBcAg(SEQ ID NO：4)，HBsAg(SEQ ID NO：5)，N355(SEQ ID NO：2，3)，CN355(HBV核心抗原与N355的融合基因)(SEQ ID NO：7)，SN355m(HBV的表面抗原S与鼠gp96N端N355的融合基因)(SEQ ID NO：8)，SN355h(是HBV的表面抗原S与人gp96N端N355的融合基因)(SEQ ID NO：9)，S2S(SEQ ID NO：6)，S2SN355(HBV的表面抗原S2S与gp96N端N355的融合基因)(SEQ ID NO：10)和N355S2S(HBV的表面抗原S2S与gp96N端N355的融合基因)(SEQ ID NO：11)，等基因产物的分子量分别为17kDa，24kDa，45kDa，62kDa，69kDa，69kDa，31kDa，76kDa和76kDa。(a)抗小鼠的核心抗原单抗检测截短的核心抗原及其与N355的融合产物。(b，c，d)抗小鼠的表面抗原单抗检测乙肝膜抗原的S和M蛋白及其与N355的融合产物。非糖基化(小带)和糖基化(大带)的带都能够检测出来。

B.DNA免BALB/c鼠和HLA/A2转基因鼠后体液免疫反应的检测。共免疫三次，每组5只鼠，每次肌肉注射100μg质粒。对于共免疫组，注射前将两种质粒各50μg混合。最后一次免疫后10天眼眶取血，ELISA系列稀释法测抗体效价。结果以光吸收平均值(A_490nm)±SD表示。(A)BALB/c鼠血清1/1000稀释后的表面抗体，(B)Anti-HBs in HLA/A2转基因鼠血清1/1000稀释后的表面抗体，(C)和(D)分别是BALB/c鼠和HLA/A2转基因鼠血清1/10000稀释后的核心抗体，(E)BALB/c鼠和HLA/A2转基因鼠血清1/100稀释后N355抗体(IgG)。所有数据均为三次不同实验的一个代表值。

C.ELISPOT检测HBV特异细胞反应。DNA疫苗免疫BALB/c鼠和HLA/A2转基因鼠三次，每组5只鼠，每次肌肉注射100μg质粒。对于共免疫组，注射前将两种质粒各50μg混合。最后一次免疫后10天取小鼠脾脏细胞进行分析。HBV特异的IFN-γ和CD8⁺双阳性细胞形成的斑点数以5×10⁵脾脏细胞计算。每组斑点数(减去没有多肽刺激的对照斑点)以三个数的均值±标准方差表示，所有数据均为三次不同实验的一个代表值。(A)表位HBs362-371和Ld28-39用BALB/c鼠分析，表位HBs348-357用于HLA/A2转基因鼠分析。(B)表位HBc87-95用于BALB/c鼠分析，表位HBc18-27用于HLA/A2转基因鼠分析。

图4：携带抗原表位-MHC-I的SCT重组DNA载体。

SCT是通过将抗原表位，β2m和MHC-I类分子通过15个氨基酸的GS连接子连接而构建的融合基因，其结构如图A所示。B，SCT可以有效地将抗原表位呈递在细胞表面。C用SCT重组DAN载体免疫HLA-A2转基因鼠可以产生特异的CTL，并具有抑制HepG2.2.15细胞中HBV复制的能力。pcDNA-SCT-C18(SEQ ID NO：13)，pcDNA-SCT-C107(SEQID NO：14)，pcDNA-SCT-HIV-gag(SEQ ID NO：15)

图5：携带多抗原表位和佐剂分子融合基因的重组DNA载体。由多表位融合而构建的融合基因(SEQ ID NO：12)的模式图

图6：重组痘苗病毒和多载体治疗性HBV和HIV疫苗免疫产生的CTL。用实施例一载体2B中的HBV核心抗原-SCT重组DNA和如图A所示的重组痘苗构成的多载体HBV治疗性疫苗免疫HLA-A2转基因鼠可以高效的诱发HBV核心抗原相关的CTL水平。用HIV的gag表位具有一致的实验结果。图6A，重组痘苗病毒的构建形式之一。图6B，用含SCT的重组DAN载体和重组痘苗病毒免疫HLA-A2转基因鼠可以高效产生HBV核心抗原和HIVgag抗原特异的CTL。在本实施例中，载体上的A是γ-IFN，B是S2SN355，C是HLA-A2-SCT-C18。

图7单载体鸡尾酒疫苗。

HBV的单载体鸡尾酒疫苗中，载体上的ABC是IFNα及β，S，S2S，S1S2S，C，SCT，gp96，Gp96N-S/C的可任选的组合。D是调节基因和非编码基因特异的RNA干涉序列。单载体鸡尾酒疫苗还包括含有不同元件的分别由重组DNA、腺病毒或重组痘苗病毒的同一个载体所形成的单载体的混合。HCV的单载体治疗性鸡尾酒疫苗是指实施例二1中的单载体治疗性鸡尾酒疫苗。HIV的单载体鸡尾酒疫苗是指实施例三和实施例四种的单载体HIV预防性和治疗性疫苗。其中载体上的ABC是IFNα及γ，core，E1，E2，Gp96，Gp96或其N端-Core/E1/E2的可任选的组合，D是调节基因和非编码基因特异的RNA干涉序列。HIV的单载体鸡尾酒疫苗是指实施例三和实施例四种的单载体HIV预防性和治疗性疫苗，其中载体上的ABC是IFNα及γ，gag，pol，env，Gp96，Gp96或其N端-gag/pol/env的可任选的组合，D是调节基因和非编码基因特异的RNA干涉序列。

图8：真核分泌表达的囊膜病毒膜融合抑制基因的构建策略。

A带tPA信号肽的膜融合抑制剂的构建策略

B带IgG信号肽的膜融合抑制剂的构建策略

图9：HBV的RNA干涉序列。

A：与HBV X抗原对应的干涉RNA序列转化成的***到pAVU6+27载体上的序列。

B：与HBV S抗原对应的干涉RNA序列转化成的***到pAVU6+27载体上的序列。

C：与HBV C抗原对应的干涉RNA序列转化成的***到pAVU6+27载体上的序列。

D：与HBV P抗原对应的干涉RNA序列转化成的***到pAVU6+27载体上的序列。

实施例

下面是本发明的一些实施例，但是所述实施例仅是举例说明性的，而对本发明的范围不起限定作用。

实施例一：HBV的治疗性鸡尾酒疫苗

根据HBV感染引起的免疫耐受的特点，其治疗性鸡尾酒疫苗是包含多个元件的单载体疫苗或者多载体组合疫苗。鸡尾酒疫苗具有优于单个元件所实现的治疗目的组合优势。本实施例提供一种多载体鸡尾酒疫苗的构建和组合方式以及一种单载体鸡尾酒疫苗的构建方式，但本专利所包含的内容不限于本实施例所公开的鸡尾酒疫苗的组合方式。

1.多载体HBV治疗性鸡尾酒疫苗(图1)

多载体HBV治疗性鸡尾酒疫苗的组成及应用

载体1：含有RNA干扰序列的重组腺病毒

持续的病毒复制是免疫耐受性病毒病的一个重要特征，病毒的复制不仅补充了病毒在宿主内的库容，产生大量的突变体，还造成了免疫***的枯竭和功能缺陷。因此，免疫耐受性病毒病治疗的一个重要的举措是首先抑制病毒的滴度和复制水平。对于RNA或者具有RNA中间体的病毒来说，选择病毒基因组的特定序列，通过合适的载体携带的RNA于涉元件可以非常高效特异的抑制病毒的持续复制和抗原的持续表达。在本实施例中，我们以携带HBV干扰序列的重组腺病毒降低HBV的复制水平为例，给出制备具有抑制HBV病毒复制的RNA干涉疫苗的方法。但本专利所包含的载体一的内容不仅限于此公开的序列和载体。

A：单个腺病毒载体上针对乙肝病毒单个位点的RNA干扰

针对乙肝病毒(HBV)X抗原的mRNA序列，利用Dharmacon公司的网上设计siRNA序列的软件，设计了多个siRNA序列，并将其各自转换成互补的两条DNA序列(图2A)，其中为方便与SalI/XbaI消化载体pAVU6+27得到的U6+27启动子相连，在DNAoligos的5’末端加了SalI，3’端加了XbaI酶切位点。为使翻译有效终止，还在末端设计了终止信号dT(5)。于博亚公司合成后，100℃煮沸3分钟，自动降温至室温进行双链退火，克隆到载体pAVU6+27(购自Clontech)中，得到能够表达针对HBV的siRNA的表达框载体pAVU6+27-siHBV。先行瞬时共转染pUC19-HBV1.3(MBI)质粒和pAVU6+27-siHBV质粒到HepG2(购自ATCC)细胞中，利用ELISA检测乙肝相关S抗原和e抗原的表达，进行初步推断能有效抑制HBV表达的序列，初步筛选得到2个序列，命名为pAVU6+27-siHBV1(SEQ ID NO：20)和pAVU6+27-siHBV2(SEQ IDNO：21)(图2A所示)，进一步将包含有效序列(见图2A所示)的pAVU6+27-siHBV1和pAVU6+27-siHBV2载体中表达框克隆到腺病毒的pshuttle(购自Stratagene)载体中。方法是：将载体pAVU6+27-siHBV中的siRNA的表达盒利用HindIII切下，并行胶回收。将pshuttle载体利用HindIII酶切，并且去磷酸化，与回收的siRNA的表达框连接，得到目的质粒pshuttle-U6+27-siHBV1和pshuttle-U6+27-siHBV2。将该目的质粒用pmeI线性化，利用乙醇沉淀回收，与pAdEasy-1(购自Stratagene)质粒共同电转到感受态细胞BJ5183(购自Stratagene)中，进行同源重组，得到含有siRNA表达框的重组体。进一步将重组体利用pacI线性化酶切回收后转染病毒包装细胞系GP-293(购自ATCC)，7-10天后，收集病毒。

将GP-293细胞铺成单层，按照梯度加入系列稀释的病毒液，然后用1％半固体培养基培养培养48小时，计数形成的嗜斑数，根据病毒稀释比例和嗜斑数确定重组腺病毒的滴度。按照0.1MOI的感染复数感染HepG2.2.15细胞(购自ATCC)(稳定表达HBV的各个抗原，并能包装完整病毒颗粒)，72小时后用ELISA法检测HBV表面抗原S和e抗原的表达情况，与对照细胞(C)相比，转染了siHBV1(P1)或siHBV2(P2)重组病毒的细胞中S、e抗原的水平被明显抑制。感染了siHBV1病毒的细胞，其S抗原下降了90.6±0.5％(P＝0.00226)，e抗原下降了88.4±0.9％(P＝0.00011)；感染了siHBV2腺病毒的细胞，其S抗原下降了92.9±0.6％(P＝0.00216)，e抗原下降了89.7±1.0％(P＝0.0001)(图2B)。Northern杂交结果显示，被病毒感染的细胞中，3.5Kb和2.4Kb/2.1Kb的mRNA水平明显降低(图2C)。荧光定量PCR检测结果显示，被感染的细胞，其上清中的HBV DNA水平与对照(14.48±2.15×10⁴copys/mL)相比分别下降了3.7倍(3.91±0.72×10⁴copys/mL；P＝0.00821)和3.3倍(4.41±0.85×10⁴copys/mL；P＝0.00780)(图2D)。这些结果表明，此腺病毒介导的特异靶向HBV基因的RNAi方法可以有效抑制HepG2.2.15细胞中HBV基因的表达，并最终有效抑制HBV的复制。

B：单个腺病毒载体上针对乙肝病毒多个位点的RNA干扰

利用A中的方法，我们筛选到了分别针对HBV的S、X、C或者聚合酶P抗原的siRNA序列，获得了6个可以有效抑制HBV复制的pAVU6+27-siHBV重组质粒。其中：

X干扰序列为1.5‘-GAGGACTCTTGGACTCTCA-3’(SEQ IDNO：62)；2.5‘-CCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTG-3’(SEQ IDNO：63)；其***到pAVU6+27中的结构如图9A所示。

S干扰序列1.5‘-CATCACATCAGGATTCCTA-3’(SEQ ID NO：64)；2.5‘-CTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTC-3’(SEQ ID NO：65)；其***到pAVU6+27中的结构如图9B所示。

C干扰序列5‘-CATCACATCAGGATTCCTAAA-3’(SEQ IDNO：66)；其***到pAVU6+27中的结构如图9C所示。

P聚合酶干扰序列，5‘-AGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTC-3′(SEQ ID NO：67)。其***到pAVU6+27中的结构如图9D所示。

进一步分别将构建好的载体中的针对S、X、C或P的siRNA的表达框两两组合克隆到pshuttle载体中，即：先利用HindIII酶切下pAVU6+27-siHBV中的表达框，胶回收后连到经同样处理的pshuttle中，得到目的克隆pshuttle-siHBV1，进一步将针对另一个抗原的pAVU6+27-siHBV的表达框用ECoRV和stuI切下并回收，用ECoRV酶切pshuttle-siHBV1并且去磷酸化与用ECoRV和stuI切下的siRNA的表达框进行平末端连接，这样得到了一个pshuttle载体上连接有两个siRNA的表达框。同样的方法，将所有得到的针对HBV的siRNA的表达框进行两两组合。利用A中所述的腺病毒建立的方法，得到了X，S，P和C的三利两两组合的腺病毒颗粒。感染HepG2.2.15后，得到了与以上类似的结果。进一步将所得到的腺病毒作为一个库，感染HepG2.2.15细胞后，对HBV的抑制效率要好于用单个腺病毒颗粒的感染。

载体2：含有HBV结构抗原、佐剂、佐剂和结构抗原融合基因、表位及多表位融合基因、表位与佐剂融合基因以及表位-MHC-SCT的重组DNA载体

A.含有HBV结构抗原、佐剂、佐剂和结构抗原融合基因的重组DNA载体

以HBV的结构蛋白核心抗原HbcAg(C)编码序列(SEQ ID NO：4)，膜抗原的小蛋白HBsAg(S)(SEQ ID NO：5)和中蛋白S2S(SEQ ID NO：6)、人或小鼠的gp96的N端355个氨基酸(成熟肽，不含信号肽)编码序列N355^h(SEQ ID NO：2)以及N355^m(SEQ ID NO：1)、以及上述结构蛋白和gp96N端构建融合基因。构建融合基因时，引入连接子“GGSGG”，其编码序列为“GGT TCC TCT GGA GGT”。融合基因的扩增方法是：先分别用两侧引物与中间引物分别扩增gp96N端以及抗原序列，纯化得到的两端片段；然后混合两个片段作为模板，用两侧的引物扩增融合基因。所有扩增引物列入表1中，其中斜体字母为限制性酶切位点，黑体字母为引入的连接子。构建的DNA疫苗的示意图如图3A所示。

表1构建HBV结构基因以及融合基因疫苗的引物序列

注：“N355^m”代表鼠源的N355(SEQ ID NO：1)，“N355^h”代表人源的N355(SEQ IDNO：2)。其中(a)为SEQ ID NO：24；(b)为SEQ ID NO：25；(c)为SEQ ID NO：26；(d)为SEQ ID NO：27；(e)为SEQ ID NO：28；(f)为SEQ ID NO：29；(g)为SEQ ID NO：30；(h)为SEQ ID NO：31；(i)为SEQ ID NO：32；(j)为SEQ ID NO：33；SEQ ID NO：34为ggttcctctggaggtgacgatgaagttgatgt；(k)为SEQ ID NO：35；acctccagaggaaccaataacacaagtctccg为SEQ ID NO：36；acctccagaggaaccaatgtatacccaaag为SEQ ID NO：37；ggttcctctggaggtgatgatgaagtcgac为SEQ ID NO：38；(l)为SEQ ID NO：39；(m)为SEQ ID NO：40；acctccagaggaaccaatgtatacccaaag为SEQ ID NO：41；ggttcctctggaggtgatgatgaagtcgac为SEQ ID NO：42。

获得的DNA疫苗分别以肌肉注射的方式免疫BALB/c以及HLA-A2转基因鼠(购自Jackson Lab)，免疫三次，剂量为100μg/鼠，间隔两周。最后一次免疫的两周后取鼠的外周血制备血清，检测HBV中相关抗原的抗体滴度。取鼠的脾脏细胞，检测脾脏中产生的HBV抗原特异的CTL产生的水平。实验结果表明，DNA疫苗免疫的形式可以产生明显的抗体和CTL水平，在gp96N端的佐剂作用下，产生Th1类的中和抗体，CTL的水平提高6-8倍。图3B和图3C解释了抗体水平和CTL产生的水平。

B.由抗原表位-MHC-I SCT构建的重组DNA

通过预先将表位融合到MHC-I和β2-微球蛋白上构建成单分子的SCT可以有效地将病毒抗原相应的表位呈递在细胞表面，非常高效地诱发病毒抗原相关的CTL的产生。本实施例中给出HLA-A2限制的HBV核心抗原相关的两个表位构建的方法和免疫小鼠所产生的CTL的结果。本专利所包含的内容不限于HLA-A2和核心抗原的表位，所获得的重组DNA载体可以是包含一个表位的单载体，也可以是包含多个表位的多表位重组DNA混合物。

图4A所示为SCT的模式图，其中各个基因之间通过15个氨基酸的GS连接子进行连接。SCT的N端是信号肽，其所包含的表位可以通过引物突变的方式引入。构建的SCT DNA载体可以有效地将核心抗原表位呈递在细胞表面(图4B)。用SCT DNA载体免疫HLA-A2转基因鼠可以产生表位特异的CTL，并能降低HepG2.2.15细胞中HBV表面抗原和核心抗原的表达水平(图4C)。

采用PCR突变的方式改变HLA-A2所携带的抗原表位：

SCT引物：

A2-SCT-up1：CAGCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAG(SEQ ID NO：43)

A2-SCT-primer2：AATCAGCAAGCTTGGTACCGA(SEQ ID NO：44)

HBcAg18-27突变引物：

A2SCT-HBcAg 18-27-1(match 1)：

AACAGAAGGAAAGAAGTCAGAAGGCAAAAAAGCCTCCAGGCCAG

AAAG(SEQ ID NO：45)

A2SCT-HBcAg18-27-2(match 2)：

TTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCTGTTGGAGGTGGGGGAGGCGG

A(SEQ ID NO：46)

HBcAg107-115的突变引物

A2SCT-HBcAg107-115-1(match 1)：

AACAGTTTCTCTTCCAAAAGTAAGACAAGCCTCCAGGCCAGAAAG

(SEQ ID NO：47)

A2SCT-HBcAg107-115-2(match 2)：

TGTCTTACTTTTGGAAGAGAAACTGTTGGAGGTGGGGGAGGCGGA

(SEQ ID NO：48)

C.由多抗原表位与佐剂融合形成的多表位重组DNA载体

在细胞内泛素可以促进蛋白降解，提高表位的加工效率，因此可以增强细胞免疫功能。表位可以在机体内诱导特异性CTL的产生。我们合成了五个HBV的T细胞表位，分别为HLA-A2限制性的表位C18-27(FLPSDFFPSV)(SEQ ID NO：72)、E335-343(WLSLLVPFV)(SEQ IDNO：73)和E183-191(FLLTRILTI)(SEQ ID NO：74)，HLA-A11限制性的表位C88-96(YVNVNMGLKL)(SEQ ID NO：75)，HLA-A24限制性的表位C117-125(EYLVSFGVW)(SEQ ID NO：76)，将其串连合成，串连方式如图5所示。在多表位序列5’端连接破伤风类毒素Th通用辅助表位(QYIKANSKFIGITE)(SEQ ID NO：77)，并且与泛素串连在一个阅读框中，各个表位之间通过连接子AAY连接。设计的融合基因序列命名为NHTU(SEQ ID NO：12)，串连方式如图5所示。将表达此串连序列的合成DNA连接在pcDNA3.1(购自Invitrogen)真核表达载体中构成DNA疫苗。用重组DNA免疫HLA-A2转基因鼠，通过肌肉免疫三次，可以在机体内有效产生特异性CTL，从而对机体产生免疫保护效果。

载体3：含有HBV结构抗原、佐剂、佐剂和结构抗原融合基因、表位及多表位重组体以及表位-MHC-I SCT、γ-IFN的重组痘苗病毒载体

重组痘苗载体可以携带多种表达元件，同时痘苗病毒可以高效的诱发粘膜免疫反应，激活天然免疫***。包含多个元件的重组痘苗病毒可以用于单独免疫，也可以与腺病毒或/和重组DNA载体一起免疫或分阶段免疫。本实施例中提供一种包含多个元件的重组痘苗病毒的构建方式，但本专利所包含的内容不限于本公开中所包含的元件和元件的组合顺序。

以全基因合成的方式按照NCBI(National Center for BiotechnologyInformation，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)所公开的IFN-γ(NM_000619)所示的序列合成IFN-γ的全基因中的127-627位碱基，其中序列的前端加入5’-GCGAAGCTTG-3’序列(SEQ ID NO：49)，序列的后端加入3’-ACTCGAGCAT-5’序列(SEQ ID NO：50)。合成的基因***pMD 18T载体(购自TAKARA)，进行序列测定。测序正确的基因用HindIII/Xho I进行双酶切，然后***同样酶切的pcDNA3.0载体(购自Invitrogen)中。构建IFN-γ的真核表达载体。pcDNA3.0-IFN-γ表达载体经过BglII和SmaI的双酶切和平端化，***到重组痘苗载体(购自武汉大学)中，构建含有IFN-γ的重组痘苗病毒载体。

将本实施例一载体2中的元件进行酶切和平端化，然后连接到重组痘苗载体上，通过酶切和测序的方式确定***方向。将获得的重组痘苗载体1μg与野生痘苗病毒天坛株(购自中国CDC)(0.1MOI)在Vero细胞(购自ATCC)中进行同源重组，24小时后通过EGFP的表达或者目的基因的表达筛选重组病毒。重组病毒经过六轮的单斑筛选进行纯化，纯化的病毒在Vero细胞中进行扩增，并用36％的蔗糖垫进行纯化。图6A是包含多个元件的若干重组痘苗病毒载体的一个实例，图6B是利用含有载体2和载体3的鸡尾酒疫苗，取100μg的重组质粒pcDNA3.0-SCT-C18肌肉注射免疫转基因鼠，一周后用2×10^6-8PFU的重组病毒采用肌肉注射的方式进行加强免疫，一周后取小鼠的脾脏细胞检测小鼠所产生的CTL。

多载体HBV治疗性疫苗的比较优势

用上述构建的重组DNA、腺病毒和痘苗病毒载体疫苗，免疫HBV转基因鼠的流程是：首次免疫使用2×10⁶MOI重组腺病毒或重组腺病毒库RNAi干涉疫苗降低HBV复制，一个月后用重组DNA疫苗各50μg(pcDNA3.0-SN和pcDNA3.0-CN)肌肉注射免疫转基因鼠，同时辅以20μg的gp96和50μg的重组S蛋白皮下注射免疫转基因鼠，第二次免疫的2周后用2×10⁶MOI的重组痘苗病毒进行加强免疫。实验结果表明：用重组腺病毒和重组腺病毒库RNAi疫苗进行初免后转基因鼠体内HBV滴度降低90％以上，第二次免疫一周后开始出现表面抗原和核心抗原特异的CTL反应，并产生保护性的S抗体，HBV的滴度继续降低，2周后血清HBV DNA呈现阴性。第三次用重组痘苗病毒(含有γ-IFN、S抗原和C抗原基因)加强免疫后，血清中表面抗原和核心抗原对应的抗体水平显著提高，伴随着抗原特异CD8⁺T细胞及γ-IFN的产生和向肝脏内部迁移，血清中出现轻度ALT水平提高。治疗三个月后，血清HBV DNA阴性，ALT水平正常，肝脏中核心抗原阳性细胞为阴性，cccDNA检测阴性。HBV转基因鼠经鸡尾酒疫苗综合治疗后，产生明显优于单组分疫苗的综合性治疗效果。由于佐剂分子的应用，产生的抗体和细胞免疫是Th1性的；由于γ-IFN的产生及向肝脏内部的迁移，获得了肝脏细胞非裂解性的HBV清除能力；经DNA疫苗和痘苗疫苗的联合免疫，体内产生显著的多克隆CTL应答，并产生记忆性T细胞克隆，从而进一步清除了肝脏内部痕量的感染细胞。由于保护性抗体以及多表位CTL和免疫记忆的产生，HBV转基因鼠内部的病毒颗粒得到了有效的清除。

2.单载体HBV治疗性鸡尾酒疫苗(图7)

本专利申请所包含的HBV治疗性鸡尾酒疫苗还包括将实施例一中的多载体HBV治疗性疫苗对应的元件进行组合而构建的单载体重组DNA、腺病毒或痘苗病毒载体疫苗。一个具体的实例是如图7所示的重组痘苗病毒，其中包含降低病毒复制所需要的RNA干涉元件、γ-IFN、诱发中和抗体和多克隆CTL的结构抗原基因以及与佐剂融合的结构基因，以及诱发高效CTL的SCT等。

本专利申请所包含的单载体HBV治疗性疫苗还包括由同种载体构成的包含不同元件的重组质粒或重组病毒的组合。

本专利申请所述的单载体HBV治疗性疫苗与多载体HBV治疗性疫苗具有一致的抑制病毒复制和诱发免疫反应的功能。

实施例二：HCV的治疗性鸡尾酒疫苗(图1)

1.HCV的多载体治疗性鸡尾酒疫苗

HCV的多载体治疗性疫苗的构建策略和方法与HBV的多载体治疗性鸡尾酒疫苗类似，如图1所示，其中载体1为含有RNA干涉元件的重组腺病毒或者腺病毒库。载体2和3中的ABC是指IFN，HCV的结构抗原衣壳蛋白(core)，E1，E2，表位相关的SCT以及多表位融合基因，gp96编码序列(SEQ ID NO：3)，Gp96N-core/E1/E2融合基因的可任选的组合。

本实施例中简单的阐述与其中的部分载体相关的重组体的构建策略。

利用与实施例一载体1同样的方法得到了抑制HCV表达的有效序列：5‘-CCCGCTCAATGCCTGGAG-3’(SEQ ID NO：68)，转化为***pAVU6+27载体上的序列，获得具有抑制HCV复制的有效序列(SEQ IDNO：22)，该序列是针对HCV 5‘UTR区域，利用上述的方法包装病毒备用。以Huh-mono细胞(购自ATCC)为模型(稳定表达I389/hyg-ubi/NS3-3′/5.1HCV复制子)，将包装好的病毒感染该细胞。结果表明：被病毒感染的细胞中HCV的复制水平下降60％以上，其中的一个重要蛋白HCV-NS5B的表达水平下降了70％以上。

将包含HCV结构基因的重组DNA疫苗以及包含γ-IFN、HCV结构基因以及HCV表位SCT基因的重组痘苗病毒免疫HLA-A2转基因鼠，可产生高效的HCV特异的多克隆CTL反应。

2.HCV的单载体治疗性鸡尾酒疫苗(图7)

本专利申请所包含的HCV治疗性鸡尾酒疫苗还包括将实施例二1中的多载体HCV治疗性疫苗对应的元件进行组合而构建的单载体重组DNA、腺病毒或痘苗病毒载体疫苗。一个具体的实例是如图7所示的重组痘苗病毒，其中包含降低病毒复制所需要的RNA干涉元件和γ-IFN或α-IFN，诱发中和抗体和多克隆CTL的结构抗原基因以及与佐剂融合的结构基因，以及诱发高效CTL的SCT等。

本专利所包含的单载体HCV治疗性疫苗还包括由同种载体构成的包含不同元件的重组质粒或重组病毒的组合。

本专利申请所述的单载体HCV治疗性疫苗与多载体HCV治疗性疫苗具有一致的抑制病毒复制和诱发免疫反应的功能。

实施例三：HIV-I预防性鸡尾酒疫苗

本发明中公开的HIV预防性鸡尾酒疫苗是选自以下几个元件的组合而构建的DNA、腺病毒或痘苗病毒疫苗：(1)可阻断病毒与细胞融合的七肽重复序列HR212；(2)gp96或其氨基端片段的佐剂分子；(3)HIV的结构抗原env、gag和pol或其与佐剂融合的融合基因和/或HIV的抗原表位、多表位融合基因以及抗原表位-MHC-I构建的SCT基因。与实施例一和实施例二相似，本专利公开的HIV-1的预防性鸡尾酒疫苗包括多载体鸡尾酒疫苗(图1)和单载体鸡尾酒疫苗(图7)。多载体鸡尾酒疫苗是指图1中与抑制HIV入侵相关的载体2和载体3的组合，其中ABC是指IFNα或γ，gag，env，HR212，SCT，gp96，Gp96N-gag/env融合基因的可任选的组合。单载体HIV-1预防性鸡尾酒疫苗是指将上述多载体中相关的元件进行任选的组合而构建的重组DNA、腺病毒或痘苗病毒，其要点是包含抑制膜融合的HR212、中和抗体以及CTL相关的结构基因以及结构基因与佐剂的融合基因。其中的单载体预防性鸡尾酒疫苗还包括将包含不同元件的同一载体进行的组合。

本实施例中简单的阐述与其中的部分载体相关的重组体的构建策略。利用与实施例一同样的方法，筛选到了抑制HIV的tat基因的siRNA序列(SEQ ID NO：23)，转成DNA序列为：5‘-AAGTGTTGCTTTCATTGCCAAGTTTGTT-3’(SEQ ID NO：71)，克隆到pshuttle中，在BJ5183感受态细胞中得到重组腺病毒载体，经GP-293包装好的腺病毒冻存于低温冰箱备用。以293T细胞为实验模型，先利用HIVNL4.3质粒转染293T细胞，6小时后转染包装好的腺病毒颗粒，72小时后检测抑制的效果。Western blotting结果显示P24蛋白的表达被抑制掉73％，gag蛋白被抑制掉60％以上，Northern blotting表明HIV-RNA被明显抑制。说明腺病毒载体介导的RNA干扰技术能有效的抑制HIV中重要蛋白的表达，并进一步影响了病毒的复制。利用同样的原理构建的HIV gag表位相关的SCT重组DNA和痘苗病毒载体也可以高效的诱发HIV表位相关的CTL作用(图4、6)。

本实施例中所用的HIV-1的膜融合抑制序列是通过构建真核分泌表达基因而构建的重组DNA、腺病毒和痘苗病毒(图8)。在一个具体的实例中，我们选择了真核表达载体pcDNA3.0和pSecTag2B。

用pcDNA3.0(Invitrogen)，pSecTag2B(Invitrogen)两个真核表达载体，构建分别含有tPA和IgG信号肽序列的分泌表达载体。pcDNA3.0-tPA-HR212的构建采用搭桥PCR的方式，引物序列分别为：

Up-tPA-p1：GTCTTCGTTTCGCCCAGCTGGATGGAGTGGGACAG(SEQID NO：51)

Up-tPA-p2：

GCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCCA(SEQID NO：52)

Up-tPA-p3：GATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGC(SEQ ID NO：53)

Up-tPA-p4：CGCAGGATCCGCCACCATGGATGCAATGAAGAGAG(SEQID NO：54)

Down-HR212-p1：CGCGCTCGAGCTACAATAATTCTTGTTCATTC(SEQID NO：55)

所构建的基因结构如图8A所示。

pSecTag2B-HR212的引物序列如下，所构建的基因结构如图8B所示。

Up-pSec-p1：CGCAGGATCCTGGATGGAGTGGGACAGAG(SEQ IDNO：56)

Down-HR212-p1：CTCTGTCCCACTCCATCCAGGATCCTGCG(SEQ IDNO：57)

将PCR所获得的基因tPA-HR212(SEQ ID NO：19)和pSec-HR212用BamHI/Xho I进行双酶切，然后连入同样酶切的真核表达载体中，构建分泌表达的真核重组DNA。

将所构建的真核分泌表达载体转染293T细胞(购自ATCC)，培养48-72小时后收集上清，并进行浓缩。包装HIV的假病毒，具体操作方法为转染前24h，消化293T细胞并传至10cm皿中，浓度为4-5×10⁶/皿。24h后，细胞大约80％铺满。用磷酸钙法将pNL43LucE-R(购自Invitrogen)和pMT3-HXB-2(购自Invitrogen)两个质粒共转染293T细胞，转染48h后，细胞长满变圆，离心(3000rpm×10min)收获含HIV-1假病毒上清液。

进行融合抑制实验前24小时，消化GHOST-CXCR4(购自ATCC)细胞并传至24孔板中，细胞浓度为8×10⁴/孔。将真核分泌表达载体表达的上清与病毒按照1∶1混合，然后将混合物接种到GHOST-CXCR4细胞(购自ATCC)中，待病毒吸附细胞2h后，吸弃病毒混合物，加入新鲜培养基继续培养，每个稀释度做2个重复，48-72小时后收获并裂解细胞，测定细胞上清中萤火虫荧光酶的活性。实验结果如表2所示。

表2：HR212抑制HIV侵染靶细胞

阴性	阳性	对照	pcDNA3.0-tPA-HR212	pSecTag2B-HR212
					72	26342	15674	6739	2384
82	16598	22252	2009	5243

阴性：GHOST-CXCR4细胞无处理

阳性：GHOST-CXCR4细胞中接入假病毒

对照：GHOST-CXCR4细胞中接入假病毒和293细胞上清

pcDNA3.0-tPA-HR212：GHOST-CXCR4细胞中接入假病毒和转染

pcDNA3.0-TPA-HR212的293细胞上清

pSecTag2B-HR212：GHOST-CXCR4细胞中接入假病毒和转染

pSecTag2B-HR212的293细胞上清

与已经存在的HIV的小分子化学药物鸡尾酒疫苗不同，本实施例所公开的内容是按照HIV感染特征而设计的生物鸡尾酒疫苗。本实施例所公开的分泌表达的HIV HR212可以有效的抑制包装的HIV假病毒对靶细胞的侵染，另外，由于真核载体疫苗可以自主在体内复制、表达并正确加工目的蛋白，因此可以有效的降低HIV治疗时持续用药的特点。与实施例一1B、C的构建方式一样，构建的包含HIV结构基因以及包含HIV抗原表位的SCT DNA-痘苗疫苗在HLA-A转基因鼠中可以高效诱发HIV的多表位CTL应答。

实施例四：HIV-I治疗性鸡尾酒疫苗

与实施例三类似，HIV-1治疗性鸡尾酒疫苗也包含多载体治疗性鸡尾酒疫苗和单载体治疗性鸡尾酒疫苗。除实施例三所包含的多个元件外，本实施例中还包含能抑制HIV-1复制的有效的RNA干涉元件及构建的重组DNA、腺病毒和痘苗病毒。

本实施例中简单的阐述与其中的部分载体相关的重组体的构建策略。利用与实施例一同样的方法，筛选到了抑制HIV的tat基因的siRNA序列(SEQ ID NO：23)，转成DNA序列为：5‘-AAGTGTTGCTTTCATTGCCAAGTTTGTT-3’，克隆到pshuttle中，在BJ5183感受态细胞中得到重组腺病毒载体，经GP-293包装好的腺病毒冻存于低温冰箱备用。以293T细胞为实验模型，先利用HIVNL4.3质粒转染293T细胞，6小时后转染包装好的腺病毒颗粒，72小时后检测抑制的效果。Western blotting结果显示P24蛋白的表达被抑制掉73％，gag蛋白被抑制掉60％以上，Northern blotting表明HIV-RNA被明显抑制。说明腺病毒载体介导的RNA干扰技术能有效的抑制HIV中重要蛋白的表达，并进一步影响了病毒的复制。与HIV预防性鸡尾酒疫苗一样，包含HIV结构抗原、结构抗原与佐剂的融合基因、HIV多表位佐剂融合基因以及HIV表位-SCT的重组DNA-痘苗疫苗在HLA-A2转基因鼠内可以高效诱发多表位CTL作用。

参考文献

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序列表

<110>中国科学院微生物研究所

<120>一种抗免疫耐受性和免疫缺陷性病毒的鸡尾酒疫苗及其应用

<130>IBO67386

<160>77

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1071

<212>DNA

<213>小鼠

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1071)

<223>

<400>1

atggathatg aagtcgacgt ggatggcaca gtggaagagg acctgggtaa aagccgagaa 60

ggctcaagga cagatgatga agttgtgcag agagaggaag aagctattca gttggatggg 120

ttaaacgcat cacagataag agaacttaga gaaaaatctg aaaagttcgc cttccaagct 180

gaagtgaaca ggatgatgaa acttatcatc aattctttgt ataaaaataa agagattttc 240

ctgagagaac tgatttcaaa tgcttctgat gctttagaca agataaggct catctcccta 300

actgatgaaa atgcactcgc tggaaatgag gagttaacgg tcaagattaa gtgtgacaaa 360

gagaaaaacc tgctgcatgt cacagacacg ggtgtaggaa tgactagaga ggagttggtt 420

aaaaatctcg gcaccatagc caaatctgga acaagcgagt ttttaaacaa aatgacagaa 480

gctcaagaag atggtcagtc aacctctgaa ctgattggcc agtttggtgt cggtttttat 540

tctgccttcc ttgtagcaga taaggtcatt gtcacatcga aacacaacaa tgatacccag 600

cacatctggg aatcagactc caatgaattc tctgtaattg ctgacccaag aggaaacaca 660

ctaggtcgtg gaacaacaat tactcttgtc ttaaaagaag aagcatctga ttaccttgaa 720

ttggacacaa ttaaaaatct cgtcaggaag tactctcagt tcatcaactt tcccatctac 780

gtgtggagta gcaagacaga gactgttgag gagcccttgg aagaagatga agcagcaaaa 840

gaagagaaag aagaatctga tgatgaagct gcagtagagg aggaagaaga agaaaagaaa 900

ccaaaaacta agaaagttga aaaaactgtg tgggattggg aacttatgaa tgatatcaaa 960

ccaatatggc agagaccatc caaagaagta gaagaagacg aatacaaagc tttctacaaa 1020

tcattttcaa aggaaagtga tgaccccatg gcttatatcc acttcactta a 1071

<210>2

<211>1071

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1071)

<223>

<400>2

atggacgatg aagttgatgt ggatggtaca gtagaagagg atctgggtaa aagtagagaa 60

ggatcaagga cggatgatga agtagtacag agagaggaag aagctattca gttggatgga 120

ttaaatgcat cacaaataag agaacttaga gagaagtcgg aaaagtttgc cttccaagcc 180

gaagttaaca gaatgatgaa acttatcatc aattcattgt ataaaaataa agagattttc 240

ctgagagaac tgatttcaaa tgcttctgat gctttagata agataaggct aatatcactg 300

actgatgaaa atgctctttc tggaaatgag gaactaacag tcaaaattaa gtgtgataag 360

gagaagaacc tgctgcatgt cacagacacc ggtgtaggaa tgaccagaga agagttggtt 420

aaaaaccttg gtaccatagc caaatctggg acaagcgagt ttttaaacaa aatgactgaa 480

gcacaggaag atggccagtc aacttctgaa ttgattggcc agtttggtgt cggtttctat 540

tccgccttcc ttgtagcaga taaggttatt gtcacttcaa aacacaacaa cgatacccag 600

cacatctggg agtctgactc caatgaattt tctgtaattg ctgacccaag aggaaacact 660

ctaggacggg gaacgacaat tacccttgtc ttaaaagaag aagcatctga ttaccttgaa 720

ttggatacaa ttaaaaatct cgtcaaaaaa tattcacagt tcataaactt tcctatttat 780

gtatggagca gcaagactga aactgttgag gagcccatgg aggaagaaga agcagccaaa 840

gaagagaaag aagaatctga tgatgaagct gcagtagagg aagaagaaga agaaaagaaa 900

ccaaagacta aaaaagttga aaaaactgtc tgggactggg aacttatgaa tgatatcaaa 960

ccaatatggc agagaccatc aaaagaagta gaagaagatg aatacaaagc tttctacaaa 1020

tcattttcaa aggaaagtga tgaccccatg gcttatattc actttactta a 1071

<210>3

<211>2352

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2352)

<223>

<400>3

atggacgatg aagttgatgt ggatggtaca gtagaagagg atctgggtaa aagtagagaa 60

ggatcaagga cggatgatga agtagtacag agagaggaag aagctattca gttggatgga 120

ttaaatgcat cacaaataag agaacttaga gagaagtcgg aaaagtttgc cttccaagcc 180

gaagttaaca gaatgatgaa acttatcatc aattcattgt ataaaaataa agagattttc 240

ctgagagaac tgatttcaaa tgcttctgat gctttagata agataaggct aatatcactg 300

actgatgaaa atgctctttc tggaaatgag gaactaacag tcaaaattaa gtgtgataag 360

gagaagaacc tgctgcatgt cacagacacc ggtgtaggaa tgaccagaga agagttggtt 420

aaaaaccttg gtaccatagc caaatctggg acaagcgagt ttttaaacaa aatgactgaa 480

gcacaggaag atggccagtc aacttctgaa ttgattggcc agtttggtgt cggtttctat 540

tccgccttcc ttgtagcaga taaggttatt gtcacttcaa aacacaacaa cgatacccag 600

cacatctggg agtctgactc caatgaattt tctgtaattg ctgacccaag aggaaacact 660

ctaggacggg gaacgacaat tacccttgtc ttaaaagaag aagcatctga ttaccttgaa 720

ttggatacaa ttaaaaatct cgtcaaaaaa tattcacagt tcataaactt tcctatttat 780

gtatggagca gcaagactga aactgttgag gagcccatgg aggaagaaga agcagccaaa 840

gaagagaaag aagaatctga tgatgaagct gcagtagagg aagaagaaga agaaaagaaa 900

ccaaagacta aaaaagttga aaaaactgtc tgggactggg aacttatgaa tgatatcaaa 960

ccaatatggc agagaccatc aaaagaagta gaagaagatg aatacaaagc tttctacaaa 1020

tcattttcaa aggaaagtga tgaccccatg gcttatattc actttactgc tgaaggggaa 1080

gttaccttca aatcaatttt atttgtaccc acatctgctc cacgtggtct gtttgacgaa 1140

tatggatcta aaaagagcga ttacattaag ctctatgtgc gccgtgtatt catcacagac 1200

gacttccatg atatgatgcc taaatacctc aattttgtca agggtgtggt ggactcagat 1260

gatctcccct tgaatgtttc ccgcgagact cttcagcaac ataaactgct taaggtgatt 1320

aggaagaagc ttgttcgtaa aacgctggac atgatcaaga agattgctga tgataaatac 1380

aatgatactt tttggaaaga atttggtacc aacatcaagc ttggtgtgat tgaagaccac 1440

tcgaatcgaa cacgtcttgc taaacttctt aggttccagt cttctcatca tccaactgac 1500

attactagcc tagaccagta tgtggaaaga atgaaggaaa aacaagacaa aatctacttc 1560

atggctgggt ccagcagaaa agaggctgaa tcttctccat ttgttgagcg acttctgaaa 1620

aagggctatg aagttattta cctcacagaa cctgtggatg aatactgtat tcaggccctt 1680

cccgaatttg atgggaagag gttccagaat gttgccaagg aaggagtgaa gttcgatgaa 1740

agtgagaaaa ctaaggagag tcgtgaagca gttgagaaag aatttgagcc tctgctgaat 1800

tggatgaaag ataaagccct taaggacaag attgaaaagg ctgtggtgtc tcagcgcctg 1860

acagaatctc cgtgtgcttt ggtggccagc cagtacggat ggtctggcaa catggagaga 1920

atcatgaaag cacaagcgta ccaaacgggc aaggacatct ctacaaatta ctatgcgagt 1980

cagaagaaaa catttgaaat taatcccaga cacccgctga tcagagacat gcttcgacga 2040

attaaggaag atgaagatga taaaacagtt ttggatcttg ctgtggtttt gtttgaaaca 2100

gcaacgcttc ggtcagggta tcttttacca gacactaaag catatggaga tagaatagaa 2160

agaatgcttc gcctcagttt gaacattgac cctgatgcaa aggtggaaga agagcccgaa 2220

gaagaacctg aagagacagc agaagacaca acagaagaca cagagcaaga cgaagatgaa 2280

gaaatggatg tgggaacaga tgaagaagaa gaaacagcaa aggaatctac agctgaaaaa 2340

gatgaattgt aa 2352

<210>4

<211>450

<212>DNA

<213>乙肝病毒

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(450)

<223>

<400>4

atgcaacttt ttgaattctg cctaatcatc tcatgttcat gtcctactgt tcaagcctcc 60

aagctgtgcc ttgggtggct ttggggcatg gacattgacc cgtataaaga atttggagct 120

tctgtggagt tactctcttt tttgccttct gacttctttc cttctgttcg agagcttctc 180

gacaccgcct ctgctctgta tcgggaggcc ttagagtctc cggaacattg ttcacctcat 240

catacggcac tcaggcaagc tattctgtgt tgggttgagt tgatgaatct agccacctgg 300

gtgggaagta atttggaaga cccagcatcc agggaattgg tagtcagcca tgtcaatgtt 360

aatatgggcc taaaaatcag acaactattg tggtttcaca tttcctgtct tacttttgga 420

agagaaactg ttcttgaata tttggtgtaa 450

<210>5

<211>681

<212>DNA

<213>乙肝病毒

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(681)

<223>

<400>5

atggagaaca tcgcatcagg actcctagga cccctgctcg tgttacaggc ggggtttttc 60

tcgttgacaa aaatcctcac aataccacag agtctagact cgttgtggac ttctctcaat 120

tttctagggg aaacacccgt gtgtcttggc caaaattcgc agtcccaaat ctccagtcac 180

tcactaactt gttgtcctcc aatttgtcct ggttatcgct ggatgtgtct gcggcgtttt 240

atcatcttcc tctgcatcct gctgctatgc ctcatcttct tgttggttct tctggactat 300

caaggtatgt tgcccgtttg tcctctaatt ccaggatcat caaccaccag caccggacca 360

tgcagaacct gcacgactcc tgctcaagga acctctatgt ttccctcatg ttgctgtaca 420

aaacctacgg acggaaactg cacctgtatt cccatcccat catcttgggc tttcgcaaaa 480

tacctatggg agtgggcctc agtccgtttc tcttggctca gtttactagt gccatttgtt 540

cagtggttcg tagggctttc ccccactgtc tggctttcag ttatatggat gatgtggtat 600

tgggggccaa gtctgtacaa catcttgagt ccctttatgc cgctgttacc aattttcttt 660

tgtctttggg tatacattta a 681

<210>6

<211>846

<212>DNA

<213>乙肝病毒

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(846)

<223>

<400>6

atgcagtgga attccacaac ctttcaccaa actctgcaag atcccagagt gagaggcctg 60

tatttccctg ctggtggctc cagttcagga gcagtaaacc ctgttccgac tactgcctct 120

cccttatcgt caatcttctc gaggattggg gaccctgcgc tgaacatgga gaacatcaca 180

tcaggattcc taggacccct tctcgtgtta caggcggggt ttttcttgtt gacaagaatc 240

ctcacaatac cgcagagtct agactcgtgg tggacttctc tcaattttct agggggaact 300

accgtgtgtc ttggccaaaa ttcgcagtcc ccaacctcca atcactcacc aacctcctgt 360

cctccaactt gtcctggtta tcgctggatg tgtctgcggc gttttatcat cttcctcttc 420

atcctgctgc tatgcctcat cttcttgttg gttcttctgg actatcaagg tatgttgccc 480

gtttgtcctc taattccagg atcctcaacc accagcacgg gaccatgccg aacctgcatg 540

actactgctc aaggaacctc tatgtatccc tcctgttgct gtaccaaacc ttcggacgga 600

aattgcacct gtattcccat cccatcatcc tgggctttcg gaaaattcct atgggagtgg 660

gcctcagccc gtttctcctg gctcagttta ctagtgccat ttgttcagtg gttcgtaggg 720

ctttccccca ctgtttggct ttcagttata tggatgatgt ggtattgggg gccaagtctg 780

tacagcatct tgagtccctt tttaccgctg ttaccaattt tcttttgtct ttgggtatac 840

atttaa 846

<210>7

<211>1530

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1530)

<223>

<400>7

atgcaacttt ttgaattctg cctaatcatc tcatgttcat gtcctactgt tcaagcctcc 60

aagctgtgcc ttgggtggct ttggggcatg gacattgacc cgtataaaga atttggagct 120

tctgtggagt tactctcttt tttgccttct gacttctttc cttctgttcg agagcttctc 180

gacaccgcct ctgctctgta tcgggaggcc ttagagtctc cggaacattg ttcacctcat 240

catacggcac tcaggcaagc tattctgtgt tgggttgagt tgatgaatct agccacctgg 300

gtgggaagta atttggaaga cccagcatcc agggaattgg tagtcagcca tgtcaatgtt 360

aatatgggcc taaaaatcag acaactattg tggtttcaca tttcctgtct tacttttgga 420

agagaaactg ttcttgaata tttggtgggt tcctctggag gtgatgatga agtcgacgtg 480

gatggcacag tggaagagga cctgggtaaa agccgagaag gctcaaggac agatgatgaa 540

gttgtgcaga gagaggaaga agctattcag ttggatgggt taaacgcatc acagataaga 600

gaacttagag aaaaatctga aaagttcgcc ttccaagctg aagtgaacag gatgatgaaa 660

cttatcatca attctttgta taaaaataaa gagattttcc tgagagaact gatttcaaat 720

gcttctgatg ctttagacaa gataaggctc atctccctaa ctgatgaaaa tgcactcgct 780

ggaaatgagg agttaacggt caagattaag tgtgacaaag agaaaaacct gctgcatgtc 840

acagacacgg gtgtaggaat gactagagag gagttggtta aaaatctcgg caccatagcc 900

aaatctggaa caagcgagtt tttaaacaaa atgacagaag ctcaagaaga tggtcagtca 960

acctctgaac tgattggcca gtttggtgtc ggtttttatt ctgccttcct tgtagcagat 1020

aaggtcattg tcacatcgaa acacaacaat gatacccagc acatctggga atcagactcc 1080

aatgaattct ctgtaattgc tgacccaaga ggaaacacac taggtcgtgg aacaacaatt 1140

actcttgtct taaaagaaga agcatctgat taccttgaat tggacacaat taaaaatctc 1200

gtcaggaagt actctcagtt catcaacttt cccatctacg tgtggagtag caagacagag 1260

actgttgagg agcccttgga agaagatgaa gcagcaaaag aagagaaaga agaatctgat 1320

gatgaagctg cagtagagga ggaagaagaa gaaaagaaac caaaaactaa gaaagttgaa 1380

aaaactgtgt gggattggga acttatgaat gatatcaaac caatatggca gagaccatcc 1440

aaagaagtag aagaagacga atacaaagct ttctacaaat cattttcaaa ggaaagtgat 1500

gaccccatgg cttatatcca cttcacttaa 1530

<210>8

<211>1761

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1761)

<223>

<400>8

atggagaaca tcgcatcagg actcctagga cccctgctcg tgttacaggc ggggtttttc 60

tcgttgacaa aaatcctcac aataccacag agtctagact cgttgtggac ttctctcaat 120

tttctagggg aaacacccgt gtgtcttggc caaaattcgc agtcccaaat ctccagtcac 180

tcactaactt gttgtcctcc aatttgtcct ggttatcgct ggatgtgtct gcggcgtttt 240

atcatcttcc tctgcatcct gctgctatgc ctcatcttct tgttggttct tctggactat 300

caaggtatgt tgcccgtttg tcctctaatt ccaggatcat caaccaccag caccggacca 360

tgcagaacct gcacgactcc tgctcaagga acctctatgt ttccctcatg ttgctgtaca 420

aaacctacgg acggaaactg cacctgtatt cccatcccat catcttgggc tttcgcaaaa 480

tacctatggg agtgggcctc agtccgtttc tcttggctca gtttactagt gccatttgtt 540

cagtggttcg tagggctttc ccccactgtc tggctttcag ttatatggat gatgtggtat 600

tgggggccaa gtctgtacaa catcttgagt ccctttatgc cgctgttacc aattttcttt 660

tgtctttggg tatacattgg ttcctctgga ggtgatgatg aagtcgacgt ggatggcaca 720

gtggaagagg acctgggtaa aagccgagaa ggctcaagga cagatgatga agttgtgcag 780

agagaggaag aagctattca gttggatggg ttaaacgcat cacagataag agaacttaga 840

gaaaaatctg aaaagttcgc cttccaagct gaagtgaaca ggatgatgaa acttatcatc 900

aattctttgt ataaaaataa agagattttc ctgagagaac tgatttcaaa tgcttctgat 960

gctttagaca agataaggct catctcccta actgatgaaa atgcactcgc tggaaatgag 1020

gagttaacgg tcaagattaa gtgtgacaaa gagaaaaacc tgctgcatgt cacagacacg 1080

ggtgtaggaa tgactagaga ggagttggtt aaaaatctcg gcaccatagc caaatctgga 1140

acaagcgagt ttttaaacaa aatgacagaa gctcaagaag atggtcagtc aacctctgaa 1200

ctgattggcc agtttggtgt cggtttttat tctgccttcc ttgtagcaga taaggtcatt 1260

gtcacatcga aacacaacaa tgatacccag cacatctggg aatcagactc caatgaattc 1320

tctgtaattg ctgacccaag aggaaacaca ctaggtcgtg gaacaacaat tactcttgtc 1380

ttaaaagaag aagcatctga ttaccttgaa ttggacacaa ttaaaaatct cgtcaggaag 1440

tactctcagt tcatcaactt tcccatctac gtgtggagta gcaagacaga gactgttgag 1500

gagcccttgg aagaagatga agcagcaaaa gaagagaaag aagaatctga tgatgaagct 1560

gcagtagagg aggaagaaga agaaaagaaa ccaaaaacta agaaagttga aaaaactgtg 1620

tgggattggg aacttatgaa tgatatcaaa ccaatatggc agagaccatc caaagaagta 1680

gaagaagacg aatacaaagc tttctacaaa tcattttcaa aggaaagtga tgaccccatg 1740

gcttatatcc acttcactta a 1761

<210>9

<211>1761

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1761)

<223>

<400>9

atggagaaca tcgcatcagg actcctagga cccctgctcg tgttacaggc ggggtttttc 60

tcgttgacaa aaatcctcac aataccacag agtctagact cgttgtggac ttctctcaat 120

tttctagggg aaacacccgt gtgtcttggc caaaattcgc agtcccaaat ctccagtcac 180

tcactaactt gttgtcctcc aatttgtcct ggttatcgct ggatgtgtct gcggcgtttt 240

atcatcttcc tctgcatcct gctgctatgc ctcatcttct tgttggttct tctggactat 300

caaggtatgt tgcccgtttg tcctctaatt ccaggatcat caaccaccag caccggacca 360

tgcagaacct gcacgactcc tgctcaagga acctctatgt ttccctcatg ttgctgtaca 420

aaacctacgg acggaaactg cacctgtatt cccatcccat catcttgggc tttcgcaaaa 480

tacctatggg agtgggcctc agtccgtttc tcttggctca gtttactagt gccatttgtt 540

cagtggttcg tagggctttc ccccactgtc tggctttcag ttatatggat gatgtggtat 600

tgggggccaa gtctgtacaa catcttgagt ccctttatgc cgctgttacc aattttcttt 660

tgtctttggg tatacattgg ttcctctgga ggtgacgatg aagttgatgt ggatggtaca 720

gtagaagagg atctgggtaa aagtagagaa ggatcaagga cggatgatga agtagtacag 780

agagaggaag aagctattca gttggatgga ttaaatgcat cacaaataag agaacttaga 840

gagaagtcgg aaaagtttgc cttccaagcc gaagttaaca gaatgatgaa acttatcatc 900

aattcattgt ataaaaataa agagattttc ctgagagaac tgatttcaaa tgcttctgat 960

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gaactaacag tcaaaattaa gtgtgataag gagaagaacc tgctgcatgt cacagacacc 1080

ggtgtaggaa tgaccagaga agagttggtt aaaaaccttg gtaccatagc caaatctggg 1140

acaagcgagt ttttaaacaa aatgactgaa gcacaggaag atggccagtc aacttctgaa 1200

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gtcacttcaa aacacaacaa cgatacccag cacatctggg agtctgactc caatgaattt 1320

tctgtaattg ctgacccaag aggaaacact ctaggacggg gaacgacaat tacccttgtc 1380

ttaaaagaag aagcatctga ttaccttgaa ttggatacaa ttaaaaatct cgtcaaaaaa 1440

tattcacagt tcataaactt tcctatttat gtatggagca gcaagactga aactgttgag 1500

gagcccatgg aggaagaaga agcagccaaa gaagagaaag aagaatctga tgatgaagct 1560

gcagtagagg aagaagaaga agaaaagaaa ccaaagacta aaaaagttga aaaaactgtc 1620

tgggactggg aacttatgaa tgatatcaaa ccaatatggc agagaccatc aaaagaagta 1680

gaagaagatg aatacaaagc tttctacaaa tcattttcaa aggaaagtga tgaccccatg 1740

gcttatatt cactttactta a 1761

<210>10

<211>1926

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1926)

<223>

<400>10

atgcagtgga attccacaac ctttcaccaa actctgcaag atcccagagt gagaggcctg 60

tatttccctg ctggtggctc cagttcagga gcagtaaacc ctgttccgac tactgcctct 120

cccttatcgt caatcttctc gaggattggg gaccctgcgc tgaacatgga gaacatcaca 180

tcaggattcc taggacccct tctcgtgtta caggcggggt ttttcttgtt gacaagaatc 240

ctcacaatac cgcagagtct agactcgtgg tggacttctc tcaattttct agggggaact 300

accgtgtgtc ttggccaaaa ttcgcagtcc ccaacctcca atcactcacc aacctcctgt 360

cctccaactt gtcctggtta tcgctggatg tgtctgcggc gttttatcat cttcctcttc 420

atcctgctgc tatgcctcat cttcttgttg gttcttctgg actatcaagg tatgttgccc 480

gtttgtcctc taattccagg atcctcaacc accagcacgg gaccatgccg aacctgcatg 540

actactgctc aaggaacctc tatgtatccc tcctgttgct gtaccaaacc ttcggacgga 600

aattgcacct gtattcccat cccatcatcc tgggctttcg gaaaattcct atgggagtgg 660

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ctttccccca ctgtttggct ttcagttata tggatgatgt ggtattgggg gccaagtctg 780

tacagcatct tgagtccctt tttaccgctg ttaccaattt tcttttgtct ttgggtatac 840

attggttcct ctggaggtga tgatgaagtc gacgtggatg gcacagtgga agaggacctg 900

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aggctcatct ccctaactga tgaaaatgca ctcgctggaa atgaggagtt aacggtcaag 1200

attaagtgtg acaaagagaa aaacctgctg catgtcacag acacgggtgt aggaatgact 1260

agagaggagt tggttaaaaa tctcggcacc atagccaaat ctggaacaag cgagttttta 1320

aacaaaatga cagaagctca agaagatggt cagtcaacct ctgaactgat tggccagttt 1380

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aacaatgata cccagcacat ctgggaatca gactccaatg aattctctgt aattgctgac 1500

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tctgattacc ttgaattgga cacaattaaa aatcttgtca ggaagtactc tcagttcatc 1620

aactttccca tctacgtgtg gagtagcaag acagagactg ttgaggagcc cttggaagaa 1680

gatgaagcag caaaagaaga gaaagaagaa tctgatgatg aagctgcagt agaggaggaa 1740

gaagaagaaa agaaaccaaa aactaagaaa gttgaaaaaa ctgtgtggga ttgggaactt 1800

atgaatgata tcaaaccaat atggcagaga ccatccaaag aagtagaaga agacgaatac 1860

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actt aa 1926

<210>11

<211>1926

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1926)

<223>

<400>11

atggatgatg aagtcgacgt ggatggcaca gtggaagagg acctgggtaa aagccgagaa 60

ggctcaagga cagatgatga agttgtgcag agagaggaag aagctattca gttggatggg 120

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cacatctggg aatcagactc caatgaattc tctgtaattg ctgacccaag aggaaacaca 660

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ttggacacaa ttaaaaatct tgtcaggaag tactctcagt tcatcaactt tcccatctac 780

gtgtggagta gcaagacaga gactgttgag gagcccttgg aagaagatga agcagcaaaa 840

gaagagaaag aagaatctga tgatgaagct gcagtagagg aggaagaaga agaaaagaaa 900

ccaaaaacta agaaagttga aaaaactgtg tgggattggg aacttatgaa tgatatcaaa 960

ccaatatggc agagaccatc caaagaagta gaagaagacg aatacaaagc tttctacaaa 1020

tcattttcaa aggaaagtga tgaccccatg gcttatatcc acttcactgg ttcctctgga 1080

ggtcagtgga attccacaac ctttcaccaa actctgcaag atcccagagt gagaggcctg 1140

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cccttatcgt caatcttctc gaggattggg gaccctgcgc tgaacatgga gaacatcaca 1260

tcaggattcc taggacccct tctcgtgtta caggcggggt ttttcttgtt gacaagaatc 1320

ctcacaatac cgcagagtct agactcgtgg tggacttct ctcaattttct agggggaact 1380

accgtgtgtc ttggccaaaa ttcgcagtcc ccaacctcca atcactcacc aacctcctgt 1440

cctccaactt gtcctggtta tcgctggatg tgtctgcggc gttttatcat cttcctcttc 1500

atcctgctgc tatgcctcat cttcttgttg gttcttctgg actatcaagg tatgttgccc 1560

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aattgcacct gtattcccat cccatcatcc tgggctttcg gaaaattcct atgggagtgg 1740

gcctcagccc gtttctcctg gctcagttta ctagtgccat ttgttcagtg gttcgtaggg 1800

ctttccccca ctgtttggct ttcagttata tggatgatgt ggtattgggg gccaagtctg 1860

tacagcatct tgagtccctt tttaccgctg ttaccaattt tcttttgtct ttgggtatac 1920

attt aa 1926

<210>12

<211>1440

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1440)

<223>

<400>12

atggacgatg aagttgatgt ggatggtaca gtagaagagg atctgggtaa aagtagagaa 60

ggatcaagga cggatgatga agtagtacag agagaggaag aagctattca gttggatgga 120

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gaagttaaca gaatgatgaa acttatcatc aattcattgt ataaaaataa agagattttc 240

ctgagagaac tgatttcaaa tgcttctgat gctttagata agataaggct aatatcactg 300

actgatgaaa atgctctttc tggaaatgag gaactaacag tcaaaattaa gtgtgataag 360

gagaagaacc tgctgcatgt cacagacacc ggtgtaggaa tgaccagaga agagttggtt 420

aaaaaccttg gtaccatagc caaatcaggg acaagcgagt ttttaaacaa aatgactgaa 480

gcacaggaag atggccagtc aacttctgaa ttgattggcc agtttggtgt cggtttctat 540

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cacatctggg agtctgactc caatgaattt tctgtaattg ctgacccaag aggaaacact 660

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ccaaagacta aaaaagttga aaaaactgtc tgggactggg aacttatgaa gcttgctgct 960

tactttttgc catctgactt ctttccatcc gtagctgctt actatgtcaa tgttaatatg 1020

ggcctaaaat tagctgctt actggctcagt ttactagtgc catttgttgc tgcttacgaa 1080

tatttggtgt cttttggagt gtgggctgct tacttcttgt tgacaagaat cctcacaata 1140

gctgcttacg atgctgctta ccagtatata aaagcaaatt ctaaatttat aggtataact 1200

gaatctagaa tgcagatctt cgtgaagact ctgactggta agaccatcac cctcgaggtg 1260

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gactacaaca tccagaaaga gtccaccttg cacctggtac tccgtctcag aggtgggtaa 1440

<210>13

<211>1503

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1503)

<223>

<400>13

atgtctcgct ccgtggcctt agctgtgctc gcgatactct ctctttctgg cctggaggct 60

tttttgcctt ctgacttctt tccttctgtt ggaggtgggg gaggcggatc aggaggctca 120

ggtgggtcag gaggcatcca gcgtactcca aagattcagg tttactcacg tcatccagca 180

gagaatggaa agtcaaattt cctgaattgc tatgtgtctg ggtttcatcc atccgacatt 240

gaagttgact tactgaagaa tggagagaga attgaaaaag tggagcattc agacttgtct 300

ttcagcaagg actggtcttt ctatctcttg tactacactg aattcacccc cactgaaaaa 360

gatgagtatg cctgccgtgt gaaccatgtg actttgtcac agcccaagat agttaagtgg 420

gatcgagaca tgggaggtgg cggttcgggc ggaggcggct cgggtggcgg cggctctggc 480

tctcactcca tgaggtattt cttcacatcc gtgtcccggc ccggccgcgg ggagccccgc 540

ttcatcgcag tgggctacgt ggacgacacg cagttcgtgc ggttcgacag cgacgccgcg 600

agccagagga tggagccgcg ggcgccgtgg atagagcagg agggtccgga gtattgggac 660

ggggagacac ggaaagtgaa ggcccactca cagactcacc gagtggacct ggggaccctg 720

cgcggctact acaaccagag cgaggccggt tctcacaccg tccagaggat gtatggctgc 780

gacgtggggt cggactggcg cttcctccgc gggtaccacc agtacgccta cgacggcaag 840

gattacatcg ccctgaaaga ggacctgcgc tcttggaccg cggcggacat ggcagctcag 900

accaccaagc acaagtggga ggcggcccat gtggcggagc agttgagagc ctacctggag 960

ggcacgtgcg tggagtggct ccgcagatac ctggagaacg ggaaggagac gctgcagcgc 1020

acggacgccc ccaaaacgca tatgactcac cacgctgtct ctgaccatga agccaccctg 1080

aggtgctggg ccctgagctt ctaccctgcg gagatcacac tgacctggca gcgggatggg 1140

gaggaccaga cccaggacac ggagctcgtg gagaccaggc ctgcagggga tggaaccttc 1200

cagaagtggg cggctgtggt ggtgccttct ggacaggagc agagatacac ctgccatgtg 1260

cagcatgagg gtttgcccaa gcccctcacc ctgagatggg agccgtcttc ccagcccacc 1320

atccccatcg tgggcatcat tgctggcctg gttctctttg gagctgtgat cactggagct 1380

gtggtcgctg ctgtgatgtg gaggaggaag agctcagata gaaaaggagg gagctactct 1440

caggctgcaa gcagtgacag tgcccagggc tctgatgtgt ctctcacagc ttgtaaagtg 1500

tga 1503

<210>14

<211>1500

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1500)

<223>

<400>14

atgtctcgct ccgtggcctt agctgtgctc gcgatact ctctctttctgg cctggaggct 60

tgtcttactt ttggaagaga aactgttgga ggtgggggag gcggatcagg aggctcaggt 120

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aatggaaagt caaatttcct gaattgctat gtgtctgggt ttcatccatc cgacattgaa 240

gttgacttac tgaagaatgg agagagaatt gaaaaagtgg agcattcaga cttgtctttc 300

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cactccatga ggtatttctt cacatccgtg tcccggcccg gccgcgggga gccccgcttc 540

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gagacacgga aagtgaaggc ccactcacag actcaccgag tggacctggg gaccctgcgc 720

ggctactaca accagagcga ggccggttct cacaccgtcc agaggatgta tggctgcgac 780

gtggggtcgg actggcgctt cctccgcggg taccaccagt acgcctacga cggcaaggat 840

tacatcgccc tgaaagagga cctgcgctct tggaccgcgg cggacatggc agctcagacc 900

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gacgccccca aaacgcatat gactcaccac gctgtctctg accatgaagc caccctgagg 1080

tgctgggccc tgagcttcta ccctgcggag atcacactga cctggcagcg ggatggggag 1140

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cccatcgtgg gcatcattgc tggcctggtt ctctttggag ctgtgatcac tggagctgtg 1380

gtcgctgctg tgatgtggag gaggaagagc tcagatagaa aaggagggag ctactctcag 1440

gctgcaagca gtgacagtgc ccagggctct gatgtgtctc tcacagcttg taaagtgtga 1500

<210>15

<211>1500

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1500)

<223>

<400>15

atgtctcgct ccgtggcctt agctgtgctc gcgatactct ctctttctgg cctggaggct 60

agcctgtaca acaccgtcgc gaccctagga ggtgggggag gcggatcagg aggctcaggt 120

gggtcaggag gcatccagcg tactccaaag attcaggttt actcacgtca tccagcagag 180

aatggaaagt caaatttcct gaattgctat gtgtctgggt ttcatccatc cgacattgaa 240

gttgacttac tgaagaatgg agagagaatt gaaaaagtgg agcattcaga cttgtctttc 300

agcaaggact ggtctttcta tctcttgtac tacactgaat tcacccccac tgaaaaagat 360

gagtatgcct gccgtgtgaa ccatgtgact ttgtcacagc ccaagatagt taagtgggat 420

cgagacatgg gaggtggcgg ttcgggcgga ggcggctcgg gtggcggcgg ctctggctct 480

cactccatga ggtatttctt cacatccgtg tcccggcccg gccgcgggga gccccgcttc 540

atcgcagtgg gctacgtgga cgacacgcag ttcgtgcggt tcgacagcga cgccgcgagc 600

cagaggatgg agccgcgggc gccgtggata gagcaggagg gtccggagta ttgggacggg 660

gagacacgga aagtgaaggc ccactcacag actcaccgag tggacctggg gaccctgcgc 720

ggctactaca accagagcga ggccggttct cacaccgtcc agaggatgta tggctgcgac 780

gtggggtcgg actggcgctt cctccgcggg taccaccagt acgcctacga cggcaaggat 840

tacatcgccc tgaaagagga cctgcgctct tggaccgcgg cggacatggc agctcagacc 900

accaagcaca agtgggaggc ggcccatgtg gcggagcagt tgagagccta cctggagggc 960

acgtgcgtgg agtggctccg cagatacctg gagaacggga aggagacgct gcagcgcacg 1020

gacgccccca aaacgcatat gactcaccac gctgtctctg accatgaagc caccctgagg 1080

tgctgggccc tgagcttcta ccctgcggag atcacactga cctggcagcg ggatggggag 1140

gaccagaccc aggacacgga gctcgtggag accaggcctg caggggatgg aaccttccag 1200

aagtgggcgg ctgtggtggt gccttctgga caggagcaga gatacacctg ccatgtgcag 1260

catgagggtt tgcccaagcc cctcaccctg agatgggagc cgtcttccca gcccaccatc 1320

cccatcgtgg gcatcattgc tggcctggtt ctctttggag ctgtgatcac tggagctgtg 1380

gtcgctgctg tgatgtggag gaggaagagc tcagatagaa aaggagggag ctactctcag 1440

gctgcaagca gtgacagtgc ccagggctct gatgtgtctc tcacagcttg taaagtgtga 1500

<210>16

<211>102

<212>DNA

<213>人免疫缺陷病毒

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(102)

<223>

<400>16

atggagtggg acagagaaat taacaattac acaagcttaa tacactcctt aattgaagaa 60

tcgcaaaacc agcaagaaaa gaatgaacaa gaattattgtaa 102

<210>17

<211>108

<212>DNA

<213>人免疫缺陷病毒

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(108)

<223>

<400>17

atgtctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc gcaacagcat 60

ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg caagataa 108

<210>18

<211>336

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(336)

<223>

<400>18

atggagtggg acagagaaat taacaattac acaagcttaa tacactcctt aattgaagaa 60

tcgcaaaacc agcaagaaaa gaatgaacaa gaattattgg gtggttctgg tggatctggt 120

atagtgcagc agcagaacaa tttgctgagg gctattgagg cgcaacagca tctgttgcaa 180

ctcacagtct ggggcatcaa gcagctccag gcaagaggtt cctctggagg ttggatggag 240

tgggacagag aaattaacaa ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa 300

aaccagcaag aaaagaatga acaagaatta ttgtag 336

<210>19

<211>405

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(405)

<223>

<400>19

atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60

tcgcccagca tggagtggga cagagaaatt aacaattaca caagcttaat acactcctta 120

attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag aattattggg tggttctggt 180

ggatctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc gcaacagcat 240

ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg caagaggttc ctctggaggt 300

tggatggagt gggacagaga aattaacaat tacacaagct taatacactc cttaattgaa 360

gaatcgcaaa accagcaaga aaagaatgaa caagaattat tgtag 405

<210>20

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(56)

<223>

<400>20

tcgagaggac tcttggactc tcattcaaga gatgagagtc caagagtcct cttttt 56

<210>21

<211>68

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(68)

<223>

<400>21

tcgaccgtgt gcacttcgct tcacctctgt tcaagagaca gaggtgaagc gaagtgcaca 60

cggttttt 68

<210>22

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(56)

<223>

<400>22

tcgacccgct caatgcctgg agattcaaga gatctccagg cattgagcgg gttttt 56

<210>23

<211>74

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(74)

<223>

<400>23

tcgaaagtgt tgctttcatt gccaagtttg ttttcaagag aaacaaactt ggcaatgaaa 60

gcaacacttt tttt 74

<210>24

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>24

gcggatccat ggagaacatc acatcaggat 30

<210>25

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>25

gcgctcgagt taaatgtata cccaaagac 29

<210>26

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>26

gcggatccat ggacattgac ccgtataaag 30

<210>27

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>27

gcgctcgagt taaataacac aagtctccgg 30

<210>28

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>28

gcggatccat ggatgatgaa gtcgacgt 28

<210>29

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>29

gcgctcgagt taagtgaagt ggatataagc cat 33

<210>30

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>30

gcggtaccat gcagtggaat tccacaacct 30

<210>31

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>31

tagcggccgc ttaaatgtat acccaaagac 30

<210>32

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>32

acctccagag gaaccaatgt atacccaaag ac 32

<210>33

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>33

ggttcctctg gaggtgatga tgaagtcgac gt 32

<210>34

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>34

ggttcctctg gaggtgacga tgaagttgatgt 32

<210>35

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>35

gcgctcgagt taagtaaagt gaatataagc c 31

<210>36

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>36

acctccagag gaaccaataa cacaagtctc cg 32

<210>37

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>37

acctccagag gaaccaatgt atacccaaag 30

<210>38

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>38

ggttcctctg gaggtgatga tgaagtcgac 30

<210>39

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>39

tagcggccgc ttaagtgaag tggatataag 30

<210>40

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>40

taggtaccat ggatgatgaa gtcgacgtgg 30

<210>41

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>41

acctccagag gaaccaatgt atacccaaag 30

<210>42

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

ggttcctctg gaggtgatga tgaagtcgac 30

<210>43

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>43

cagctgtgga atgtgtgtca gttag 25

<210>44

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>44

aatcagcaag cttggtaccg a 21

<210>45

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<400>45

aacagaagga aagaagtcag aaggcaaaaa agcctccagg ccagaaag 48

<210>46

<211>8

<212>DNA

<213>人工序列

<400>46

tttttgcctt ctgacttctt tccttctgtt ggaggtgggg gaggcgga 48

<210>47

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<400>47

aacagtttct cttccaaaag taagacaagc ctccaggcca gaaag 45

<210>48

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<400>48

tgtcttactt ttggaagaga aactgttgga ggtgggggag gcgga 45

<210>49

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<400>49

gcgaagctt g 10

<210>50

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<400>50

actcgagcat 10

<210>51

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>51

gtcttcgttt cgcccagctg gatggagtgg gacag 35

<210>52

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<400>52

gctgtgtgct gctgctgtgt ggagcagtct tcgtttcgcc ca 42

<210>53

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<400>53

gatgcaatga agagagggct ctgctgtgtg ctgctgc 37

<210>54

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>54

cgcaggatcc gccaccatgg atgcaatgaa gagag 35

<210>55

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>55

cgcgctcgag ctacaataat tcttgttcat tc 32

<210>56

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>56

cgcaggatcc tggatggagt gggacagag 29

<210>57

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>57

ctctgtccca ctccatccag gatcctgcg 29

<210>58

<211>3027

<212>DNA

<213>丙肝病毒

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(3027)

<223>

<400>58

atgagcacaa atcctaaacc tcaaagaaaa accaaacgta acaccaaccg ccgcccacag 60

gacgtcaagt tcccgggcgg tggtcagatc gttggtggag tttacctgtt gccgcgcagg 120

ggccccaggt tgggtgtgcg cgcgactagg aagacttccg agcggtcgca acctcgtgga 180

aggcgacaac ctatccccaa ggctcgccgg cccgagggca gggcctgggc tcagcccggg 240

tacccttggc ccctctatgg caatgagggc ttggggtggg caggatggct cctgtcaccc 300

cgtggctctc ggcctagttg gggccccaca gacccccggc gtaggtcgcg taatttgggt 360

aaggtcatcg ataccctcac atgcggcttc gccgacctca tggggtacat tccgcttgtc 420

ggcgcccccc tagggggcgc tgccagggcc ctggcgcatg gcgtccgggt tctggaggac 480

ggcgtgaact atgcaacagg gaatttgccc ggttgctctt tctctatctt cctcttggct 540

ttgctgtctt gtctgaccat cccagcttcc gcttatgaag tgcgcaacgt gtccggggtg 600

taccatgtca cgaacgactg ctccaactca agtattgtgt atgaggcagc ggacatgatc 660

atgcacaccc ccgggtgcgt accctgcgtc cgggaggcca actcctcccg ctgctgggta 720

gcgctcactc ccacgctcgc ggccaggaac agcagcgtcc ccactacgac aatacgacgc 780

cacgtcgatt tgctcgttgg ggcagctgct ctctgctccg ccatgtacgt gggagatctc 840

tgcggatctg ttttcctcat ctcccagctg ttcaccttct cacctcgcca gtatgagacg 900

gtacaagact gcaattgctc actctatccc ggccacgtat caggtcaccg catggcttgg 960

gatatgatga tgaactggtc acctacaaca gccctggtgg tatcgcagtt gctccggatc 1020

ccacaagccg tcgtggacat ggtggcgggg gcccactggg gagtcctagc gggccttgcc 1080

tactattcca tggtggggaa ctgggctaag gttctgattg tgatgctact ctttgccggc 1140

gtcgacgggg ctacctacac gtcagggggg acggtaggcc ggaccaccag aggccttacg 1200

tccttctttg cacctggccc gtctcagaag atccaactta tcaacaccaa cggcagctgg 1260

cacatcaata ggactgccct gaattgcaat gactccctcc acaccgggtt ccttgctgcg 1320

ctgttctaca cgcacaagtt caactcgtcc ggatgctcgg agcgtatggc cagctgccgc 1380

cccattgaca agttcgccca ggggtggggt cccatcactc atggtgtgcc tgacgacccg 1440

gaccagaggc cctactgttg gcactacgcg cctcggccgt gcggtatcgt acccgcgtcg 1500

caggtgtgtg gtccagtgta ttgcttcacc ccgagccctg tcgtggtggg gacgaccgat 1560

cgttccggcg cccccacgta cacctggggg gagaatgaga cggacgtgct actccttaac 1620

aacacgcgac cgccgcaagg caactggttc ggttgcacat gggtgaacag caccgggttc 1680

accaaaacgt gcgggggccc cccatgcaac attggagggg tcggcaacaa caccttgacc 1740

tgccccacgg actgcttccg gaagcacccc gaggccactt acaccaaatg cggctcgggg 1800

ccatggttga cacccaggtg catggttgac tacccataca gactctggca ctacccttgc 1860

actgtcaatt ttaccatctt caaggtcagg atgtatgtag ggggtgtgga gcacaggctc 1920

gacgccgcgt gcaattggac ccgaggagag cgttgcaatg tggaggacag ggatagatca 1980

gagcttagcc cactgctact gtccacaaca gagtggcagg tactgccctg ttctttcacc 2040

accctaccgg ctctgtccac tggtttgatc cacctccacc agaacatcgt ggacgtgcaa 2100

tacctgtacg gtgtggggtc agtggttgtc tccgttgtaa tcagatggga gtatgtcgtg 2160

ctgctcttcc ttctcctggc ggacgcacgc gtctgcgcct gcttgtggat gatgctgctg 2220

gtagcccagg ctgaggccgc cttagagaac ttggtggtcc tcaatgcggc atctgtagcc 2280

ggagcgcatg gcattctctc cttccttgtg ttcttctgtg ctgcctggta catcaagggc 2340

aagctggtcc ctggggcggc atatgccttc tatggcgtat ggccgctgct cctgctcctg 2400

ctggcgttac caccacgagc atacgccatg gaccgggaga tggctgcatc atgcggaggc 2460

gcggttttcg taggtctggc actcttgacc ttgtcaccac actataaagt gttcctcgcc 2520

aggctcatat ggtggttgca ataccttatc accagggccg aggcgctgct gcaagtgtgg 2580

atcccccctc tcaacgttcg ggggggccgc gatgccatca tcctcctcac gtgcgcggtc 2640

catccagagc taatctttga catcaccaaa atcttgctcg ccatatttgg tccgctcatg 2700

gtgctccagg ctggcttaac cagagtgccg tacttcgtgc gcgctcaggg gctcatccgt 2760

gtgtgcatgt tggtgcggaa ggtcgctggg ggtcactacg tccagatggc tctcatgagg 2820

ctcgccgcac tgacgggcac gtacgtttac gaccatctca ctccgctgcg gggctgggcc 2880

catgcgggcc tgcgggacct tgcggtggca gttgagcccg tcgtcttctc tgacatggag 2940

accaagatca tcacctgggg ggcagacacc gcggcgtgtg gggacatcat cctgggtcta 3000

cccgtctccg cccgaagggg gaggtaa 3027

<210>59

<211>1524

<212>DNA

<213>人免疫缺陷病毒

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1524)

<223>

<400>59

atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg ggaaaattag ataaatggga aaaaattcgg 60

ttacggccag gaggaaagaa acaatataga ttaaaacatt tagtatgggc aagcagggaa 120

ttagaacgat tcgcagttaa tcctggcctt ttagagacag cagaaggctg taaacaaatt 180

ctggaacagc tacaaccatc ccttcagaca ggatcagaag aacttaggtc attatttaat 240

acagtagcaa ccctctattg tgtccatcag aggatagagg taagagacac caaggaagcc 300

ttagataagg tagaggagga gcaaaacaac agtaagaaaa aggcacagca agcagcagct 360

ggcacaggaa atagcagcca ggccagccaa aattacccta tagtgcagaa catgcagggg 420

caaatggtac atcaggcaat atcacccaga actttaaatg catgggtaaa agtagtagaa 480

gaaaagggtt ttagcccaga agtaataccc atgttttcag cattatcaga aggaggcacc 540

ccacaagatt taaacaccat gctaaacaca atagggggac atcaagcagc catgcaaatg 600

ttaaaagaca ccatcaatga ggaagctgca gaatgggaca gattacatcc agtgcatgca 660

ggacctatcc caccaggcca gatgagggaa cctaggggaa gtgatatagc tggatccact 720

agtacccttc aggaacaaat acaatggatg acaagcaacc cacctgtccc agtgggagaa 780

atctataaaa gatggattat cctaggatta aataaaatag taagaatgta tagccctgtc 840

agcattttgg acataaaaca agggccaaag gaacccttta gagactacgt agacaggttc 900

tttaaaaccc taagagctga gcaagctaca caggaagtaa agggttggat gacagacacc 960

ttgttggtcc aaaatgcgaa cccagattgt aagaccattt taaaagcact gggaccaggg 1020

gcttcactag aagaaatgat gacagcatgt cagggagtag gaggacccgg ccataaagca 1080

agagttttgg ctgaagcaat gagccacatg acaaattcag ctgctataat gatgcagaaa 1140

ggcaatttta ggaatcaaag aaaaactgtc aagtgtttca attgtggcaa agaagggcac 1200

atagccagaa attgcagggc ccctagaaaa aagggctgtt ggaaatgtgg aagagaagga 1260

caccaaatga aagactgcac tgaaagacag gctaattttt tagggagaat gtggccttcc 1320

cacaagggga ggccgggaaa tttccttcag aacaggccag agccaacagc cccaccagca 1380

gagagcttcg ggttcggaga ggagataacc ccatctccga aggtgacccc ctctccgaag 1440

caggagcaga agcaggagca gaaggacgag ggactgtacc ctcccttagc ttccctcaaa 1500

tcactctttg gcaacgacca ctag 1524

<210>60

<211>3045

<212>DNA

<213>人免疫缺陷病毒

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(3045)

<223>

<400>60

atgtttttta gggagaatgt ggccttccca caaggggagg ccgggaaatt tccttcagaa 60

caggccagag ccaacagccc caccagcaga gagcttcggg ttcggagagg agataacccc 120

atctccgaag gtgaccccct ctccgaagca ggagcagaag caggagcaga aggacgaggg 180

actgtaccct cccttagctt ccctcaaatc actctttggc aacgaccact agttacaata 240

aaaatagagg gacagctaat ggaagctcta ttagatacag gagcagatga tacagtatta 300

gaagatgtaa atttgccagg aaaatggaga ccaaaaatga tagggggaat tggaggtttt 360

atcaaagtaa aacagtatga taacatactc atagaaattt gtggacataa ggctataggt 420

acagtgttgg taggacctac gcctgtcaac ataattggaa gaaacatgat gactcagatt 480

ggttgtactt taaattttcc aattagtcct attaggactg taccagtaaa attgaagcca 540

ggaatggatg gcccaaaggt taaacaatgg ccattgacag aagaaaaaat aaaagcatta 600

acagaaatat gtttggaaat ggaaaaagaa ggaaaaattt caaaaattgg gcctgaaaat 660

ccatacaata ctccagtatt tgccataaag aaaaaagaca gtactaaatg gagaaaatta 720

gtagatttca gagaacttaa taaaagaact caagattttt gggaaattca attaggaata 780

ccacatcctg cagggttaaa aaagaaaaag tcagtgacag tactggatgt gggagatgca 840

tatttttcaa ttcccttaga tgaggatttc aggaagtaca ctgcattcac catacctagt 900

atcaacaatg agacaccagg aattaggtac cagtacaatg tgcttccaca aggatggaaa 960

ggatcaccag caatattcca atgtagcatg acaaaaatct tagacccctt tagaacaaaa 1020

aatccagaca tagtgatctg ccaatacatg gatgatttgt atgtagggtc tgacttagaa 1080

atagggcaac atagagcaaa aatagaggag ttaagagaac atctattgaa atggggactt 1140

actacaccag acaaaaaata tcaaaaggag cctccattcc actggatggg gtatgaactc 1200

catcctgata agtggacagt gcagcctata caattgccag acaaggacag ctggactgtc 1260

aatgatatac agaagttagt aggaaaacta aattgggcaa gtcagattta tccagggatt 1320

aaagtaaagc aattatgtaa actccttagg ggagccaagg cattaacaga aatagtgcca 1380

ctgactgcag aagcagagtt agaattagca gagaataggg aaattctaaa agaaccagta 1440

catggggtat attatgaccc atcaaaagac ttaatagcag aaatacagaa acaagggcaa 1500

gggcagtgga catatcaaat ttatcaagag ccatttaaaa atctaaaaac aggaaagtat 1560

gcaaaaatga ggtctgccca cactaatgat gtaaaacaat taacagaagc agtgcaaaag 1620

atagctctag aaagcatagt catatgggga aagactccta agtttagact acccatatta 1680

aaagagacat gggatacatg gtggacagag tattggcaag ccacctggat tcctgaatgg 1740

gagtttgtca ataccccccc tctagtaaaa ctatggtatc agctagaaac agagcccata 1800

gcaggagcag aaaccttcta tgtagatggg gcatctaata gggagaccaa aaaaggaaaa 1860

gcaggatatg ttactgacag aggaagacaa aaagctgttt ccctaactga gaccacaaat 1920

cagaaagccg agttacaggc aattcagtta gctttacagg attcaggatc aaaagtgaac 1980

atagtaacag actcacagta tgtgttagga atcattcaag cacaaccaga taagagtgac 2040

tcagaattag tcaatcaaat aatagagcaa ttaatagaaa aggaaaaggt ctacctgtca 2100

tgggtaccag cacacaaagg aattggagga aatgaacaag tagataaatt agtcagtgct 2160

gggatcagga aagtattatt tttagatgga atagataagg cccaagagga acatgaaaaa 2220

tatcacaata attggagatc aatggctagt gattttaatc tgccacctgt agtagcaaaa 2280

gaaatagtgg ccagttgtga taaatgtcag ctaaaaggag aagccatgca tggacaagta 2340

gactgtagtc caggaatatg gcagctagat tgtacacact tagaaggaaa aattatcctg 2400

gtagcagttc atgtagccag tggatatata gaagcagaag ttattccagc agaaacaggg 2460

caagaaacag catacttcat cttaaaatta gcaggaagat ggccagtaaa aataatacat 2520

acagacaatg gcagcaattt caccagtact acagttaagg ccgcctgttg gtgggcgggg 2580

atcaaacagg aatttggcat tccctacaat ccccaaagtc agggagtaat agaatctatg 2640

aataaggagt taaagaaaat tataggacag gtaagagatc aggctgaaca tcttaagaca 2700

gcagtacaaa tggcagtatt catccacaat tttaaaagaa aaggggggat tggggggtac 2760

agtgcagggg aaagaataat agacataata gcaacagaca tacaaactaa agaattacaa 2820

aaacaaatta caaaaattca aaatttccgg gtttattaca gggacagcag agacccagtt 2880

tggaaaggac cagcaaagct actctggaaa ggtgaagggg cagtagtcat acaagacaat 2940

agtgaaataa aagtagtacc aagaagaaaa gcaaagatca ttagggatta tggaaaacag 3000

atggcaggtg atgattgtgt ggcaggtgga caggatgagg attaa 3045

<210>61

<211>2583

<212>DNA

<213>人免疫缺陷病毒

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2583)

<223>

<400>61

atgagagtga gggggatgca gaggaattgg caggacttgg ggaagtgggg ccttttattc 60

ctgggaatat taataatctg taatgctgaa caaaatttgt gggtcacagt ctattatggg 120

gtacctgtgt ggaaagaagc atccactactct attctgtg catcagatgc taaatcatat 180

gaaagagaag tgcataatgt ctgggctaca catgcctgtg tacccacaga tcccaatcca 240

caagaactag ttctgggaaa tgtaacagaa aattttgata tgtggaaaaa tgatatggta 300

gaacaaatgc atgaagatat aattagctta tgggatcaaa gcctaaaacc atgtgtgaag 360

ttaaccccac tctgtgttac tttaaactgt actaatgcca aggccattaa ctcctctgac 420

aatgccacca attctactcc cttgcctata accagccccc tgaaggaaga ggcaggggca 480

atacaaaact gttctttcaa tgtgaccaca gagttaagag ataagaagaa gaaagaatat 540

gcaatttttt ataaacttga tatagtacca atagaacaaa tcagcaataa aagttacaat 600

acatacaggc taataaattg taacacctca accactacac aggcttgtcc aaaggtatct 660

tgggatccaa ttcccataca ttattgtgct ccagctggtt ttgcgattct aaagtgtaat 720

aataaaacgt tcaatgggac agggccatgc aagaatgtca gtacagtaca atgtacacat 780

ggaattaaac cagtggtatc aactcaattg ttgttaaatg gtagcctagc agaagaagat 840

atagtaatca gatttcaaaa tatctcagat aatgcaaaaa ccataatagt acactttaat 900

gaatctgtac agattaattg tacaagaccc aacaacaata caagaaaagg tatacatatg 960

ggaccaggac aagcatttta tgcagcagga gaaataatag gagacatcag aaaagcatat 1020

tgtactatta atggaacaca atggaatgac actttagaac aggtaaaggc aaagttgcag 1080

gagcatttcc ctaatagaac aataatgttt aactcatctg caggagggga cctagaaatt 1140

acaacacata tttttaattg tagaggagaa tttttttact gcaatacatc agaactgttt 1200

aataacacaa aaaacaatgg caccatcatt ctcccatgta aaataaaaca aattgtaaac 1260

atgtggcaga gagtaggacg agcaatgtat gccaatccca ttgcaggaaa aattaactgt 1320

aactcaaata ttacaggtct attattgaca agagatggtg gtaatcaggc taatgagact 1380

agtggtattc agactaatgg gactgagatc ttcagacctg gaggaggaaa tatgagagac 1440

aattggagaa gtgaattata taaatataaa gtagtacaaa ttaaaccact aggaatagca 1500

cccaccaggg caaaaagacg agtggtgcag agagcaagaa gagcagtggg aataggagct 1560

cttttcattg gattcttagg agcagcagga agcactatgg gcgcggcgtc aataacgctg 1620

acggtacagg ccagacaatt attgtctgga atagtgcaac agcaaaacaa tttactgcag 1680

gctattgaag cgcaacagca tctgttgcag ctcacagtct ggggcattaa acagctccag 1740

gcaagactcc tggctgtgga aagattccta catgatcaac agctcctagg gctttggggc 1800

tgctctggaa aactcatctg caccactagt gtgccctgga actctagttg gagcaataaa 1860

tcttatgaca agatttggga taacatgacc tggatggagt gggaaaaaga gattagcaat 1920

tactcagatg aaatatacag gttaattgaa aaatcgcaga accagcagga aataaatgaa 1980

caagaattat tagcattgga taaatgggca agtctgtgga attggtttga cataacaagc 2040

tggctgtggt atataaaaat attcataatg atagtaggag gcttgatagg cttaagaata 2100

gtttttactg tgctttctat agtaaataga gttaggaagg gatactcacc tttgtcattt 2160

cagacccata tcccaagctc gagggaacaa cccgacaggc ccgaaggaat cgaagaagga 2220

ggtggagagc aagacaaaga cagatccgtg agattagtga gcggattctt agctcttgtc 2280

tggaacgacc tgagggacct gtgcctcttc agctaccacc tcttgagaga cttcacatta 2340

cttgcagcga ggattgtgga cagagggctg aggagggggt gggaagccct caaatatctg 2400

tggaatctcg cgcagtattg gagtcgggaa ctaaagaata gtgctattag cttgtttaat 2460

accacagcaa tagtagtagc tgaagggaca gatagagttc tagaagcttt gcaaagagct 2520

ggtagagctg ttctccatat ccctagaaga ataagacagg gctttgaaag agctttgcta 2580

taa 2583

<210>62

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>62

gaggactctt ggactctca 19

<210>63

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>63

ccgtgtgcac ttcgcttcac ctctg 25

<210>64

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>64

catcacatca ggattccta 19

<210>65

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>65

ctcagtttac tagtgccatt tgttc 25

<210>66

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>66

catcacatca ggattcctaa a 21

<210>67

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>67

agaagatctc aatctcggga atctc 25

<210>68

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>68

cccgctcaat gcctggag 18

<210>69

<211>111

<212>DNA

<213>丙肝病毒

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(111)

<223>

<400>69

atggttttcg gcggccattg gggtgtggtg tttggcttgg cctatttttc catgcaagga 60

gcgtgggcca aagtcattgc catcctcctc cttgtcgcag gagtggacgcg 111

<210>70

<211>1098

<212>DNA

<213>丙肝病毒

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1098)

<223>

<400>70

ggcacctata ccaccggtgc agtcacgggt cgaaccacca atgtgtttac tagcctcttt 60

tcatctgggt cccagcagaa gctcagttta atcaacacca atggcagctg gcacataaac 120

cggaccgccc tcaattgcaa tgacagcctg cagacggggt ttatcgcctc cttgttttac 180

acgcacaggt ttaacagctc cggctgcccc gagcgcttgt cttcctgccg caggctggaa 240

gatttccgca tcgggtgggg aaccttggaa tacgagacta atgtcaccaa tgatgaggac 300

atgaggccgt actgctggca ttaccctcca agaccctgcg gtatcgtcca ggctaagacg 360

gtttgcgggc cggtctattg tttcaccccc agccctgtcg tcgtgggtac cactgacagg 420

cagggcgtgc ccacttacag ctggggggaa aatgagaccg atgttttctt gttaaatagt 480

acaagacccc cgcaaggagc ctggttcggc tgcacttgga tgaatgggac tgggttcact 540

aagacatgcg gtgcaccacc ttgccgcatt aggagggact acaacggaac cctcgaccta 600

ttgtgcccca cagactgttt cagaaagcac ccagatacta cctaccttaa gtgtggagcg 660

gggccttggt tgacccccaa atgcatggta gactatccct atagattgtg gcattatccg 720

tgcactgtga attttaccat cttcaaggtg cggatgtatg tgggaggagt ggagcatcgg 780

ttccatgcag cgtgcaatta cacgcgcggg gaccgctgca gtttggagga cagggacagg 840

ggtcagcaga gtccactact gcattccacc accgagtggg cggtgttgcc atgctctttc 900

tccgacctac cggcactatc cactggtcta ctgcacctcc accaaaacat cgtggacgtg 960

cagtacctct atggactctc tccggctatc acaaaataca tcgtgaagtg ggaatgggtg 1020

atccttcttt tcctgttgct ggcagacgcc agggtctgtg cttgcctctg gatgctcatt 1080

atattgggcc aggccgaa 1098

<210>71

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>71

aagtgttgct ttcattgcca agtttgtt 28

<210>72

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<400>72

Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val

1 5 10

<210>73

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<400>73

Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val

1 5

<210>74

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<400>74

Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ilc

1 5

<210>75

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<400>75

Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Leu

1 5 10

<210>76

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<400>76

Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp

1 5

<210>77

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<400>77

Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu

1 5 10

Claims

1.一种抗免疫耐受病毒的鸡尾酒疫苗，其包括下列元件，所述元件以重组DNA和/或重组病毒的形式存在，所述元件是(A)细胞因子编码序列或RNA干涉序列；(B)免疫佐剂编码序列；(C)抗原基因、病毒抗原表位编码序列或病毒抗原表位-MHC-I SCT基因，其中所述免疫耐受病毒是乙肝病毒(HBV)或丙肝病毒(HCV)；所述免疫佐剂为热休克蛋白gp96或其N355片段，所述的N355片段是由gp96N端的第22-376个端氨基酸组成；所述细胞因子选自细胞因子IFN α1，IFN α2或IFNγ，TNFα或IL-2；所述RNA干涉序列其靶序列选自病毒编码序列或非编码序列；所述抗原基因选自病毒抗原的比对保守序列，主要流行株序列，或病毒抗原与佐剂融合的融合基因序列；所述病毒抗原表位编码序列选自病毒结构基因或调解基因表位序列；所述病毒抗原表位-MHC-I SCT基因选自HLA-A2、HLA-A11、HLA-A24、HLA-A30与病毒抗原和β2m的融合序列。

2.根据权利要求1的鸡尾酒疫苗，其中所述重组DNA为重组质粒。

3.根据权利要求2的鸡尾酒疫苗，其中所述质粒为真核表达载体。

4.根据权利要求1的鸡尾酒疫苗，其中所述重组病毒为重组腺病毒或重组痘苗病毒。

5.根据权利要求1的鸡尾酒疫苗，其是通过将所述元件组合而构建的包含重组DNA、腺病毒和/或痘病毒的多载体疫苗。

6.根据权利要求1的鸡尾酒疫苗，其是通过将所述元件包含到同一个DNA或腺病毒或痘病毒载体中而构建的单载体疫苗。

7.根据权利要求1的鸡尾酒疫苗，其中所述鸡尾酒疫苗为HBV治疗性鸡尾酒疫苗，所述元件以重组DNA和/或重组病毒的形式存在，其中所述(A)元件选自：有效降低HBV-DNA复制的干扰RNA(siRNA)，所述干扰RNA(siRNA)如SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ IDNO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66或SEQ ID NO：67所示；所述(B)元件选自佐剂分子gp96或其N355片段编码序列，所述的N355片段是由gp96N端的第22-376个端氨基酸组成；所述(C)元件选自HBV的结构抗原HBsAg、HBcAg，HBV的抗原表位编码序列或抗原表位-MHC-I SCT基因。

8.根据权利要求1的鸡尾酒疫苗，其中所述鸡尾酒疫苗为HCV治疗性鸡尾酒疫苗，所述元件以重组DNA和/或重组病毒的形式存在，所述(A)元件选自：有效降低HCV复制的干扰RNA(siRNA)，所述干扰RNA(siRNA)如SEQ ID NO：68所示；所述(B)元件选自佐剂分子gp96或其N355片段，所述的N355片段是由gp96N端的第22-376个端氨基酸组成；所述(C)元件选自HCV的结构抗原Core、E1、E2编码序列，HCV的抗原表位编码序列或抗原表位-MHC-I SCT基因。

9.根据权利要求1-8中任一项的鸡尾酒疫苗在制备预防和/或治疗由免疫耐受性病毒引起的疾病的药物中的用途，其中所述免疫耐受病毒是乙肝病毒(HBV)或丙肝病毒(HCV)。

10.一种制备权利要求9所述的药物的方法，所述方法包括将在权利要求1-8中任一项中所述(A)，(B)和(C)元件中的元件分别与重组DNA和/或重组病毒构建成活性载体。